Name: Het beoordelen van specificiteit van geneesmiddelen tegen kanker In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Leer hoe u de specificiteit van kankergeneesmiddelen beoordeelt in vitro met gemengde culturen van tumor- en niet-tumorcellen. Deze methode maakt dosisafhankelijke responsanalyse mogelijk voor nauwkeurige geneesmiddelontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Mevrouw Alster, de heer Honrath en Dr. Jiang worden gewaardeerd om hun uitstekende technische bijstand. Ook gewaardeerd is Dr. Volz en de onderzoeksgroep van Dr. Dandri voor het verstrekken van de toegang tot hun digitale PCR-apparaat.

1. Voorbereiding Mix Cultuur die zowel tumorcellen en niet-tumorcellen <ol><li> Gebruik tumorcellen uit een gevestigde cellijn MPNST S462 5. Gebruik fibroblasten de niet-tumorcellen 6,7 </li><li> Cultuur zowel tumorcellen en fibroblasten in standaard DMEM-medium met 10% foetaal runderserum (BSA), 3 mM glutamine, 0,1 mM 2-mercaptoethanol, 500 U / ml penicilline, 500 g / ml streptomycine en 1 mM natriumpyruvaat bij 37 ° C en 5% CO 5-7 februari. Op sub-samenvloeiing, de oogst van de cellen met 0,05% trypsine en tel ze met behulp van een hemocytometer. </li><li> Meng 400 tumorcellen en 1600 niet-tumorcellen samen in elke well van een 96-well kweekplaat in 0,2 ml medium. Gezien snellere groei van tumorcellen bij de behandelingsperiode van 5 dagen, de initiële percentage van tumorcellen werd vastgesteld op 25%. Opgezet 4 replica voor elke concentratie geneesmiddel. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO 2 O / N. </li></ol> 2. Drug De behandeling <ol><li> Gebruik nilotinib als de test drug. Bereid voorraad oplossingen van 0, 2, 4 en 20 mm nilotinib in DMSO. Vul telkens hunner 200-voudig in 5 ml DMEM medium, die 2-voudig geconcentreerde drug-oplossingen van 0, 10, 20 en 100 uM 6,7. </li><li> Verwijder 0,1 ml medium uit elk putje en voeg 0,1 ml medium met geneesmiddel. De uiteindelijke concentraties 0, 5, 10 en 50 uM. Verder incuberen van de cellen in medium met geneesmiddel gedurende 5 dagen. </li><li> Na afloop van de behandeling Controleer de aangehechte cellen met behulp van een fasecontrastmicroscoop en foto&#39;s nemen. Zuig het medium weg, was de overleefde lijm cellen eenmaal met 0,2 ml PBS. </li></ol> 3. Voorbereiden van DNA voor Digital PCR <ol><li> Lyseren cellen met behulp HotShot 8. <ol><li> Voeg 50 ul alkalische lysis-oplossing (25 mM NaOH, 0,2 mM EDTA) aan elk putje. Verzegeling van de putten met folie. Incubeer de plaat bij 95 ° C in een oven of op een verwarmingsplaat gedurende 30 min. Controleer onder een MICRoscope ervoor zorgen dat niet meer intacte cellen bleven aan het oppervlak van de putjes. In het geval dat niet de cellen niet volledig lyseren, verhoging van de opwarmtijd of voeg wasmiddel. Vries ze eenmaal bij -20 ° C verhoogt ook het breken van cellen. </li><li> Voeg 50 ul neutraliserende oplossing (40 mM Tris-HC, pH 4,0) aan elk putje. Breng alle lysaten in U-vorm putjes van een PCR-plaat en droog in een PCR cycler bij 95 ° C gedurende 10 tot 30 min. Reconstitueer de lysaten met 20 pi gedestilleerd water. </li></ol></li><li> Ontzouten met behulp van Drop-Dialyse 9 <ol><li> Gebruik membraanfilters met een gemiddelde poriegrootte 0,025 micrometer. </li><li> Drijven het filter aan gedestilleerd water met glanzende zijde in putjes van een 12-wells plaat. Nat filter 5 min. Besteed aandacht aan luchtbellen tussen de filter en het water te vermijden. </li><li> Pipet de opgeloste lysaten van elk monster uit stap 3.1.4 voorzichtig op op elk van de gebieden 4 van het filter. Bedek de plaat en dialyseer gedurende 30 tot 60 minuten. </li><li> Zuigen weg het water onder de filter zonder flippen over het filter noch het verstoren van de druppels. </li><li> Breng de lysaat-druppels in putjes van een nieuwe PCR-plaat. Droog de DNA-drops door verwarming bij 95 ° C gedurende 10 tot 30 minuten in een PCR cycler. Reconstitueer de lysaten in 10 pi water. </li></ol></li></ol> 4. Digitale PCR <ol><li> Ontdooi bevroren componenten zoals DNA, buffer en het analysemengsel bij kamertemperatuur, het afsluiten gedurende 10 s bij maximale kracht van elke beschikbare centrifuge (bijvoorbeeld VWR mini centrifuge) en bewaar ze op ijs. </li><li> Bereid meester mengsel dat alle componenten met uitzondering van DNA (tabel 1). Denk aan dood volume en bereken meester mengsel ongeveer 10% meer dan het vereiste bedrag. OPMERKING: Gebruik de primers en probes gebruikt in de commerciële kit. </li><li> Vortex de meester mengsel, spin down gedurende 10 seconden op maximale kracht van alle beschikbare centrifuge (bijvoorbeeld VWR mini-centrifuge) en afzien 15 pi aan elkputje van een 96-PCR plaat. Voeg alle lysaat van elk monster aan de putjes die de master mengsel (die DNA bevat). Overdracht 20 pi van elke reactie mengsel in een put aan de monsterzijde van een patroon bij KT. </li><li> Verdeel 70 ui druppelgenerator olie in elke put op de olie-kant van een patroon. Sluit de cartridge met de pakking en plaats de hele omgeving in een druppel generator. Start druppel generatie. </li><li> Overdracht 40 ul druppel-oplossing in putjes van een 96-well PCR plaat. Seal de plaat met een folie en zet de plaat in een PCR cycler. Stel de lid-temperatuur bij 105 ° C en oprit snelheid 2 ° C / sec. Voer PCR met de instellingen in Tabel 2. Na de PCR, breng de plaat in een druppel lezer en begint te lezen. Alternatief bewaar de plaat bij 4 ° C gedurende maximaal 24 uur. </li></ol> 5. Het berekenen Aandeel van tumorcellen <ol><li> Laad de digitale PCR data en het uitvoeren van automatische analysis. </li><li> Controle van de resultaten van elke test handmatig door inspectie van de één-dimensionale en 2-dimensionale verdeling van de positieve en negatieve druppeltjes en bevatten goed gescheiden en de drempel lijnen waren in de juiste posities. Uitsluiten resultaten niet aan de criteria bijvoorbeeld geen duidelijke scheiding tussen positieve en negatieve druppeltjes, verder onderzocht. Kopieer de resulterende verhouding NF1 / RPP30 in een Excel-sheet. </li><li> Bereken het aandeel van de tumorcellen als: 2 x (1- NF1 / RPP30). </li></ol> 6. Dosisafhankelijke Verandering van Aandeel van tumorcellen <ol><li> Voor elk geneesmiddel-concentratie berekent het gemiddelde en de standaardafwijking van 4 herhalingen. Teken de middelen en de standaarddeviaties tegen drug-concentraties. </li></ol>

