Name: Driedimensionale alginaat-bead cultuur van de mens hypofyseadenoom Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Leer een driedimensionale alginaat-bead cultuur voor menselijke hypofyseadenoomcellen. Deze methode maakt onderzoek naar tumorcelbiologie en expressie van invasiviteitsmarkers mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken de heer O. Rios voor zijn technische assistentie.

Deze studie werd goedgekeurd voor het gebruik van menselijk materiaal door de lokale ethische commissies van de medische instelling en het Centrum voor Onderzoek en Advance Studies van het Nationaal Polytechnisch Instituut. 1. Tumor Sample Acquisition <ol><li> Het verkrijgen van de hypofyseadenoom weefsel biopsie van een patiënt door middel van een trans-sphenoidal chirurgische ingreep 14. </li><li> Verzamel de hypofyseadenoom monster af en breng het in een steriele glazen fles met 50 ml vers 199 kweekmedium (M199) verrijkt met 10% foetaal runderserum (FBS), 0,6 mg / ml natriumbicarbonaat, 2,4 mg / ml HEPES en 1% antibiotica (penicilline / streptomycine) bij pH 7,4. Handhaving van het monster in een glazen fles op het ijs. Opmerking: De tumorweefsel kan meerdere uren worden verwerkt na de operatie. </li><li> Vervoer de tumor monster naar het laboratorium in de glazen fles op ijs. </li></ol> 2. Bereiding van de enzymatische Tissue Dissociatie Solutions,Trypsineremmer Solution en Alginate Solutions Opmerking: Voorafgaand aan de celkweek procedure bereid de volgende oplossingen. Filtreer alle oplossingen met een 0,22 urn membraanfilter, vóór gebruik. <ol><li> Bereid collagenase 1% oplossing door het oplossen van 5 mg collagenase (type I) in 5 ml M199-serumvrij. </li><li> Bereid 0,01% trypsine-oplossing door het oplossen van 0,01 g trypsine in 10 ml PBS-EDTA 0,3%. </li><li> Bereid 0,1% trypsineremmer oplossing door het oplossen van 2 mg soja trypsineremmer in 20 ml M199-serumvrij. </li><li> Bereid DNAse-oplossing door oplossen van 20 ui DNAse I 134 U / ml in 4 ml trypsineremmer oplossing. </li><li> Bereid EGTA-oplossing (1,2 M) door het oplossen van 22,8 mg EGTA in 40 ml 155 mM NaCl. Breng de pH op 7,4. Verder tot een eindvolume van 50 ml. </li><li> Bereid HEPES-oplossing (20 mM) door het oplossen van 238 mg in 50 ml HEPES van 155 mM NaCl. </li><li> Bereid 1,2% alginaatoplossing door het oplossen van 1,2g natriumalginaat in 100 ml HEPES oplossing. Autoclaaf de alginaatoplossing. </li><li> Bereid calcium oplossing (102 mM) door het oplossen van 750 mg CaCl2 in 50 ml HEPES-oplossing, pH instellen op 7,4 </li></ol> 3. Primaire Cell Cultuur en alginaat inkapseling <ol><li> Binnen een laminaire stroming kast, plaatst het tumorweefsel in een 35 mm petrischaal met ongeveer 20 ml PBS Ca 2+ en Mg 2+ gratis, pH 7,4 (PBS *). </li><li> Neem het weefsel met een chirurgische pincet en plaats het in een andere petrischaaltje met verse PBS * voorzichtig het weefsel te wassen. Herhaal deze stap totdat de rode bloedcellen en vuil verwijderd. </li><li> Met behulp van een chirurgische pincet, houdt u de hypofyseadenoom weefsel, en met een kleine chirurgische schaar, snijd deze in kleine stukjes. Met een Pasteur pipet met afgeronde hoeken, overdragen weefselfragmenten en PBS * in een 15 ml buis Centrifugeer bij 68 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Opmerking: Om de randen van een Pasteur rondenpipet, licht vlam de punt van de pipet in een bunsenbrander. </li><li> Verwijder de PBS * Met een Pasteur-pipet en voeg 3-5 ml collagenase oplossing (ongeveer 5 ml van 65 mm3 weefsel), meng 2-3 keer door omkeren. Incubeer het weefsel in de collagenase gedurende 30 minuten bij 37 ° C in constante rotatie. </li><li> Centrifugeer de buis bij 68 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur en verwijder de collagenase met een Pasteur pipet. </li><li> Voeg 5 ml DNAse en meng 2-3 keer door het omkeren en centrifugeer de buis bij 68 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Opmerking: Als het weefsel niet volledig gedissocieerd uitvoeren van een tweede enzymatische digestie met trypsine gedurende 3 min bij 37 ° C. Stop de digestie door toevoeging van 2 volumina trypsineremmer oplossing. </li><li> Zuig het supernatant met een Pasteur pipet en gooi ze weg. Resuspendeer de pellet in 1 volume EGTA-oplossing en mengen met 2 volumes alginaatoplossing. </li><li> Meng de celsuspensie en alginaatpipetteren met een pasteurpipet. Neem een ​​steriele spuit met een 21 G naald, verwijder de plunjer; Gebruik een pipet om de spuit met het alginaat en celoplossing laden. </li><li> Duw de plunjer in de spuit en zorgvuldig afzien het alginaat-celoplossing druppel voor druppel in een bekerglas met ca. 30 ml van de calcium-rijke oplossing. </li><li> Plaats de naald van de spuit ongeveer 5 cm tot de CaCl 2-oplossing. De alginaat-celsuspensie gels bij contact met de CaCl 2 bolvormige korrels te vormen. Houd de alginaatkorrels in de calciumoplossing gedurende 5 min. Let op: Roer het bekerglas waarin de korrels worden gedropt. Beweeg het langzaam met de hand in cirkelvormige bewegingen, om te voorkomen dat ze vasthouden aan elkaar. </li><li> Verwijder voorzichtig de calcium-oplossing met een Pasteur pipet, en was de kralen tweemaal met 3-5 ml M199 verrijkt met 20% FBS. </li><li> Breng de alginaat kralen in een gewone T25 