Name: Het kweken van pluripotente menselijke en neurale stamcellen in een afgesloten cel Cultuur System for Basic en preklinisch onderzoek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Leer pluripotente en neurale stamcellen kweken in een afgesloten kweeksysteem met strikte controle over gasconcentraties en temperatuur. Deze methode garandeert maximale steriliteit en reproduceerbaarheid voor fundamenteel en preklinisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag aan het personeel bij Biospherix erkennen voor hun hulp bij het leren van de Xvivo ingesloten celkweek systeem, met name Matt Freeman te gebruiken; het personeel van Miles &amp; Kelley Construction Company, Inc. voor hun werk bij het opzetten van het laboratorium-infrastructuur, met name Russ Hughes; het personeel van het Children&#39;s Hospital van Orange County afdeling Faciliteiten en Support Services voor hun werk bij het coördineren van het laboratorium renovatie, vooral Adam Lukhard en Devin Hugie; het personeel van het Children&#39;s Hospital van Orange County afdeling Information Systems voor hun hulp bij het opzetten van de data management infrastructuur en toegang op afstand, met name Viet Tran; het Children&#39;s Hospital van Orange County Executive Management Team voor hun jarenlange ondersteuning van het project, in het bijzonder Dr. Maria Minon en Brent Dethlefs. Dit werk werd gefinancierd door Children&#39;s Hospital van Orange County en het California Institute for Regenerative Medicine door middel van subsidie ​​TR3-05476 te PHS. Alle auteurs eveneens bijgedragen tot dit werk.

