Name: Een snelle en efficiënte methode voor het zuiveren van Endoderm Cellen Generated van menselijke embryonale stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Leer een snelle methode voor het zuiveren van endodermcellen uit menselijke embryonale stamcellen met magnetische bead-sorting. Deze techniek verbetert downstream-toepassingen in stamcelonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De bekwame technische bijstand van Jasmin Kresse is dankbaar erkend.

1. Differentiatie van Human ESC naar de Definitive Endoderm <ol><li> Cultiveren menselijke embryonale stamcellen (SER) in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Bekleed een nieuwe 6-well celcultuur plaat met 1 ml van een basaalmembraan matrix en incubeer de kweek-ware gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur. Voor specifieke informatie kunt u zich wenden tot de instructies van de desbetreffende fabrikant. </li><li> Controleer of de gekweekte menselijke SER 80% -90% samenvloeiing onder de microscoop met behulp van een lage vergroting (bijvoorbeeld 4X) hebben bereikt. Zuig het medium van de holten te zuigen uit het medium met een steriele glazen Pasteur pipet. Was de cellen eenmaal met fosfaat- gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing. Voor deze, voeg 2 ml PBS aan elk putje zachtjes schudden de plaat en zuigen uit de oplossing om de dode cellen en celresten te verwijderen. </li><li> Voeg 1 ml enzym-vrije passage reagens voor zachte dissociatie van celgroepen. Incubeer de cellen bij 37 ° C eend 5% CO2 totdat de cellen vertonen duidelijke tekenen van verstoring in kleine clusters. OPMERKING: De incubatietijd is afhankelijk van de gebruikte reagens. Voor de in de sectie materialen genoemd enzym-vrije passage oplossing incubatietijd is ongeveer 7 minuten. </li><li> Voeg 1 ml DMEM / F-12 medium en verstoren de resterende celaggregaten in enkele cellen door op en neer pipetteren met een 1 ml pipet tip. Gebruik de cellen van het oppervlak te spoelen en breng de cellen in een centrifugebuis. Alle elementen ophalen, wassen elk putje met 1 ml DMEM / F-12 medium en voeg het medium aan de centrifugebuis. </li><li> Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 5 ml ES celcultuur medium dat 10 uM Rho-kinase (ROCK) remmer. </li><li> Tel de cellen onder de microscoop met een hemocytometer en zaden 150.000 - 400.000 cellen per 6 putjes of andere plaatindeling, afhankelijk van de ES cellijn. gebruik cultuur medium dat 10 pM ROCK inhibitor apoptose en kweek bij 37 ° C en 5% CO 2 voorkomen dat de cellen in een incubator. </li><li> Ongeveer 24 uur na het zaaien aspireren het medium met een steriele glazen Pasteur pipet en voeg 2 ml primitieve streep inductie medium. LET OP: Dit medium bevat finale concentraties van 1% glutamine, 0,2% FCS, 5 uM CHIR-99021 en 50 ng / ml activine A in Advanced RPMI-1640-medium. Gewoonlijk gebruiken 2 ml medium voor kweken in 6-well platen. </li><li> 48 uur na het zaaien, vervang dan de middellange tot inductie medium endoderm. Cultiveren van de cellen in dit medium een ​​48 uur dagelijkse mediumverversing. LET OP: Dit medium bestaat uit 1% glutamine, 0,2% FCS en 50 ng / ml activine A in Advanced RPMI-1640-medium. Cellen die zich inzetten in de richting van de definitieve endoderm drukken de oppervlakte marker CXCR4. De kleuring van CXCR4 kan worden gebruikt om het aantal DE-voorbestemde cellen te kwantificeren. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Kleuring van CXCR4 + Definitive Endoderm Cellen voor Flowcytometrieanalyse <ol><li> Voor de laatste 24 uur, maar ten minste 1 uur vóór het verzamelen van cellen toe 10 pM ROCK inhibitor aan het kweekmedium. </li><li> Coat de celkweek-software die wordt gebruikt voor het opnieuw enten met een basaalmembraan matrix, dat wil zeggen 12-well platen voor qPCR analyse of kamer objectglaasjes voor immunofluorescentie kleuring. Incubeer de platen of dia gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Zuig het medium met een steriele glazen Pasteur pipet uit de putjes van de gedifferentieerde cellen gebruikt voor het kleuren en / of sorteren. </li><li> Voeg 1 ml enzym-vrije passage reagens voor de zachte dissociatie van celgroepen. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 totdat de cellen vertonen duidelijke tekenen van verstoring in kleine clusters. OPMERKING: De incubatietijd is afhankelijk van de gebruikte reagens. Voor de in de genoemde materialen enzymvrije passages oplossingALS Sectie, incubatietijd is ongeveer 7 min. </li><li> Voeg 1 ml DMEM / F-12 medium en verstoren overige celaggregaten in enkele cellen door op en neer pipetteren met een 1 ml tip. Gebruik de cellen van het oppervlak te spoelen en breng de cellen in een centrifugebuis. Alle elementen ophalen, wassen elk putje met 1 ml DMEM / F-12 medium w / o FCS en voeg het medium aan de centrifugebuis. </li><li> Tel de cellen onder de microscoop met een hemocytometer. Cellen van drie putjes van een 6-wells plaat zou leiden tot 10-15 x 10 6 cellen na drie dagen van differentiatie. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g. Opmerking: Het exacte aantal verkregen cellen zal afhangen van de pluripotente cellijn die voor de differentiatie. </li><li> Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in PEB-buffer die 10 uM ROCK inhibitor. Met 100 ul van deze buffer tot 10 7 cellen. Voeg de 10 pM ROCK-remmer op de dag van staining. Gebruik deze buffer voor alle downstream-toepassingen (aangeduid als PEB buffer + RI). OPMERKING: PEB buffer bevat 0,5% BSA en 2 mM EDTA in PBS. Als er meer cellen worden gekleurd, aan te passen aan de buffer volume dienovereenkomstig. </li><li> Voeg 10 ul van een CXCR4-APC antilichaam per 10 7 cellen in 100 ul, dit komt ongeveer overeen met een verdunning van 1:10. Opmerking: het gebruik van een APC-gekoppelde antilichaam niet verplicht. In plaats daarvan kan worden vervangen, afhankelijk van de gebruikte microkralen. Als er meer cellen worden gekleurd dienovereenkomstig aan te passen het volume antilichaam. </li><li> Meng door voorzichtig omkeren van de buis met de vingers en incuberen bij 4 ° C in een koelkast gedurende 15 minuten. Resuspendeer de cellen met 1-2 ml PEB-buffer. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g. </li><li> Zuig het supernatant met een steriele glazen Pasteur pipet en resuspendeer de celpellet in 80 pi per PEB 10 7 cellen en voeg 20 ul anti-APC microbolletjes. NOTITIE: </strong&gt; Als er meer cellen worden gekleurd, pas de micro-bead volume dienovereenkomstig. </li><li> Meng door voorzichtig omkeren van de buis met de vingers en incuberen bij 4 ° C in een koelkast gedurende 15 minuten. Resuspendeer de cellen met 1-2 ml PEB buffer + RI. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g. Zuig de buffer. Resuspendeer in 500 ui PEB buffer + RI. </li></ol> 3. Magnetische scheiding van CXCR4 + cellen <ol><li> Plaats een middelgrote magnetische kolom in een magnetisch veld volgens vervaardiging instructies. Pre-spoel de kolom met 500 pi PEB buffer + RI. Breng de gehele celsuspensie op de kolom. Verzamel de stroom door aangezien niet alle cellen zullen binden aan de kolom. Zorg ervoor dat niet om de kolommen te storen voor een optimale ophalen van CXCR4 + cellen. </li><li> Was de kolom driemaal met 500 ul buffer PEB + RI. Het verzamelen van de eerste stroom door en deze combineren met de verzamelde cellen uit stap 3.1. Verwijder de magnetische kolom uit het magnetische veld en plaats het in eengeschikt collectie buis. Voeg 1 ml PEB buffer + RI op de kolom. Om elueren de cellen stevig druk de zuiger in de kolom. </li><li> Optioneel: Verzamel alle stroming door monsters afzonderlijk gebruiken 20 pi elk van het aantal CXCR4 + cellen met flowcytometrie geanalyseerd. Hun aantal moet afnemen bij iedere wasstap. LET OP: Minstens 2 x 10 4 levensvatbare, gated cellen moeten worden geteld voor betrouwbare resultaten. </li><li> Herhaal stap 3,1-3,3 met de verzamelde-doorstroming monster uit stap 3.1 en de eerste stroom door monster van stap 3.2 met behulp van een nieuwe kolom. Niet opnieuw gebruik maken van de vorige kolom. Via de plunjer lucht wordt geperst in de kolom, die blokkeert. </li><li> Tel de cellen onder de microscoop met een hemocytometer. Afhankelijk van de efficiëntie van de differentiatie tot 6 x 10 6 cellen kunnen eerst worden gesorteerd en een 1 x 10 6 cellen door een tweede kolom bij gebruik 10 7 cellen voor de procedure. </li&gt; <li> Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 5 min. Zuig het supernatant en van een steriele glazen Pasteur pipet en resuspendeer de cellen in 1 ml endoderm inductie medium uit stap 1.9 met extra 10 pM ROCK inhibitor. </li><li> Tel de cellen onder de microscoop met een hemocytometer. Zaad van de cellen met een geschikte dichtheid, dat wil zeggen, ~ 4 x 10 5 cellen per putje van een 12-well plaat (ong. 3,6 cm2 oppervlak) of ~ 1,5 x 10 5 cellen per putje van een 8-well kamer-slide. </li></ol> 4. Optioneel: Analyse van gezuiverde Definitive Endoderm Bevolking <ol><li> Voor immunofluorescentiekleuring zet de gezuiverde cellen uit stap 3,7 ongeveer 24 uur na enten met 4% paraformaldehyde en vlekken definitieve endoderm (DE) en / of pluripotentie marker eiwitten. LET OP: Veelgebruikte DE merkers omvatten FOXA2 en Sox17, vaak gebruikt pluripotentie markers omvatten Oct3 / 4, NANOG en SOX2 6, 8. </li><li> for RT-qPCR analyse, de oogst van de gezuiverde cellen direct of 24 uur na het zaaien, te extraheren totaal-RNA en reverse transcriberen cDNA uit de uitgepakte totaal-RNA-monsters. Met 10 ng cDNA als matrijs per RT-qPCR reactie (triplo&#39;s) bij de expressie van DE en pluripotentie markergenen 6, 8 analyseren. LET OP: Veel gebruikte merkergenen worden vermeld in stap 4.1. Cyclusomstandigheden zijn 5 min bij 95 ° C en 40 cycli van 15 sec bij 95 ° C en 1 minuut bij 60 ° C, gevolgd door smeltcurve analyse. </li></ol>

