Een snelle en efficiënte methode voor het zuiveren van Endoderm Cellen Generated van menselijke embryonale stamcellen
3 maart 2016
Hier beschrijven we een werkwijze voor het zuiveren van gedifferentieerde menselijke embryonale stamcellen die zijn toegewijd aan de definitieve endoderm ter verbetering van downstreamtoepassingen en verdere onderverdelingen.
Het algemene doel van deze methode is het zuiveren van endodermale cellen die zijn gegenereerd uit menselijke embryonale stamcellen of ES-cellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het stamcelveld over endodermdifferentiatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat een zuivere populatie endodermcellen kan worden verkregen na het verwijderen van ongedifferentieerde cellen.
Voordat u met de procedure begint, bedekt u zes welborden voor celkweek met één milliliter basement membrane matrix per putje. Gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens, om de menselijke ES-cellen te oogsten, aspireer het medium van een 80 tot 90% confluente menselijke embryonale stamcelcultuur met een steriele glazen Pasteur-pipet.
En was de cellen met twee milliliter PBS per putje. Schud de plaat en aspireer de zoutoplossing om de dode cellen en puin te verwijderen. Vervolgens dissocieert u voorzichtig de celclusters met één milliliter enzymvrij passageringsoplossingsreagens, bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide totdat de cellen duidelijke tekenen van ontwrichting in kleinere clusters vertonen.
Na ongeveer zeven minuten, voegt u één milliliter DMMF12-medium toe aan de putjes. En pipet omhoog en omlaag een paar keer met een pipettip van één milliliter om de resterende celaggregaten te detacheren in een enkele celsuspensie. Gebruik dezelfde pipet om de cellen over te brengen naar een centrifugeerbuis en spoel de putjes met één milliliter vers DMMF12-medium, waarbij de spoelingen in de buis worden verzameld.
Na het afcentrifugeren van de cellen, resuspendeert u het pellet in vijf milliliter ES-celkweekmedium gesupplementeerd met ROCK-remmer. Tel de cellen en zaai 1,5:4 keer 10 tot de vijfde cellen per putje op de met basement membrane matrix beklede platen in kweekmedium gesupplementeerd met ROCK-remmer om apoptose te voorkomen. Incubeer de cellen gedurende ongeveer 24 uur.
En gebruik vervolgens een steriele, glazen Pasteur-pipet om het medium in elk van de putjes te vervangen door 2 milliliter primitief streep inductiemedium. Na nog 24 uur kweek, vervangt u het medium door endoderm inductiemedium voor een 48-urige incubatie met dagelijkse mediumverversingen. Op de laatste kweekdag en ten minste een uur voordat u de cellen oogst, voegt u vers ROCK-remmer toe aan het kweekmedium.
Gebruik vervolgens een steriele, glazen Pasteur-pipet om het medium uit elk van de putjes te aspireren en de cellen te dissociëren met enzymvrije passageringsoplossingsreagens zoals zojuist is gedemonstreerd. Wanneer een enkele celsuspensie is bereikt, telt u de cellen en centrifugeert u ze. Zorg ervoor dat vanaf dit punt alle medium en buffers de ROCK-remmer bevatten om te voorkomen dat de cellen afsterven.
Anders zullen ze niet goed worden gehecht na het terugtrekken. Resuspendeer het pellet in 100 microliter PEB-buffer, gesupplementeerd met ROCK-remmer per 1 keer 10 tot de zevende cel. Voeg vervolgens CXCR4 APC-antilichaam toe aan de cellen.
Lichtjes flikkerend de buis om te mengen. Na 15 minuten bij 4 graden Celsius, was de cellen in één tot twee milliliter PEB-buffer en gebruik een steriele, glazen Pasteur-pipet om het supernatant te aspireren. Resuspendeer het pellet in 80 microliter PEB-buffer per 1 keer 10 tot de zevende cel en voeg 20 microliter anti-APC microbeads toe aan de cellen.
