Name: Kwantificering van cerebrale vasculaire architectuur met behulp van twee-foton microscopie in een muismodel van de HIV-geïnduceerde Neuroinflammation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-12T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Leer cerebrale vasculaire architectuur kwantificeren met twee-foton microscopie in muismodellen. Deze methode onderzoekt capillaire veranderingen door HIV-virotoxine en helpt bij het begrijpen van neuroinflammatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Maria Jepson, Dr. Paivi Jordan en Dr. Linda Callahan van de University of Rochester Multiphoton Core voor technische adviezen tijdens het voltooien van dit protocol. We danken ook Dr. Changyong Feng voor statistisch deskundig advies, en Dr. Maiken Nedergaard van het University of Rochester Medical Center voor het headplate-ontwerp dat in dit artikel is gebruikt. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door grants T32GM007356 en R01DA026325 van de National Institutes of Health (NIH); en door de University of Rochester Center for AIDS Research grant P30AI078498 (NIH).

De Universiteit van de Universiteit van Rochester Comité op Animal Resources goedgekeurd alle procedures uitgevoerd in dit document. 1. Pre-operatieve voorbereiding (Muizen) <ol><li> Bereid de chirurgische gebied met alle benodigde apparatuur. Steriliseren alle gereedschappen die tijdens de procedure vooraf behulp 70% ethanol. Optioneel gebruik maken van een glazen kraal sterilisator of autoclaaf om de instrumenten te steriliseren. </li><li> Plaats de muis in een isofluraan inductie kamer aangesloten op een isofluraan vaporizer. Stel isofluraan niveau tot 4% bij een snelheid van 1 l / min. Opmerking: voor de experimenten hier gerapporteerde muizen met doxycycline (DOX) induceerbaar HIV-1 Tat transgen gedreven door astrocyt specifieke gliale fibrillaire eiwit (GFAP) promoter (HIV Tat-Tg-muizen) 10 werden gebruikt om het effect van HIV onderzocht -1 veroorzaakte neuro-inflammatie op de cerebrale vasculaire structuur, zoals eerder beschreven 7,10. </li><li> Zachtjes tip de inductie kamer te observeren de muis &amp;# 39; s oprichtende reflex. Zodra de oprichtreflex is onderdrukt, stellen de isofluraan niveau 2% en leid de luchtstroom van de inductie kamer naar de neuskegel van de operatiewond bank. </li><li> Beweeg snel de muis van de inductie kamer aan het water toegediend verwarming pad. Blijven isofluraan (1,5-2%) toe te passen door middel van de neuskegel. Pas anesthesie volgens de individuele muis tolerantie beoordeeld via ademhalingsfrequentie (RR) monitoring. Opmerking: De depressie van RR kunnen verstoren fysiologische gas parameters veranderen van bloedtoevoer naar de hersenen en de beoordeling diameter vat. Poging om RR 55-65 ademhalingen per minuut te houden. Hartslag (HR) kan ook worden gebruikt beoordelen diepte van anesthesie; houden HR tussen de 300-450 slagen per minuut om fysiologische veranderingen in diameter vat te voorkomen. Typisch zal adequate narcose tussen 1,5-2,0% isofluraan ten 1 l / min gedurende een bepaalde muis. </li><li> Voer een teen knijpen om verder te controleren van de diepte van de anesthesie. Als de muis niet reageert, commvloeden de chirurgische procedures. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Thin-schedel Cranial Window <ol><li> Pas kunstmatige traan gel voor de ogen van de muis. Volledig te verwijderen het haar van de hoofdhuid van de muis met een schaar of een elektrisch scheerapparaat. </li><li> Steriliseer de hoofdhuid door toepassing van povidon-joodoplossing; laten drogen. Vervolgens onder een lichtmicroscoop, verwijder de huid van de hoofdhuid van de muis, volledig bloot de pariëtale botten, staart voorhoofdsbeenderen en bregma markering. </li><li> Breng een kleine hoeveelheid van een 10% ferrichloride-oplossing op de schedel teneinde de membranen voor het eenvoudig verwijderen drogen. Verwijder de gedroogde membranen met de # 5/45 tang door voorzichtig schrapen de schedel. </li><li> Breng een dunne laag lijm rond de headplate venster. Druk de kopplaat tegen de schedel van de muis, waarbij het interessegebied in het midden van het venster. Breng een druppel tandheelkundig cement op de hoofdplaat om de lijm te polymeriseren. </li><li> Breng een dun laagjelijm langs de rand van de kopplaat venster om een ​​reservoir waarin zoutoplossing moeten dekken. Zodra de lijm droog is, schroef de hoofdplaat in de muis headplate harnas. Let op: de muis hoofdplaat tuig gebruikt in deze procedure is een structuur met een metalen voet en twee metalen kolommen. Op elke kolom is er een veer en een vleugelmoer. De kopplaat is geplaatst op de top van de lente, en de vleugel moer wordt aangedraaid, totdat de kop is vlak en niet beweegt. </li><li> Verwijder eventuele lijm van de hoofdplaat venster met behulp van een boor gekoppeld aan een Microtorque boor ingesteld op 6000 rpm. Stoppen elke 10-15 sec tot oververhitting van de muis cranium die kunnen leiden tot structurele beschadiging van vaten voorkomen. <ol><li> Met een nieuwe boor, plaats de Microtorque boor 1,5 mm lateraal van de middellijn (één-derde van de diameter van de kopplaat venster). Beginnen te dun de schedel rond deze locatie op 4000 rpm. Beweeg de boor voorzichtig over de schedel met geen directe neerwaartse druk. </li><li> Cease drilleng elke 10-15 sec tot oververhitting van de muis schedel te voorkomen. Gedurende deze tijd, verwijder het opgehoopte schedel stof met een perslucht bus. </li><li> Gebruik druppels RT zoutoplossing om schedel afkoelen 5-10 sec. Verwijder voorzichtig alle vloeistof met een zacht weefsel aan de schedel dunner blijven. </li></ol></li><li> Voor de laatste verdunning van de schedel, plaats een kleine hoeveelheid zout in de hoofdplaat reservoir en licht vegen een tandheelkundige microblad over het gebied van de rente tot kleine schepen zijn duidelijk zichtbaar. </li></ol> 3. Monitoring van fysiologische parameters <ol><li> Zodra de schedel volledig is uitgedund, los van de muis uit de houder en plaats hem op zijn rug. Zachtjes band naar beneden beide achterpoten aan de mediale dijen duidelijk bloot. </li><li> Verwijder de haren over beide mediale dijen met een schaar of een elektrisch scheerapparaat. Ontsmet de operatiewond door het bedekken van de dijen met povidonjood. </li><li> Neem de huid aan de mediale rechterdij boven de femorale aderen slagader via de # 5 tang. Trek de huid naar boven en gebruik een schaar te knippen en verwijder de huid. Opmerking: de linkerdij is gereserveerd in het geval van chirurgische complicaties (vasculaire afwijkingen, gescheurde schepen). </li><li> Breng ongeveer 3-5 druppels 0,9% zoutoplossing operatieplaats. Dit zorgt voor een grotere vergroting van schepen, alsmede het bijhouden van de locatie gehydrateerd en het voorkomen van het drogen van de vaten. Scheid de dijader van slagader door botweg ontleden in het dijbeen neurovasculaire bundel met twee # 5/45 tang. </li><li> Plaats twee, 3 cm stukken van chirurgische hechtdraad onder de dij slagader ongeveer 1 cm uit elkaar. Draai de bovenste hechting met de klok mee om een ​​vasculaire tourniquet die zullen helpen om overmatig bloedverlies tijdens catheterisatie voorkomen creëren. </li><li> Maak een kleine incisie in de dij slagader met behulp van de lente een schaar. Plaats de katheter in de slagader door de incisie en vooruit totdat de catheter stevig in de slagader. </li><li&gt; untwist de bovenste hechtdraad (tourniquet) te beoordelen op lekken en