Name: Sequencing van Plant Muur Heteroxylans Met behulp van Enzymatische, Chemical (Methylering) en fysieke (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Technieken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Ontdek de structuurkarakterisering van heteroxylanen in plantencelwanden door enzymatische hydrolyse en 2-aminobenzamide-labeling. Deze methode combineert massaspectrometrie en NMR voor gedetailleerde glycaansequentiebepaling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd ondersteund door fondsen van het Commonwealth Scientific and Research Organisation Flagship Collaborative Research Program, verstrekt aan de High Fibre Grains Cluster via de Food Futures Flagship. AB erkent ook de steun van een Australia Research Council (ARC)-subsidie aan het ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls (CE110001007).

1. Bij de etikettering van het reducerende einde (RE) Sugar Residu van W-sol AXs met 2-aminobenzamide (2AB) <ol><li> Incubeer W-sol AXs met 2AB (0,2 M) in aanwezigheid van 1 M NaBH3CN (natriumcyaanboorhydride) (pH 5,5) gedurende 2 uur bij 65 ° C aan de reducerende uiteinden van de polysaccharide backbone ketens zetten hun fluorescerende derivaten. VOORZICHTIG: De volgende stap moet worden uitgevoerd in de zuurkast zoals NaBH3CN releases giftige cyanide gas wanneer het in contact met water. <ol><li> Weeg NaBH3CN (62,8 mg) en los op in water (1 ml) in een microcentrifugebuis (1,5 ml) aan een 1 M NaBH3CN te bereiden. Ontbinden 2AB reagens (27,2 mg) in 1 M NaBH3CN oplossing (1 ml) door verwarming bij 65 &#160; ° C en de pH van het reactiemengsel (0,2 M 2AB, 1 M NaBH3CN) tot pH 5,5 met 10% azijnzuur. </li><li> Voeg 200 pl reactiemengsel (0,2 M 2AB, 1 M NaBH3CN) W-sol AXs (1 mg) in een glazen buis met een pet en meng met behulp van een vortex mixer. Incubeer gedurende 2 uur bij 65 &#160; ° C in een zuurkast. Koel de suspensie tot kamertemperatuur en voeg 4 vols. absolute ethanol. </li><li> Plaats de suspensie in een koelcel (4 ° C) O / N polysacchariden precipiteren. </li><li> Centrifuge (1500 x g, 10 min, RT) naar supernatant te verwijderen. Was de pellet uitgebreid met absolute ethanol (4x), aceton (1x) en methanol (1x), gecentrifugeerd tussen elke wassing. Vacuüm droog bij 40 ° CO / N. Opmerking: Uitgebreide wassen verwijdert ook de resterende 2AB. </li></ol></li></ol> 2. Genereren van Xylo-oligosacchariden van 2 AB gelabelde W-sol AXs <ol><li> Ontbinden 2AB gemerkte W-sol AXs (1 mg) in 500 pl natriumacetaat buffer (100 mM, pH 5) in een microcentrifugebuis (1,5 ml). Voeg 4 eenheden van endoxylanase (GH 11, [M1]) en incubeer bij 37 &#160; ° C gedurende 16 uur. </li><li> Vernietigen enzymactiviteit door verhitting van het reactiemengsel mixture gedurende 10 min in een bad met kokend water. Koel de suspensie tot kamertemperatuur en overbrengen naar glazen buis met een kap. Voeg 4 vols. absolute ethanol en zet de suspensie in een koelcel (4 ° C) O / N één onverteerd polysachariden precipiteren. </li><li> Centrifuge (1500 x g, 10 min, RT) onverteerd polysachariden (pellet) scheiden en endoxylanase gegenereerd xylo-oligosachariden (supernatant). Giet supernatant in een schone glazen buis en plaats deze in een warm water bad (40 ° C). </li><li> Damp het ethanol onder een stroom stikstofgas om een ​​eindpunt volume (~ 500 pi). Bevries de supernatans bij -80 ° C gedurende 4 uur en droog de bevroren supernatant in een vriesdroger te xylo-oligosacchariden herstellen. </li></ol> 3. Productie van Xylo-oligosacchariden van KOH-sol AXs en 2AB Labelling <ol><li> Behandel KOH-sol AXs met endoxylanase (GH 11, [M1]) om xylo-oligosacchariden te genereren, zoals hierboven (paragrafen 2.1-2.4) beschreven. </li><li> Behandel endoxylanase gegenereerd xylo-oligosachariden van KOH-sol AXs met 2AB reactiemengsel (0,2 M 2AB, 