<ol><li>Brick, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Autism+Spectrum+Disorders+Stem+Cell+Resource+at+Children%27s+Hospital+of+Orange+County%3A+Implications+for+Disease+Modeling+and+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.Med%22%5BJournal%5D)">The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery.</a> Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).</li>
<li>Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+by+lentiviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction.</a> Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).</li>
<li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+HIF1alpha+repress+the+differentiative+effects+of+BMPs+in+high-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma.</a> Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).</li>
<li>Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+tension+controls+the+expansion+of+human+CNS+precursors+and+the+generation+of+astrocytes+and+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes.</a> Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).</li>
<li>Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+non-viable+airborne+particles+correlates+with+airborne+colonies+and+represents+an+acceptable+surrogate+for+daily+assessment+of+cell-processing+cleanroom+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance.</a> Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).</li>
<li>Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+stem+cell+therapies+for+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.Rev.Neurother%22%5BJournal%5D)">The potential of stem cell therapies for neurological diseases.</a> Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapies+for+the+lysosomal+storage+diseases+-+the+quintessential+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Stem+Cell+Res.Ther%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases.</a> Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).</li>
<li>Stover, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process-based+expansion+and+neural+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+for+transplantation+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.Res%22%5BJournal%5D)">Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling.</a> J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).</li>
<li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).</li>
<li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Cellen gekweekt binnen de CPF zie geen veranderingen in zuurstof of kooldioxide-concentraties als ze van incubator aan de verwerking van kamer naar kamer microscoop en terug. Het is essentieel dat de omstandigheden in elke kamer zijn aangepast aan de specifieke incubator waarin de cellen worden gehouden voordat de cellen uit de incubator verwijderd. De lucht binnen de inrichting continu HEPA-gefiltreerd en is aanpasbaar met betrekking tot zuurstof en kooldioxide concentraties. Cellen kunnen worden gekweekt bij standaardconcentraties voor PSC of NSC, 5% en 9%, respectievelijk; of andere concentraties kunnen worden gekozen voor verschillende celtypen of voor specifieke experimenten. Aldus is de inrichting voorzien van een constante bron van medische kwaliteit zuurstof, kooldioxide en stikstof (figuur 4). Alle drie van deze gassen worden door gas-specifieke spruitstukken die de constante levering garanderen. De inrichting is tevens voorzien van een ijkgas mengsel bestaande uit10% (± 0,01%) kooldioxide in zuurstof. De manifold systemen bevinden zich buiten de cel productie-installatie en de gassen worden doorgesluisd naar de faciliteit door het plafond. De kalibratie gas is ondergebracht binnen de faciliteit. De inrichting is bovendien voorzien huisvacuüm, ook door het plafond. Met behulp van een elektronisch bewakingssysteem en draadloze eenheden verzenden, worden de output druk van alle spruitstukken voortdurend bewaakt. In het geval dat enige druk valt buiten het bereik, zijn de cel productiefaciliteit operators automatisch gebeld en een dergelijke melding dat passende maatregelen kunnen worden genomen. De kracht eisen van het apparaat wordt voldaan door zes dedicated 120 V circuits afdalen van het plafond en verbonden met back-up generatoren van het ziekenhuis om een ​​constante aanvoer te verzekeren. De werking van het apparaat wordt geregeld via software op een pc-computer wordt aangedreven door middel van een noodvoeding. Deze kracht en computer regelingenzorgen dat het systeem functioneert onophoudelijk zelfs bij een openbare stroom systeemfout. De software besturen van de inrichting een gebruikersvriendelijke grafische interface (figuur 1) die zorgt voor de besturing van zuurstof en kooldioxide concentratie en temperatuur, vochtigheid en kamerdruk. De waarden van deze parameters worden continu geregistreerd op een doorlopend verslag van alle apparatuur