<ol><li>Caponigro, G., Sellers, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+preclinical+testing+of+cancer+therapeutic+hypotheses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 179-187 (2011).</li>
<li>McMillin, D. W., Negri, J. M., Mitsiades, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+tumour-stromal+interactions+in+modifying+drug+response%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The role of tumour-stromal interactions in modifying drug response: challenges and opportunities.</a> Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 217-228 (2013).</li>
<li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li>
<li>Edwards, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+target+validation+using+patient-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Preclinical target validation using patient-derived cells.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 149-150 (2015).</li>
<li>Frahm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+phenotypic+characterization+of+tumor+cells+derived+from+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+of+neurofibromatosis+type+1+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Genetic and phenotypic characterization of tumor cells derived from malignant peripheral nerve sheath tumors of neurofibromatosis type 1 patients.</a> Neurobiol Dis. 16 (1), 85-91 (2004).</li>
<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+selectivity+of+nilotinib+on+NF1-associated+tumors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Efficacy and selectivity of nilotinib on NF1-associated tumors in vitro.</a> J Neurooncol. 116 (2), 231-236 (2014).</li>
<li>Jiang, W., Mautner, V. F., Friedrich, R. E., Kluwe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+assessment+of+the+anticancer+drug+response+of+plexiform+neurofibroma+tissue+using+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Preclinical assessment of the anticancer drug response of plexiform neurofibroma tissue using primary cultures.</a> J Clin Neurol. 11 (2), 172-177 (2015).</li>
<li>Montero-Pau, J., Gomez, A., Munoz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+an+inexpensive+and+high-throughput+genomic+DNA+extraction+method+for+the+molecular+ecology+of+zooplanktonic+diapausing+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography-Methods%22%5BJournal%5D)">Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extraction method for the molecular ecology of zooplanktonic diapausing eggs.</a> Limnology and Oceanography-Methods. 6, 218-222 (2008).</li>
<li>Saraswat, M., Grand, R. S., Patrick, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desalting+DNA+by+drop+dialysis+increases+library+size+upon+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Desalting DNA by drop dialysis increases library size upon transformation.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 77 (2), 402-404 (2013).</li>
<li>Iglesias-Bartolome, R., Martin, D., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+head+and+neck+cancer+oncogenome%3A+widespread+PI3K-mTOR+pathway+alterations+and+novel+molecular+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Exploiting the head and neck cancer oncogenome: widespread PI3K-mTOR pathway alterations and novel molecular targets.</a> Cancer Discov. 3, 722-725 (2013).</li>
</ol>