de juiste katheter. Zet de katheter in de liesslagader door koppelverkoop twee knopen rond de katheter in het vat met behulp van de hechtingen. </li><li> Injecteer 10 ul heparine (100 IU / ml) door de katheter om bloedstolling te voorkomen. Vervolgens chirurgisch sluiten van de rechterdij door het naaien van de huid samen met een 4-0 hechtdraad op een eenvoudige onderbroken patroon. </li><li> Injecteer 50 pi urethaan (1,2 mg / g) intraperitoneaal in het kwadrant rechtsonder. Vijf minuten later herhaald met een andere 50 pi injectie naar links onderste kwadrant voor een totaal van 100 pl intraperitoneaal urethaan. Langzaam verminderen van de isofluraan niveau tot ongeveer 0,25%, terwijl gelijktijdig hercontrole muis voor de diepte van de anesthesie. Opmerking: De naald oppervlakkig in de peritoneale holte langs de buikwand zodat het niet de darm perforeren. Dit kan worden bewerkstelligd door afklemmen van de abdominale rectus muscles weg van de ingewanden en vervolgens injecteren. </li><li> Met behulp van een capillaire buis, verzamel een 40 ui monster van arterieel bloed uit de katheter. Bevestig de katheter om het bloed drukomvormer voorzien van een zoutoplossing gevulde vier-weg kraan en heparine-injectiespuit. </li><li> Tape de bloeddruk transducer op de chirurgische inrichting om de onbedoelde verwijdering van de katheter te voorkomen. Begin bewaking van de gemiddelde arteriële druk. </li><li> Steek het bloed gevulde capillair in een bloedgasanalysator ingangspoort. Zodra al het bloed is onttrokken, verwijder het capillair van de ingangspoort. De O 2 en CO 2 bloed gas niveaus zal verschijnen op een papier afgedrukt uit het bloed gas analyzer. </li></ol> 4. Injectie van de fluorescerende kleurstof <ol><li> Neem de huid aan de mediale linkerdij met de # 5 tang. Trek de huid naar boven en gebruik een schaar te knippen en verwijder de huid. Bereid dextran geconjugeerd rood uitstralende rhodamine kleurstof(70 kDa) (10 mg / kg opgelost in zoutoplossing). </li><li> Zoek het dijbeen vein.Using een 1 ml spuit met een 30 G naald bevestigd, trek een eerder bereide oplossing van een fluorescerende kleurstof die geschikt is voor beeldvorming van de 130 ul lijn van de spuit. Verwijder alle luchtbellen door het tekenen van de kleurstof volledig in de spuit en stevig vegen de spuit muur. <ol><li> Buig de 30 G-naald op een ongeveer 30 graden door het tegen een hard oppervlak schuine kant naar boven. Vul de naald met de kleurstof en geen vocht ontdoen, waardoor een 100 pl monster. </li></ol></li><li> Injecteer 100 ui monster van kleurstof langzaam in de femorale ader. Na verwijdering van de naald, passen stevig vast en druk op de injectieplaats elke bloeden te stoppen. Laat het kleurstof circuleren gedurende 5 min. Opmerking: Als alternatief kan de rechter femorale ader plaats daarvan worden gebruikt voor de fluorescerende kleurstof injectie verdere bloedverlies te voorkomen door het creëren van een andere operatieplaats. Bovendien, als dedier ongecontroleerd bloeden uit de operatieplaats, kan dit een indicatie dat teveel heparine werd aan de katheter te spoelen. Als er geen stolling binnen 10-15 min en de muis blijft bloeden, eens het experiment opnieuw starten met een nieuwe muis. </li><li> Sluit de linker dij door het naaien van de huid samen met een 4-0 hechtdraad, dan voorzichtig flip de muis op zijn buik, en plaats deze in de muis headplate harnas. </li></ol> 5. In vivo twee-foton Imaging <ol><li> Verplaats de chirurgische apparatuur om de twee-foton microscoop, en zorg ervoor dat continue anesthesie op peil te houden. Een kleine hoeveelheid van 0,9% zoutoplossing in de kopplaat reservoir en laat de microscoopobjectief zodat het in contact komt met de zoutoplossing. Zoek het gebied van belang met behulp van de helderveld bekijken van objectieve </li><li> Stel de twee-foton excitatie laser op een golflengte die geschikt is voor de fluorescente kleurstof. Begin twee-foton beeldvorming met behulp van de 25x oOEL. Merk op dat in deze experimenten gebruikten we een dextran geconjugeerd aan een rood uitstralende rhodamine kleurstof die opgewonden bij een golflengte van 780 nm. Een emissiefilter 607/36 bandpass de fluorescentie van de kleurstof te detecteren, en een 480/20 bandpass emissiefilter werd gebruikt om arteriële autofluorescentie detecteren </li><li> Zoek een capillair bed op het scherm bekijken, en vergroot dit gebied met behulp van optische zoom 2. Acquire beelden van de haarvaten met behulp van de twee-foton imaging software. </li><li> Na beeldvorming is voltooid, offeren de muizen door cervicale dislocatie waarna zij werden onthoofd. </li></ol> 6. ex vivo twee-foton Imaging <ol><li> De extra fijne schaar, een insnijding in de hoofdhuid van de interparietal botten voorhoofdsbeenderen van de muis. Bevestig de huid aan de zijkant van de schedel met de wijsvinger en duim. </li><li> Plaats de extra fijne schaar onder de mediale interparietal bot en snijd de schedel langs de pijlnaad. Stoppen met het snijden van de schedel van ongeveer 3 mm na de bregma markering. Opmerking: Breng opwaartse druk bij het snijden van de schedel te voorkomen dat het snijden van de hersenen. </li><li> De # 5 tang, scheid de schedel de hersenen en eventueel aanwezig meninges van het oppervlak van de hersenen. Resterende hersenvliezen kan per ongeluk verscheuren de hersenen; extreme zorg moet worden genomen om dit te voorkomen. Schuif de # 5 tang onder de hersenen langzaam naar voren vooruit totdat de hersenen is vrij van de schedel. Merk op: dat neerwaartse druk moet worden gebruikt om te beschadigen de hersenen. </li><li> Plaats de hersenen in hersenen snijden instrument specifiek voor muizen. Was de hersenen door het aanbrengen van druppels van kunstmatige cerebrospinale vloeistof over de hersenen. </li><li> Verwijderen van een 2 mm coronale sectie van de hersenen van bregma 0 tot bregma -2. Plaats de coronale sectie op een holle glazen dia met kunstmatige cerebrospinale vloeistof met de 0 bregma (de meeste craniale deel van de sectie) naar boven. Bedekken voorzichtig de hersenen slijs met een glazen afdekplaat slip. Opmerking: Vermijd het indrukken van de glazen eenmaal geplaatst op het traject hersenen als dit de vasculaire architectuur kan vervormen. </li><li> Breng de schuif naar microscooptafel en plaats een kleine hoeveelheid 0,9% zoutoplossing op het dekglas. Laat de microscoopobjectief totdat deze in contact met de zoutoplossing. Zoek de middellijn van de hersenen met behulp van de helderveld doel. </li><li> Begin twee-foton beeldvorming en zoek de middellijn weer met behulp van de 25x doelstelling. Dit te bereiken door te zoeken naar de longitudinale spleet in de corticale oppervlak van de coronale sectie. Plaats de rechterrand van het afbeeldscherm van de middellijn en beweeg de kijker scherm over lateraal drie volledige frames (ongeveer 1,5 mm middellijn). Merk op dat in deze experimenten, de beeldvormende parameters waren identiek aan die in de nota vermeld in stap 5,2. </li><li> Zoek de diepte waarop haarvaten zijn nauwelijks zichtbaar op het scherm bekijken. Verlaag het vlak van aandacht een extra 20urn tot boven de z-stack bepalen. </li><li> Stel het beeld dikte tot 1 pm. Verlaag het scherm 100 urn uitzicht en pas laservermogen gedurende zodanig dat minder dan 1% van de pixels oververzadigde. Opmerking: de z-stack beelden zijn samengesteld uit een reeks van 100 opeenvolgende afbeeldingen 500x500x1 urn. Hoe groter de z-stack hoe nauwkeuriger de nabewerking berekeningen. In