1 M NaBH3CN) zoals hierboven (paragrafen 1.1.1-1.1.2) beschreven. </li><li> Giet supernatant in een schone glazen buis en plaats deze in een warm water bad (40 ° C). Damp het ethanol onder een stroom stikstofgas om een ​​eindpunt volume (~ 500 pi). Bevries de supernatans bij -80 ° C gedurende 4 uur en droog de bevroren supernatant in een vriesdroger te xylo-oligosacchariden herstellen. </li></ol> 4. MALDI-TOF-MS <ol><li> Bereiding van MALDI-matrix oplossing <ol><li> Voeg een klein bolletje 2, 5-dihydroxbenzoic acid (DHB) tot 50% acetonitril (500 ml) dat 0,1% mierenzuur in een buis (MALDI-matrix oplossing). Meng met behulp van een vortex, als het snel oplost, voeg een ander klein bolletje DHB. Noot: Ideale concentratie van MALDI-matrix oplossing 10 ug / ul -1. </li></ol></li><li> Bereiding van MALDI-target Plate <ol><li> Stort de aqueoons oligosaccharide (native) monsters (5-10 ug) (W-sol en / of KOH-sol) op een MALDI-target plaat. Voeg 0,3 gl MALDI-matrix oplossing wordt met een apart puntje en meng door en neer te pipetteren. Laat het mengsel bij kamertemperatuur drogen. Opmerking: Goed gedroogde monsters moeten bestaan ​​uit lange naaldvormige kristallen wijst naar het midden van de vlek. Als de aanbetaling is kleverig en / of morsig het monster kan ofwel te worden geconcentreerd of bestaan ​​uit zouten, zoals deposito&#39;s zijn waarschijnlijk niet goed spectra te produceren en het monster moet verder worden gezuiverd. </li><li> Introduceer het doel plaat in de MS bron en werken in positieve (+ ive) ion-modus. Gas terugnemen spanning tot 19,0 kV bij ionenbron 1 en 16,3 kV bij ionenbron 2. Stel het laservermogen tot meer dan 70%. Selecteer het monster plek op de MALDI-target bord en klik op Start om laserpulsen te beginnen. Let op: Alle ruimtes van het doel zal geen signalen opleveren. Een bepaalde plaats slechts een signaal voor een paar laserpulsen gevolg van hetzijuitputting van het monster / matrix mengsel of kenmerken van het kristal. <ol><li> Verplaats de laser naar verschillende gebieden van het doel tijdens acquisitie en gemiddeld ongeveer 200 willekeurig spectra voldoende signaal-ruisverhouding te verkrijgen. </li></ol></li></ol></li></ol> 5. ESI-MS-QTOF <ol><li> Analyseer-endoxylanase gegenereerde oligosachariden (native) met behulp van nano-HPLC in combinatie met een elektrospray ionisatie (ESI) quadrupool time of flight (QTOF) MS instrument met online chromatografische scheiding met behulp van een RP C-18-kolom (75 urn x 150 mm; 3,5 urn kraal grootte). <ol><li> Breng de endoxylanase-gegenereerde waterige oligosacchariden mengsel in een flesje en plaats in de HPLC autosampler. Programmeer de elutiegradiënt van 5-80% met de mobiele fase 0,1% (v / v) mierenzuur in water en 0,1% (v / v) mierenzuur in acetonitril, respectievelijk, over 60 min. </li><li> Stel het debiet tot 0,2 pl / min. Pas de positieve-ion modus in de scan rangevan 300-1,600 m / z en een scan-snelheid van 0,5 scans / seconde met behulp van de ESI bron voorwaarden als volgt: gordijn gas 10, GS1 4, bron temperatuur van 100 ° C, ion spuiten spanning 2300 V, en de-clustering potentieel 50 V. Run de LC chromatografische programma en elueer oligosacchariden. De resulterende totale ion chromatogram (TIC) wordt automatisch opgeslagen door de software. </li><li> Open de opgeslagen TIC en kies extract chromatogram. Typ de verwachte massa&#39;s (bijvoorbeeld 271, 403, 535, 667, 799 en 931 m / z) op de opdrachtregel. Scan chromatogram door te klikken op Enter. Verwerk de geselecteerde ionen scans van de ESI-QTOF MS chromatogram gegevens met software volgens de instructies van de fabrikant 14. </li></ol></li></ol> 6. ESI-MS n <ol><li> Plaats 1-2 pl per-O-gemethyleerde oligosaccharide (gemethyleerd zoals beschreven door Pettolino et al. 1) monster in 50% acetonitril in