weefselkweekkolf met een steriele spatel, voeg 4-5 ml M199 aangevuld met 20% FBS en geïncubeerd bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. Verander het kweekmedium elke derde dag. </li></ol> 4. Bevrijd Cellen van het alginaat Opmerking: Alvorens de cellen te bevrijden van de alginaatkorrels, laag 13 mm dekglaasjes met poly-D-lysine. LET OP: Zwavelzuur is een sterk bijtend zuur en APTS KAN OGEN EN HUID. GEBRUIK latexhandschoenen om deze reagentia te behandelen. <ol><li> In een zuurkast met een punt pincet onderdompelen de dekglaasjes in een glazen petrischaaltje met 20% waterig zwavelzuur gedurende 1 uur bij KT. </li><li> Giet het zwavelzuur en spoel de dekglaasjes vijfmaal met gedestilleerd water gedurende 5 minuten elk. Met een punt pincet plaats de schone dekglaasjes in een petrischaaltje met 0,1 M NaOH gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur 15. </li><li> Giet het NaOH en was één keer met Distilgeleid water, zuigen het water en droog de dekglaasjes. </li><li> Met een micropipet het bekleden van de dekglaasjes met APTS (aminopropyltriethoxysilaan) gedurende 4 minuten (gebruik 500 ul voor 6 dekglaasjes) overspoelen de petrischaal met gedestilleerd water. Snel zuigen het water en blijven wassen met gedestilleerd water, het verplaatsen van de dekglaasjes punt pincet om het water naar beneden te dringen. </li><li> Zuig het water en droog de dekglaasjes, met behulp van een punt pincet plaats de dekglaasjes in een schone petrischaal en steriliseer ze in de magnetron gedurende 3 keer, 45 seconden per stuk. Voeg 1.000 III steriel water tot 100 ug poly-D-lysine (0,1 mg / ml). </li><li> Incubeer de dekglaasjes met ongeveer 50 pl poly-D-lysine gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zuig het poly-D-lysine volledig. Opmerking: Dit is belangrijk omdat oplosbaar poly-D-lysine in het cultuurmedium celproliferatie kunnen remmen. </li><li> Spoel de dekglaasjes vijf keer met steriel water gedurende 5 minuten elk. Zuig het sterile water en laat de dekglaasjes te drogen in een laminaire stroming kast. </li><li> Om het actine cytoskelet te analyseren, te bevrijden van de hypofyse cellen van het alginaat. Neemt een deel van de alginaatparels van de kolf met een 1 ml pipet en plaats ze in een 15 ml buis. </li><li> Voeg 5 ml 55 mM natriumcitraat (los 323,6 mg Na 3 C 6 H 5 O 7, 2 H 2 O in 20 ml HEPES-oplossing) en gecentrifugeerd bij 68 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Zuig het supernatant en gooi. </li><li> Resuspendeer de pellet in 1 ml warm M199 verrijkt met 20% FSB; meng de celsuspensie met een Pasteur pipet. LET OP: Phalloidin EN DAPI ZIJN giftig. GEBRUIK handschoenen om deze reagentia te behandelen. </li><li> Om de cellen te tellen, overdracht 125 ul van 0,4% trypan blauwe oplossing met een 1,5 ml buis. Voeg 75 gl M199 en 50 pi van de celsuspensie verkregen in de laatste stap (verdunningsfactor = 5). Meng goed. </li><li> Gebruik een micropipet tip om place ongeveer 10 gl van de trypan blauw-celsuspensie in de hemocytometer kamer. </li><li> Tel de cellen in de hemocytometer teller met behulp van een omgekeerde microscoop met een fasecontrastmicroscoop. Tel alle cellen in de 1 mm centrum plein en vier 1 mm hoek pleinen. Verkrijgen van de celdichtheid per milliliter met het gemiddelde aantal per vierkante vermenigvuldigen met de verdunningsfactor -. 10 4 Bijvoorbeeld als de gemiddelde tellingen per vierkante cellen is 45 x 5 x 104 = 2,25 x 106 cellen / ml. Let op: Tel de cellen in tien pleinen van de hemocytometer kamer. Weet cellen raken de middelste lijn onderaan en rechts niet mee. </li><li> Zaad 35.000 cellen op 13 mm diameter glazen dekglaasjes bedekt met poly-D-lysine. </li></ol> 5. actine cytoskelet Arrangement <ol><li> Na 48 uur in de cultuur, verwijder het kweekmedium met een Pasteur pipet en snel toe te voegen 500 ul per dekglaasje van PBS, onmiddellijk verwijderen van de PBS. </li><li> Fix en permeabilize thij cellen met 500 ul per dekglaasje van fixatie buffer (0,1 M PIPES, pH 6,75, 4% PEG-6000, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, 0,5% Triton X-100 en 2% formaldehyd) gedurende 10 min bij 37 ° C </li><li> Verwijder de fixatie buffer en voeg 500 ul per dekglaasje van 3,5% paraformaldehyde in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de paraformaldehyde oplossing. </li><li> Was de dekglaasjes driemaal door toevoeging van 500 ul per dekglaasje van PBS gedurende 5 minuten elk. Spoel de dekglaasjes bij kamertemperatuur, voortdurend roeren. </li><li> Incubeer de cellen met 50 mM ammoniumchloride gedurende 10 min, zuigen de ammoniumchlorideoplossing en herhaal stap 5,4. </li><li> Incubeer de cellen met 1% BSA (IgG-vrij, proteases-vrij) in PBS gedurende 30 minuten, verwijder de BSA-oplossing en herhaal stap 5,4. </li><li> Incubeer de cellen met 50 uM rhodamine geconjugeerde phalloidin gedurende 7 min bij RT, herhaalt u stap 5.4. </li><li> Incubeer de cellen met 255 uM DAPI verdund in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur Herhaal stap 5,4. Tot slot zet thij coverslips met een montage medium en verzegelen ze met nagellak. </li><li> Acquire beelden van het actine cytoskelet regeling met behulp van een confocale laser scanning microscoop met een 63x doelstelling, bij 541 nm excitatie golflengte. </li></ol>