het algemeen proberen een z-stack van 100 micrometer of groter verzamelen. </li><li> Druk op de XY Repeat icoon gevolgd door het aangrenzende XY icoon. Zodra de z-stack compleet is, drukt u op het pictogram Series Gedaan en sla het bestand. </li></ol> 7. Data Processing <ol><li> Open een afbeelding in vivo capillaire in de ImageJ software. Handmatig de pixel afstandsverhouding basis van de waarden verkregen van de twee-foton software. <ol><li> Selecteer de * recht * icoon uit het menu Extra. Trek een lijn die zich uitstrekt van de ene capillaire muur om de OPPOter capillairwand en noteer de lengte door ImageJ. Merk op dat het nodig kan zijn in het beeld te zoomen om duidelijk zichtbaar de randen van de capillaire wanden. </li><li> Herhaal stap 7.1.1 op verschillende plaatsen langs het capillair, alsmede voor meerdere capillairen in het beeld. </li></ol></li><li> Open de z-stack bestand in de analysesoftware zoals Amira. Selecteert u het pictogram Filament Editor op de werkbalk sub-applicatie <ol><li> Stel de kijker dikte tot ongeveer 20. Beweeg de kijker aan de boven- of onderzijde van de z-stack. </li><li> Selecteer het pictogram Trace en beweeg de cursor over de geladen afbeelding. Plaats knooppunten op de capillairen in de in figuur 2C beschreven locaties; segmenten verschijnt automatisch tussen aangrenzende knooppunten. Trace haarvaten in het gehele z-stack. Opmerking: het zal noodzakelijk zijn om knooppunten te plaatsen tussen de eindpunten en vertakkingspunten teneinde de capillairen thr tracerenoughout de z-stack. </li><li> Om deze knooppunten te verwijderen, klikt u op het verwijderen Intermediate icoon. Opmerking: Dit kan foutieve lus segmenten die handmatig moet worden verwijderd door het selecteren van de lus met behulp van de Select Single pictogram en vervolgens de Verwijder geselecteerde pictogram te creëren. Als loops steeds in hetzelfde gebied tijdens tracering, is het waarschijnlijk dat de knooppunten op verschillende capillairen werden geplaatst. </li><li> Zodra de tracing is voltooid, selecteert u het pictogram Grafiek informatie naar een spreadsheet met het automatisch uitgepakt vasculaire parameters te openen. Het aantal knooppunten en segmenten zijn beschikbaar op de belangrijkste weergave scherm. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kraft-Terry, S. D., Buch, S. J., Fox, H. S., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coat+of+many+colors%3A+neuroimmune+crosstalk+in+human+immunodeficiency+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A coat of many colors: neuroimmune crosstalk in human immunodeficiency virus infection.</a> Neuron. 64 (1), 133-145 (2009).</li>
<li>Ghafouri, M., Amini, S., Khalili, K., Sawaya, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+associated+dementia%3A+symptoms+and+causes%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 associated dementia: symptoms and causes.</a> Retrovirology. 3, 28(2006).</li>
<li>Antinori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updated+research+nosology+for+HIV-associated+neurocognitive+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Updated research nosology for HIV-associated neurocognitive disorders.</a> Neurology. 69 (18), 1789-1799 (2007).</li>
<li>Clifford, D. B., Ances, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-associated+neurocognitive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">HIV-associated neurocognitive disorder.</a> The Lancet. Infectious diseases. 13 (11), 976-986 (2013).</li>
<li>Lindl, K. A., Marks, D. R., Kolson, D. L., Jordan-Sciutto, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-associated+neurocognitive+disorder%3A+pathogenesis+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroimmune+pharmacology+%3A+the+official+journal+of+the+Society+on+NeuroImmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HIV-associated neurocognitive disorder: pathogenesis and therapeutic opportunities.</a> Journal of neuroimmune pharmacology : the official journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 5 (3), 294-309 (2010).</li>
<li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS-targeted+production+of+IL-17A+induces+glial+activation%2C+microvascular+pathology+and+enhances+the+neuroinflammatory+response+to+systemic+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">CNS-targeted production of IL-17A induces glial activation, microvascular pathology and enhances the neuroinflammatory response to systemic endotoxemia.</a> PloS one. 8 (2), e57307(2013).</li>
<li>Silva, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+central+nervous+system+expression+of+HIV-1+Tat+leads+to+accelerated+rarefaction+of+neocortical+capillaries+and+loss+of+red+blood+cell+velocity+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Chronic central nervous system expression of HIV-1 Tat leads to accelerated rarefaction of neocortical capillaries and loss of red blood cell velocity heterogeneity.</a> Microcirculation. 21 (7), 664-676 (2014).</li>
<li>Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin-skull+window+technique+for+chronic+two-photon+in+vivo+imaging+of+murine+microglia+in+models+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (43), (2010).</li>
<li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).</li>
<li>Bruce-Keller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+causes+rapid+increases+in+glial+activation+and+neuronal+injury+in+the+striatum+of+inducible+HIV-1+Tat+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Morphine causes rapid increases in glial activation and neuronal injury in the striatum of inducible HIV-1 Tat transgenic mice.</a> Glia. 56 (13), 1414-1427 (2008).</li>
<li>Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+and+extracellular+matrix+in+vivo+by+using+second-harmonic+generation+and+two-photon+excited+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11014-11019 (2002).</li>
<li>Silva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+hypercapnia+reveals+an+underlying+cerebrovascular+pathology+in+a+murine+model+for+HIV-1+associated+neuroinflammation%3A+role+of+NO-cGMP+signaling+and+normalization+by+inhibition+of+cyclic+nucleotide+phosphodiesterase-5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Transient hypercapnia reveals an underlying cerebrovascular pathology in a murine model for HIV-1 associated neuroinflammation: role of NO-cGMP signaling and normalization by inhibition of cyclic nucleotide phosphodiesterase-5.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 253(2012).</li>
<li>Farber, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+and+agent-specific+dilation+of+intracerebral+microvessels+by+volatile+anesthetics+in+rat+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Region-specific and agent-specific dilation of intracerebral microvessels by volatile anesthetics in rat brain slices.</a> Anesthesiology. 87 (5), 1191-1198 (1997).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier beschreven methode kan worden toegepast op de hersenen microvasculaire te analyseren in een groot aantal experimentele modellen / instellingen. Voor het succes van deze werkwijze moet drie cruciale stappen worden beheerst. Ten eerste moet de dunne schedel raam schedel of onderliggende hersenen niet beschadigen. Het is gemakkelijk om de schedel te doorboren tijdens dunner, of ervoor zorgen dat de warmte-geïnduceerde vasculaire lekkage. Dit kan interfereren met beeldvorming als de fluorescerende kleurstof zal lekk...