een nanospray spuitkop en een spuit. trimmennano-spuittip met een glazen mes te passen in de discrete nano-nevel houder naar het MS. </li><li> Stel de massa volgens de verwachte massabereik (200-1,500 m / z) en gordijn gas 10, Ionenspray spanning van 1900 V en polariteit positief. </li><li> Druk op de knop verwerven om relevante venster te openen, voert u de gegevens bestandsnaam tot een totaal ion scan (ESI-MS 1) te verkrijgen. Druk vervolgens op de STOP-knop. </li><li> Wijzig scan soort van product ion tot een piek van belang fragmenteren. Voer de massa van belang (bijvoorbeeld, 885 m / z) te fragmenteren en aanpassen van de massa-range (200-900 m / z). Druk op de knop verwerven en pas de botsingsenergie (boven en / of naar beneden op het tabblad verbinding) om hele versnippering van de ouder-ion (885 m / z) te bereiken en het verwerven van een fragment ion scan (ESI-MS 2). </li><li> Voer de massa van fragment ion van belang (bijvoorbeeld, 711 m / z) en stel de massa-range (200-720 m / z). Druk op de knop Acquire eend de botsingsenergie aanpassen om volledige fragmentatie van precursorion (711 m / z) bereiken en het verwerven van een fragment ion scan (ESI-MS 3). </li></ol> 7. 1 H NMR spectroscopie <ol><li> Ontbinden endoxylanase gegenereerde mengsel van oligosachariden (KOH-sol, natuurlijke vorm) (~ 500 ug) in D 2 O (1,0 ml, 99,9%) in een plastic reageerbuis (15 ml). Bevries de suspensie bij -80 ° C gedurende 4 uur en droog de bevroren suspensie in een vriesdroger te xylo-oligosacchariden herstellen. </li><li> Herhaal 7,1 maal om de H 2 O volledig uitwisselen D 2 O. </li><li> Oplossen gedroogd oligosacchariden in D 2 O (0,6 ml, 99,9%) en voeg 0,5 pl aceton (5% in D 2 O) als interne standaard. Breng de gedeutereerde oligosacchariden in de NMR-monsterbuis. </li><li> Houd de NMR-buis met monster door de top en steek de monsterbuis in een plastic spinner. Plaats de spinner in de steekproef dieptemeter. Push of trek de monsterbuis om de diepte van het monster aan te passen zodat de hartlijn van het monster bovenste en onderste dieptemeter gelijk. </li><li> Verwijder de dieptemeter en plaats het monster in de autosampler aangesloten op een 600 MHz NMR-spectrometer uitgerust met een cryo-sonde. </li><li> Inloggen open spectrometer besturingssoftware. Voer de naam voorbeeld bestand. Open een bestaande dataset en vervolgens de opdracht &quot;edc&quot; om het op te slaan onder een nieuwe naam. Typ het positienummer van het monster in de auto-sampler en druk op &quot;ENTER&quot;. Opmerking: Door op de knop &quot;ENTER&quot; zal voorzichtig de monsterbus dalen tot de magneet boring waar het op de top van de sonde zal worden gepositioneerd. </li><li> Stel de gewenste temperatuur van het monster door het intikken van &quot;edte&quot; op de opdrachtregel. Wacht tot de temperatuur van het monster op de gewenste waarde te bereiken voordat u verder gaat met de volgende stap. Voer &quot;lock&quot; op de opdrachtregel en kies geschikt oplosmiddel (D 2 O). Wacht op de &amp;#34; lock afgewerkte &quot;boodschap verschijnt aan de onderkant van het venster. </li><li> Typ &quot;atmm&quot; op de opdrachtregel en klik op &quot;optimaliseren&quot; aan de bovenkant van de atmm menubalk. Kies start voor het afstemmen en de matching van de sonde voor het geselecteerde kanaal (1 H in dit geval). </li><li> Typ &quot;topshim&quot; op de opdrachtregel voor de shimming proces waarbij kleine aanpassingen zijn gemaakt om het magnetisch veld tot uniform magnetisch veld het signaal wordt bereikt rond de sample.Acquire door het intikken van &quot;zg&quot; op de opdrachtregel en voer. </li><li> Analyseren spectra gebruik van software 15 volgens de instructies van de fabrikant met 1H chemische verschuivingen gerefereerd als interne standaard aceton bij 2,225 ppm. </li></ol>