<ol><li>Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Highly+Purified+Cardiomyocytes+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Small+Molecule-modulated+Differentiation+and+Subsequent+Glucose+Starvation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
<li>Sgodda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+hepatic+differentiation+strategies+for+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Improved hepatic differentiation strategies for human induced pluripotent stem cells.</a> Curr Mol Med. 13 (5), 842-855 (2013).</li>
<li>Naujok, O., Burns, C., Jones, P. M., Lenzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-producing+surrogate+beta-cells+from+embryonic+stem+cells%3A+are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Insulin-producing surrogate beta-cells from embryonic stem cells: are we there yet.</a> Mol Ther. 19 (10), 1759-1768 (2011).</li>
<li>Katsirntaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+sublineage+specification+of+pluripotent+stem+cells%3A+effect+of+dexamethasone+plus+cAMP-elevating+agents+and+keratinocyte+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar sublineage specification of pluripotent stem cells: effect of dexamethasone plus cAMP-elevating agents and keratinocyte growth factor.</a> Tissue Eng Part A. 21 (3-4), 669-682 (2015).</li>
<li>Abranches, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+embryonic+stem+cells+in+vitro%3A+a+road+map+to+neurogenesis+in+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of embryonic stem cells in vitro: a road map to neurogenesis in the embryo.</a> PLoS One. 4 (7), e6286(2009).</li>
<li>Naujok, O., Diekmann, U., Lenzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+definitive+endoderm+from+human+embryonic+stem+cells+is+initially+independent+from+activin+A+but+requires+canonical+Wnt-signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">The generation of definitive endoderm from human embryonic stem cells is initially independent from activin A but requires canonical Wnt-signaling.</a> Stem Cell Rev. 10 (4), 480-493 (2014).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).</li>
<li>Diekmann, U., Lenzen, S., Naujok, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reliable+and+efficient+protocol+for+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+into+the+definitive+endoderm+based+on+dispersed+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">A reliable and efficient protocol for human pluripotent stem cell differentiation into the definitive endoderm based on dispersed single cells.</a> Stem Cells Dev. 24 (2), 190-204 (2015).</li>
<li>Kim, P. T., Ong, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+definitive+endoderm+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Results+Probl+Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Differentiation of definitive endoderm from mouse embryonic stem cells.</a> Results Probl Cell Differ. 55, 303-319 (2012).</li>
<li>Katoh, M., Katoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomic+analyses+of+CXCR4%3A+transcriptional+regulation+of+CXCR4+based+on+TGFbeta%2C+Nodal%2C+Activin+signaling+and+POU5F1%2C+FOXA2%2C+FOXC2%2C+FOXH1%2C+SOX17%2C+and+GFI1+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomic analyses of CXCR4: transcriptional regulation of CXCR4 based on TGFbeta, Nodal, Activin signaling and POU5F1, FOXA2, FOXC2, FOXH1, SOX17, and GFI1 transcription factors.</a> Int J Oncol. 36 (2), 415-420 (2010).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+signaling+through+TGFbeta+family+members+and+WNT+regulates+patterning+and+pancreatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Development. 138 (5), 861-871 (2011).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+functional+islets+capable+of+treating+pre-existing+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice.</a> Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).</li>
<li>Bruin, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+and+function+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+in+macroencapsulation+devices+following+transplant+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice.</a> Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).</li>
<li>Fu, W., Wang, S. J., Zhou, G. D., Liu, W., Cao, Y., Zhang, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+undifferentiated+cells+during+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Residual undifferentiated cells during differentiation of induced pluripotent stem cells in vitro and in vivo.</a> Stem Cells Dev. 21 (4), 521-529 (2012).</li>
<li>Hentze, H., Soong, P. L., Wang, S. T., Phillips, B. W., Putti, T. C., Dunn, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratoma+formation+by+human+embryonic+stem+cells%3A+evaluation+of+essential+parameters+for+future+safety+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies.</a> Stem Cell Res. 2 (3), 198-210 (2009).</li>
<li>Herberts, C. A., Kwa, M. S., Hermsen, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+in+the+development+of+stem+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Risk factors in the development of stem cell therapy.</a> J Transl Med. 9, 29(2011).</li>
<li>Naujok, O., Kaldrack, J., Taivankhuu, T., Jörns, A., Lenzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+removal+of+undifferentiated+embryonic+stem+cells+from+differentiation+cultures+through+HSV1+thymidine+kinase+and+ganciclovir+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Selective removal of undifferentiated embryonic stem cells from differentiation cultures through HSV1 thymidine kinase and ganciclovir treatment.</a> Stem Cell Rev. 6 (3), 450-461 (2010).</li>
<li>Pan, Y., Ouyang, Z., Wong, W. H., Baker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+FACS+approach+isolates+hESC+derived+endoderm+using+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new FACS approach isolates hESC derived endoderm using transcription factors.</a> PLoS One. 6 (3), 17536(2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Op dit moment gebruikt differentiatie protocollen zelden tot 100% gedifferentieerde cellen. Om redenen die nog moeten worden aangepakt sommige cellen weerstaan ​​aan de differentiatie proces. Afhankelijk van de efficiëntie van de gebruikte differentiatie protocol en de neiging van het ESC lijn een aantal residuele pluripotente cellen worden vaak waargenomen, zelfs na differentiatie in de definitieve endoderm. Deze resterende cellen kunnen stroomafwaarts differentiaties of verdere analyse, zoals transcriptomics, proteomi...