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) binnendringt de hersenen tijdens de acute fase van virusinfectie en productief infecteert zowel microglia en brein macrofagen, waardoor hun activering - de afgifte van zowel gastheer afkomstig ontstekingsmediatoren en oplosbare HIV-1 virotoxins zoals Tat en gp120 (besproken in 1,2). Bijgevolg wordt een chronische neuro-inflammatoire toestand ingesteld in het CZS, waarvan wordt gedacht dat bijdraagt ​​aan de pathogenese van HIV-1 geassocieerde Neurocognitieve Disorders (HAND) 3-5. Chronische overexpressie van HIV-1 Tat en interleukine (IL) -17A in het CZS van muizen is aangetoond dat het resulteert in microvasculaire verdunning 6,7. Dit verhoogt de mogelijkheid dat chronische inflammatoire processen kan bijdragen tot de pathogenese van de hand door effecten op de cerebrale vasculatuur. Om dit vraagstuk nader te bestuderen, hebben we methoden om cerebrovasculaire struc kwantificeren ontwikkeldturen. Dit document beschrijft een werkwijze voor het kwantificeren van het aantal capillaire knooppunten capillaire segmenten gemiddelde segmentlengte, totale segmentlengte, gemiddelde capillair diameter en totale capillaire volume met in vivo beeldvorming van capillaire netwerken via een dunne schedel corticale venster (gemodificeerd van eerder beschreven protocols) 8,9, en ex vivo beeldvorming van hersencoupes, met behulp van twee-foton microscopie. Deze gecombineerde aanpak voorziet in een holistische kwantificering van cerebrale vasculaire parameters, omdat de in vivo dunne schedel corticale venster zorgt voor het behoud van de cerebrale milieu, maar ex vivo beeldvorming van capillaire netwerken in hersencoupes maakt de reconstructie van de volledige driedimensionale capillaire netwerken - dat vervolgens kan worden gekwantificeerd met behulp van commercieel verkrijgbare software.