<ol><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+Extracellular+Matrix+Mimics+for+3D+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture.</a> Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li>
<li>Amsden, B., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+characteristics+of+calcium+alginate+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Diffusion characteristics of calcium alginate gels.</a> Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).</li>
<li>Andersen, T., Strand, B., Formo, K., Alsberg, E., Christensen, B. Alginates as biomaterials in tissue engineering. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndersen%2C+T+%22Carbohydrate+chemistry%22">Carbohydrate chemistry</a>. Rauter, A. P., Lindhorst, T. K. Vol. 37, Royal Society of Chemistry. 227-258 (2012).</li>
<li>Jonitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+capacity+of+human+chondrocytes+embedded+in+alginate+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Connect.+Tissue.+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation capacity of human chondrocytes embedded in alginate matrix.</a> Connect. Tissue. Res. 52 (6), 503-551 (2011).</li>
<li>Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+scaffolds+to+enhance+transplanted+myoblast+survival+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue.+Eng%22%5BJournal%5D)">Designing scaffolds to enhance transplanted myoblast survival and migration.</a> Tissue. Eng. 12 (5), 1295-1304 (2006).</li>
<li>Purcell, E. K., Singh, A., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+composition+effects+on+a+neural+stem+cell-seeded+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue.+Eng.+Part.+C.+Methods%22%5BJournal%5D)">Alginate composition effects on a neural stem cell-seeded scaffold.</a> Tissue. Eng. Part. C. Methods. 15 (4), 541-550 (2009).</li>
<li>Wee, S., Gombotz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+release+from+alginate+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug.+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein release from alginate matrices.</a> Adv. Drug. Deliv. Rev. 31 (4), 267-285 (1998).</li>
<li>Tashjian, A. H. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+strains+of+hormone-producing+pituitary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Clonal strains of hormone-producing pituitary cells.</a> Methods. Enzymol. 58, 527-535 (1979).</li>
<li>Fasekas, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+pituitary+adenomas+in+cell+cultures+by+light+and+electron+microscopic+morphology+and+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Folia.+Histochem.+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of human pituitary adenomas in cell cultures by light and electron microscopic morphology and immunolabeling.</a> Folia. Histochem. Cytobiol. 43 (2), 81-90 (2005).</li>
<li>Kohler, P. O., Bridson, W. E., Rayford, P. L., Kohler, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone+Production+by+Human+Pituitary+Adenomas+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Hormone Production by Human Pituitary Adenomas in Culture.</a> Metabolism. 18 (9), 782-788 (1969).</li>
<li>Kletzkky, O. A., Marrs, R. P., Rundall, T. T., Weiss, M. H., Beierle, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+and+suspension+culture+of+human+prolactin-secreting+pituitary+adenoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Obstet.+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Monolayer and suspension culture of human prolactin-secreting pituitary adenoma.</a> Am. J. Obstet. Gynecol. 138 (6), 660-664 (1980).</li>
<li>Melmed, S., Odenheimer, D., Carlson, H. E., Hershman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+functional+human+pituitary+tumor+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Establishment of functional human pituitary tumor cell cultures.</a> In Vitro. 18 (1), 35-42 (1982).</li>
<li>Thompson, K. W., Vincent, M. M., Jensen, F. C., Price, R. T., Schapiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+hormones+by+human+anterior+pituitary+cells+in+serial+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Production of hormones by human anterior pituitary cells in serial culture.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102 (2), 403-408 (1959).</li>
<li>Cappabianca, P., Cavallo, L. M., Solari, D., Stagno, V., Esposito, F., de Angelis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoscopic+endonasal+surgery+for+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22World+neurosurg%22%5BJournal%5D)">Endoscopic endonasal surgery for pituitary adenomas.</a> World neurosurg. 82 (6 Suppl), S3-S11 (2014).</li>
<li>Aplin, J. Model Matrices for Studing Cell Adhesion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAplin%2C+J+%22Measuring+cell+adhesion%22">Measuring cell adhesion</a>. Curtis, A. S. G., Lackie, J. M. , John Wiley & Sons. 110-111 (1991).</li>
<li>Guiraud, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+prolactin-producing+pituitary+adenomas+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22In.+Vitro.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Human prolactin-producing pituitary adenomas in three-dimensional culture.</a> In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 27 (3), 188-190 (1991).</li>
<li>Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenesis+of+human+mesenchymal+stem+cells+encapsulated+in+alginate+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 64 (2), 273-281 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol heeft een aantal kritische stappen. De eerste is korrelgrootte homogeniteit, die nodig is om dezelfde voorwaarden van diffusie van voedingsstoffen en gassen in alle van de celcultuur te behouden. In onze ervaring, het gebruik van een 21 G naald om de alginaatkorrels maken maakt het verkrijgen van een efficiënte kweek van uniforme grootte kraal. De tweede belangrijke factor is de afstand van de naald; deze afstand mag maximaal 5 cm van de calciumoplossing misvormde parels en dode cellen als gevolg van de bot...