<ol><li>Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+polysaccharide+composition+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Determining the polysaccharide composition of plant cell walls.</a> Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).</li>
<li>Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reducing+end+sequence+of+wheat+endosperm+cell+wall+arabinoxylans%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxylans.</a> Carbohydr. Res. 386, 23-32 (2014).</li>
<li>Bacic, A., Harris, P. J., Stone, B. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBacic%2C+A+%22The+Biochemistry+of+Plants%2C+Vol.+14%2C+Carbohydrates%22">The Biochemistry of Plants, Vol. 14, Carbohydrates</a>. Preiss, J. 14, Academic Press. San Diego. 297-371 (1988).</li>
<li>York, W. S., O'Neill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+control+of+xylan+biosynthesis+-+which+end+is+up%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical control of xylan biosynthesis - which end is up?</a> Plant Biol. 11, 258-265 (2008).</li>
<li>Fincher, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revolutionary+times+in+our+understanding+of+cell+wall+biosynthesis+and+remodeling+in+the+grasses%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Revolutionary times in our understanding of cell wall biosynthesis and remodeling in the grasses.</a> Plant Physiol. 149, 27-37 (2009).</li>
<li>Faik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xylan+Biosynthesis%3A+News+from+the+Grass%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Xylan Biosynthesis: News from the Grass.</a> Plant Physiol. 153, 396-402 (2010).</li>
<li>Scheller, H. V., Ulskov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemicelluloses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Hemicelluloses.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 61, 263-289 (2010).</li>
<li>Bacic, A., Stone, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%281%E2%86%923%29-+and+%281%E2%86%924%29-linked+%CE%B2-D-glucan+in+the+endosperm+cell-wall+of+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">A (1→3)- and (1→4)-linked β-D-glucan in the endosperm cell-wall of wheat.</a> Carbohydr. Res. 82 (13), 372-377 (1980).</li>
<li>Comino, P., Collins, H., Lahnstein, J., Beahan, C., Gidley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+soluble+and+insoluble+cell+wall+fractions+from+rye%2C+wheat+and+hull-less+barley+endosperm+flours%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Hydrocolloids%22%5BJournal%5D)">Characterisation of soluble and insoluble cell wall fractions from rye, wheat and hull-less barley endosperm flours.</a> Food Hydrocolloids. 41, 219-226 (2014).</li>
<li>Pena, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+irregular+xylem8+and+irregular+xylem9%3A+Implicationsfor+the+Complexity+of+Glucuronoxylan+Biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis irregular xylem8 and irregular xylem9: Implicationsfor the Complexity of Glucuronoxylan Biosynthesis.</a> Plant Cell. 19, 549-563 (2007).</li>
<li>Andersson, S. I., Samuelson, O., Ishihara, M., Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+reducing+end-groups+in+Spruce+xylan%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Structure of the reducing end-groups in Spruce xylan.</a> Carbohydr. Res. 111, 283-288 (1983).</li>
<li>Mazumder, K., York, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+arabinoxylans+isolated+from+ball-milled+switchgrass+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of arabinoxylans isolated from ball-milled switchgrass biomass.</a> Carbohydr. Res. 345, 2183-2193 (2010).</li>
<li>Kulkarni, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ability+of+land+plants+to+synthesize+glucuronoxylans+predates+the+evolution+of+tracheophytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiol%22%5BJournal%5D)">The ability of land plants to synthesize glucuronoxylans predates the evolution of tracheophytes.</a> Glycobiol. 22 (2012), 439-451 (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Agilent+MassHunter+Workstation+Software+-+Quantitative+Analysis+Familiarization+Guide%22">Agilent MassHunter Workstation Software - Quantitative Analysis Familiarization Guide</a>. , Agilent Technologies. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G3335_90061_Quant_Familiarization-EN.pdf">http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G3335_90061_Quant_Familiarization-EN.pdf</a> (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Topspin+User+Manual%22">Topspin User Manual</a>. , Bruker. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.nmr.ucdavis.edu/docs/user_manual_topspin_ts30.pdf ">http://www.nmr.ucdavis.edu/docs/user_manual_topspin_ts30.pdf </a> (2010).</li>
<li>Domon, B., Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+nomenclature+for+carbohydrate+fragmentation+in+FAB-MS%2FMS+spectra+of+glycoconjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate.+J%22%5BJournal%5D)">A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentation in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates.</a> Glycoconjugate. J. 5, 397-409 (1988).</li>
<li>Hoffmann, R. A., Leeflang, B. R., De Barse, M. M. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+by+1H-n.m.r.+spectroscopy+of+oligosaccharides%2C+derived+from+arabinoxylans+of+white+endosperm+of+wheat%2C+that+contain+the+elements+----4%29%5Balpha-L-Araf-%281----3%29%5D-beta-D-Xylp-%281----+or+----4%29%5Balpha-+L-Araf-%281----2%29%5D%5Balpha-L-Araf-%281----3%29%5D-beta-D-Xylp-%281----%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Characterisation by 1H-n.m.r. spectroscopy of oligosaccharides, derived from arabinoxylans of white endosperm of wheat, that contain the elements ----4)[alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1---- or ----4)[alpha- L-Araf-(1----2)][alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1----.</a> Carbohydr. Res. 221, 63-81 (1991).</li>
<li>Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+by+1H+NMR+spectroscopy+of+enzymically+derived+oligosaccharides+from+alkali-extractable+wheat-flour+arabinoxylan%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan.</a> Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).</li>
<li>Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+enzymatic+cleavage+of+cellulose+using+polysaccharide+analysis+by+carbohydrate+gel+electrophoresis+%28PACE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE).</a> Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