Pluripotente cellen zoals embryonale stamcellen (SER) hebben de mogelijkheid om te differentiëren in vrijwel elk type cel van het menselijk lichaam. Aldus kan in vitro differentiatie protocollen worden gebruikt om verschillende volwassen celtypes zoals cardiomyocyten 1, hepatocyten 2, 3 beta-cellen, long epitheelcellen 4 of 5 neuronale cellen te genereren. Dit maakt SER een waardevol instrument voor de mogelijke behandeling van verschillende degeneratieve ziekten 3. De in vitro differentiatie van SER richting volwassen weefsels van de longen, lever en pancreas is een pseudo-gastrulatie in cellen die doet denken aan de definitieve endoderm (DE) 6. Aangezien stroomafwaarts differentiatie naar de genoemde somatische celtypen aanzienlijk minder efficiënt wordt een optimale endoderm differentiatie geacht snelheidsbepalende 7. Cellen die zich inzetten in de richting van de endoderm afstamming ondergaan characteristic veranderingen in hun expressie van genen profiel. Pluripotentie meester regulator genen worden naar beneden gereguleerd, terwijl de expressie van andere transcriptiefactoren zoals FOXA2, Sox17, HNF1B, leden van de familie GATA en het oppervlak receptor CXCR4 is sterk opgereguleerd 6, 8, 9. CXCR4 is bekend dat transactivated door SMAD2 / 3, stroomafwaarts van Nodal / TGF-β signalering en Sox17 gevolg van specifieke bindingsplaatsen in het promotorgebied 10. Aldus is een zeer geschikte marker gebruikt in een aantal rapporten 6, 8, 11-13. Deze uitdrukking veranderingen weerspiegelt een pseudo-gastrulatie event, waarbij SER eerste kenmerken van een primitieve streep-achtige celpopulatie te verwerven en vervolgens te plegen in de kiem endoderm laag 6. Echter, differentiatie protocollen zelden 100% efficiënt als enkele cellen het differentiatieproces kan weerstaan ​​of differentiëren tot andere ongewenste lijnen 14. Deze cellen kunnen negatief Influenvu verdere differentiatie. Bovendien resterende ongedifferentieerde cellen herbergen grote risico&#39;s voor later transplantatie experimenten en kan aanleiding geven tot teratomas 15-17 te geven. Om deze ongewenste cellen vroeg op het oppervlak marker CXCR4 kan worden gebruikt voor het zuiveren van cellen die zijn toegewijd aan het voorste 18 verwijderen. Hier beschrijven we een werkwijze voor de positieve selectie van CXCR4 + cellen uit DE differentiatie culturen. Hierbij wordt het oppervlak marker CXCR4 gebonden door een antilichaam dat dan op zijn beurt bindt aan magnetische microkralen. Anders dan de zware omstandigheden tijdens FACS-sortering, de magnetisch gemerkte DE-achtige cellen kunnen vervolgens eenvoudig worden gezuiverd in een benchtop formaat met behulp van een zachte zuiveringswerkwijze. Dit protocol verschaft een eenvoudige werkwijze voor het verwijderen van celpopulaties die het voorste differentiatieproces tegengegaan.