<table><tbody><tr><td>Leica Microscoop</td><td>Leica Inc.</td><td>MZ8</td><td></td></tr><tr><td>High Intensity Illuminator</td><td>Dolan-Jenner</td><td>180</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingskussen</td><td>Stryker&nbsp;</td><td>TP3E</td><td></td></tr><tr><td>T/PUMP</td><td>Gaymar Industries, Inc.</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>TEC-4 Isoflurane Verdamper</td><td>Datex Ohmeda</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>Kunstmatig Tranengel</td><td>Butler AHS</td><td>7312</td><td></td></tr><tr><td>Povidon-jood oplossing&nbsp;</td><td>Aplicare</td><td>52380-1855-9</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fijne Bonn Schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumot #5 Pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Ferric Chloride Oplossing</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-16</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 454 Prisma Instant Lijmgel</td><td>Henkel</td><td>45404</td><td></td></tr><tr><td>Tandartslijm</td><td>Stoelting</td><td>51459</td><td></td></tr><tr><td>Microtoruqe II Handpiece Kit</td><td>Pearson Dental</td><td>R14-0002</td><td></td></tr><tr><td>005 Burr voor Micro Boor</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>Norland Blad (Tandheelkundige Microblad)</td><td>Salvin Dental</td><td>6900</td><td></td></tr><tr><td>Urethane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U2500</td><td>Groep 2B Carcinogeen</td></tr><tr><td>Gevlochten Hechtdraad</td><td>Ethicon</td><td>735G</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Veerschaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Arteriële katheter</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>MAC-01</td><td>Het einde van de katheter werd handmatig uitgerekt om de diameter ervan te verkleinen.&nbsp;</td></tr><tr><td>Bloeddruk Monitor</td><td>World Precision Intruments</td><td>SYS-BP1</td><td></td></tr><tr><td>Bloeddruk Transducer en Kabel</td><td>World Precision Intruments</td><td>BLPR2</td><td></td></tr><tr><td>RAPIDLab Bloedgas Analyzer&nbsp;</td><td>Siemens&nbsp;</td><td>248</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu;l Capillaire buis</td><td>VWR</td><td>15401-413</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-dextran (70.000 MW, 10 mg/kg opgelost in zoutoplossing)</td><td>Invitrogen</td><td>D-1830</td><td></td></tr><tr><td>Volwassen Muis Hersenslicer Matrix</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS001-1</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multifoton Microscoop</td><td>Olypmus</td><td>FV-1000 MPE</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>National Institutes of Health (NIH)</td><td></td><td>Beschikbaar op http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Amira Software</td><td>Visage Imaging&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kwantificering van cerebrale vasculaire architectuur met behulp van twee-foton microscopie in een muismodel van de hiv-geïnduceerde neuroinflammation