De meeste matrix fase celwandpolysacchariden hebben schijnbaar willekeurig vervangen backbones (met zowel glycosyl en non-glycosyl residuen) die zeer variabel zijn, afhankelijk van de plantensoort, ontwikkelingsstadium en weefseltype 3. Omdat polysachariden secundaire genproducten de sequentie niet template afgeleid en er dus geen enkele analytische benadering, zoals bekend van nucleïnezuren en eiwitten voor hun sequencing. De beschikbaarheid van gezuiverde linkage-specifieke hydrolytische enzymen verschaft e...

Heteroxylans zijn een familie van polysachariden die de overheersende cellulosevrije polysacchariden van de eerste wanden van grassen en de secundaire wanden van angiospermen 3-6 zijn. Xylaan ruggengraat verschillen in hun soorten en substitutiepatronen met glycosyl (glucuronzuur (GlcA), arabinose (Araf)) en niet-glycosyl (O-acetyl, ferulinezuur) residuen afhankelijk weefseltype, ontwikkelingsstadium en soorten 7. Wanden van tarwe (Triticum aestivum L.) endosperm bestaan ​​voornamelijk uit arabinoxylaan (AXs) (70%) en (1 → 3) (1 → 4) -β-D-glucanen (20%) met kleine hoeveelheden cellulose en heteromannans (2% elk) 8. Xylaan backbone kan op verschillende niet-gesubstitueerde en overwegend mono-gesubstitueerde (voornamelijk O-2 positie en in mindere mate O-3) en met de digesubstitueerde (O-2 en O-3 posities) met α-L-Ara zijn f resten 9. Het reducerende einde (RE) van heteroxylanen van tweezaadlobbigen (bijvoorbeeld Arabidopsis thaliana) en 10 naaktzadigen (bijvoorbeeld spar (Picea abies)) 11 bevat een karakteristieke tetrasaccharide glycosyl sequentie; -β-D-Xyl p - (1 → 3) -α-L-Rha p - (1 → 2) -α-D-Gal A- p (1 → 4) -D-Xyl p. Om heteroxylan biosynthese en functie (biologische industrie) te begrijpen, is het belangrijk om volledige sequentie xylaan backbone op de soort en de patronen van substituties alsook de sequentie van het reducerende einde (RE) begrijpen. Specifieke technieken die worden gebruikt voor de structurele karakterisering van reducerende einde (RE) en intern gebied glycosyl sequentie (s) van heteroxylans worden beschreven in dit manuscript. De betekenis berust op fluorofoor tagging (met 2 aminobenzamide (2AB)) het reducerende einde (RE) van de heteroxylan keten vóór enzymatische (endoxylanase) hydrolyse. Deze benadering, met name voor de RE sequencing waseerst gemeld door het laboratorium York 10,12-13 maar is nu uitgebreid met de interne regio sequentie omvatten en is een combinatie van bekende technieken die even aanpasbaar aan alle heteroxylans onafhankelijk van de bron van isolatie. Deze benadering kan ook worden toegepast op andere soorten polysacchariden gebruikt (indien beschikbaar) passende endo-hydrolasen. In de onderhavige studie werden de gesteven tarwe endosperm celwanden geïsoleerd als een alcohol-onoplosbare residu (AIR) en achtereenvolgens geëxtraheerd met water (W-sol Fr) en 1M KOH bevattende 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) zoals beschreven in Ratnayake et al. (2014) 2. De vrijgemaakte oligosacchariden zowel W- en KOH-sol FR&#39;s vervolgens gemethyleerd en de gedetailleerde structurele analyse van zowel de natieve als gemethyleerde oligosacchariden wordt uitgevoerd met een combinatie van MALDI-TOF-MS, ESI-QTOF-MS-HPLC gekoppeld aan de online chromatografische scheiding onder toepassing van een RP C-18 kolomen ESI-MS n. Endoxylanase gedigereerd KOH-sol AXs ook gekenmerkt door kernmagnetische resonantie (NMR).

<table><tbody><tr><td>2 aminobenzamide (2AB)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>A89804</td><td></td></tr><tr><td>sodium borohydride (NaBH4)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>247677</td><td>Gevaarlijk, met zorg gebruiken</td></tr><tr><td>sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>156159</td><td>Gevaarlijk, met zorg gebruiken</td></tr><tr><td>endo-1,4-&beta;-Xylanase M1 (van Trichoderma viride) (120101a)</td><td>Megazyme (www.megazyme.com)</td><td>E-XYTR1</td><td></td></tr><tr><td>Deuterium Oxide (D2O)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Vriesdroger (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RP C18 Zorbax eclipse plus kolom&nbsp;</td><td>Agilent&nbsp;</td><td></td><td>(2,1&times;100 mm; 1,8 &micro;m kraalgrootte)&nbsp;</td></tr><tr><td>MicroFlex MALDI-TOF MS&nbsp;&nbsp; (Model - MicroFlex LR)</td><td>(Bruker Daltonics, Duitsland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(ESI) -(QTOF) MS&nbsp;&nbsp; (Model # 6520)</td><td>(Agilent, Palo Alto, CA )</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESI-MSn &nbsp;- ion-trap&nbsp; (Model # 1100 HCT)</td><td>(Agilent, Palo Alto, CA).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 600 MHz -NMR</td><td>Bruker Daltonics, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Topspin (versie 3.0)-Biospin- software&nbsp;</td><td>Bruker&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC-MS (Model # 7890B)</td><td>Agilent&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sequencing van plant muur heteroxylans met behulp van enzymatische, chemical (methylering) en fysieke (mass spectrometry, nuclear magnetic resonance) technieken

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Dit protocol beschrijft de specifieke technieken die voor de karakterisering van reducerende einde (RE) en intern gebied glycosyl sequentie (s) van heteroxylans. De-gesteven tarwe endosperm celwanden werden geïsoleerd als alcohol-onoplosbare residu (AIR) 1 en achtereenvolgens geëxtraheerd met water (W-sol Fr) en 1 M KOH bevattende 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) zoals beschreven door Ratnayake et al. (2014) 2. Twee verschillende benaderingen (zie overzicht in figuur 1) worden aangenomen. In de eerste, intact W-sol AXs behandeld met 2AB de oorspronkelijke RE hoofdketen suikerrest label en vervolgens behandeld met een endoxylanase aan een mengsel van gelabelde 2AB RE en intern gebied reducerende oligosacchariden, respectievelijk genereren. In een tweede benadering wordt de KOH-sol Fr gehydrolyseerd met endoxylanase eerst genereren van een mengsel van oligosacchariden die vervolgens gelabeld met 2AB. De enzymatisch vrijgegeven ((on) met het label) oligosacchariden uit beideW- en KOH-sol FR&#39;s vervolgens gemethyleerd en de gedetailleerde structurele analyse van zowel de natieve als gemethyleerde oligosacchariden wordt uitgevoerd met een combinatie van MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-MS-QTOF en ESI-MS n. Endoxylanase gedigereerd KOH-sol AXs worden ook gekenmerkt door kernmagnetische resonantie (NMR), die ook informatie over de anomere configuratie. Deze technieken kunnen worden toegepast op andere soorten polysacchariden met de juiste endo-hydrolasen.