<table><tbody><tr><td>Hues8 humane embryonale stamcellenlijn</td><td>Harvard Department of stem cell &amp; regeneratieve biologie</td><td></td><td>Geschikt celtype voor endoderm generatie</td></tr><tr><td>Hes3 humane embryonale stamcellenlijn</td><td>ES Cell International</td><td></td><td>Geschikt en robuust celtype voor endoderm generatie</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td>ESC kweekmedium</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biowest</td><td>S1860</td><td></td></tr><tr><td>Advanced RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>CD184 (CXCR4)-APC, humaan</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-357</td><td></td></tr><tr><td>anti-APC MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>OctoMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>magnetisch veld</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td>ROCK remmer</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>Activine A</td><td>Peprotech</td><td>120-14</td><td></td></tr><tr><td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7174</td><td>Enzymevrije passageoplossing, alternatief: Trypsin/EDTA</td></tr><tr><td>Matrigel*</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>bazale membraanmatrix * los op en bewaar in aliquoten bij -80 &deg;C zoals beschreven in de handleiding van de leverancier. Bij gebruik, ontdooi op ijs, verdun in 25 ml ijskoud knockout DMEM/F-12. Voeg 1 ml toe aan elke put van een 6-welplate en incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de matrigel en gebruik onmiddellijk. </td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>30-042-201</td><td></td></tr><tr><td>MACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Human FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga</td><td>Life Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Human FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOX17 TaqMan assay</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs00751752_s1</td><td></td></tr><tr><td>Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human POU5F1 REV ctgcagtgtgggtttcgggca</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Nanog FW ccgagggcagacatcatcc</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t </td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17320</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FOXA2</td><td>MerckMillipore</td><td>07-633</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX17</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF1924</td><td></td></tr></tbody></table>

een snelle en efficiënte methode voor het zuiveren van endoderm cellen generated van menselijke embryonale stamcellen

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

De differentiatie mogelijkheden van pluripotente stamcellen zoals embryonale stamcellen (SER) maken voor een potentiële therapeutische toepassing voor celvervangingstherapieën. Terminaal gedifferentieerde celtypen kunnen worden gebruikt voor de behandeling van verschillende degeneratieve ziekten. In vitro differentiatie van deze cellen aan weefsels van de longen, lever en pancreas vereist in de eerste stap het genereren van definitieve endodermale cellen. Deze stap is snelheidsbepalend voor verdere differentiatie richting terminaal rijpte celtypes zoals insuline producerende beta-cellen, hepatocyten of andere endoderm afgeleide celtypen. Cellen die zich inzetten in de richting van de endoderm afstamming sterk drukken een veelheid van transcriptiefactoren zoals FOXA2, Sox17, HNF1B, leden van de familie GATA, en het oppervlak receptor CXCR4. Echter, differentiatie protocollen zelden 100% efficiënt. Hier beschrijven we een werkwijze voor het zuiveren van een CXCR4 + celpopulatie na differentiatiein het voorste via magnetische microkralen. Deze zuivering bovendien verwijdert cellen ongewenste lijnen. De zachte reiniging methode is snel en betrouwbaar en kunnen worden gebruikt om downstream-toepassingen en differentiaties te verbeteren.