Meng het monster met lichtjes flikkeren. Bewaar de cellen vervolgens gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, was de cellen met één tot twee milliliter PEB-buffer gesupplementeerd met ROCK-remmer.
En resuspendeer het pellet in 500 microliter vers PEB-buffer plus remmer. Om de CXCR4+cellen te isoleren door magnetische parelkettingscheiding, laadt u een middelgrote magnetische kolom op een geschikte magneet en spoelt u de kolom vooraf met 500 microliter PEB-buffer plus ROCK-remmer. Wanneer al het wassen van de bovenkant van de kolom is weggedraineerd, brengt u het hele volume van het magnetische parelkettinglabel op de kolom aan, waarbij u de doorstroming in een conische buis verzamelt.
Was de kolom met drie toepassingen van 500 microliter PEB-buffer plus ROCK-remmer. Breng vervolgens de kolom van de magneet over in een geschikte opvangbuis. En dompel één milliliter PEB-buffer plus ROCK-remmer door de kolom om de CXCR4+cellen te verzamelen.
Optioneel kunnen alle doorstromende monsters afzonderlijk worden verzameld en kunnen 20 microliter aliquots van elk monster worden gebruikt om het percentage CXCR4+cellen in elke alouette te bepalen door middel van flowcytometrie. Deze procedure kan worden herhaald met de eerste doorstroming om cellen te verzamelen die niet aan de kolom hebben gebonden. Vervolgens worden zowel alle CXCR4+samples gepoold en gecentrifugeerd.
Ten slotte resuspendeer het pellet in één milliliter endoderm inductiemedium gesupplementeerd met ROCK-remmer En zaai de cellen met de juiste dichtheid in een met basement membrane matrix beklede celkweekcontainer. Voorafgaand aan hun differentiatie, drukken menselijke ES-cellen hoge niveaus van de pluripotentiemarker SOX2 uit. Terwijl de definitieve endodermmarker, FOXA2, niet wordt gedetecteerd.
Bij differentiatie ondergaan de ES-cellen drastische veranderingen in hun gen- en eiwitexpressie. Inderdaad, na vier dagen in differentiatiemedium, worden SOX17 en FOXA2 uniform in de kernen van veel van de voormalige ES-cellen co-geëxpresseerd, een kenmerk van definitieve endodermtoewijzing. Sommige cellen weerstaan het differentiatieproces en drukken geen van beide markereiwitten uit.
En houden in feite hun pluripotentiemarker SOX2-expressie. In dit representatieve experiment, op dag drie van differentiatie, drukte bijna 60% van de geoogste ES-cellen CXCR4 uit, waarvan de zuiverheid werd verrijkt tot meer dan 85% na magnetische parelkettingsortering van de pluripotente en andere ongewenste lijnagecellen. Na het zaaien van de gezuiverde CXCR4+cellen, worden slechts enkele SOX2+cellen gedetecteerd, waarbij de meerderheid van de gezaaide cellen FOXA2 tot expressie brengt.
Eenmaal onder
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het zuiveren van gedifferentieerde menselijke embryonale stamcellen die bestemd zijn voor het definitieve endoderm. Deze techniek verbetert downstream-toepassingen en verdere differentiaties.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Stamceldonderszoek
- Celdifferentiatie
- Endodermele ontwikkeling
Achtergrond
- Menselijke embryonale stamcellen (ES-cellen) kunnen zich differentiëren in verschillende celtypen.
- Het begrijpen van endodermele differentiatie is cruciaal voor de ontwikkelingsbiologie.
- Zuivering van specifieke celtypen helpt bij onderzoek en therapeutische toepassingen.
- Huidige methoden leveren mogelijk geen zuivere populaties van gedifferentieerde cellen op.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het zuiveren van endodermele cellen uit menselijke ES-cellen.
- Om onderzoek naar endodermele differentiatie te vergemakkelijken.