Driedimensionale steigers zijn uitgebreid gebruikt in celkweek omdat ze een driedimensionale structurele steun voor celcultuur en het onderhoud van cel-tot-cel communicatie 1. Natuurlijk verkregen polymere materialen zijn gebruikt om driedimensionale scaffolds inbegrip van type I collageen, chitosan en alginaat maken. Alginaat is een natuurlijk polymeer afkomstig van de bruine zeealgen Macrocystispyrifera (Kelp). Dit polymeer bestaat uit herhaalde eenheden van β-D-mannuronzuur (M) en α-L-guluronzuur (G) 2 en vormt stabiele gels in de aanwezigheid van bepaalde divalente kationen, zoals calcium en barium. Calciumchloride (CaCl2) oplossingen worden vaak gebruikt als de crosslinking reagens alginaatkorrels vormen. Alginaat oplossingen liet zich in CaCl2 onmiddellijk vormen driedimensionale bolvormige gels. Wanneer de alginaat oplossing gemengd met cellen, worden de cellen ingekapseld in de alginaat beads 3. Alginaat eigenschappen die het had kunnen worden gebruikt als matrix voor het inkapselen van verschillende cellen, waaronder chondrocyten 4, skeletmyoblasten 5 en 6 neurale stamcellen. Het is een inert materiaal en maakt de diffusie van voedingsstoffen, zuurstof en stofwisselingsproducten die cel overleving en functie te behouden; Bovendien, in tegenstelling tot andere op gel gebaseerde kweeksystemen, cellen gekweekt in alginaat kralen kunnen ook worden vrijgemaakt uit het skelet via calciumvangers, zoals natriumcitraat, en de cellen kunnen vervolgens voor verder onderzoek 7 worden geoogst. Hypofyseadenomen zijn meestal goedaardige tumoren met een lage proliferatie tarieven. Rat hypofyse adenoma cellijnen met succes gekweekt in een tweedimensionaal systeem 8 is. Echter, deze cultuur secretoire humane hypofyse celtumoren geen efficiënte ontwikkeling; verspreide tumor hypofyse cellen groeien slechtin kweek werden de cellen vertonen beperkte hechting en spreiding en de cellen vormen typisch drijven aggregaten in de kweekschaal 9,10. Verschillende pogingen zijn gedaan om een tumor hypofyse celsuspensie te verkrijgen, zoals een enzymatische en mechanische dispersie benadering 11, een uitsluitend mechanische dispersie benadering 12 en het kweken van tumor explantaten 10. Met deze benaderingen hebben verschillende auteurs levensvatbare adherente kweken verkregen voor verschillende tijdsperioden. De capaciteit van de tumor secretoire cellen overleven in deze tweedimensionale systemen zijn afhankelijk van het tumortype en de proliferatiesnelheden 9. In langdurige kweken, cellen van fibroblast fenotypes overheersen 11,13. Dit artikel beschrijft een werkwijze voor het verkrijgen van een primaire kweek van hypofyseadenoom cellen ingekapseld in alginaatkorrels dat ze verder vrijmaakt uit het alginaat scaffold uitvoerige analyses steltaspecten van de celbiologie, bijvoorbeeld hun cytoskelet regelingen.

