Ontwikkeling van een Backbone cyclisch peptide bibliotheek als potentieel antiparasitaire Therapeutics behulp van microgolfstraling

Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van een gefocuste bibliotheek van backbone-cyclische peptidomimetica met conformationele diversiteit met behulp van microgolfbestraling voor nieuwe antiparasitaire therapeutica. Deze methode kan helpen bij de ontwikkeling van nieuwe instrumenten om specifiek eiwit-eiwitinteracties te targeten. Om met deze procedure te beginnen, voegt u 2,5 milliliters van het gewenste aminozuur, één milliliter activator en 0,5 milliliters activatorbase toe aan een polypropyleencartridge.

Plaats de cartridge in een geautomatiseerde magnetronsynthesizer en laat de koppelingsreactie 300 seconden duren bij 25 watt en 75 °C. Zodra de reactie is voltooid, wordt de hars gewassen met zeven milliliters N, N-dimethylformamide, of DMF, gedurende 120 seconden bij kamertemperatuur. Na het vijfmaal herhalen van de vorige stap, worden zeven milliliters 20% piperidine in DMF met 0,1 molair 1-hydroxybenzotriazole, of HOBt, aan de polypropyleencartridge toegevoegd en wordt dit 30 seconden geïncubeerd bij 45 watt en 75 °C.

Giet na voltooiing het reactiemengsel af. Voeg vervolgens zeven milliliter 20% piperidine in DMF met 0,1 molair HOBt toe aan de polypropyleencartridge en incubeer dit gedurende 180 seconden bij 45 watt en 75 graden Celsius. Giet na het aflaten van het reactiemengsel de hars schoon met zeven milliliter DMF gedurende 120 seconden bij kamertemperatuur.

Was daarna de hars gedurende 120 seconden bij kamertemperatuur met zeven milliliter dichloormethaan, of DCM. Voor anhydridekoppeling wordt de hars gedurende 120 seconden bij kamertemperatuur gewassen met zeven milliliter 1-methyl-2-pyrrolidinon, of NMP. Laat na voltooiing het reactiemengsel vervolgens aflopen.

Nadat de vorige stap drie keer is herhaald, wordt 10 equivalenten van het overeenkomstige anhydride opgelost in vijf milliliter NMP in een polypropyleen buis van 50 milliliter. Voeg vervolgens één equivalent 4-dimethylaminopyridine, of DMAP, en 10 equivalenten N, N-diisopropylethylamine, of DIEA, toe aan de oplossing. Voeg dit mengsel toe aan de hars en incubeer gedurende 300 seconden bij 25 watt en 75 °C.

Nadat de hars met NMP is gewassen, wordt deze gedurende 120 seconden bij kamertemperatuur gewassen met zeven milliliter DMF. Breng de hars op dit punt over naar een polypropyleencartridge die is voorzien van een dop en een stopkraan. Zodra de hars met DCM is gewassen, voegt u per 1 gram hars 15 tot 25 milliliter van een mengsel van 1% trifluorazijnzuur, 5% triisopropylsilaan en 94% DCM toe aan de polypropyleencartridge.

Plaats de polypropyleencartridge op een schudapparaat en schud gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Laat vervolgens de oplossing uit de polypropyleencartridge lopen door een vacuüm aan te leggen. Nadat de voorgaande stappen drie keer zijn herhaald, wordt de hars gewassen met zeven milliliters DCM gedurende 120 seconden bij kamertemperatuur.

Deze stappen zijn zeer belangrijk, aangezien werd vastgesteld dat de tritylbeschermingsgroepen in verschillende harsen gedeeltelijk werden gesplitst in de DCM-trifluorazijnzuuroplossingen. Het verwijderen van methyltritylgroepen is een traag proces dat meerdere wasbeurten vereist. Los vijf equivalenten Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate op in vijf milliliter dibroommethaan in een polypropyleenbuis van 50 milliliter.

Voeg vervolgens 10 equivalenten DIEA toe aan de oplossing. Voeg het mengsel toe aan de met DCM gespoelde hars en incubeer dit gedurende 300 seconden bij 25 watt en 75 graden Celsius. Was daarna de hars met zeven milliliter DCM gedurende 120 seconden bij kamertemperatuur.

Na twee wasbeurten met DCM wordt de hars overgebracht naar een polypropyleencartridge en tweemaal gewassen met diethylether. Droog de hars in een vacuümdesiccator bij kamertemperatuur gedurende ten minste drie uur boven kaliumhydroxide. Voeg vervolgens 10 milliliters van een vooraf gekoelde trifluorazijnzuur-splitsingscocktail toe aan elke gram hars.

Plaats de polypropyleencartridge op een schudapparaat en schud gedurende 3 uur bij kamertemperatuur. Verzamel vervolgens de splitsingsoplossing door de hars te filteren in een polypropyleenbuis van 50 milliliter. Voeg 35 milliliter koude diethylether toe aan de buis.

Centrifuge gedurende vijf minuten bij 1.207 ×g bij vier graden Celsius. Decanteer vervolgens de etherlaag. Bereid voor de Kaiser-test Oplossing A door 16,5 milligram kaliumcyanide op te lossen in 25 milliliters gedestilleerd water.

Verdun één milliliter van de oplossing met 49 milliliter peridine. Bereid vervolgens Oplossing B door één gram ninhydrine op te lossen in 20 milliliter ethanol. Bereid Oplossing C door 40 gram fenol op te lossen in 20 milliliter ethanol.

Nadat de oplossingen zijn bereid, brengt u enkele kraaltjes van de hars over naar een reageerbuis. Voeg drie druppels van elke oplossing toe aan de buis en meng deze. Verwarm de reageerbuis tot slot vijf minuten lang op een warmteblok bij 110 °C.

De synthese van de cyclische backbone-peptiden werd uitgevoerd met een geautomatiseerde magnetronsynthesizer op een vaste drager volgens het FMOC, t-butyl protocol. Het product werd geanalyseerd via massaspectrometrie, en de zuiverheidsgraad werd bepaald met behulp van HPLC. Biologische screening toonde aan dat peptide pL1 actief was tegen Leishmania donovani, een parasiet die viscerale leishmaniasis veroorzaakt, de ernstigste vorm van leishmaniasis bij mensen.

Peptide pL1 verminderde de levensvatbaarheid van de parasiet met 75% vergeleken met de controlebehandeling. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in drie tot vijf dagen worden uitgevoerd mits deze correct wordt toegepast. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in een breed scala aan vakgebieden om peptiden te onderzoeken als farmacologische regulatoren in fundamenteel onderzoek en therapeutica.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een gerichte bibliotheek van peptidomimetica met conformationele diversiteit kunt ontwikkelen om specifiek eiwit-eiwitinteracties te targeten. Vergeet niet dat werken met trifluorazijnzuur uiterst gevaarlijk kan zijn; neem daarom altijd voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van een oogbescherming, een laboratoriumjas en handschoenen, terwijl u deze procedure uitvoert in een goed geventileerde zuurkast.