Een snelle en efficiënte methode voor het zuiveren van Endoderm Cellen Generated van menselijke embryonale stamcellen

Het algemene doel van deze methode is het zuiveren van endodermale cellen die zijn gegenereerd uit menselijke embryonale stamcellen of ES-cellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied van stamcellen over endodermale differentiatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat een zuivere endodermale celpopulatie kan worden verkregen na het verwijderen van ongedifferentieerde cellen.

Coat vóór aanvang van de procedure zes-wellscellkweekplaten met één milliliter basementmembraanmatrix per well gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur. Aspireer vervolgens het medium uit een 80 tot 90% confluente humane embryonale stamcelkweek met een steriele glazen Pasteurpipet om de humane ES-cellen te oogsten.

Was de cellen vervolgens met twee milliliters PBS per putje. Schud de plaat en aspireer de zoutoplossing om de dode cellen en het debris te verwijderen. Dissocieer daarna voorzichtig de celclusters met één milliliter enzymvrije passageringsoplossing bij 37 °C en 5% CO2 totdat de cellen duidelijke tekenen vertonen van opdeling in kleinere clusters.

Voeg na ongeveer zeven minuten één milliliter DMMF12-medium toe aan de putjes. Pipetteer vervolgens enkele keren op en neer met een pipetteertip van één milliliter om de overgebleven celaggregaten tot een enkelcellige suspensie te lossen. Breng de cellen met dezelfde pipette over naar een centrifugebuis en spoel de putjes met één milliliter vers DMMF12-medium, waarbij de spoelvloeistoffen in de buis worden verzameld.

Resuspendeer na het centrifugeren van de cellen de pellet in vijf milliliters ES-celcultuurmedium aangevuld met ROCK-remmer. Tel de cellen en zaai 1,5-4 × 10⁵ cellen per putje op platen gecoat met basaalmembraanmatrix in cultuurmedium aangevuld met ROCK-remmer om apoptose te voorkomen. Incubeer de cellen gedurende ongeveer 24 uur.

Gebruik vervolgens een steriele glazen Pasteur-pipet om het medium in elke put te vervangen door 2 milliliters primitieve streep-inductiemedium. Na nog eens 24 uur cultuur wordt het medium vervangen door endoderm-inductiemedium voor een incubatie van 48 uur met dagelijkse mediumwisselingen. Voeg op de laatste dag van de cultuur en ten minste één uur voor het oogsten van de cellen verse ROCK-inhibitor toe aan het cultuurmedium.

Gebruik vervolgens een steriele glazen Pasteurpipet om het medium uit elke put te aspireren en dissocieer de cellen met een enzymvrije passageringsoplossing zoals zojuist gedemonstreerd. Wanneer een suspensie van enkelvoudige cellen is bereikt, tel de cellen en centrifugeer ze. Zorg ervoor dat vanaf dit punt alle media en buffers de ROCK-inhibitor bevatten om te voorkomen dat de cellen afsterven.

Anders zullen ze na het terugtrekken niet correct hechten. Resuspendeer de pellet in 100 µL PEB-buffer, aangevuld met ROCK-remmer per 1 × 10⁷ cellen. Voeg vervolgens CXCR4 APC-antilichaam toe aan de cellen.

Tik voorzichtig tegen de buis om te mengen. Was de cellen na 15 minuten bij 4 °C in één tot twee milliliters PEB-buffer en gebruik een steriele, glazen Pasteurpipet om het supernatant af te zuigen. Resuspendeer de pellet in 80 µL PEB-buffer per 1 × 10⁷ cellen en voeg 20 µL anti-APC-microbeads toe aan de cellen.

Meng het monster door voorzichtig tegen de wand te tikken. Incubeer de cellen vervolgens 15 minuten bij vier graden Celsius. Was na afloop van de incubatie de cellen met één tot twee milliliters PEB-buffer aangevuld met ROCK-remmer.

Resuspendeer het pellet in 500 µL verse PEB-buffer met inhibitor. Om de CXCR4+-cellen te isoleren via magnetische bead-scheiding, plaatst u een magnetische kolom van gemiddelde grootte op een passende magneet en spoelt u de kolom voor met 500 µL PEB-buffer met ROCK-inhibitor. Wanneer al het spoelmiddel uit de bovenkant van de kolom is gelopen, brengt u het volledige volume aan van de met magnetische beads gelabelde cellen op de kolom en verzamelt u de doorstroom in een conische buis.

Was de kolom drie keer met 500 µL PEB-buffer plus ROCK-remmer. Plaats de kolom vervolgens vanuit de magneet in een geschikte opvangbuis. Voeg één milliliter PEB-buffer plus ROCK-remmer toe aan de kolom om de CXCR4+-cellen op te vangen.

Optioneel kunnen alle doorstroommonsters afzonderlijk worden opgevangen, waarbij aliquoten van 20 µL van elk monster kunnen worden gebruikt om het percentage CXCR4+-cellen in elke aliquot te bepalen via flowcytometrie. Deze procedure kan worden herhaald met de eerste doorstroom om cellen te verzamelen die niet aan de kolom zijn gebonden. Voeg vervolgens beide aliquoten met CXCR4+-monsters samen en centrifugeer deze.

Resuspendeer tot slot de pellet in één milliliter endoderm-inductiemedium aangevuld met ROCK-inhibitor en zaai de cellen uit met de juiste dichtheid in een celkweekcontainer die is gecoat met een basaalmembraanmatrix. Voordat ze differentiëren, vertonen menselijke ES-cellen hoge niveaus van de pluripotentiemarker SOX2, terwijl de definitieve endoderm-marker FOXA2 niet wordt gedetecteerd.

Bij differentiatie ondergaan de ES-cellen drastische veranderingen in hun gen- en eiwitexpressie. Inderdaad, na vier dagen in differentiatiemedium worden SOX17 en FOXA2 uniform gecoe-expressie in de kernen van veel van de voormalige ES-cellen, wat een kenmerk is van commitment naar definitief endoderm. Sommige cellen resisteren het differentiatieproces en brengen geen van de twee marker-eiwitten tot expressie.

En in feite behouden ze de expressie van hun pluripotentiemarkeur SOX2. In dit representatieve experiment expresseerden, op dag drie van de differentiatie, bijna 60% van de geoogste ES-cellen CXCR4, waarvan de zuiverheid werd verrijkt tot boven de 85% na magnetische kraal-sortering van de pluripotente en andere ongewenste lineage-cellen. Na het uitplaten van de gezuiverde CXCR4+-cellen worden slechts enkele SOX2+-cellen gedetecteerd, waarbij de meerderheid van de uitgeplaatte cellen FOXA2 expressieert.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze, mits correct uitgevoerd, binnen twee uur worden voltooid. Na deze procedure kunnen andere technieken, zoals immunohistochemie of qPCR, worden uitgevoerd om aanvullende vragen over het differentiatieproces te beantwoorden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe endodermcellen kunnen worden gezuiverd door middel van magnetische bead-sortering.