Geregisseerd Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Bibliotheek Creatie en Screening
1 april 2016
We presenteren een gedetailleerd protocol om mutantenbibliotheken te construeren en te screenen voor gerichte evolutiecampagnes in Saccharomyces cerevisiae.
Het algemene doel van dit protocol is om te laten zien hoe mutantenbibliotheken in Saccharomyces Cerevisiae kunnen worden geconstrueerd en gescreend voor gerichte evolutie-experimenten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het laboratorium voor gerichte evolutie-experimenten, zoals hoe overlappende gebieden kunnen worden toegewezen voor in de assemblage en klonen. Het grote voordeel van deze techniek is de eenvoud en robuustheid, aangezien in slechts één transformatiestap iets van goede kwaliteit kan worden toegewezen.
Dit protocol voor het maken en screenen van mutantenbibliotheken zal worden gedemonstreerd voor een schimmel aryl-alcohol oxidase of AAO. De gebieden voor gerichte geëvolueerde richting worden eerst gekozen met behulp van computationele algoritmen op basis van de beschikbare kristalstructuur of homologiemodellen van het enzym. Twee gebieden van AAO zullen worden gericht op willekeurige mutagenese en recombinatie: de M1-regio en de M2-regio.
Mutagene PCR wordt uitgevoerd om de gerichte gebieden te versterken. Om in vivo splicing in gist te bevorderen, worden overlappende gebieden tussen segmenten van ongeveer 50 basenparen elk gemaakt door superpositie PCR-reacties van de gedefinieerde regio's. Bereid mutagene PCR's van 50 microliter volume, elk bevattend 46 nanogram DNA-sjabloon 90 nanomolar van zin- en antisense-primers 0,3 milimolar DNTP's, 3% DMSO, 1,5 milimolar magnesiumchloride, 05 milimolar mangaanchloride en 05 eenheden per microliter tack DNA-polymerase.
Gebruik het volgende PCR-programma. 95 graden Celsius gedurende twee minuten, 95 graden Celsius gedurende 45 seconden, 50 graden Celsius gedurende 45 seconden en 74 graden Celsius gedurende 45 seconden gedurende 28 cycli en 74 graden Celsius gedurende 10 minuten. De rest van het AAO-gen, het HF-gebied, wordt versterkt door hoge-fideliteit PCR met de corresponderende gebieden die overlappen met de mutagene segmenten en of gelineariseerde vector overhangs inbegrepen.
Bereid de hoge-fideliteit PCR in een eindvolume van 50 microliters met 10 nanogram DNA-sjabloon, 250 nanomolar van zin- en antisense-primers, 0,8 milimolar DNTP's, 3% DMSO en 02 eenheden per microliter iProof ultra hoge-fideliteit DNA-polymerase. Gebruik het volgende PCR-programma. 98 graden Celsius gedurende 30 seconden, 98 graden Celsius gedurende 10 seconden, 55 graden Celsius gedurende 25 seconden en 72 graden Celsius gedurende 45 seconden gedurende 28 cycli en 72 graden Celsius gedurende 10 minuten.
Alle PCR-fragmenten worden vervolgens gezuiverd met een commercieel gel-extractiekit volgens het protocol van de fabrikant. De volgende stap is het lineariseren van de vector om flankerende gebieden van ongeveer 50 basenparen te creëren die homoloog zijn aan de vijf prime en drie prime uiteinden van het doelgen. Bereid een linearisatiereactiemengsel van 20 microliters met 2 microgram DNA, 7,5 eenheden van BamH-een, 7,5 eenheden van XHO-een, 20 microgram BSA en twee microliters van 10x buffer BamH-een.
Incubeer de reactiemengsel gedurende twee uur en 40 minuten bij 37 graden Celsius. Daarna inactiveer de reactie gedurende 20 minuten bij 80 graden Celsius. Om de gelineariseerde vector te zuiveren om besmetting met het resterende circulaire plasmide te voorkomen, laadt u de verteringsreactiemix in de mega-well van een semi-preparatief laagsmeltend punt Agarose-gel.