De procedure is octrooibeschermd (10 2013 221 452, Duitsland)

De belangrijkste stap in deze genetisch en op cellen gebaseerde instrument voor de beoordeling van geneesmiddelen specificiteit in vitro bepaling van de hoeveelheid tumorcellen via een of meer tumor-specifieke genetische eigenschappen. In tegenstelling tot conventionele fenotypische kenmerken 7, genetische kenmerken zijn bepaald, stabiel en gemakkelijk te kwantificeren. Bijvoorbeeld een tumor-specifieke mutatie of copy number variation aanwezig uitsluitend de tumorcellen, maar niet in niet-tumorcellen. Een dergelijke genetische stigma betrouwbaar en precies gekwantificeerd, bijvoorbeeld onder gebruikmaking van digitale PCR zoals aangetoond in deze studie. Voor digitale PCR, hoge zuiverheid van DNA is niet essentieel. Echter, ontzouten en verwijderen van remmende moleculen nodig die kunnen worden bereikt door een drop-dialyse met een geschikt filter. De gecombineerde lyse en drop-dialyse is eenvoudig en snel, vereist geen speciale instrumenten en derhalve kan op elke standaard laboratorium worden uitgevoerd. Als de cellen niet breaen k, kunnen aanvullende behandeling worden genomen zoals het bevriezen van de cellen bij -20 ° C, het toevoegen van detergens en / of gebruiken protease. In deze studie, de heterozygote deletie van het NF1-gen werd gebruikt als tumor-specifieke eigenschap voor de kwantificering. Evenzo deleties van andere genen of loci kunnen ook worden gebruikt. Verder kunnen mutaties ook worden gebruikt voor het kwantificeren van tumorcellen. In dat geval digitaal PCR assays voor de mutant en de normale allelen moeten grondig worden gevalideerd hun specificiteit voor elk daarvan waarborgen. Dosisafhankelijke percentage tumorcellen een indicatie voor drug-specificiteit of selectiviteit. Voorts maakt ook toe respons van tumorcellen uit de reactie van totale cellen van een gemengde kweek van een geneesmiddel (figuur 4). Deze extractie strategie verschaft een oplossing voor het technische probleem bij het gebruik van primaire kweken (die zowel tumor en bevat geenn-tumorcellen) voor drug-testen. De genetisch en cell-based in vitro hulpmiddel gedemonstreerd in de huidige studie kan daarom toepassingsmogelijkheden (1) in drug-discovery, waar het biedt een platform voor de beoordeling van geneesmiddelen specificiteit of selectiviteit in vitro en (2) in gepersonaliseerde oncologische zorg waar het maakt het testen van drugs in primaire kweken en dus kan bijdragen aan drugs-selectie in adjuvante chemotherapie 4. Verder kunnen farmacologisch mechanisme van een geneesmiddel worden bestudeerd met dit hulpmiddel, aangezien bepaalde genetische verandering of meer genetische veranderingen in de drug-behandeling kan worden gevolgd. Een moeilijkheid bij het gebruik van individuele primaire kweken is het ontbreken van een universele genetische eigenschap voor de kwantificering van de tumorcellen. Echter, met de huidige vooruitgang in hele genoom, de meest veranderde genen en gebieden zijn bekend voor zachte tumoren. Bijvoorbeeld, onder het hoofd en de nektumoren, 71%, 23% en 22% hebben mutaties in de TP53, FAT1 en CDKN2A genen en 60%, 34% en 26% hebben deleties in het gen regio CDKN2A, STK11 en PTEN, respectievelijk 10. Screening 5 tot 10 dergelijke genen en / of gebieden door gerichte sequencing en / of digitale PCR zal daarom waarschijnlijk identificeren van één of meer genetische veranderingen die kunnen worden gebruikt voor de kwantificering van tumorcellen in de verkregen primaire kweek. Een andere beperking is het vaak onvoldoende hoeveelheid weggesneden tumoren opzetten primaire kweken. Ondanks de voordelige eigenschappen en veelbelovende toepassing potentieel van de genetisch en op cellen gebaseerde in vitro tool, maar heeft haar beperkingen in het achterhoofd worden gehouden en de in vitro aard moet worden benadrukt. Bijvoorbeeld, de differentiële effecten of cytotoxiciteit van geneesmiddel op tumorcellen plaats als gevolg van verschil in celtypes (fibroblasten versus Schwann-cellen) of hunverschillende oorsprong (uit verschillende individuen). Hoe sterker effect van een geneesmiddel op tumorcellen dan op niet-tumorcellen kan ook worden verklaard door het feit dat de eerstgenoemde sneller groeien dan de laatste. Belangrijker, cellen in vitro gedrag verschilt dan cellen in het menselijk lichaam en dus de resultaten van in vitro assessment vaak niet of slechts gedeeltelijk overeen met de werkelijke klinische situatie. Daarom werkzaamheid, specificiteit en cytotoxiciteit van geneesmiddelen verkregen gekweekte cellen zijn eerder biomarker van aard, maar niet de betrouwbaarheid van gemeten preklinisch werkzaamheid van antibiotica. Niettemin verplaatsen van cellijnen gemengde kweken en / of primaire kweken is een stap voorwaarts bij de beoordeling drug-effect en specificiteit / selectiviteit in vitro. Met grote inspanningen, in vitro omstandigheden te vinden die redelijk correlatie van in vitro gegevens met echte reacties van patiënten, althans voor sommige geneesmiddelen mogelijk maakt.