- Om de kwaliteit van downstream-toepassingen met deze cellen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bekleding van celcultuurplaten met basement membraanmatrix.
- Oogsten van menselijke ES-cellen uit culturen.
- Verwijdering van ongedifferentieerde cellen om zuivere endoderm-populaties te verkrijgen.
- Gebruik van steriele technieken gedurende de hele procedure.
Belangrijkste resultaten
- Een zuivere populatie van endodermele cellen werd met succes verkregen.
- De methode toonde effectiviteit aan bij het differentiëren van menselijke ES-cellen.
- Belangrijke vragen in stamcelonderzoek met betrekking tot endodermele differentiatie werden aangepakt.
- De techniek biedt een betrouwbare aanpak voor toekomstige studies.
Conclusies
- De zuiveringsmethode verbetert de studie van endodermele cellen.
- Het biedt een significante vooruitgang in stamcelonderzoeksmethodologieën.
- Toekomstige toepassingen kunnen regeneratieve geneeskunde en ontwikkelingsstudies omvatten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Purification of definitive endoderm cells from human embryonic stem cells addresses a critical bottleneck in differentiation workflows for regenerative medicine. Enriching CXCR4+ populations improves the fidelity of downstream differentiation toward pancreatic, hepatic, or pulmonary lineages. This method supports target validation and assay readiness by reducing lineage heterogeneity in stem cell-derived models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of endodermal commitment by isolating CXCR4+ cells co-expressing FOXA2 and SOX17.
- Operational Value: Removes pluripotent and off-lineage contaminants that confound mechanistic interpretation.
- Predictive Value: Increases confidence in target engagement studies by providing a homogeneous definitive endoderm substrate.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates a reproducible cellular substrate for compound screening in endoderm-dependent pathways.
- Operational Value: Standardizes starting material purity (>85% CXCR4+) to reduce assay variability.
- Scalability: Magnetic bead separation allows processing of 10^7 cells per run, supporting medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Purified CXCR4+ cells serve as a defined starting point for differentiation into hepatocytes, beta cells, or lung epithelial cells.
- Mechanistic De-risking: Reduces noise from residual pluripotent cells that could form teratomas in vivo.
- Predictive Confidence: Enables more accurate modeling of endoderm-derived tissue responses to drug candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits between definitive endoderm specification and lineage-specific maturation, enabling progression from discovery biology to preclinical modeling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of transcription factor networks (e.g., FOXA2/SOX17) in endoderm commitment.
- Screening: Delivers standardized, lineage-enriched cells for compound library screening in endoderm-mediated assays.
- Analytics: Facilitates qPCR and immunocytochemistry readouts with reduced background from undifferentiated cells.
- Translational Research: Bridges in vitro differentiation to preclinical validation of endoderm-derived cell therapies.
- Enterprise Reuse: Column-based magnetic separation is adaptable across multiple endoderm differentiation protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation rigor by minimizing lineage noise in differentiation models.
- Operational Value: Completes in under two hours with standard magnetic separation equipment.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by increasing predictive confidence in endoderm-dependent assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds targeting endoderm-derived disease mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture and flow cytometry for validation.
- Dependent on magnetic column systems and APC-conjugated CXCR4 antibody availability.
- Necessitates ROCK inhibitor inclusion throughout to prevent apoptosis during purification.
- Adaptable to other surface markers if alternative endoderm-specific epitopes are validated.
- Limited by starting differentiation efficiency; typically enriches from ~60% to >85% CXCR4+ cells.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:34
Human ES Cell Differentiation toward the Definitive Endoderm
2:57
CXCR4+ Definitive Endoderm (DE) Cell Immunostaining for Flow Cytometric Analysis
4:55
CXCR4+ Cell Magnetic Bead Isolation
6:34
Results: Representative Changes in Gene/Protein Expression after Human ESC into DE Differentiation
7:59
Conclusion