<table><tbody><tr><td>Reagens&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>199 kweekmedium&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>31100-027</td><td>Voor het kweken, verwarmen in een 37 &deg;C waterbad vóór gebruik&nbsp;</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum&nbsp;</td><td>PAA</td><td>A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat (NaHCO3)</td><td>Merck</td><td>106329</td><td></td></tr><tr><td>N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N&acute;-2ethansulfonzuur (HEPES)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H-4034</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type I</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>27250-018</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Research Organics</td><td>3002E</td><td></td></tr><tr><td>Sorbean trypsine inhibitor&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington</td><td>2139</td><td></td></tr><tr><td>Alginezuur, Van Macrocystis Pyrifera (Kelp)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A-2158</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride (CaCl2)</td><td>J.T. Baker</td><td>1332</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitraat (Na3C6H5O7)</td><td>J.T. Baker</td><td>3646</td><td></td></tr><tr><td>Piperazine-N,N&prime;-bis(2-ethaansulfonzuur) (PIPES)</td><td>Research Organics</td><td>9624P</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleen Glycol 6000 (PEG 6000)</td><td>Calbiochem</td><td>528877</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleenglycol tetraazijnzuur (EGTA)</td><td>Research Organics</td><td>9574E</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat (MgSO4)</td><td>J.T. Baker</td><td>2500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>J.T. Baker</td><td>2106</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchloride (NH4Cl)</td><td>J.T. Baker</td><td>660</td><td></td></tr><tr><td>BSA Bovine Serum Albumine IgG-Vrij</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>001-000-161</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>Toxisch. Gebruik handschoenen om dit reagens te hanteren&nbsp;</td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Fenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>D1306</td><td>Toxisch. Gebruik handschoenen om dit reagens te hanteren&nbsp;</td></tr><tr><td>Zwavelzuur (H2SO4)</td><td>J.T. Baker</td><td>9681</td><td>Zeer corrosief. Gebruik handschoenen om dit reagens te hanteren&nbsp;</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide (NAOH)</td><td>Merck</td><td>1.06498</td><td>Kan oog- en huidirritatie veroorzaken. Gebruik handschoenen om dit reagens te hanteren&nbsp;</td></tr><tr><td>(3-Aminopropyl)triethoxysilaan (APTS)</td><td>Sigma</td><td>A-3648</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblauw oplossing</td><td>Sigma</td><td>T8154&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Naam&nbsp;&nbsp;</td><td>Bedrijf&nbsp;</td><td>Catalogusnummer&nbsp;</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Toxisch: Kan kanker veroorzaken. Gebruik handschoenen om dit reagens te hanteren&nbsp;</td></tr><tr><td>Rotator&nbsp;</td><td>Boekel Scientific</td><td>Model 230300</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>DuPont Corporation&nbsp;</td><td>Model sorvall TC6</td><td></td></tr><tr><td>schudder&nbsp;</td><td>Lab-line Instruments</td><td>Model 314-820&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

driedimensionale alginaat-bead cultuur van de mens hypofyseadenoom cells

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Een driedimensionale kweekmethode beschreven waarbij primaire hypofyseadenoom cellen worden gekweekt in alginaatkorrels. Alginaat is een polymeer afgeleid uit bruine zeealgen. In het kort wordt het tumorweefsel in kleine stukjes gesneden en met collagenase en trypsine aan een enzymatische digestie ingediend. Vervolgens wordt een celsuspensie verkregen. De tumor celsuspensie wordt gemengd met 1,2% natriumalginaat en vallen in een CaCl2-oplossing, en de alginaat / cel suspensie wordt gegeleerd in contact met de CaCl 2 bolvormige korrels te vormen. De cellen ingebed in de alginaatkorrels voedingsstoffen aangeleverd door het kweekmedium aangevuld met 20% FBS. Driedimensionale kweek in alginaatkorrels de levensvatbaarheid van adenoom cellen voor langere tijd, tot vier maanden. Bovendien kunnen de cellen worden vrijgemaakt uit het alginaat door wassen van de bolletjes met natriumcitraat en gezaaid op glazen dekglaasjes voor verdere immunocytochemische analyse. Het gebruik van een cell cultuurmodel maakt de fixatie en visualisatie van het actine cytoskelet met minimale ontwrichting. Samengevat, alginaatkorrels een betrouwbare kweeksysteem voor het handhaven van hypofyseadenoom cellen.