De therapeutische effecten van geneesmiddelen tegen kanker op tumorcellen worden geassocieerd met verschillende ongewenste toxische effecten op niet-tumorcellen. Giftige effecten zijn moeilijk te beoordelen in het laboratorium, grotendeels vanwege het ontbreken van geschikte hulpmiddelen1. Celculturen die zowel tumor- als niet-tumorcellen bevatten, zouden een potentiële in vitro bron kunnen zijn voor het beoordelen van de specificiteit of selectiviteit van een geneesmiddel, wat licht kan werpen op klinische toxiciteit. Echter, conventionele in vitro assays zoals proliferatie- of levensvatbaarheidsassays meten het effect van een geneesmiddel op het totaal aantal cellen, maar kunnen het effect niet verdelen in het deel op tumorcellen en het deel op niet-tumorcellen. Bijvoorbeeld, een 50% reductie van het totale aantal cellen in een cultuur bestaande uit 50% tumorcellen en 50% niet-tumorcellen kan de dood van alle tumorcellen betekenen, de dood van alle niet-tumorcellen of, waarschijnlijker, de dood van delen van beide in verschillende verhoudingen. 
Ook vanwege dit technische probleem zijn primaire culturen die tumor- en niet-tumorstromacellen bevatten, vaak ongeschikt voor het testen van geneesmiddelen. Aan de andere kant, vanwege deze cellulaire heterogeniteit, lijken primaire culturen veel beter op hun oorspronkelijke tumoren dan klonale cellen in gevestigde cellijnen2. Belangrijker nog, primaire culturen zijn patiëntspecifiek en kunnen geïndividualiseerd geneesmiddelentesten mogelijk maken2-4.
Een essentiële kwestie is daarom de ontwikkeling van een methode voor het bepalen van het aandeel tumorcellen in gemengde culturen, inclusief primaire culturen. Om deze uitdaging aan te gaan, werd een genetische oplossing bedacht die gebaseerd is op de bepaling van de kwantitatieve verhouding van een tumorspecifiek genetisch kenmerk tot een universele referentiesequentie. Uit deze verhouding kan het aandeel tumorcellen in een gemengde cultuur worden berekend. 
Deze studie illustreert de procedure van het genetische en cel-gebaseerde hulpmiddel voor het beoordelen van de specificiteit van geneesmiddelen tegen kanker, inclusief (1) het voorbereiden van een gemengde cultuur van tumorcellen van een gevestigde lijn en niet-tumor fibroblasten, (2) het behandelen van de gemengde cultuur met een testgeneesmiddel, (3) het voorbereiden van DNA voor digitale PCR, (4) het bepalen van de verhouding van een tumorspecifieke heterozygote deletie tot een referentiesequentie met behulp van een dual-probe droplet digitale PCR-assay, (5) het berekenen van de verhoudingen van tumorcellen bij elke geneesmiddelconcentratie en (6) het opstellen van dosisafhankelijke veranderingen in het aandeel tumorcellen.

<table><tbody><tr><td>Membraanfilter van 25 mm diameter</td><td>Merk-Millipore</td><td>VSWP 02500</td><td>Voor druppel-dialyse</td></tr><tr><td>ddPCR-assay voor NF1</td><td>BioRad</td><td>dHsaCP1000177</td><td>FAM-gelabeld</td></tr><tr><td>ddPCR-assay voor RPP30</td><td>BioRad</td><td>dHsaCP2500350</td><td>HEX-gelabeld</td></tr><tr><td>QX200</td><td>BioRad</td><td>186-4001</td><td>De vorige versie QX werd in het onderzoek gebruikt, die niet meer beschikbaar is. De vervanger is QX200</td></tr><tr><td>Droplet olie</td><td>BioRad</td><td>186-3005</td><td></td></tr><tr><td>Cartridges&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>186-3004</td><td></td></tr><tr><td>Pakkingen</td><td>BioRad</td><td>186-3009</td><td></td></tr><tr><td>Cartridge houder</td><td>BioRad</td><td>186-3051</td><td></td></tr><tr><td>Doorboorbaar folie</td><td>BioRad</td><td>181-4040</td><td></td></tr></tbody></table>

het beoordelen van specificiteit van geneesmiddelen tegen kanker<em&gt; in vitro</em