Endoxylanase digestie van 2AB gelabelde W-sol AXs genereert een mengsel van 2AB gemerkte RE oligosacchariden en een serie-un gemerkte (zonder 2AB label) Oligosacchariden afgeleid van de inwendige gebieden van het xylaan keten (figuur 1, van Ratnayake et al. 2). Een reeks chromatografische methoden wordt vervolgens gebruikt voor het complexe mengsel van isomeren fractioneren. Tenslotte worden MS-technieken gebruikt om de isomere structuren die vervolge...

Dit protocol beschrijft de specifieke technieken die worden gebruikt voor de structurele karakterisering van het reducerende einde (RE) en de interne glycosylsequenties van heteroxylanen door het RE te labelen met 2-aminobenzamide voorafgaand aan enzymatische (endoxylanase) hydrolyse en vervolgens analyse van de resulterende oligosacchariden met behulp van massaspectrometrie (MS) en nucleaire magnetische resonantie (NMR).

Sequencing van Plant Muur Heteroxylans Met behulp van Enzymatische, Chemical (Methylering) en fysieke (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Technieken

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Het algemene doel is om de glycosyle sequenties van het reducerende uiteinde en de interne regio van heteroxylanen te karakteriseren door het oorspronkelijke reducerende uiteinde suikerresidu van de wateroplosbare heravenaxylanen te labelen en vervolgens te behandelen met een endoxylanase om een mengsel van gelabelde dolara sacchariden te genereren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het glycomische veld, zoals veranderingen in de fijnstructuur van oligosachariden of polysachariden als reactie op geplande groeionwikkeling, alsook abiotische en biotische stressfactoren. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het een geïntegreerde aanpak beschrijft voor het sequensen van zowel de reducerende n-sequentie als de interne regensequentie van elk glycaan of polysacharide.Bereid een een molaire natriumcyanoborohydride-oplossing in één millilitre water. Los vervolgens 27,2 milligram 2AB-reagens op in de natriumcyanoborohydride-oplossing door te verhitten op 65 °C en de pH van het reactiemengsel aan te passen naar pH 5,5 met 10 % azijnzuur. Voeg 200 µL van het reactiemengsel toe aan één milligram wateroplosbare arabinoxylanen in een glazen buis met dop en meng dit met een vortexmixer.Incubeer het monster gedurende twee uur bij 65 °C in een zuurkast. Koel de suspensie na incubatie af tot kamertemperatuur en voeg vier volumes absolute ethanol toe. Plaats de suspensie gedurende één nacht in een koelkast om polysachariden te laten neerslaan.Centrifugeer vervolgens het monster en verwijder het supernatant. Was het pellet grondig met absoluut ethanol, aceton en methanol, waarbij tussen elke wasbeurt opnieuw wordt gecentrifugeerd. Droog het pellet overnight vacuüm bij 40 °C.Los één milligram van de voorbereide 2AB-gelabelde wateroplosbare arabinoxylanen op in 500 µL natriumacetaatbuffer in een microcentrifugebuisje. Voeg vier eenheden endoxylanas toe en incubeer gedurende 16 uur bij 37 °C. Schakel de enzymactiviteit uit door het reactiemengsel 10 minuten te verhitten in een kokend waterbad.Koel de suspensie af tot kamertemperatuur en breng deze over naar een glazen buis met dop. Voeg vier volumes absolute ethanol toe en bewaar de suspensie een nacht in een koude opslag om niet-verteerde polysacchariden te laten neerslaan. Centrifugeer om de niet-verteerde polysacchariden te scheiden van de door endoxylanase gegenereerde oligosacchariden.Giet vervolgens de supernatant over in een schone plastic buis en plaats deze in een warm waterbad. Laat het ethanol verdampen onder een stroom nitrogengas tot een eindvolume. Vries de supernatant vier uur lang in bij min 80 °C voordat de bevroren supernatant in een vriesdroger wordt gedroogd om de xylo-oligosachariden terug te winnen.Raadpleeg het tekstprotocol voor het genereren van xylo-oligosachariden uit oplosbare arabinoxylanen van KO8 en 2AB-labeling. Bereid de MALDI-matrixoplossing door een kleine schep DHB toe te voegen aan 500 millilitres van 50 procent acetonitril met 0,1 procent mierenzuur in een buisje. Meng dit met een vortex.Als het snel oplost, voeg dan nog een klein schepje DHB toe. Breng de inheemse waterige oligosacharide-monsters aan op een MALDI-targetplaat. Voeg 0,3 µL van de MALDI-matrixoplossing toe met een aparte tip en meng door herhaaldelijk te pipetteren.Laat het mengsel drogen bij kamertemperatuur. Plaats de doelplaat in de MS-bron en werk in positieve ionmodus. Stel de acceleratiespanning in op 19 kilovolt bij ionbron één en 16,3 kilovolt bij ionbron twee.Stel het laservermogen in op meer dan 70 procent. Selecteer de monsterplek op de MALDI-targetplaat en klik op start om de lasershots te beginnen. Analyseer de door native endoxylanase gegenereerde oligosachariden met nano-HPLC, gekoppeld aan een elektrospray-ionisatie quadrupool tijd-van-vlucht MS-instrument met online chromatografische scheiding met behulp van een reversed-phase C18-kolom.Breng het door endoxylanase gegenereerde waterige oligosacharidemengsel over in een vial en plaats deze in de HCLC-autosampler. Programmeer een elutiegradiënt van 5 tot 80 procent met als mobiele fasen respectievelijk 0,1 procent mierenzuur in water en 0,1 procent mierenzuur in acetonitril, over een periode van 60 minuten. Start