Dit protocol werd met succes in de cultuur en het onderhoud van adenoom hypofysecellen in alginaatkorrels voor verschillende tijdsperioden toegepaste Figuur 1 toont cellen ingebed in alginaatkorrels na drie maanden.; deze cellen vertonen bi brekingsindex afgeronde vormen onder een omgekeerde lichtmicroscoop (figuur 1). Figuur 2 toont de lokalisatie van N-cadherine in ratten hypofyse adenoma cellen ingebed in alginaat. De N-cadherine is g...

Driedriedimensionaal kweeksel in alginaatbolletjes, vanwege zijn eenvoud en reproduceerbaarheid, werd gekozen om de adenoomcellen van de hypofyse te onderhouden. De procedures omvatten een initiële enzymatische vertering en mechanische dissociatie van het tumorweefsel, en de daaropvolgende celsuspensie werd ingekapseld in alginaatbolletjes.

Driedimensionale alginaat-bead cultuur van de mens hypofyseadenoom Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Het algemene doel van deze methode is het beschrijven van een driedimensionale alginaatkralencultuur voor het behoud van menselijke hypofyseadenoomcellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van tumorcelbiologie, zoals de expressie van verschillende markers voor invasiviteit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het alginaatsteiger, in tegenstelling tot andere driedimensionale systemen, het mogelijk maakt om hypofyseadenoomcellen uit de alginaatkralen te halen voor verder onderzoek.De procedure zal worden gedemonstreerd door Carmen Solano-Agama, een onderzoeksassistent uit mijn laboratorium. Om te beginnen, plaats u terwijl u in een laminaire flowkast werkt, eerder verkregen adenoomtumorgeweefse in een schaal van 35 millimeter met ongeveer 20 milliliters calcium- en magnesiumvrij PBS. Verplaats het weefsel met een chirurgische pincet naar een andere petrischaal met vers PBS om het weefsel te wassen.Herhaal de overdracht naar verse buffer totdat de rode bloedcellen en het debris zijn verwijderd. Houd vervolgens het weefsel van het hypofyseadenoom vast met de chirurgische pincet en knip het weefsel met een kleine chirurgische schaar in kleine stukjes. Breng daarna de weefselfragmenten en de buffer met een pasteurpipet met afgeronde randen over naar een buis van 15 milliliter.Centrifugeer bij 68 ×g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Verwijder na het centrifugeren de PBS met een pasteurpipet en voeg drie tot vijf milliliters collagenase-oplossing toe. Meng twee tot drie keer door de buis om te keren en incubeer het weefsel in de collagenase bij 37 °C onder constante rotatie gedurende 30 minuten.Centrifugeer de buis opnieuw gedurende 10 minuten en gebruik een pasteurpipet om de collagenase-oplossing te verwijderen. Voeg 5 milliliters TNase toe, meng twee tot drie keer door te keren en centrifugeer het monster vervolgens opnieuw. Als het weefsel niet volledig is gedissocieerd, voer dan een tweede enzymatische digestie uit volgens het tekstprotocol.Aspireer vervolgens het supernatant en gooi dit weg. Gebruik daarna één volume EGTA-oplossing om het pellet opnieuw te suspenderen en meng dit voorzichtig met twee volumes alginaatoplossing. Verwijder de zuiger uit een steriele spuit met een 21 gauge naald en gebruik een pipet om de alginaat- en celoplossing in de spuit te laden.Schuif de zuiger voorzichtig in de spuit en plaats de spuitnaald in het bekerglas, ongeveer vijf centimeter boven de calciumchloride-oplossing. Doseer nu voorzichtig de alginaat-celsuspensie druppel voor druppel in het bekerglas. De suspensie zal bij contact met de oplossing geleren tot sferische kraaltjes.Roer langzaam met cirkelvormige bewegingen in het glazen bekerglas om te voorkomen dat de kraaltjes aan elkaar plakken. Laat de alginaatkraaltjes vervolgens vijf minuten in de calciumchloride-oplossing liggen. Verwijder na de incubatie voorzichtig de calciumoplossing en was de kraaltjes twee keer met drie tot vijf milliliter M199 verrijkt met 20% FBS.Breng de alginaatkralen met een steriele spatel over naar een standaard T25 weefselkweekfles en voeg vier tot vijf milliliter M199 met FBS toe. Incubeer bij 37 °C met 5% koolstofdioxide in een bevochtigde incubator. Bereid vervolgens poly-D-lysine gecoate dekglasjes voor, volgens het tekstprotocol.Om het actine-cytoskelet te analyseren, gebruikt u de pipet om één milliliter