parameters. Deze data back-up naar een externe server elke nacht om hun integriteit te beschermen. De computer en de software kan op afstand worden benaderd door administratieve gebruikers in staat om te beoordelen en / of te wijzigen parameter. Bovendien kan de computer en software afstand toegankelijk, waardoor interactieve parameters van apparaten en probleemoplossing lokale gebruikers. Een extra verzendende eenheid alarm is aangesloten op het apparaat zoals die cel productiefaciliteit exploitanten in kennis worden gesteld van een out-of-range toestand van het apparaat. De toegang op afstand capabilities laten inloggen en de beoordeling van de specifieke kenmerken van de out-of-range conditie. De inrichting is ontworpen als een modulair systeem zowel macro- en micro zin. Individuele celkweek modules, zoals incubatoren en behandelingskamers, kan worden aangepast met betrekking tot hun afmetingen en eisen en in hun indeling ten opzichte van elkaar. Bovendien, de meeste van de functies van de afzonderlijke modules zelf modulair zodat individuele atmosferische gas controllers, bijvoorbeeld, kan gemakkelijk worden vervangen zonder significante verstoring van het systeem. Gespecialiseerde behandelingskamers, zoals een voor microscopische visualisatie en manipulatie van celkweken, worden gemakkelijk aangepast aan het systeem. Zowel fase-contrast en fluorescentie microscoop in het systeem (figuur 6), zodat de cellen levend kan worden gekleurd, en kolonies kunnen op dezelfde atmosferische omstandigheden worden ontleed als in thij incubators. Routeren van kabels door afgedichte dichtingsringen in de zijwanden van de bewerkingskamer laat apparatuur zoals voedingen en computers buiten de inrichting worden gehouden, gewoonlijk op een kar (figuur 6). De behandelingskamers in de cel productiefaciliteit heeft een ander patroon dan conventionele luchtstroom BSC. In conventionele BSC, de luchtstroom naar beneden stroomt vanuit een centrale uitlaat en splitst in twee aparte stromen, die vervolgens door twee verschillende luchtinlaten zijn genomen in het voorste en achterste gedeelte van de vloer van het kabinet. Daarentegen heeft de CPF een enkele opening in het voorste gedeelte van het plafond. Lucht naar beneden stroomt en naar de achterkant van de kamer, waar het dan omhoog in een luchtinlaatopening getekend. Hoewel de CPF inherent zeer schoon, unieke luchtstroom patroon betekent dat technici hun techniek om het risico op verontreiniging te verminderen enigszins aanpassen. Net als bij een conventionele BSC, een laboratoriumarbeider should Vermijd het plaatsen van hun handen stroomopwaarts open celkweek platen en media flessen. Echter, de richting die stroomopwaarts is veranderd in de CPF De cel productiefaciliteit laboratorium zelf is vrij standaard en is uitgerust met een -20 ° C vriezer, een -80 ° C vriezer, een 4 ° C koelkast, een centrifuge en een waterbad. Het laboratorium heeft ook een wastafel met voet controles voor gemakkelijk hands-free bediening. Om dit laboratorium een ​​functionele klinische cel productiefaciliteit worden echter verschillende andere wijzigingen moeten blijven mogelijk. Ten eerste moet de inrichting zelf worden opgewaardeerd tot het vermogen om vluchtige organische stoffen, deeltjes en concentraties van chloordioxide dat wordt gebruikt voor decontaminatie gaten te houden. Ten tweede kan een bewerkingskamer met een FACS-machine worden gehuisvest en verbonden met de rest van de inrichting via een buffer module. Dit zal zorgen voor celsortering en zuivering van transplantable celpopulaties onder de juiste omstandigheden. Ten slotte moet de gehele inrichting worden opgenomen binnen een zachte wand clean room. Dit zorgt voor een International Organization for Standardization (ISO) klasse 8 omgeving voor het apparaat 5. De hoge steriliteit en computergestuurde karakter van het CPF maakt het een ideaal systeem voor toekomstige toepassingen met cellen gebaseerde therapie en goede productieprocessen. Het risico op besmetting is sterk afgezwakt, maar nog belangrijker, zijn de voorwaarden van de cel expansie automatisch geregistreerd en gearchiveerd door het computersysteem. Afwijkingen in gasconcentraties, temperatuur, vochtigheid, en alle gebeurtenissen van de toegang tot het systeem worden streng gedocumenteerd. Dit kan enorm helpen bij het onderzoeken van problemen met de productkwaliteit. Er zijn echter nog steeds beperkingen. Het gebruik van elke en alle reagentia en benodigdheden (bv media componenten, pipetten, platen) moet afzonderlijk worden gedocumenteerd. Toevoegenitionally, er een veelheid van mogelijke problemen (waaronder veel vormen van menselijke fout) die kan ontstaan ​​die niets met de variabelen gedocumenteerd door de CPF toezichtsysteem zijn. Dus de noodzaak van hoog opgeleid personeel en uitgebreide handmatige documentatie van taken blijft bestaan.