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infectie resulteert vaak in HIV-1 Geassocieerde Neurocognitieve Stoornissen (HAND), en wordt gekenmerkt door een chronische neuroinflammatoire toestand binnen het centrale zenuwstelsel (CZS), waarvan wordt aangenomen dat deze voornamelijk wordt aangedreven door virologisch-gemedieerde activering van microglia en in de hersenen aanwezige macrofagen. HIV-1 infectie gaat ook gepaard met veranderingen in de cerebrovasculaire bloedstroom (CVB), waardoor de mogelijkheid ontstaat dat HIV-geassocieerde chronische neuro-inflammatie kan leiden tot veranderingen in CVB en/of in de cerebrale vasculaire architectuur. Om deze vraag te beantwoorden, hebben we een muismodel voor HIV-geïnduceerde neuro-inflammatie gebruikt, en we hebben getest of langdurige blootstelling aan deze inflammatoire omgeving schade aan de hersenvaten kan veroorzaken en resulteren in verdunning van capillaire netwerken. In dit artikel beschrijven we een methode om veranderingen in corticale capillaire dichtheid te kwantificeren in een muismodel van neuroinflammatoire ziekte (HIV-1 Tat transgene muizen). Deze veralgemeende aanpak gebruikt in vivo twee-foton beeldvorming van corticale haarvaten via een dunne schedel corticale venster, evenals ex vivo twee-foton beeldvorming van corticale haarvaten in muis hersensecties. Deze procedures produceren respectievelijk afbeeldingen en z-stack bestanden van capillaire netwerken, die vervolgens kunnen worden onderworpen aan kwantitatieve analyse om veranderingen in de cerebrale vasculaire architectuur te beoordelen.

