Een nieuwe strategie combinatie matrix-CGH, geheel-exome Sequencing en In Utero Electroporation bij knaagdieren ter identificatie van de oorzakelijke genen voor hersenen misvormingen

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van nieuwe kandidaatgenen voor hersenmisvormingsstoornissen en het direct bevestigen van hun causale rol in-vivo. Deze strategie kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van de neurobiologie door moleculaire paden te ontdekken die geassocieerd zijn met de hersenontwikkeling en gecorreleerde pathologieën. Het belangrijkste voordeel van deze strategie is dat het zal helpen bij het ontdekken van nieuwe genen die geassocieerd zijn met hersenstoornissen en bij het ontwikkelen van nieuwe diagnostische hulpmiddelen.

Met deze benadering konden we de cruciale bijdrage van het C6orf70-gen onthullen bij de pathogenese van periventriculaire nodulaire heterotopie, een hersenafwijking veroorzaakt door abnormale neuronale migratie. De procedure zal worden gedemonstreerd door Fabienne Schaller, een ingenieur uit ons laboratorium. Bereid een E15 drachtige rat voor voor de procedure, zoals beschreven in het schriftelijke protocol en in overeenstemming met de institutionele en nationale richtlijnen.

Zorg ervoor dat het dier correct is geanestheseerd, dat er oogzalf in de ogen is aangebracht en dat de buik correct is geschoren en gedesinfecteerd. Gebruik een schaar om een verticale incisie van twee centimeter te maken in de huid en de spieren van de middenlijn van de caudale buik en leg vervolgens voorzichtig één uterine horn bloot uit de buikholte. Breng druppelsgewijs op 37 degree Celsius voorverwarmde normale zoutoplossing aan om de embryo's vochtig te houden.

Houd de baarmoeder gedurende de gehele procedure vochtig. Om DNA te injecteren, houdt u een embryo voorzichtig in één hand vast, waarbij de kop gemakkelijk toegankelijk is. Voer vervolgens met de andere hand voorzichtig een glazen capillair, verbonden met een micro-injector, in het linker laterale ventrikel, dat zich één millimeter vanaf de middellijn en op een diepte van twee tot drie millimeter bevindt.

Gebruik de micro-injector om ongeveer 1 µL DNA met fast green te injecteren, zodat de injectie visueel kan worden gemonitord. Om het DNA in de cellen te electroporeren, wordt eerst een normale zoutoplossing op het oppervlak van de 3 bij 7 mm elektrode gedruppeld. Plaats vervolgens de positieve elektrode aan de geïnjecteerde zijde en de negatieve elektrode op de niet-geïnjecteerde rechterventrikel.

Gebruik het voetpedaal om vijf elektrische pulsen toe te dienen met intervallen van 950 milliseconden. Plaats na de elektroporatie de uterinehoorn terug in de buikholte en voeg steriele zoutoplossing toe om de embryo's een natuurlijkere positionering mogelijk te maken en om intraoperatief vochtverlies te compenseren. Sluit de spierwand met absorbeerbare chirurgische hechtingen en vervolgens de huid met een eenvoudige onderbroken hechting.

Bied postoperatieve analgesie voor maximaal 48 uur of zoals aangegeven in de institutionele richtlijnen. Plaats de rat terug in zijn schone thuiskooi en houd deze in de gaten totdat het dier volledig is uitgewaakt uit de anesthesie. Nadat de hersenen zijn gefixeerd in 4%paraformaldehyde volgens de beschrijving in het geschreven deel van het protocol, worden deze gedurende 10 minuten gewassen in PBS.

Bereid tijdens het wassen 50 milliliters van 4% agar in PBS voor, waarbij u ervoor zorgt dat de temperatuur van de opgeloste agarose niet boven de 50 degrees Celsius uitkomt. Giet de agarose in plastic inbeddingsvormen en plaats vervolgens de hersenen in de agarose. Plaats de ingebedde hersenen bij vier degrees Celsius en laat de agarose gedurende ten minste een uur polymeriseren.

Nadat de agarose is gepolymeriseerd, snijdt u het overtollige agarose rondom de hersenen weg en lijmt u de hersenen vervolgens op de basisplaat van de vibratoom, waarbij de anterieur-posterieure as van de hersenen loodrecht op het mes staat. Wacht enkele minuten tot de lijm is gedroogd en plaats daarna de plaat met de vastgelijmde hersenen in de kamer van de vibratoom. Vul de vibratoom met PBS en begin met het snijden van coupes met een dikte van 100 micron.

Breng na het maken van de coupes de coupes over naar microscopische objectglazen en verwijder het overtollige vloeistof. Voeg vervolgens enkele druppels monteermedium toe en plaats een dekglas bovenop de coupes. Laat dit een nacht drogen.

Beeld de coupes af met een 10x vergroting op een laser scanning confocale microscoop. Om de beelden te analyseren, wordt het beeld eerst omgezet naar 8-bit met behulp van geschikte software voor kwantitatieve beeldanalyse. Selecteer vervolgens één representatieve GFP-positieve fluorescente cel en definieer handmatig de vorm door op 'estimate' te klikken en de tool voor vrije selectie te gebruiken om de rand van de cel te tekenen.

De software behoudt automatisch de diameter en de intensiteitsdrempel van de cel. Klik op find cells om de software de getransfecteerde cellen in de gehele cortex te laten lokaliseren. Verwijder vervolgens, indien nodig, handmatig de fout-positieven.

Verdeel de volledige dikte van de cortex in acht gebieden van belang, genormaliseerd in individuele secties, door op het regio-instrument te klikken en acht regiostrepen te selecteren, waarbij streep één en acht respectievelijk overeenkomen met de ventriculaire zone en de bovenkant van de corticale plaat. Klik vervolgens op toepassen om de software de relatieve positie van GFP-getransfecteerde cellen in de gehele cortex te laten tellen. Klik ten slotte op kwantificering opslaan om de gegevens te exporteren naar een Excel-bestand voor analyse.

Array CGH en whole exome sequencing identificeerden C6orf70 als een kandidaatgen voor ontwikkelingsgenetische abnormaliteiten. Kwantitatieve PCR bepaalde dat dit gen, samen met PHF10 en DLL1, tot expressie komt in de cerebrale cortex van ratten. De volgende afbeeldingen tonen representatieve neocorticale coronale coupes van E20 rattenhersenen 5 dagen na electroporatie met enkel een groen fluorescent eiwit-construct of in combinatie met shRNA gericht tegen de coderende sequentie van C6orf70 of met het relatief ineffectieve mismatch-construct.

Filament A knock-down werd gebruikt als controle voor een verminderde neuronale migratie. In-utero elektroporatie met shRNA gericht tegen C6orf70 of Filament A veroorzaakte een arrestatie van GFP-positieve cellen binnen de ventriculaire zone, zoals aangegeven door de witte pijlen, terwijl cellen die enkel GFP tot expressie brachten, of in combinatie met het mismatch-construct, de neuronale migratie niet beïnvloedden. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met welk stadium van de corticale genese u wilt analyseren, namelijk neuronale proliferatie, migratie of maturatie.

Vergeet niet dat het aanleren van in-utero electroporatie in het embryonale brein van knaagdieren een lange trainingsperiode, vaardigheden en regelmatige oefening vereist.