Standaard stamcelkweektechnieken lijden aan verschillende omgevingsbeperkingen die onnodige stress op de cellen uitoefenen en de cellen blootstellen aan onaanvaardbare risico's op besmetting. Tot de stress die cellen onder standaard celkweekcondities kunnen ondergaan, behoren plotselinge veranderingen in de niveaus van kooldioxide en zuurstofconcentraties3,4. Dit gebeurt wanneer de cellen van de incubator naar de bioveiligheidskast en/of microscoop worden verplaatst, wat mogelijk niet optimaal is voor de cellen. Eerdere studies hebben de voordelen bevestigd van het kweken van zowel pluripotente als neurale stamcellen onder hypoxische omstandigheden4,11, en voor de beste resultaten moeten deze omstandigheden continu zijn. Bovendien zijn de risico's op cellulaire besmetting hoger aangezien de laboratoriumomgeving en het personeel bij bijna elke stap van hun kweek en manipulatie de cellen beïnvloeden. Traditionele schone ruimtes vormen een effectieve methode om de besmettingsrisico's aanzienlijk te verminderen, maar ze zijn duur, hebben een grote voetafdruk en pakken de stressfactoren met betrekking tot kooldioxide en zuurstofconcentraties niet aan. 
Een celproductiefaciliteit die zowel besmettingsrisico's als gasconcentraties kan aanpakken en die gekwalificeerd kan worden om aan cGMP-criteria9 te voldoen, levert hoge kwaliteit cellen voor zowel fundamenteel wetenschappelijk onderzoek als klinische toepassingen1,6,7. Een dergelijke celproductiefaciliteit bestaat minimaal uit de volgende componenten: een proceskamer, die dient als verwarmde werkruimte voor het voeren en manipuleren van celculturen; een laminaire stroomkap, voor de initiële sterilisatie van reagentia, buisjes en gereedschappen; twee bufferluchtsluiskamers tussen de kap en de proceskamer; twee celkweekincubatoren die toegankelijk zijn vanuit de proceskamer; een microscoopkamer naast de proceskamer; en ten slotte computersoftware om de omstandigheden binnen deze modules in te stellen en te bewaken. Met behulp van deze basisinfrastructuur kan een breed scala aan taken worden uitgevoerd, zoals standaard voeding en passage van pluripotente stamcellen en multipotente neurale stamcellen, evenals meer gespecialiseerde methoden zoals Sendai-virusgebaseerde herprogrammering, in vitro migratiestudies en differentiatie van neurale stamcellen voor elektrofysiologische karakterisering.