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

Een methode voor de specificiteit van geneesmiddelen tegen kanker in vitro middels kweken die zowel tumor- en non-tumorcellen aangetoond. Centraal staat de kwantitatieve bepaling van een tumor-specifieke genetische verandering ten opzichte van een universele sequentie met een dual-probe digitale PCR en de daaropvolgende berekening van het percentage van tumorcellen. De test wordt uitgevoerd op een kweek die tumorcellen van een gevestigde lijn en droeg spiked-in niet-tumorcellen. De gemengde kweek wordt behandeld met een testgeneesmiddel in verschillende concentraties. Na de behandeling wordt DNA rechtstreeks bereid uit de overleefden klevende cellen in putjes van 96-putjes platen met behulp van een eenvoudige en goedkope werkwijze en onderworpen aan een dual-probe digitale PCR-test voor het meten van een tumor-specifieke genetische verandering en referentie universele sequentie . In deze demonstratie wordt een heterozygote deletie van het NF1 gen als tumor-specifieke genetische verandering eneen RPP30 gen als het referentie-gen. De verhouding NF1 / RPP30, werd het percentage tumorcellen berekend. Aangezien de dosis-afhankelijke verandering van het aantal tumorcellen verschaft een in vitro indicatie voor specificiteit van het geneesmiddel, dit genetische en op cellen gebaseerde in vitro assay waarschijnlijk toepassingsmogelijkheden in drug discovery. Verder is het voor gepersonaliseerde kanker-care kan dit genetisch en op cellen gebaseerde hulpmiddel een bijdrage leveren aan het optimaliseren van adjuvante chemotherapie door middel van het testen van de werkzaamheid en de specificiteit van kandidaat-medicijnen met behulp van primaire kweken van individuele tumoren.

Kwaliteit van DNA bereid met de gecombineerde HotShot / Drop-Dialyse is voldoende voor bevredigende digitale PCR (Figuur 1B). Voor 2000 fibroblasten ongeveer 3000 ± 500 positieve druppeltjes verkregen, overeenkomend met 75% van de verwachte 4000 kopieën (twee exemplaren in een cel). In deze studie, de tumorcellen waren van een gevestigde lijn MPNST S462 waarvan bekend is dat een heterozygote deletie van het NF1 gen 5 hebben. Dit gen dosering reductie van 50% werd duidelijk waargenomen door de dubbele digitale PCR-test (Figuur 1B). Daarentegen werden twee kopieën van dit gen gemeten in fibroblasten. Deze genetische verschillen tussen tumor- en non-tumorcellen maakt berekening van het percentage van tumorcellen in gemengde kweken (figuur 2). Door de relatieve gendosage van NF1 tot RPP30 kan hoeveelheid tumorcellen in een gemengde kweek vastgesteldbij elk geneesmiddel-concentratie (Figuur 3). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig1.jpg" /> Figuur 1. Digitale PCR. (A) illustratie van het principe. (B) een dual-probe-test onthult verminderde hoeveelheid van een doel (NF1) gen in de tumorcellen MPNST S462 ten opzichte van een referentie (RPP30) gen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 2" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig2.jpg" /> Figuur 2. Berekende Percentage tumorcellen. Tumorcellen en niet-tumorcellen werden gemengd in verschillende verhoudingen en geënt in elk putje van een 96-plaat. Na hechting O / N werden de cellen gelyseerd with HotShot / Drop-dialyse en ontzout lysaten werden onderworpen aan digitale PCR waarin de verhouding van NF1 / RPP30 gaf. Basis van deze verhouding, percentage tumorcellen in elk putje werd berekend. Gemiddelde en standaarddeviatie van percentage tumorcellen werden berekend uit 4 replicaten van elke set-up verhouding. De berekende verhoudingen van tumorcellen (Y-as) werden uitgezet tegen de set-up proporties (X-as). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig3.jpg" /> Figuur 3. Dosisafhankelijke Verandering van Aandeel van tumorcellen. (A) dosis-afhankelijke reductie van zichtbare vitale cellen. (B) hoeveelheid tumorcellen (gemiddelde en standaarddeviatie van 4 herhalingen) berekend uit de<html> verhouding NF1: RPP30, daalde in het bereik van 0-10 uM. Bij de hoogste dosis 50 pm, werden enkele vitale cellen verlaten, waarschijnlijk als gevolg van toxische effect op alle cellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig4.jpg" /> . Figuur 4. Scheiden Reactie tumorcellen van die van niet-tumorcellen (A) de levensvatbaarheid en / of proliferatie van totale cellen kan worden gemeten met conventionele testen; Percentage van tumorcellen kan worden vastgesteld volgens de procedure aangetoond in deze studie. (B) met de twee parameters, kan reactie van totale cellen in een gemengde kweek van een geneesmiddel worden verdeeld in respons van de tumorcellen en de respons van de niet-tumorcellen..com / files / ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <table fo:keep-together.within-page="1"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"></td><td style="width:171px;"> 1 Reactie </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> 2 x ddPCR supermix </td><td style="width:171px;"> 12 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> Analysemengsel voor NF1 </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> Analysemengsel voor RPP30 </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> HaeIII </td><td style="width:171px;"> 0.6 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> Subtotaal </td><td style="width:171px;"> 15 </td><td style="width:99px;"> modelmengsel </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> DNA </td><td style="width:171px;"> 9 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> Totaal </td><td style="width:171px;"> 24 </td><td style="width:99px;"> Uiteindelijke PCR Mengsel </td></tr></tbody></table> Tabel 1 instellen Dual ddPCR Reaction <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Stap </td><td> Actie </td><td> Temperatuur </td><td> Tijd </td><td> Cycles </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Polymwissen activering </td><td> 95 ° C </td><td> 10 min </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> DNA denaturatie </td><td> 94 ° C </td><td> 30 sec </td><td rowspan="2"> 40 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Annealing / exetension </td><td> 60 ° C </td><td> 1 minuut </td></tr><tr><td> 4 </td><td> polymerase deactivering </td><td> 98 ° C </td><td> 10 min </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Hold (optioneel) </td><td> 4 ° C </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 2 PCR Cycler Instellingen