het vloeistofchromatografische programma en elueer de oligosachariden.Klik op 'add sample', typ de naam van het monster in en klik op de knop 'okay'. Selecteer het bestand met de massaspectrometrie-methode en klik op de knop 'submit'. Start vervolgens de monsteranalyse.Het resulterende totale ionenchromatogram, of TIC, wordt automatisch door de software opgeslagen. Open het opgeslagen TIC en selecteer 'extract chromatogram'. Voer de verwachte massa's in bij de opdrachtregel.Scan het chromatogram door op enter te klikken voordat de geselecteerde ionenscans worden verwerkt met software volgens de instructies van de fabrikant. Breng met een spuit één tot twee µL van het per O-gemethyleerde oligosacharide-monster in 50% acetonitril aan in een nanospray-tip. Trim de nanospray met een glassnijder zodat deze in de discrete nanospray-houder past die aan de MS is bevestigd. Stel de massa in volgens het verwachte massa-bereik, het curtain gas op 10, de ion spray-spanning op 1900 volt en de polariteit op positief.Druk op de acquisitieknop om het betreffende venster te openen. Voer vervolgens de naam van het gegevensbestand in om een totale ionenscan uit te voeren voordat u op de stopknop drukt. Wijzig het scantype van production naar fragment om een specifiek deel van interesse te analyseren.Voer de massa in van het te fragmenteren ion en stel het massabereik in. Druk op de acquire-knop en pas de botsingsenergie aan om volledige fragmentatie van het ouderion te bereiken en voer een fragmention-scan uit. Los het door endoxylanase gegenereerde mengsel van oligosachariden op in één millilitre deuteriumoxide in een plastic reageerbuis van tien millilitre.Bevries de suspensie bij -80 °C gedurende vier uur voordat de bevroren suspensie in een vriesdroger wordt gedroogd om xylo-oligosachariden terug te winnen. Los vervolgens de gedroogde oligosachariden op in 0,6 mL deuteriumoxide en voeg 0,5 µL van vijf procent aceton in deuteriumoxide toe als interne standaard. Breng de gedeutereerde oligosachariden over in de NMR-monsterbuis.Houd de NMR-buis met de monsteroplossing aan de bovenkant vast en plaats de monsterbuis in een plastic spinner. Plaats de spinner in de monsterdieptemeter. Duw of trek de monsterbuis om de diepte van het monster aan te passen, zodat de centrumlijnen van de bovenste en onderste dieptemeters gelijk zijn.Verwijder de dieptemeter en plaats het monster in de autosampler die is gekoppeld aan een 600 megaHertz NMR-spectrometer uitgerust met een cryoprobe. Voer het NMR-experiment uit en analyseer de resulterende spectra zoals beschreven in het tekstprotocol. De signalen in het MALDI-TOF MS-spectrum van oligosachariden afgeleid van 2AB-gelabelde native wateroplosbare arabinoxylanen bevatten een reeks ongelabelde neutrale en zure oligosachariden uit de interne regio, evenals oligosachariden die oorspronkelijk met 2AB waren gelabeld aan hun reducerende uiteinde.Hier worden geselecteerde ionenscans getoond van de ESI cutoff MS-chromatogrammen van natuurlijke oligosachariden afgeleid van oligosachariden uit de interne regio, gegenereerd door endoxylanasebehandeling van de met 2AB gelabelde wateroplosbare arabinoxylanen. Ook worden scans getoond van natuurlijke oligosachariden afgeleid van reducerende endooligosachariden met een 2AB-label en zure regionale oligosachariden die op dezelfde wijze zijn gegenereerd. Niet-gemethyleerde hydroxylgroepen die ontstaan tijdens gasfasfragmentatie van per-O-gemethyleerde oligosachariden in MS zorgen voor een massaverschil van 14 Dalton, een kenmerk dat wordt gebruikt om het vertakkingspatroon en de glycosylequenties te identificeren.Elk litteken dat door het fragmentatieproces is gegenereerd, is aangegeven als een doorgetrokken lijn, aangezien er voor een bepaalde massa meerdere isomere structuren mogelijk zijn. Y-ionen zijn in het rood gelabeld en B-ionen zijn in het zwart gelabeld. Analyse van de electrospray-ionisatie tandem MS-spectra van per-o-gemethyleerde reducerende en neutrale glycosal-alditolen, bestaande uit vier pentose-suikerreste en xylitol bij een massa-ladingsverhouding van 885, wijst erop dat de glycosal-sequentie aan het reducerende uiteinde bestaat uit de arabinose-zijketen gebonden aan het xylitol-residu aan het reducerende uiteinde en/of zowel het xylitol-residu aan het reducerende uiteinde als het voorlaatste xylosil-residu.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals chrompriansomichro poly profiling en electropulsen, worden uitgevoerd om vragen te beantwoorden zoals de specificiteit van antilichaamepitopen en het snel screenen van veranderingen in de fijnstructuur. Na de ontwikkeling heeft deze techniek onderzoekers op het gebied van glycomica de weg vrijgemaakt om de structurele kenmerken van glycanen te onderzoeken, inclusief het type en patroon van substituties met glycaan- of niet-glycaanresiduen in verschillende typen weefsels, ontwikkelingsstadia en soorten. Deze benadering kan worden toegepast op andere klassen polysachariden door gebruik te maken van geschikte endrohydrilasen.Vergeet niet dat werken met metaalhalogeniden en natriumcyanoborohydride uiterst gevaarlijk kan zijn; voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van geschikte handschoenen en het werken in een zuurkast, moeten altijd worden getroffen bij het uitvoeren van deze procedure.