Het corticale window dunne schedel maakt in vivo twee-foton beeldvorming van corticale capillairen (figuur 1). Een geschikte ruimte om afbeelding toont vele, verschillende haarvaten (Figuur 1A). In hetzelfde gezichtsveld, is er geen arteriële celwand autofluorescentie en kunnen er andere fluorescentiesignalen, zoals collageen fluorescentie, geïnduceerd door frequentieverdubbeling 11 (Figuur 1B). <p class="jove_con...

Dit document beschrijft een methode waarmee de vasculaire architectuur in de hersenen kan worden gekwantificeerd met behulp van in vivo en ex vivo twee-foton microscopie.

Kwantificering van cerebrale vasculaire architectuur met behulp van twee-foton microscopie in een muismodel van de HIV-geïnduceerde Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Het algemene doel van deze procedure is om veranderingen in de corticale capillaire netwerken te kwantificeren na langdurige blootstelling aan het HIV-virotoxine tat. Deze methode kan helpen bij het onderzoeken van belangrijke veranderingen in de corticale capillaire morfologie die kunnen bijdragen aan de pathogenese van HIV-geassocieerde neurocognitieve stoornissen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een fysiologisch nauwkeurige kwantificering van meerdere capillaire morfologische parameters mogelijk maakt.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de pathogenese van HIV-geassocieerde neurocognitieve stoornissen, kan deze ook worden toegepast op andere ziekten waarbij vasculaire veranderingen optreden, zoals de ziekte van Alzheimer. Begin deze procedure door kunsttranengel aan te brengen in de ogen van een geanestheseerde muis.Scheer vervolgens de kop van het dier met een elektrisch scheerapparaat. Breng daarna een povidonjodiumoplossing aan om de hoofdhuid te steriliseren en laat dit drogen. Verwijder onder een lichtmicroscoop de hoofdhuid van het dier, zodat de pariëtale beenderen, de caudale frontale beenderen en het bregmapunt volledig bloot komen te liggen.Breng een kleine hoeveelheid van een tien procent ijzer(III)chloride-oplossing aan op de schedel, om het membraan te drogen voor eenvoudige verwijdering. Verwijder vervolgens het gedroogde membraan door voorzichtig over de schedel te schrapen met de pincet. Breng daarna een dunne laag lijm aan rondom het venster van de hoofdplaat.Druk de hoofdplaat voorzichtig tegen de schedel van de muis om het gebied van interesse in het centrum van het venster te houden. Breng vervolgens een druppel tandcement aan op de hoofdplaat om de lijm te polymeriseren. Breng daarna een dunne laag lijm aan langs de rand van het venster van de hoofdplaat om een reservoir te creëren voor de zoutoplossing.Zodra de lijm is gedroogd, schroeft u de hoofdplaat in het hoofdharnas voor de muis. Verwijder eventuele lijmresten uit het venster van de hoofdplaat met een boortje op een micro-torp boormachine, ingesteld op 6.000 rpm. Stop elke 10 tot 15 seconden om oververhitting van het schedeldak van de muis te voorkomen.Gebruik daarna een nieuwe boorkop om de schedel dunner te maken met een micro-torp boormachine ingesteld op 4.000 rpm. Beweeg de boor voorzichtig over de schedel zonder directe neerwaartse druk uit te oefenen. Zodra de schedel volledig is uitgedund, haalt u de muis uit de houder en plaatst u deze op de rug.Plak beide achterpoten voorzichtig vast om de mediale dijbenen duidelijk bloot te leggen. Verwijder vervolgens het haar op beide mediale dijbenen en desinfecteer de operatielocatie door de dijbenen te bedekken met povidonjodium. Verwijder daarna voorzichtig de huid op het mediale rechterdijbeen, boven de vena femoralis en arteria femoralis.Breng ongeveer drie tot vijf druppels 0,9% zoutoplossing aan op de chirurgische plek. Scheid vervolgens de vena femoralis van de arteria door bot te disseceren in het femorale neurovasculaire bundel. Plaats nu twee stukken chirurgisch hechtmateriaal van drie centimeter onder de arteria femoralis, met een tussenruimte van ongeveer één centimeter.Draai de bovenste hechting met de klok mee om een vasculaire tourniquet te creëren, wat helpt om overmatig bloedverlies tijdens de catheterisatie te voorkomen. Maak vervolgens met veerschaar een kleine incisie in de arteria femoralis, waar de katheter later zal worden ingebracht om de fysiologische parameters van de muis te monitoren. Verwijder bij deze procedure de huid op de mediale linker dij van de muis.Lokaliseer vervolgens de vena femoralis. Trek met een spuit van 1 ml en een naald van 30 gauge 130 µL van de fluorescerende kleurstofoplossing op. Injecteer langzaam 100 µL van de kleurstof in de vena femoralis.Verwijder de naald en oefen een gestage, lichte druk uit op de injectieplaats om eventuele bloedingen te stoppen en laat de kleurstof vijf minuten circuleren. Sluit vervolgens de chirurgische wond met hechtingen. Draai de muis voorzichtig op de buik en plaats deze in het hoofdharnas voor muizen.Verplaats voor in vivo tweefoton-imaging de chirurgische apparatus naar de tweefotonmicroscoop en zorg ervoor dat het anesthesieniveau van het dier gehandhaafd blijft. Plaats vervolgens een kleine hoeveelheid 0,9% saline in het reservoir van de hoofdplaat en laat het objectief van de microscoop zakken zodat dit in contact komt met de saline. Lokaliseer daarna het gebied van interesse met behulp van het brightfield-objectief.Begin vervolgens met twee-fotonenbeeldvorming. Lokaliseer een capillair bed op het scherm en vergroot dit gebied ook met de optische zoom. Leg beelden van de capillairen vast met behulp van de software voor twee-fotonenbeeldvorming.Maak voor ex vivo twee-fotonen-beeldvorming een incisie in de hoofdhuid van de onthoofde muis, vanaf de interpariëtale beenderen tot aan de frontale beenderen. Zet de huid met de wijsvinger en de duim vast aan de zijkanten van de schedel, plaats de extra fijne schaar onder het mediale interpariëtale bot en knip de schedel langs de sagittale naad door tot ongeveer drie millimeter voorbij het bregmapunt. Scheid vervolgens de schedel van de hersenen en verwijder voorzichtig alle hersenvliezen van het hersenoppervlak met de pincet.Schuif de pincet voorzichtig onder de hersenen om deze uit de schedel te bevrijden. Plaats de hersenen vervolgens in een hersenmatrix, specifiek voor muizen, en spoel deze af met druppels ACSF. Verwijder daarna een coronaal hersensegment met een dikte van één millimeter.Plaats de hersensectie op een concave glazen objectglas met ACSF, waarbij het meest anterieure deel van de sectie naar boven is gericht. Dek de hersenplak vervolgens voorzichtig af met een glazen dekglas. Verplaats het objectglas naar de microscooptafel en breng een kleine hoeveelheid 0,9% zoutoplossing aan op het dekglas.Laat het microscoopobjectief zakken tot het in contact komt met de zoutoplossing. Lokaliseer vervolgens de middellijn van de hersenen met behulp van het bright field-objectief. Start nu de tweefoton-beeldvorming en lokaliseer de middellijn opnieuw met het 25x-objectief.Bereik dit door te zoeken naar de longitudinale fissuur op het corticale oppervlak van de coronale doorsnede. Plaats vervolgens de rechterrand van het beeldscherm op de middellijn en verplaats het weergavevenster lateraal over drie volledige frames. Bepaal de diepte waarbij de capillairen nauwelijks zichtbaar zijn op het weergavevenster.Verlaag vervolgens het focusvlak met nog eens 20 micrometers om de bovenkant van de z-stack te bepalen. Stel de beelddikte in op één micrometer. Verlaag het viewscherm met 100 micrometers en pas de lasersterkte gedurende het proces zo aan dat minder dan één procent van de pixels oververzadigd is.Verwerf tot slot de z-stack. In deze figuur, nadat de hersenplak is geprepareerd, wordt een beeldgevingsgebied op ongeveer 1,5 millimeter van de middenlijn gelokaliseerd. Een z-stack van 100 micrometer produceert een driedimensionaal beeld dat wordt gebruikt voor analyse in de Amira Analytical Software.Het capillairnetwerk wordt vervolgens handmatig getraceerd door knooppunten te plaatsen aan het begin en einde van een capillair of op elke locatie waar één capillair vertakt in een ander. Dit resulteert in een volledig geskeletiseerd beeld waaruit de morfologische parameters automatisch worden geëxtraheerd. Het aantal capillaire knooppunten, segmenten, de gemiddelde segmentlengte en de totale segmentlengte kunnen worden geëxtraheerd met behulp van twee-foton ex vivo beeldvorming van plakjes muizenhersenen.Hier wordt een tweedimensionaal beeld van de capillaire netwerken geproduceerd via in vivo beeldvorming, waarbij de capillaire diameter kan worden bepaald en het totale capillaire volume kan worden berekend met behulp van de capillaire diameter en de totale segmentlengte verkregen uit de ex vivo beeldvorming. Zodra de methode onder de knie is, kan deze procedure in drieënhalf uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om snel te handelen terwijl een constant anesthesieniveau wordt gehandhaafd, aangezien isofluraan vaatverwijding van corticale capillairen kan veroorzaken, wat de gegevens kan vertekenen.Tijdens deze procedure kunnen andere capillaire parameters worden verkregen, zoals de snelheid van rode bloedcellen of de flux van rode bloedcellen, wat een dieper inzicht kan geven in de pathogene veranderingen die worden waargenomen bij HIV-geassocieerde neurocognitieve stoornissen en andere neurodegeneratieve ziekten. Veel succes met uw experimenten.