Het doel van dit protocol is om de specificiteit van geneesmiddelen tegen kanker in vitro die gemengde kweken die zowel tumor- en non-tumorcellen beoordelen.

Het beoordelen van specificiteit van geneesmiddelen tegen kanker<em&gt; In Vitro</em

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

Het algemene doel van deze procedure is om de dosisafhankelijke proportionele verandering van tumorcellen te beoordelen in een kweek die zowel tumorcellen als niet-tumorcellen bevat. Deze methode biedt een genetisch gebaseerd instrument om het in vitro effect en de specificiteit van antikankermedicijnen te beoordelen. Het heeft potentieel voor toepassing in geneesmiddelenonderzoek en in gepersonaliseerde kankerzorg.Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat wanneer een antikankergeneesmiddel wordt getest in een kweek die zowel tumorcellen als niet-tumorcellen bevat, de respons van de tumorcellen kan worden gescheiden van die van de niet-tumorcellen. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Eena, een laborant uit mijn laboratorium. Begin deze procedure door zowel de tumorcellen als de fibroblasten gedurende de nacht te kweken in standaard DMA-medium bij 37 °C en 5% koolstofdioxide.Oogst de cellen bij subconfluentie met 0,05% trypsine en tel ze met een hemocytometer. Meng vervolgens 400 tumorcellen en 1.600 niet-tumorcellen samen in elke put van een 96-wells kweekplaat met 0,2 mL medium en stel vier replica's in voor elke drugconcentratie. Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Bereid vervolgens de stockoplossingen van Nilotinib in DMSO voor bij 0, 2, 4 en 20 mM. Verdun elk van deze oplossingen 200 keer in 5 mL DMA-medium, wat resulteert in tweevoudig geconcentreerde drugoplossingen van 0, 10, 20 en 100 uM. Verwijder daarna 0,1 mL van het medium uit elke well.Voeg 0,1 mL medium toe dat het geneesmiddel bevat en laat de cellen nog vijf dagen incuberen. Inspecteer aan het einde van de behandeling de gehechte cellen met een fasecontrastmicroscoop en maak foto's. Aspireer het medium en was de overlevende adhesieve cellen één keer met 0,2 mL PBS.Voeg voor het lyseren van de cellen met de HotSHOT-methode 50 uL alkalische lysisonlossing toe aan elke put. Seal de putten met folie. Incubeer de plaat vervolgens 30 minuten bij 95 °C in een oven of op een kookplaat.Controleer na 30 minuten onder een microscoop of er geen intacte cellen meer aanwezig zijn aan het oppervlak van de wells. Indien de cellen niet volledig zijn gelyseerd, verleng dan de verhittingstijd of voeg detergent toe. Het eenmalig invriezen bij 20 Celsius degrees bevordert tevens het openbreken van de cellen.Voeg vervolgens 50 uL van de neutraliserende oplossing toe aan elke put, breng daarna alle lysaten over naar de U-vormige putten van een PCR-plaat en droog deze in een PCR-cycler bij 95 degrees Celsius gedurende 10 tot 30 minuten. Reconstitueer de lysaten daarna met 20 uL gedestilleerd water. Om DNA te ontzouten met behulp van dropdialyse, wordt een membraanfilter met een diameter van 25 mm verdeeld in vier gebieden, waarna de gebieden worden genummerd.Laat de filters drijven op gedestilleerd water met de glanzende zijde naar boven in een well van een 12-wells plaat. Pipetteer vervolgens de 20 uL gereconstitueerd lysaat voorzichtig op het filter. Dek de plaat af en dialyseer gedurende 30 tot 60 minuten.Zuig vervolgens het water onder het filter weg zonder het filter om te draaien of de druppels te verstoren. Breng de lysaatdruppels over naar de putjes van een nieuwe PCR-plaat. Droog daarna de DNA-druppels door de plaat 10 tot 30 minuten bij 95 °C te verhitten in een PCR-cycler.Reconstitueer vervolgens de lysaten in 10 uL water. Bereid daarna de mastermix voor met alle componenten, behalve