na differentiatie SER ondergaan drastische veranderingen in gen- en eiwitexpressie. Figuur 1 toont typische merkergenen die kan worden gebruikt om een succesvolle endoderm differentiatie verifiëren. Prime doelstellingen voor een genexpressie analyse GSC, FOXA2 en Sox17. In een relatieve genexpressie analyse vooral FOXA2 en Sox17 worden verhoogd met&gt; 2.000-voudig in vergelijking met ongedifferentieerde SER...

Hier beschrijven we een werkwijze voor het zuiveren van gedifferentieerde menselijke embryonale stamcellen die zijn toegewijd aan de definitieve endoderm ter verbetering van downstreamtoepassingen en verdere onderverdelingen.

Een snelle en efficiënte methode voor het zuiveren van Endoderm Cellen Generated van menselijke embryonale stamcellen

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Het algemene doel van deze methode is het zuiveren van endodermale cellen die zijn gegenereerd uit menselijke embryonale stamcellen of ES-cellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied van stamcellen over endodermale differentiatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat een zuivere endodermale celpopulatie kan worden verkregen na het verwijderen van ongedifferentieerde cellen.Coat vóór aanvang van de procedure zes-wellscellkweekplaten met één milliliter basementmembraanmatrix per well gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur. Aspireer vervolgens het medium uit een 80 tot 90% confluente humane embryonale stamcelkweek met een steriele glazen Pasteurpipet om de humane ES-cellen te oogsten.Was de cellen vervolgens met twee milliliters PBS per putje. Schud de plaat en aspireer de zoutoplossing om de dode cellen en het debris te verwijderen. Dissocieer daarna voorzichtig de celclusters met één milliliter enzymvrije passageringsoplossing bij 37 °C en 5% CO2 totdat de cellen duidelijke tekenen vertonen van opdeling in kleinere clusters.Voeg na ongeveer zeven minuten één milliliter DMMF12-medium toe aan de putjes. Pipetteer vervolgens enkele keren op en neer met een pipetteertip van één milliliter om de overgebleven celaggregaten tot een enkelcellige suspensie te lossen. Breng de cellen met dezelfde pipette over naar een centrifugebuis en spoel de putjes met één milliliter vers DMMF12-medium, waarbij de spoelvloeistoffen in de buis worden verzameld.Resuspendeer na het centrifugeren van de cellen de pellet in vijf milliliters ES-celcultuurmedium aangevuld met ROCK-remmer. Tel de cellen en zaai 1,5-4 × 10⁵ cellen per putje op platen gecoat met basaalmembraanmatrix in cultuurmedium aangevuld met ROCK-remmer om apoptose te voorkomen. Incubeer de cellen gedurende ongeveer 24 uur.Gebruik vervolgens een steriele glazen Pasteur-pipet om het medium in elke put te vervangen door 2 milliliters primitieve streep-inductiemedium. Na nog eens 24 uur cultuur wordt het medium vervangen door endoderm-inductiemedium voor een incubatie van 48 uur met dagelijkse mediumwisselingen. Voeg op de laatste dag van de cultuur en ten minste één uur voor het oogsten van de cellen verse ROCK-inhibitor toe aan het cultuurmedium.Gebruik vervolgens een steriele glazen Pasteurpipet om het medium uit elke put te aspireren en dissocieer de cellen met een enzymvrije passageringsoplossing zoals zojuist gedemonstreerd. Wanneer een suspensie van enkelvoudige cellen is bereikt, tel de cellen en centrifugeer ze. Zorg ervoor dat vanaf dit punt alle media en buffers de ROCK-inhibitor bevatten om te voorkomen dat de cellen afsterven.Anders zullen ze na het terugtrekken niet correct hechten. Resuspendeer de pellet in 100 µL PEB-buffer, aangevuld met ROCK-remmer per 1 × 10⁷ cellen. Voeg vervolgens CXCR4 APC-antilichaam toe aan de cellen.Tik voorzichtig tegen de buis om te mengen. Was de cellen na 15 minuten bij 4 °C in één tot twee milliliters PEB-buffer en gebruik een steriele, glazen Pasteurpipet om het supernatant af te zuigen. Resuspendeer de pellet in 80 µL PEB-buffer per 1 × 10⁷ cellen en