alginaatkralen van de kweekfles over te brengen naar een 15 milliliter buis. Voeg vijf milliliter 55 millimolair natriumcitraat toe en centrifugeer bij 68 ×g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Aspireer vervolgens het supernatant en gooi dit weg.Met gebruik van één milliliter verwarmd M199 verrijkt met 20% FBS resuspenderen we het pellet en mengen we de celsuspensie voorzichtig. Daarna, na het tellen van de cellen volgens het tekstprotocol, zaaien we 35.000 cellen op glazen dekglasplaatjes van 13 millimeter diameter die zijn gecoat met poly-D-lysine. Na het incuberen van de cellen gedurende 48 uur verwijderen we het cultuurmedium en wassen we de cellen eenmaal met PBS.Voeg vervolgens per dekglas 500 µL fixatiebuffer toe om de cellen te fixeren en te permeabiliseren, en incubeer dit 10 minuten bij 37 °C. Verwijder de fixatiebuffer en voeg per dekglas 500 µL 3,5% paraformaldehyde in PBS toe. Incubeer dit vervolgens 30 minuten bij kamertemperatuur voordat de oplossing wordt verwijderd.Ten slotte, na het wassen van de cellen en incubatie in een oplossing van rhodamine-geconjugeerd phalloïdine en DAPI, volgens het tekstprotocol, gebruikt u een confocale laser-scanningmicroscoop met een 63x objectief en een excitatiegolflengte van 541 nm om beelden van het actine-cytoskelet te verkrijgen. Deze figuur toont ingebedde adenoom-hypofysecellen in alginaatkralen na drie maanden. Zoals hier getoond, vertonen de cellen dubbelbrekende, afgeronde vormen onder een omgekeerde lichtmicroscoop.In deze figuur is de lokalisatie van N-cadherine te zien in hypofyseadenoomcellen van ratten die zijn ingebed in alginaat. Het N-cadherine is gelokaliseerd bij de cel-celcontacten en de nucleus vertoont uitgebreid chromatine. In dit experiment werd de proliferatie-index bepaald bij 10 niet-functionerende menselijke hypofyseadenomen met behulp van de immunoreactiviteit voor Ki67, waarbij een gemiddelde labelingsindex van 19,2 plus of minus 1,5% werd verkregen.Hier vertoonde het actine-cytoskelet van niet-invasieve cellen langgerekte vormen met kleine actine-stressvezels. De verdere hoeveelheid en de arrangementen van actinefilamenten varieerden per hypofyseadenoom, onafhankelijk van het culturesysteem. In een niet-functionerend invasief adenoom was bijvoorbeeld de overheersende vorm van deze cellen rond, met discontinue corticale ringen van actinefilamenten.Zodra de techniek onder de knie is, kan de primaire pituitary adenoma-kweek in drie uur worden voltooid. Een alginaat-inkapseling kan in 15 minuten worden uitgevoerd mits dit correct gebeurt. Tijdens deze procedure is het belangrijk om eraan te denken de naald niet verder dan vijf centimeter van de calciumoplossing te houden om harde parels en dode cellen te voorkomen, die ontstaan door de botsing van de stroom alginaat-celoplossing met het oppervlak van de calciumoplossing.Na deze procedure kunnen andere methoden worden toegepast, zoals fixatie van de alginaatbolletjes gevolgd door dehydratatie met polyethyleenglycol, om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de wijze waarop hypofyseadenoomcellen hun cytoskelet organiseren in deze driedimensionale steiger. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het onderhouden van hypofyseadenoomcellen in een driedimensionale alginaatbeadcultuur.

three-dimensional-alginate-bead-culture-human-pituitary-adenoma

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Hier beschrijven we het gebruik van een zelf-assemblage drie-dimensionale steiger aan de cultuur menselijke neurale stamcellen. We presenteren een protocol bij de cellen van de steigers vrij te worden geanalyseerd vervolgens bijvoorbeeld door flowcytometrie. Dit protocol kan worden aangepast aan andere soorten cellen om gedetailleerde mechanistisch studies uit te voeren.

Teelt van menselijke neurale progenitorcellen in een 3-dimensionale Zelf-assemblage Peptide Hydrogel

We presenteren een eenvoudige agarose overlay platform voor 3D-meercellige sferoïden met behulp van neuro-endocriene kankercellijnen groeien. Deze methode biedt een zeer handige manier om het effect van therapeutische geneesmiddelen te onderzoeken op de neuro-endocriene tumor cellen. Het kan ons ook helpen om de menselijke neuro-endocriene tumoren sferoïden vast te stellen voor de behandeling van kanker.