het DNA, voor de dual probe digitale PCR-reactie. Vortex en centrifugeer de mastermix 10 seconden op maximale snelheid en breng 15 uL van het mengsel aan in elke well van een 96 PCR-plaat.Voeg het lysaat van elk monster toe aan de wells die de master mixture bevatten. Breng 20 uL van elk reactiemengsel over naar de well aan de monsterzijde van een cartridge bij kamertemperatuur. Dispenseer vervolgens 70 uL druppelgeneratorolie in elke well aan de oliezijde van een cartridge.Sluit de cartridge af met een pakking en plaats de gehele opstelling in een druppelgenerator voordat u start met het genereren van druppels. Breng vervolgens 40 uL van de druppeloplossing over naar elke put van een 96-well PCR-plaat. Seal de plaat met een folievel en plaats de plaat in een PCR-cycler.Stel vervolgens de temperatuur van het deksel in op 105 °C en de opwarmsnelheid op 2 °C per seconde. Wanneer dit voltooid is, wordt de plaat overgebracht naar een droplet reader en kan de uitlezing worden gestart. Als alternatief kan de plaat tot 24 uur worden bewaard bij 4 °C.Laad nu de digitale PCR-gegevens en voer de automatische analyse uit. Inspecteer de monsters handmatig om er zeker van te zijn dat de positieve en negatieve druppels goed gescheiden zijn. Sluit monsters zonder duidelijke scheiding tussen positieve en negatieve druppels uit van verdere analyse.Kopieer de resulterende ratio van NF1 ten opzichte van RPP30 naar een Excel-blad. Bereken vervolgens de proportie tumorcellen. Bereken voor elke drugconcentratie het gemiddelde en de standaarddeviatie van de vier replica's en plot vervolgens de gemiddelden en de standaarddeviaties tegen de drugconcentraties.Hier wordt de dosisafhankelijke afname van de zichtbare vitale cellen weergegeven. Het aandeel tumorcellen, berekend uit de ratio van NF1 ten opzichte van RPP30, nam af in het bereik van 0 tot 10 uM. Bij de hoogste dosis van 50 uM bleven er weinig vitale cellen over, waarschijnlijk als gevolg van een toxisch effect op alle cellen.De levensvatbaarheid en proliferatie van het totale aantal cellen kunnen worden gemeten met conventionele assays, maar het aandeel tumorcellen kan worden bepaald met de procedure die in deze studie wordt gedemonstreerd. Met behulp van deze twee parameters kan de totale celrespons op een geneesmiddel in een gemengde cultuur worden onderverdeeld in de respons van tumorcellen en de respons van niet-tumorcellen. De gehele testprocedure kan in één week worden voltooid, inclusief de behandelperiode van vijf dagen.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de ratio tussen het doelgen en het referentiegen varieert. We zien een zeer smal bereik, tussen 0 en 1, waardoor precisie essentieel is. Variatie tussen monsters en bij de hantering moet zoveel mogelijk worden beperkt.Volgens deze procedure kunnen ook primaire culturen die zowel tumorcellen als niet-tumocellen bevatten, worden gebruikt om het effect en de specificiteit van anti-kankergoederen te testen. Bovendien kan het effect van een geneesmiddel op een bepaalde subpopulatie cellen met een gedefinieerde genetische alteratie specifiek worden beoordeeld. Ik hoop dat deze video u zal helpen begrijpen hoe u genetische kenmerken kunt gebruiken om de proportie tumorcellen in een monster of in een cultuur die zowel tumorcellen als niet-tumocellen bevat, te bepalen.

assessing-specificity-of-anticancer-drugs-in-vitro

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Receptor tyrosine kinases worden ectopisch uitgedrukt in vele kanker en zijn geïdentificeerd als therapeutische doelwitten bij acute leukemie. Dit manuscript beschrijft een efficiënte strategie voor pre-klinische evaluatie van tyrosine kinase inhibitoren voor de behandeling van acute leukemie.