voeg 20 µL anti-APC-microbeads toe aan de cellen.Meng het monster door voorzichtig tegen de wand te tikken. Incubeer de cellen vervolgens 15 minuten bij vier graden Celsius. Was na afloop van de incubatie de cellen met één tot twee milliliters PEB-buffer aangevuld met ROCK-remmer.Resuspendeer het pellet in 500 µL verse PEB-buffer met inhibitor. Om de CXCR4+-cellen te isoleren via magnetische bead-scheiding, plaatst u een magnetische kolom van gemiddelde grootte op een passende magneet en spoelt u de kolom voor met 500 µL PEB-buffer met ROCK-inhibitor. Wanneer al het spoelmiddel uit de bovenkant van de kolom is gelopen, brengt u het volledige volume aan van de met magnetische beads gelabelde cellen op de kolom en verzamelt u de doorstroom in een conische buis.Was de kolom drie keer met 500 µL PEB-buffer plus ROCK-remmer. Plaats de kolom vervolgens vanuit de magneet in een geschikte opvangbuis. Voeg één milliliter PEB-buffer plus ROCK-remmer toe aan de kolom om de CXCR4+-cellen op te vangen.Optioneel kunnen alle doorstroommonsters afzonderlijk worden opgevangen, waarbij aliquoten van 20 µL van elk monster kunnen worden gebruikt om het percentage CXCR4+-cellen in elke aliquot te bepalen via flowcytometrie. Deze procedure kan worden herhaald met de eerste doorstroom om cellen te verzamelen die niet aan de kolom zijn gebonden. Voeg vervolgens beide aliquoten met CXCR4+-monsters samen en centrifugeer deze.Resuspendeer tot slot de pellet in één milliliter endoderm-inductiemedium aangevuld met ROCK-inhibitor en zaai de cellen uit met de juiste dichtheid in een celkweekcontainer die is gecoat met een basaalmembraanmatrix. Voordat ze differentiëren, vertonen menselijke ES-cellen hoge niveaus van de pluripotentiemarker SOX2, terwijl de definitieve endoderm-marker FOXA2 niet wordt gedetecteerd.Bij differentiatie ondergaan de ES-cellen drastische veranderingen in hun gen- en eiwitexpressie. Inderdaad, na vier dagen in differentiatiemedium worden SOX17 en FOXA2 uniform gecoe-expressie in de kernen van veel van de voormalige ES-cellen, wat een kenmerk is van commitment naar definitief endoderm. Sommige cellen resisteren het differentiatieproces en brengen geen van de twee marker-eiwitten tot expressie.En in feite behouden ze de expressie van hun pluripotentiemarkeur SOX2. In dit representatieve experiment expresseerden, op dag drie van de differentiatie, bijna 60% van de geoogste ES-cellen CXCR4, waarvan de zuiverheid werd verrijkt tot boven de 85% na magnetische kraal-sortering van de pluripotente en andere ongewenste lineage-cellen. Na het uitplaten van de gezuiverde CXCR4+-cellen worden slechts enkele SOX2+-cellen gedetecteerd, waarbij de meerderheid van de uitgeplaatte cellen FOXA2 expressieert.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze, mits correct uitgevoerd, binnen twee uur worden voltooid. Na deze procedure kunnen andere technieken, zoals immunohistochemie of qPCR, worden uitgevoerd om aanvullende vragen over het differentiatieproces te beantwoorden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe endodermcellen kunnen worden gezuiverd door middel van magnetische bead-sortering.

a-quick-efficient-method-for-purification-endoderm-cells-generated

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Het vermogen van menselijke embryonale stamcellen om zichzelf te vernieuwen en te differentiëren in alle celtypen van het lichaam, suggereert dat zij een grote belofte voor zowel de medische toepassingen en als een research tool voor het aanpakken van fundamentele vragen bij ontwikkeling en ziekte vast te houden. Hier bieden wij een beknopte, stap-voor-stap protocol voor de winning van menselijke embryonale stamcellen uit embryo's door immunosurgical isolatie van de binnenste celmassa.

Afleiding van menselijke embryonale stamcellen door Immunosurgery

Dit artikel zal zich richten op het genereren van humane lever endoderm van menselijke embryonale stamcellen populaties.