Human Neuro-endocriene tumor cellijnen als een drie-dimensionaal model voor de studie van de mens Neuro-endocriene Tumor Therapy

This video demonstrates a technique to establish a three-dimensional culture of glial cells. Rat-brain-derived glial cells are encapsulated within a photocrosslinkable polymer matrix containing extracellular matrix components. Upon incubating in a growth medium, the glial cells proliferate within the supporting matrix to create a three-dimensional culture.

Establishing a Three-Dimensional Culture of Rat Brain-Derived Glial Cells

This video demonstrates how gliomaspheres, derived from brain tumors, are separated into single cells and encapsulated in a hyaluronic acid-based hydrogel. This process promotes cell-cell interactions, forming a structured, three-dimensional glioblastoma model.

A Hyaluronic Acid-Based Hydrogel for 3-Dimensional Culture of Glioblastoma Cells

Bij standaard kweekmethoden cellen uit hun fysiologische omgeving en gekweekt op het plastic oppervlak van een schotel. Om het gedrag van primaire humane beenmergcellen bestuderen we een 3-D kweeksysteem waarbij cellen worden gekweekt onder omstandigheden indient de natieve micro van het weefsel.

Een Drie-dimensionale Tissue Culture Model om te studeren Primary humaan beenmerg en zijn Malignancies

Drie dimensionale cultuur van mammaire epitheelcellen op een gereconstitueerde basaalmembraan is een handige methode om de in vivo architectuur van de goedaardige borst herhalen, en het maligne fenotype onderscheiden van goedaardige borst fenotype. Belangrijk is dat dit systeem worden toegepast invasieve carcinomen studie in weefsels.

Drie dimensionaal culturen: Een hulpmiddel om te studeren Normaal Acinaire Architectuur versus maligne transformatie van cellen borst

Kankercellen worden ingebed in een collageengel en vervolgens tussen een acellulair fibrinegel gedaan om een 3D-kweeksysteem te genereren waarin de invasiviteit en vorming van satelliettumoren kunnen worden gemonitord.

Driedimensionale Culture Assay te ontdekken Cancer Cell Invasiviteit en Satellite tumorvorming

Hier presenteren we een protocol voor driedimensionale cultuur van glioblastoma patiënt-afgeleide cellen binnen orthogonaal afstembare biomaterialen ontworpen na te bootsen de hersenen-matrix. Deze aanpak biedt een in vitro, experimenteel platform die veel kenmerken van in vivo glioblastoma cellen meestal verloren in cultuur onderhoudt.

Hyaluronzuur gebaseerd Hydrogels voor 3-dimensionale cultuur van Glioblastoma patiënt-afgeleide cellen

Driedimensionale culturen van patiënt BMPC-specimens en xenografts van botgemetastaseerde prostaatkanker behouden de functionele heterogeniteit van hun oorspronkelijke tumoren, wat resulteert in cysten, sferoïden en complexe, tumorachtige organoïden. Dit manuscript biedt een optimalisatiestrategie en protocol voor de 3D-cultuur van heterogene patiëntafgeleide monsters en hun analyse met behulp van IFC.

Oprichting en analyse van driedimensionale (3D) organoïden afgeleid van patiënt prostaatkanker Bot metastase Specimens en hun Xenografts

De hypofyse is de belangrijkste regulator van het endocriene systeem van het lichaam. Dit artikel beschrijft de ontwikkeling van organoïden uit de hypofyse van de muis als een nieuw 3D in vitro model om de stamcelpopulatie van de klier te bestuderen waarvan de biologie en functie slecht begrepen blijven.

Ontwikkeling van organoïden uit muizenpluipcel als in vitro model om hypofyse stamcelbiologie te verkennen

Het huidige protocol beschrijft een experimenteel platform om de effecten van mechanische en biochemische signalen op chemotherapeutische reacties van patiënt-afgeleide glioblastoomcellen in 3D matrix-mimetische culturen te beoordelen met behulp van een op maat gemaakt UV-verlichtingsapparaat dat high-throughput photocrosslinking van hydrogels met instelbare mechanische kenmerken mogelijk maakt.

Hydrogel-arrays maken een verhoogde doorvoer mogelijk voor screeningseffecten van matrixcomponenten en therapeutica in 3D-tumormodellen

Leer een driedimensionale alginaat-bead cultuur voor menselijke hypofyseadenoomcellen. Deze methode maakt onderzoek naar tumorcelbiologie en expressie van invasiviteitsmarkers mogelijk.

Driedimensionale alginaat-bead cultuur van de mens hypofyseadenoom Cells

Meer video's verkennen