Kwantificering van cerebrale vasculaire architectuur met behulp van twee-foton microscopie in een muismodel van de HIV-geïnduceerde Neuroinflammation

Het algemene doel van deze procedure is om veranderingen in de corticale capillaire netwerken te kwantificeren na langdurige blootstelling aan de HIV-virotoxine, tat. Deze methode kan helpen om belangrijke veranderingen in de corticale capillaire morfologie te onderzoeken die kunnen bijdragen aan de pathogenese van HIV-geassocieerde neurocognitieve stoornissen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een fysiologisch nauwkeurige kwantificering van meerdere capillaire morfologische parameters mogelijk maakt.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de pathogenese van HIV-geassocieerde neurocognitieve stoornissen. Het kan ook worden toegepast op andere ziekten waarbij vasculaire veranderingen optreden, zoals de ziekte van Alzheimer. Begin deze procedure door kunstmatig traanvochtgel aan te brengen op de ogen van een verdoofde muis.

Vervolgens scheer je het hoofd met een elektrische scheerder. Breng vervolgens povidonjoop-oplossing aan om de hoofdhuid te steriliseren en laat deze drogen. Verwijder onder een lichte microscoop de hoofdhuid van het dier om de pariëtale botten, de caudale frontale botten en het bregma-punt volledig bloot te leggen.

Breng een kleine hoeveelheid tien procent ijzerchloride-oplossing aan op de schedel om het membraan te drogen voor een gemakkelijke verwijdering. Verwijder vervolgens het opgedroogde membraan door de schedel voorzichtig te schrapen met een pincet. Breng vervolgens een dunne laag lijm aan rond het raam van de hoofdplaat.

Druk de hoofdplaat voorzichtig tegen de schedel van de muis om het gebied van belang in het midden van het raam te houden. Breng vervolgens een druppel tandcement aan op de hoofdplaat om de lijm te polymeriseren. Breng vervolgens een dunne laag lijm aan langs de rand van het raam van de hoofdplaat om een reservoir te creëren om de zoutoplossing te houden.

Zodra de lijm is opgedroogd, schroeven we de hoofdplaat in de muishoofdplaatbeugel. Verwijder eventuele lijm uit het raam van de hoofdplaat met een boortje dat is bevestigd aan een micro-torp boormachine, ingesteld op 6.000 tpm. Stop elke 10 tot 15 seconden om oververhitting van de muizenschedel te voorkomen.

Begin vervolgens met een nieuw boortje om de schedel te verdunnen met behulp van een micro-torp boormachine ingesteld op 4.000 tpm. Beweeg de boor voorzichtig over de schedel zonder directe neerwaartse druk. Zodra de schedel volledig is verdund, los je de muis van de houder en leg je hem op zijn rug.

Kleef voorzichtig beide achterpoten vast om de mediale dijen duidelijk te laten zien. Vervolgens verwijder je het haar over beide mediale dijen en desinfecteer je de operatieplaats door de dijen te bedekken met povidonjoop. Verwijder vervolgens voorzichtig de huid op de mediale rechter dij, boven de femorale ader en slagader.

Breng ongeveer drie tot vijf druppels 0,9%zoutoplossing aan op de operatieplaats. Scheid vervolgens de femorale ader van de slagader door middel van een scherpe dissectie in het femorale neurovasculaire bundel. Plaats nu twee drie centimeter stukken chirurgische hechtdraad, onder de femorale ader, ongeveer een centimeter uit elkaar.

Draai de bovenste hechtdraad met de klok mee om een vasculair tourniquet te maken dat overmatige bloedverlies tijdens katheterisatie helpt voorkomen. Maak vervolgens een kleine incisie in de femorale ader met behulp van een veerschaartje, waar de katheter later zal worden ingebracht om de fysiologische parameters van de muis te monitoren. Verwijder in deze procedure de huid op de mediale linker dij van de muis.

Lokaliseer vervolgens de femorale ader. Gebruik een enkele milliliter spuit en een 30 gauge naald om 130 microliters van de fluorescente kleurstofoplossing op te trekken. Injecteer 100 microliters van de kleurstof langzaam in de femorale ader.

Na het verwijderen van de naald, oefen je gelijkmatig zachte druk uit op de injectieplaats om eventuele bloedingen te stoppen en laat je de kleurstof vijf minuten circuleren. Sluit vervolgens de operatieplaats met hechtingen. Draai de muis voorzichtig op zijn buik en plaats hem in de muishoofdplaatbeugel.

Voor in vivo twee-foton beeldvorming, verplaats je het chirurgische apparaat naar de twee-foton microscoop en zorg ervoor dat het anesthesiegehalte van het dier wordt gehandhaafd. Plaats vervolgens een kleine hoeveelheid 0,9%zoutoplossing in het reservoir van de hoofdplaat en laat het microscoopobjectief zodanig zakken dat het in contact komt met de zoutoplossing. Lokaliseer vervolgens het gebied van belang met behulp van het heldere veldbeeldobjectief.

Begin vervolgens met twee-foton beeldvorming. Lokaliseer een capillair bed op het beeldscherm en vergroten met behulp van de optische zoom. Verzamel beelden van de capillen met behulp van de twee-foton beeldvorming software.

Voor ex vivo twee-foton beeldvorming, maak je een incisie in de hoofdhuid van de onthoofde muis van de interpariëtale botten tot de frontale botten. Zet het vel vast aan de zijkanten van de schedel met de wijsvinger en de duim, plaats de extra fijne schaar onder het mediale interpariëtale bot en snijd de schedel langs de sagittale naad tot ongeveer drie millimeter na het bregma-punt. Scheid vervolgens de schedel van de hersenen en verwijder voorzichtig alle hersenvliezen van het oppervlak van de hersenen met behulp van een pincet.

Schuif voorzichtig het pincet onder de hersenen om deze los te maken van de schedel. Plaats vervolgens de hersenen in een hersenmatrix, specifiek voor muizen, en spoel ze met druppels ACSF. Verwijder vervolgens een millimeter dikke coronale hersensnede.

Plaats de hersensnede op een holle glazen plaat met ACSF, waarbij het meest voorste deel van de snede naar boven gericht is. Bedek vervolgens voorzichtig de hersensnede met een glazen dekglas. Breng de plaat over naar het microscoopplatform en plaats een kleine hoeveelheid 0,9%zoutoplossing op het dekglas.

Laat het microscoopobjectief