Pre-klinische evaluatie van tyrosinekinaseremmers voor de behandeling van acute leukemie

Werkwijze voor de synthese van lucht-gevoelige titaan en vanadium antikankermiddelen wordt beschreven, samen met de evaluatie van hun cytotoxische activiteit voor humane kankercellijn de MTT assay.

Anticancer Metal Complexen: Synthese en cytotoxiciteit Evaluatie door de MTT-test

Hier wordt real-time monitoring van het metabolisme van tumorcellen, gecombineerd met een in vivo kippenembryo chorio-allantoïsche membraan (CAM) model van metastase, gebruikt om nieuwe anti-kanker doelen/middelen te evalueren op hun vermogen om tumorcellen te sensitiviseren voor DNA-beschadigende chemotherapeutica.

Het evalueren van de effectiviteit van Cancer Drug Overgevoeligheid<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em

We presenteren een driedimensionaal (3D) longkankermodel gebaseerd op een biologisch collageenscaffold om gevoeligheid voor op non-kleincellige-longkanker-(NSCLC)-gerichte therapieën te bestuderen. We demonstreren verschillende meettechnieken om de proliferatie-index, apoptose en epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) status te bepalen. Verzamelde gegevens worden geïntegreerd in een in silico model voor voorspelling van drugsgevoeligheid.

Een gecombineerde 3D Weefselmanipulatieproducten<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Lung Tumor Model voor het voorspellen van de Drug Effectiveness in Specifieke Mutatie Achtergronden

Hier beschrijven we een protocol gericht op onderzoek naar de gevolgen van afwijkende splicing op resistentie in solide tumoren en hematologische maligniteiten. Om dit doel te bereiken, analyseerden we het transcriptoom profielen van de ouders en bestand in vitro modellen door middel van RNA-seq en vestigde een qRT-PCR-methode om kandidaatgenen te valideren.

Met behulp van RNA-sequencing te detecteren Novel Splice varianten Gerelateerd aan Drug Resistance in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cancer Models

Hier presenteren we de preklinische screening van antikanker coumarinen met behulp van 3D-cultuur en zebravissen.

Preklinische beoordeling van het topicale van de antikanker cumarine-OT48 door spheroïden, kolonie vorming Assays en Zebrafish Xenografts

Dit protocol wordt beschreven hoe synergie tussen een antikanker antilichaam en Antineoplastische drugs in preklinische modellen met behulp van de combinatie index vergelijking van Chou en Talalay beoordelen.

Potentiëring van antikanker antilichaam werkzaamheid door Antineoplastische Drugs: detectie van antilichaam-drug synergie met de combinatie Index vergelijking

Hier beschrijven we een in vitro co cultuur methode recursief uitdaging tumor-gerichte T-cellen, die het mogelijk voor fenotypische en functionele analyse van antitumorale T cel activiteit maakt.

In Vitro Tumor cel Rechallenge voor voorspellende evaluatie van chimeer antigeen Receptor T cel antitumorale functie

Een zeer nauwkeurig in vitro high-throughput testsysteem werd ontwikkeld om geneesmiddelen tegen kanker te evalueren met behulp van patiënt-afgeleide tumororganoïden (BOB's), vergelijkbaar met kankerweefsels, maar zijn ongeschikt voor in vitro high-throughput testsystemen met 96-well en 384-well platen.

High-Throughput In Vitro Assay met behulp van patiënt-afgeleide tumor organoïden

Een noodzakelijke stap in de ontwikkeling van aptameren tegen kanker is om de binding aan het doelwit te testen. We demonstreren een flowcytometrische test om deze binding te bestuderen, waarbij we het belang benadrukken van het opnemen van een negatieve controle aptamer en kankercellen die positief of negatief zijn voor dat specifieke eiwit.

Een flowcytometrie-gebaseerde celoppervlakeiwitbindingstest voor het beoordelen van selectiviteit en specificiteit van een antikanker aptamer

Hier presenteren we een methode om verbindingen te identificeren die het ADCC-mechanisme moduleren, een belangrijk kankerceldodend mechanisme van antitumorantilichamen. Het cytotoxische effect van NK-cellen wordt gemeten in sferoïden van borstkankercellen in aanwezigheid van Trastuzumab. Beeldanalyse identificeert levende en dode killer- en doelcellen in sferoïden.

Kwantificering van antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit in een tumorsferoïde model: aanvraag voor ontdekking van geneesmiddelen

Leer hoe u de specificiteit van kankergeneesmiddelen beoordeelt in vitro met gemengde culturen van tumor- en niet-tumorcellen. Deze methode maakt dosisafhankelijke responsanalyse mogelijk voor nauwkeurige geneesmiddelontwikkeling.

Het beoordelen van specificiteit van geneesmiddelen tegen kanker

Meer video's verkennen