sequencing-plant-wall-heteroxylans-using-enzymic-chemical-methylation

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Plantaardige biomassa is een belangrijke koolstof-neutrale hernieuwbare grondstof die gebruikt kunnen worden voor de productie van biobrandstoffen. Plantaardige biomassa bestaat voornamelijk uit celwanden, een structureel complex composietmateriaal genoemd lignocellulose. Hier beschrijven we een protocol voor een uitgebreide analyse van de inhoud en de samenstelling van de polyfenolische lignine.

Uitgebreide analyse van de samenstelling van de celwanden (lignocellulose biomassa) Deel I: Lignine

Plantaardige biomassa is een belangrijke koolstof-neutrale hernieuwbare grondstof die gebruikt kunnen worden voor de productie van biobrandstoffen. Plantaardige biomassa bestaat voornamelijk uit celwanden, een structureel complex composietmateriaal genoemd lignocellulose. Hier beschrijven we een protocol voor een uitgebreide analyse van de inhoud en de samenstelling van de muur afgeleid koolhydraten.

Uitgebreide analyse van de samenstelling van de celwanden (lignocellulose biomassa) Deel II: Koolhydraten

Een snelle manier is beschreven om inzicht te krijgen in de structuur van de polysacchariden in een extracellulaire matrix. De methode maakt gebruik van de specificiteit van glycosylhydrolases en de gevoeligheid van massaspectrometrie waarmee minieme hoeveelheden van de materialen worden geanalyseerd. Deze techniek is aan te passen aan direct worden gebruikt op weefsel zelf.

Oligo Mass Profiling (Olimp) van extracellulaire polysacchariden

Glycaan Profilering van Plant celwandpolymeren met behulp van Microarrays

Dit protocol beoogt een algemene methode te presenteren om lignine, cellulose en hemicellulose in plantencelwanden te visualiseren met behulp van Raman imaging en multivariate analyse.

Combinatie van Raman Imaging en Multivariate Analysis om Lignine, Cellulose en Hemicellulose in de Plant Cell Wall te visualiseren

Een protocol voor de structurele analyse van polysacchariden door elektroforese van het gel (PACE), met behulp van mannan als voorbeeld is beschreven.

Structurele karakterisering van Mannan celwand polysacchariden in installaties die gebruikmaken van tempo

Een protocol voor het voorbereiden van 13C,15N-geëtiketteerden schimmel en plant monsters voor multidimensionale Solid state NMR spectroscopie en dynamische nucleaire polarisatie (DNP) onderzoeken wordt gepresenteerd.

Voorbereiding van schimmel en plantaardig materiaal voor structurele opheldering met behulp van dynamische nucleaire polarisatie Solid state NMR

Microarray polymer profiling (MAPP) is een high-throughput techniek voor samenstellingsanalyse van glycanen in biologische monsters.

Microarray Polymer Profiling (MAPP) voor high-throughput glycaananalyse

Het huidige protocol beschrijft procedures die worden gebruikt om celwandgerelateerde enzymen, voornamelijk β-1,3-glucanase en peroxidase, in tarweplanten te bestuderen en te karakteriseren. Hun activiteitsniveaus nemen toe tijdens de interactie tussen tarwe en RWA en zijn betrokken bij de afweerreactie van de plant door middel van celwandversterking, wat de voeding van bladluizen afschrikt.

Opheldering #946;-1,3-glucanase en peroxidase fysisch-chemische eigenschappen van het verdedigingsmechanisme van de tarwecelwand tegen de besmetting met diuraphis noxia

Eiwitconformatie en dynamiek zijn de sleutel tot het begrijpen van de relatie tussen eiwit structuur en functie. Waterstofwisselproces combinatie met hoge-resolutie massaspectrometrie is een veelzijdige methode om de conformationele dynamica van proteïnen en karakteriseren eiwit-ligand en eiwit-eiwit interacties, zoals contact interfaces en allosterische effecten.

Het analyseren van Protein Dynamics gebruik van waterstof Exchange Massaspectrometrie

Ontdek de structuurkarakterisering van heteroxylanen in plantencelwanden door enzymatische hydrolyse en 2-aminobenzamide-labeling. Deze methode combineert massaspectrometrie en NMR voor gedetailleerde glycaansequentiebepaling.

Sequencing van Plant Muur Heteroxylans Met behulp van Enzymatische, Chemical (Methylering) en fysieke (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Technieken (Video) | JoVE Journal

Sequencing van Plant Muur Heteroxylans Met behulp van Enzymatische, Chemical (Methylering) en fysieke (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Technieken

Meer video's verkennen