quantification-cerebral-vascular-architecture-using-two-photon

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We beschrijven een methode voor het herhaaldelijk het visualiseren van muriene microglia en circulerende...

Een dunne-schedel Window Techniek voor chronische Twee-foton In vivo Imaging Murine Microglia in modellen van ontstekingsprocessen

Intravitale microscopie om temporele en ruimtelijke hemodynamische en inflammatoire gebeurtenissen in de pial microcirculatie te volgen.

Intravitale Microscopie van de hersenen van muizen microcirculatie met behulp van een gesloten Cranial Window

Hier beschrijven een werkwijze om direct zichtbaar microregional weefselhypoxie in de muis...

Detectie van Microregional Hypoxie in Mouse Cerebral Cortex door twee-foton Imaging van endogene NADH fluorescentie

Source: Nishimura, C. et al. Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (2016). This video demonstrates the in vivo visualization of cortical capillaries in the mouse brain using two-photon microscopy. It outlines the steps for injecting a fluorescent dye into an anesthetized mouse with a thin-skull cortical window, preparing the setup for imaging, and acquiring detailed images of brain...

 Two-Photon Microscopy for In Vivo Imaging of Mouse Brain Microvasculature 

Source: Arango-Lievano, M. et. al., Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates in vivo two-photon imaging to visualize fluorescently labeled amyloid plaques and cerebral vasculature. Blue fluorescence marks plaques, while green fluorescence highlights the cerebral blood vessels. A 3D map of the region of interest and high-resolution mosaic imaging reveal detailed interactions of amyloid plaques with cerebral...

In Vivo Imaging of Cerebral Vessels and Amyloid Plaques in an Alzheimer’s Disease Mouse Model

Dit protocol beschrijft repetitieve hypoxische preconditie, of korte blootstellingen aan systemische hypoxie die infarctvolumes en bloed-hersenbarrière-storingen verminderen na een voorbijgaande occlusie van de middelste hersenslagader bij muizen. Het beschrijft ook dubbele kwantificering van infarctvolume en bloed-hersenbarrière-storing na een beroerte om de werkzaamheid van neurovasculaire bescherming te beoordelen.

Kwantificering van Neurovasculaire Protection Na Repetitive Hypoxische Voorconditionering en Transient midden cerebrale slagader Occlusie in Muizen

Dit manuscript beschrijft een procedure om de herinrichting van de cerebrovasculature volgen tijdens amyloïde plaque accumulatie in vivo met behulp van longitudinale twee-foton microscopie. Een uitgedunde schedel bereiden voor de visualisatie van fluorescente kleurstoffen om de progressie van cerebrovasculaire schade te beoordelen in een muizenmodel van de ziekte van Alzheimer.

lengte-<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging van de Cerebrovasculature: Relevantie voor CNS ziekten

Hier presenteren we een microscopie gebaseerde protocol voor hoge resolutie beeldvorming en een drie-dimensionale reconstructie van de muis neurovasculaire eenheid en bloed - hersen barrière met behulp van vrij zwevende secties van de hersenen. Deze methode zorgt voor de visualisatie, analyse en kwantificering van intracellulaire organellen op de BBB.

Hoge resolutie Confocal beeldvorming van de bloed - hersen barrière: Imaging, 3D reconstructie en kwantificering van Transcytosis

Het doel van dit artikel is het presenteren van een methode waarmee een 3-dimensionale reconstructie van de cerebrovasculaire boom in muizen nadat micro berekende tomografie en bepaling van de hoeveelheden van hele schip segmenten die kunnen worden gebruikt voor het kwantificeren van cerebrale vasospasm in lymfkliertest modellen van subarachnoïdale bloeding.

Een volumetrische methode voor de kwantificering van cerebrale Vasospasm in een lymfkliertest Model van subarachnoïdale bloeding

Dit artikel beschrijft een methode voor chronische in vivo observatie van de rustende microglia in de hippocampus CA1 van de muis met behulp van nauwkeurig gecontroleerde chirurgie en twee-fotonenmicroscopie.

In Vivo Chronische twee-foton beeldvorming van microglia in de hippocampus van de muis

Leer cerebrale vasculaire architectuur kwantificeren met twee-foton microscopie in muismodellen. Deze methode onderzoekt capillaire veranderingen door HIV-virotoxine en helpt bij het begrijpen van neuroinflammatie.

Kwantificering van cerebrale vasculaire architectuur met behulp van twee-foton microscopie in een muismodel van de HIV-geïnduceerde Neuroinflammation (Video) | JoVE Journal

Kwantificering van cerebrale vasculaire architectuur met behulp van twee-foton microscopie in een muismodel van de HIV-geïnduceerde Neuroinflammation

Meer video's verkennen