<table><tbody><tr><td>Uitrusting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xvivo Systeem</td><td>Biospherix</td><td>op maat gemaakt</td><td></td></tr><tr><td>Xvivo Software</td><td>Biospherix</td><td>versie i.o.2.1.2.1</td><td></td></tr><tr><td>O2 Manifold</td><td>Amico</td><td>P-M2H-C3-S-U-OXY</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Manifold</td><td>Amico</td><td>M2H-C3-D-U-CO2</td><td></td></tr><tr><td>N2 Manifold</td><td>Western Innovator</td><td>CTM75-7-2-2-BM</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop met DP21 camera en fluorescentie</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>StemPro hESC Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>A100006-01</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferd Natrium</td><td>Hyclone</td><td>9236</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Groei Factor 2</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AFL233</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfaat</td><td>Protide</td><td>PP1130</td><td></td></tr><tr><td>Hank's-based Celdissociatie Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Epidermale Groei Factor</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AFL236</td><td></td></tr><tr><td>Oct-3/4 Antilichaam</td><td>Millipore</td><td>AB3209</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Antilichaam</td><td>Millipore</td><td>MAB4260</td><td></td></tr><tr><td>SSEA4 Antilichaam</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>BIT-9500 Serum Supplement</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9500</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Consumptieve Benodigdheden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml Serologische pipet</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Serologische pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-102</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Serologische pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Serologische pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-106</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Serologische pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-107</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>T25 fles</td><td>TPP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>T-75 fles</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro;l pipet tips</td><td>Eppendorf</td><td>22491130</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;l pipet tips</td><td>Eppendorf</td><td>22491148</td><td></td></tr><tr><td>1.000 pipet tips</td><td>Eppendorf</td><td>22491156</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Thermo Scientific</td><td>5000.102</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>BDH</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Sanimaster 4</td><td>Ecolab</td><td>65332960</td><td></td></tr><tr><td>Bleekmiddel</td><td>Clorox</td><td>A714239</td><td></td></tr></tbody></table>

het kweken van pluripotente menselijke en neurale stamcellen in een afgesloten cel cultuur system for basic en preklinisch onderzoek

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Dit artikel beschrijft hoe een op maat gemaakt, commercieel verkrijgbaar gesloten celkweeksysteem kan worden gebruikt voor fundamenteel en preklinisch onderzoek. Biosafety cabinets (BSC's) en incubators zijn lange tijd de standaard geweest voor het kweken en vermeerderen van cellijnen voor fundamenteel en preklinisch onderzoek. Maar naarmate de focus van veel stamcellaboratoria verschuift van fundamenteel onderzoek naar klinische toepassing, zijn er aanvullende vereisten voor het celkweeksysteem. Alle processen moeten goed gedocumenteerd zijn en uitzonderlijke eisen stellen aan steriliteit en reproduceerbaarheid. In traditionele incubators fluctueren gasconcentraties en temperaturen sterk wanneer de cellen worden verwijderd voor voeding, passagering of andere manipulaties. Dergelijke onderbrekingen dragen bij aan een omgeving die niet voldoet aan de normen voor cGMP en GLP. Deze onderbrekingen moeten worden geminimaliseerd, vooral wanneer cellen voor therapeutische doeleinden worden gebruikt. De motivatie om over te stappen van het standaard BSC- en incubatorsysteem naar een gesloten systeem is dat dergelijke onderbrekingen kunnen worden geminimaliseerd. Gesloten systemen bieden een werkruimte om celculturen te voeden en te manipuleren en ze te onderhouden in een gecontroleerde omgeving waar temperatuur en gasconcentraties consistent zijn. Op deze manier kunnen pluripotente en multipotente stamcellen vanaf het moment van hun afkomst tot aan hun uiteindelijke gebruik in therapie in optimale gezondheid worden gehouden.