Robuuste Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke embryonale stamcellen Populaties

Ondanks aanhoudende inspanningen om de overgang culturen aan feeder-vrije omstandigheden, de afleiding en de cultuur van menselijke embryonale stamcellen (hESC) blijven grotendeels afhangen van co-culturen met muis embryonale feeders (MEF). Hier laten we zien een nieuwe methodologie voor het snel verwijderen van feeders van hESC culturen voorafgaand aan de experimenten.

Snelle Fibroblast Verwijdering uit High Density menselijke embryonale stamcellen culturen

We beschrijven het gebruik van de monoklonale antilichamen TG30 (CD9) en GCTM-2 voor de gecombineerde detectie van celoppervlakantigenen via fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) voor de identificatie en verrijking van levende menselijke embryonale stamcellen (hESC) met behulp van positieve selectie en ook het gebruik van negatieve selectie om hESC's uit een gemengde celpopulatie te zuiveren.

Verrijking en zuivering van menselijke embryonale stamcellen door detectie van celoppervlakantigenen met behulp van de monoklonale antilichamen TG30 en GCTM-2

Dit protocol richt efficiënt muis embryonale stamcellen afgeleide definitieve endoderm aan de luchtwegen rijpen epitheelcellen. Deze differentiatie techniek maakt gebruik van 3-dimensionale cellen ontdane long scaffolds rechtstreekse long lijn specificatie, in een gedefinieerd serumvrij cultuurmedium setting.

Generatie van ESC afgeleide Mouse epitheelcellen behulp van cellen ontdane Lung Steigers

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) hebben de intrinsieke vermogen om onderscheid te maken en zichzelf organiseren in verschillende weefsel patronen; hoewel dit vereist de presentatie van ruimtelijke milieu-hellingen. Wij presenteren stencil micropatterning als een eenvoudige en robuuste methode om biochemische en mechanische gradiënten genereren voor het besturen van HPSC differentiatie patronen.

Stencil micropatterning van menselijke pluripotente stamcellen voor Probing ruimtelijke organisatie van Differentiatie Fates

Hier gepresenteerd is een protocol voor het genereren van een eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen en hun daaropvolgende differentiatie in neurale voorlopercellen. Het protocol is eenvoudig, robuust, schaalbaar en geschikt voor geneesmiddelen screening en toepassingen voor regeneratieve geneeskunde.

Efficiënte Neurale differentiatie met behulp van eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor differentiatie van menselijke embryonale stamcellen (hESC's) in functionele hepatocyt-achtige cellen (HCC's) door continu Activine A en CHIR99021 aan te vullen tijdens hESC-differentiatie tot definitief endoderm (DE).

Een efficiënte methode voor gerichte hepatocyt-achtige celinductie uit menselijke embryonale stamcellen

Om de beperkingen te vermijden die gepaard gaan met het enzymatisch of mechanisch passeren van menselijke embryonale stamcellen (hESC's) en door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) gekweekt op feedercellen, hebben we een snelle, effectieve, kostenefficiënte methode met een hoge opbrengst ontwikkeld voor het oogsten van hESC- of hiPSC-kolonies die worden onderhouden op een voedingscellaag van menselijke voorhuidfibroblasten met behulp van EDTA-gemedieerde kkleefkracht.

Snelle, kostenefficiënte, enzymvrije passaging van menselijke pluripotente stamcellen op voedingscellen door ethyleendiaminetetra-azijnzuur-gemedieerde dis-adhesie

Het huidige protocol laat zien hoe CD3−/CD45+CD56+ cellen met milde cytotoxiciteit kunnen worden onderscheiden van humane expanded potential stamcellen (hEPSC's) onder zowel 3D- als 2D-kweekomstandigheden. Dit maakt routinematige fenotypische validatie mogelijk zonder de vernietiging van de complexe micro-omgeving.

Generatie van Natural Killer Cellen uit Human Expanded Potential Stamcellen

Dit protocol beschrijft het genereren van snelle en reproduceerbare endodermale leverorganoïden (eHEPO's). Met dit protocol kunnen eHEPO's binnen 2 weken worden geproduceerd en op lange termijn (meer dan 1 jaar) worden uitgebreid zonder hun differentiatie en functionaliteit te verliezen.

Genereren van functionele endodermale leverorganoïden

Leer een snelle methode voor het zuiveren van endodermcellen uit menselijke embryonale stamcellen met magnetische bead-sorting. Deze techniek verbetert downstream-toepassingen in stamcelonderzoek.

Een snelle en efficiënte methode voor het zuiveren van Endoderm Cellen Generated van menselijke embryonale stamcellen

Meer video's verkennen