Dit manuscript beschrijft in detail een cel productiefaciliteit, en de unieke aspecten van het kweken van cellen in een gesloten systeem. Het grootste deel van de cel productiefaciliteit omvat een op maat gemaakte, gesloten, celcultuur inrichting die weinig ruimte nodig heeft en kunnen eenvoudig worden ondergebracht in een 6 x 7,5 m 2 kamer (figuur 2). Op geen enkel moment zijn de cellen in het apparaat blootgesteld aan laboratorium personeel of omgeving. Het apparaat bestaat uit meerdere modules: een proceskamer, een laminaire stroming kap, 2 buffering luchtsluis kamers tussen de kap en de proceskamer twee celcultuur incubators, en een microscoop kamer naast de proceskamer (figuur 3). Het systeem wordt bestuurd door software waarmee omgevingsvariabelen worden gecontroleerd en gevolgd (figuur 1). De computer waarop deze software is op een noodvoeding. Gassen worden ingevoerd in the systeem een reeks verdeelstukken voor zuurstof, stikstof en kooldioxide (figuur 4). Gassen voor het apparaat worden geleverd door spruitstuk systemen die twee sets van de tanks hebben elk - een actieve set en een reserve set. Wanneer de actieve set naar beneden wordt getrokken, schakelt het spruitstuk automatisch over naar de ingestelde reserve en het personeel orde vervanging tanks. Het vermogen is op een back-up generator systeem. Pluripotent en neurale stamcellen kunnen worden gekweekt in hypoxische omstandigheden in deze faciliteit gebruik eerder ontwikkelde protocollen 9, waarbij de extra complicaties die inherent zijn aan de nieuwe apparatuur. Pluripotente stamcellen kunnen worden afgeleid met Sendaivirus met behulp pluripotentie specifieke antilichamen volledig getransfecteerde kolonies, die vervolgens worden geïsoleerd en geëxpandeerd identificeren. (Figuur 5A en B) Uit deze iPSCs, neurale stamcellen en neuronen kunnen worden afgeleid met dubbele SMAD inhibitie en hun fenotype geverifieerd usi<html> ng NSC-specifieke antilichamen (Figuur 5C en D). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig1.jpg" /> Figuur 1. Grafische interface voor de Cell Production Facility. (A) De grafische weergave van de CPF is het standaard scherm en past de CAD-tekening in figuur 3. Een klik van de muis over de Buffer Module 1 (2F in figuur 1) opent zijn bedieningsscherm (B), waarin O 2 waarden worden ingesteld op de bewerkingskamer overeenkomen (3 in figuur 3). Evenzo klikken op de proceskamer of Incubator 1 brengt hun regelschermen (C en D respectievelijk), waarbij waarden worden gewijzigd of gecontroleerd zoals dat.<html> rGebruik = &quot;_ blank&quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig2.jpg" /> Figuur 2. De Cell Production Facility. (A) Het systeem blijkt uit een front rechts uitzicht. Let op de kracht en de gasaansluitingen in het plafond en de kar met de microscoop accessoires en computer aan de rechterkant. (B) De laminaire stroming kap met de toegangspanelen buffermodules gezien rechts. (C) Het proces kamer met de twee incubators (zwarte deuren) gezien op de achterzijde. (D) Een mening door de rechterkant van het systeem met de microscoop en monitor met de deuren naar de buffer kamers gezien in de verte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> t &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig3.jpg" /> Figuur 3. Een CAD-tekening van het Cell productiefaciliteit. Alle punten in het toestel eerst schoongeveegd met alcohol en lucht in de laminaire stroming kap gedroogd (1). Items worden dan overgebracht naar de passende sfeer in het voorste buffer module (2F) alvorens te worden doorgegeven aan de UCPC module of behandelingskamer (3). Cellen worden gekweekt in de twee incubatoren (4, 5). Live cell kleuring, kolonie plukken, de beoordeling van de algemene cellulaire morfologie en migratie analyse vindt plaats in de UPC-module, of Microscope Kamer (6). Ten slotte, afval verlaat het systeem via de achterste buffer module (2R). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.</a> &lt;<html> / P&gt; <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig4.jpg" /> Figuur 4. Bronnen van gassen en adapter. (A) Het CO 2 spruitstuk een 4 x 4 opstelling zoals levert alle incubators van het laboratorium. (B) De O 2 spruitstuk is een 2 x 2 opstelling en levert alleen de cel productiefaciliteit. Stikstof het systeem wordt opgewekt in een verdamper (C, net onder het teken van de uitgang) bevestigd aan een vloeibare stikstof verdeelstuk (naar rechts) die vult ook automatisch cryofreezers (linksonder). Het verdeelstuk is een 2 x 2 opstelling wordt geleverd door twee paar 160 L vloeibare stikstof tanks. CO2, O2 en N2 worden vanuit het plafond tot tijdens onderbrekingen (D). Huisvacuüm wordt ook geleverd op deze locatie. Gezien net achter de gasvoorziening tijdens onderbrekingen zijn een paar van stroomkabels die stroom te leveren aan het systeem.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig5.jpg" /> Figuur 5. pluripotente stamcellen Afgeleid in hypoxie met Sendai-virus. (A) SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs iPSCs (nomenclatuur gevonden in Stover et al. 9), fase contrast 10X. (B) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs live gekleurd met AF-594-gelabelde Tra-1-60, 1: 100 verdunning in de media. Alle iPSCs werden getransduceerd in de cel productiefaciliteit in 5% O 2 met Sendai-virus. (C) Fase contrast van SC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6 iPSC-afgeleide NSCs, geteeld op 5% O 2 in de kamer dia&#39;s. Cellen werden vervolgens gefixeerd in 4% paraformaldehyde en gekleurd met anti-humaan Nestin primair antilichaam en Alex-488 secundair antilichaam. Alle schaal bars liggen op 1001; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Hier is een protocol om pluripotente stamcellen (PSC) en neurale stamcellen (NSC) te kweken in een gesloten celkweeksysteem dat maximale steriliteit en reproduceerbaarheid mogelijk maakt, waardoor de traditionele bioveiligheidskast en incubator worden vervangen. Deze apparatuur voldoet aan de richtlijnen voor goede klinische fabricagepraktijken (cGMP) en goede laboratoriumpraktijken (cGLP).

Het kweken van pluripotente menselijke en neurale stamcellen in een afgesloten cel Cultuur System for Basic en preklinisch onderzoek

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Het algemene doel van het gebruik van deze apparatuur is om stamcellen te kweken onder gedefinieerde atmosferische omstandigheden met maximale steriliteit. Wat we vandaag gaan demonstreren, is het gebruik van een afgesloten celkweekfaciliteit die een uiterst precieze controle over de celkweekparameters mogelijk maakt. In ons laboratorium gebruiken we deze faciliteit voor de kweek van multipotente stamcellen en pluripotente stamcellen.Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat de cellen worden blootgesteld aan een constante omgeving, ongeacht waar ze zich bevinden tijdens de verwerking. Of ze nu worden gemanipuleerd, in de incubator verblijven of onder de microscoop liggen, de blootstelling aan zuurstof, CO2 en de temperatuur blijft gedurende de hele cyclus constant. De procedure zal worden gedemonstreerd door Alexander Stover, een staff scientist in mijn laboratorium.Om deze procedure te starten, klikt u op een module om de gasconcentratie aan te passen. Klik in het nieuwe venster met de huidige instellingen op de bestaande ingestelde zuurstofwaarde onder Setpoint en voer de gewenste zuurstofconcentratie voor deze module in. Klik vervolgens op het groene vinkje om het setpoint te bevestigen.Herhaal deze stap voor koolstofdioxide en voer een ingestelde waarde van 5% koolstofdioxide in voor alle modules, behalve voor de bufferkamers, die alleen voor zuurstof instelbaar zijn. Controleer vervolgens de huidige gasconcentraties, aangeduid als proceswaarden, om er zeker van te zijn dat deze de nieuwe ingestelde waarden bereiken. Pas daarna de gasinstellingen van alle modules aan naar de juiste waarden.Zorg dat de koolstofdioxide- en zuurstofgehaltes van de kamers die aan elkaar worden blootgesteld, overeenkomen. Pas bijvoorbeeld de proceskamer aan naar 5% zuurstof voordat een incubator wordt geopend waarin cellen bij 5% zuurstof worden gekweekt. Pas ook de bufferkamer, die wordt gebruikt om items aan de proceskamer toe te voegen, aan naar 5% zuurstof.Stel vervolgens de temperatuur van de proceskamer in op 37 °C met behulp van hetzelfde scherm voor gasinstellingen. Stel daarna de vloertemperatuur van de proceskamer in op 37 °C. Klik op de incubatiemodulebanken onder elke incubator en stel de temperatuur van de banken in op 37 °C.Besproei in de laminaire flowkast alle materialen die in het systeem worden geplaatst met 70% ethanol en laat ze drogen. Veeg alle kolven of celplaten voorzichtig af met een steriel gaasje verzadigd met 70% ethanol. Zorg vervolgens dat zowel de buiten- als de binnendeur van de bufferkamer stevig gesloten zijn, open dan de buitendeur en plaats de items binnenin voordat u deze weer sluit.Select met de software de buffermodule en klik op het tabblad Verdunningsfactor. Voer een 1 in het vak Log Factor in en klik vervolgens op start. Zodra de grafische interface stopt met het knipperen van Verdunningsfactor, open dan de binnendeur van de bufferkamer en breng de materialen over naar de proceskamer.Om items uit de proceskamer te verwijderen, moet eerst worden vastgesteld dat de bufferkamer een verdunningsfactor heeft ondergaan. Open vervolgens de binnendeur, plaats de te verwijderen items binnenin en sluit de deur. Open daarna de buitendeur en verwijder de items.Plaats drie petrischalen in de waterbak aan de onderzijde van elke incubator. Vul deze schalen met steriel water en handhaaf het waterniveau in deze schalen, aangezien deze essentieel zijn voor het behoud van de ingestelde relatieve luchtvochtigheid in de incubator. Klik in de grafische interface op incubator.Klik vervolgens op de bestaande waarde voor de relatieve vochtigheid onder het ingestelde punt en voer 85% in. Klik daarna op het groene vinkje om deze waarde te accepteren. Stel vervolgens de bufferkamers, de proceskamer en een incubator in op de gaswaarden die vereist zijn voor het type cellen dat wordt geïntroduceerd. Reinig het oppervlak van de proceskamer met steriel gaas en een niet-ontvlambaar desinfectiemiddel, zoals een product op basis van benzalkoniumchloride.Reinig vervolgens de handschoenen en oppervlakken die veelvuldig worden aangeraakt, zoals deurklinken. Maak daarna het oppervlak van de laminaire flowkast en de bufferkamer schoon met 70% ethanol en laat dit drogen. Plaats vervolgens de kolf of het plaatje met cellen in de kast en veeg het buitenste oppervlak kort af met een steriel gaasje verzadigd met ethanol.Plaats vervolgens de kolf of plaat in de bufferkamer en voer een verdunningsfactor uit. Verplaats de kolf of plaat na voltooiing onmiddellijk naar de juiste incubator. Omdat de incubator zich achterin de proceskamer bevindt, trekt u een plank in de proceskamer voor het plaatsen van de cellen en vermijdt u het onnodig lang openhouden van de incubatordeuren.Bereid in deze stap het celcultuurmedium voor. Laat het medium equilibreren met de koolstofdioxide- en zuurstofniveaus in het systeem door de mediumcontainer gedurende 20 minuten enigszins open te laten staan. Verwijder daarna het oude medium uit de wells.Verwijder bij pluripotente stamcellen bijna al het oude medium, waarbij een kleine hoeveelheid van het oude medium achterblijft om uitdroging tijdens het voedingsproces te voorkomen. Verwijder bij neurale stamcellen de helft van het oude medium. Voeg vervolgens vers medium toe aan de celkweekplaten en plaats de platen terug in de daarvoor bestemde incubator.Hier is een afbeelding van de iPSCs te zien. Hier zijn de iPSCs levend gekleurd met AF594-gelabelde Trial 160 in een verdunning van 1:100 in medium. Alle iPSCs zijn getransduceerd in de celproductiefaciliteit in 5% oxygen met Sendai-virus.En hier is de fasecontrastopname van uit iPSC afgeleide neurale stamcellen die zijn gekweekt bij 5% oxygen in kamerslides. De cellen zijn vervolgens gefixeerd in 4% paraformaldehyde en gekleurd met Anti-Human Nestin primair antilichaam en Alexa Fluor 488 secundair antilichaam. Zodra men hierin ervaren is, kan deze reeks technieken in twee uur worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken de gasconcentraties correct in te stellen voordat u begint. Na de procedure kunnen andere methoden, zoals herprogrammering en differentiatie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het effect van hypoxie op pluripotentie of multipotentie. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de stamcelbiologie om klinische celproductie te onderzoeken voor de behandeling van pediatrische neurodegeneratieve aandoeningen.

culturing-human-pluripotent-neural-stem-cells-an-enclosed-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

De mogelijkheid om menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs) te manipuleren in vitro het mogelijk maakt om hun bruikbaarheid te onderzoeken als cel transplantatie voor therapeutische doeleinden en voor de menselijke ontwikkeling van het zenuwstelsel te verkennen. Dit protocol bevat een methode voor het kweken en de passage hNSPCs in de hoop van de toenemende reproduceerbaarheid van het menselijk stamcelonderzoek.

Passage menselijke neurale stamcellen

Een eenvoudige en betrouwbare methode op isolatie en de cultuur van neurale stamcellen uit afgedankte menselijke foetale corticale weefsel wordt beschreven. Culturen zijn afgeleid van bekende menselijke neurologische aandoeningen kunnen worden gebruikt voor de karakterisering van pathologische cellulaire en moleculaire processen, maar ook als een platform om de farmacologische werkzaamheid beoordelen.

Generatie van neurale stamcellen uit afgedankte menselijke foetale Cortical weefsel

The video outlines the procedure for maintaining a controlled environment in a cell culture workstation for the growth and maintenance of neuronal stem cells. These procedures involve setting chamber conditions, cleaning protocols, and media preparation, Thus, maintaining maximum sterility and reproducibility and replacing the traditional methods.

Handling Neuronal Stem Cell Cultures in a Cell Production Facility

Hier presenteren we protocollen voor de cultuur van humane pluripotente stamcellen (hPSC), gebaseerd op het groeien van gedissocieerde enkele cellen in een niet-kolonietype monolaag (NCM). Deze nieuwe methode, die gebruik maakt van Rho-geassocieerde kinase remmers of de laminine isovorm 521 (LN-521), is geschikt voor het produceren van grote hoeveelheden homogene hPSC's, genetische manipulatie en geneesmiddelontdekking.

Alternatieve Cultures for Human pluripotente stamcellen zijn Productie, Onderhoud, en genetische analyses

Dit protocol biedt een eenvoudige en efficiënte manier om humane pluripotente stamcellen (hPSC's) te propageren met behulp van alleen geconditioneerd medium afgeleid van de menselijke placenta in een met gelatine beklede schaal zonder aanvullende exogene suppletie of hPSC-specifieke synthetische substraten.

A Novel Cultuur Model for Human Pluripotent Stem Cell Voortplanting op gelatine in Placenta-geconditioneerde Media

In dit protocol, wij streven ernaar om te beschrijven een reproduceerbare methode voor combineren losgekoppeld menselijke pluripotente stamcel afgeleid neuronen en astrocyten samen in 3D bol cocultures, behoud van deze gebieden vrij zwevende voorwaarden, en daarna het meten van synaptic circuit activiteit van de bollen met immunoanalysis en multielectrode serie opnamen.

Synaptische Microcircuit Modeling met 3D Cocultures van astrocyten en neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

Hier gepresenteerd is een protocol voor het genereren van een eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen en hun daaropvolgende differentiatie in neurale voorlopercellen. Het protocol is eenvoudig, robuust, schaalbaar en geschikt voor geneesmiddelen screening en toepassingen voor regeneratieve geneeskunde.

Efficiënte Neurale differentiatie met behulp van eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen

We tonen de automatisering van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcelculturen (hiPSC) culturen en neuronale differentiaties die compatibel zijn met geautomatiseerde beeldvorming en analyse.

Geautomatiseerde productie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide corticale en dopaminerge neuronen met geïntegreerde live-cel monitoring

Dit artikel beschrijft een protocol voor het genereren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen in een benchtop 3D-suspensie bioreactor.

Productie van menselijke neurogenine 2-induceerbare neuronen in een driedimensionale suspensie bioreactor

Dit protocol presenteert een unieke manier om celculturen van het centrale zenuwstelsel te genereren uit embryonale dag 17 muizenhersenen voor neuro(immuno)logisch onderzoek. Dit model kan worden geanalyseerd met behulp van verschillende experimentele technieken, waaronder RT-qPCR, microscopie, ELISA en flowcytometrie.

Het opzetten van gemengde neuronale en gliale celculturen van embryonale muizenhersenen om infectie en aangeboren immuniteit te bestuderen

Hier presenteren we een protocol voor een geautomatiseerd celkweeksysteem. Dit geautomatiseerde kweeksysteem vermindert arbeid en komt ten goede aan de gebruikers, waaronder onderzoekers die niet bekend zijn met het hanteren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS), van het onderhoud van iPS-cellen tot differentiatie in verschillende soorten cellen.

Een geautomatiseerd kweeksysteem voor het onderhouden en differentiëren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Leer pluripotente en neurale stamcellen kweken in een afgesloten kweeksysteem met strikte controle over gasconcentraties en temperatuur. Deze methode garandeert maximale steriliteit en reproduceerbaarheid voor fundamenteel en preklinisch onderzoek.

Het kweken van pluripotente menselijke en neurale stamcellen in een afgesloten cel Cultuur System for Basic en preklinisch onderzoek (Video) | JoVE Journal

Het kweken van pluripotente menselijke en neurale stamcellen in een afgesloten cel Cultuur System for Basic en preklinisch onderzoek

Meer video's verkennen