Laad vijf microliter van de reactiemix in de aangrenzende well als reporter. Voer DNA-elektroforese uit bij vier graden Celsius en vijf volt per centimeter tussen elektroden. Scheid vervolgens de Agarose-gel die overeenkomt met de mega-well en bewaar deze bij vier graden Celsius in één XTAE.
Kleur de baan met de molecuulgewichtladder en de reporter. Visualiseer de banden onder UV-licht en knijp op de positie waar de gelineariseerde vector zich bevindt. Bij afwezigheid van UV-licht en met behulp van de richtlijnen van de knijpjes in de gekleurde reporterbaan, identificeert u de gelineariseerde vector in het mega-well-fragment en snijdt u deze uit.
Extracteer de gelineariseerde vector uit de Agarose en zuiver deze met een commerciële gelextractiekit volgens het protocol van de fabrikant. Vervolgens wordt de gezuiverde gelineariseerde vector gemengd met de PCR-fragmenten en deze DNA-mengsel wordt gebruikt om competente gistcellen te transformeren met behulp van een commercieel kit volgens de instructies van de fabrikant. Plateer de getransformeerde cellen op SC-dropoutplaten en incubeer ze gedurende drie dagen bij 30 graden Celsius.
Om voor deze assay voor te bereiden, plukt u individuele kolonies van de SC-dropoutplaten en brengt u ze over naar 96-wellplaten met elk 50 microliter minimaal medium per well. In elke plaat inoculeert u kolom nummer zes met de ouderlijke type als interne standaard. Als negatieve controle, inoculeert u well H-een gevuld met SC-media's aangevuld met uracil met URA3 negatieve ESI viscerale cellen zonder plasmide.
Dek de platen af met hun deksels, wikkel ze in parafilm en incubeer ze gedurende 48 uur bij 30 graden Celsius in een vochtige shaker. Voeg na 48 uur 160 microliter expressiemedium toe aan elke well en sluit de platen weer af. Incubeer gedurende nog eens 24 uur.
Nadat u de platen heeft gecentrifugeerd, gebruikt u een robotische multi-station voor vloeistofbehartiging om 20 microliter van het supernatant van de wells in elke plaat over te brengen naar een replicaplaat. Voeg 20 microliter van twee milimolar P-methoxybenzylalcohol en 100 milimolaren natriumfosfaatbuffer ph 6,0 toe aan elke well. Roer de platen kort met een 96-well plate mixer en incubeer ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
Voeg vervolgens 160 microliter van de FOX reageermiddel toe aan elke replicaplaat en roer kort met de mixer. Lees de platen op 560 nanometer op een plate reader. Incubeer de platen bij kamertemperatuur totdat de kleur zich ontwikkelt.
Meet de absorptie opnieuw. De relatieve activiteit wordt berekend uit het verschil tussen de absorptiewaarde na incubatie en die van de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de constructie en screening van mutante bibliotheken in Saccharomyces cerevisiae voor gericht evolutie-experimenten. Het benadrukt een eenvoudige aanpak die effectieve mutagenese en recombinatie mogelijk maakt.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Biotechnologie
- Genetische techniek
- Microbiologie
Achtergrond
- Gerichte evolutie is een methode die wordt gebruikt om eiwitten met gewenste eigenschappen te ontwikkelen.
- Saccharomyces cerevisiae dient als modelorganisme voor deze experimenten.
- Willekeurige mutagenese en recombinatie zijn belangrijke technieken in dit proces.
- Computationele algoritmen helpen bij het selecteren van doelgebieden voor mutagenese.
Doel van het onderzoek
- Om een protocol te demonstreren voor het maken en screenen van mutante bibliotheken.
- Om overlappende gebieden te identificeren voor assemblage en klonen in gerichte evolutie.
- Om specifieke regio's van het schimmel aryl-alcohol oxidase (AAO) te targeten voor verbetering.
Gebruikte methoden
- Selectie van doelgebieden met behulp van computationele algoritmen.
- Willekeurige mutagenese van de M1 en M2 regio's van AAO.
- Screening van mutante bibliotheken via een enkele transformatiestap.
- Beoordeling van de kwaliteit van de resulterende mutanten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle constructie van mutante bibliotheken in Saccharomyces cerevisiae.
- Identificatie van effectieve mutanten met gewenste eigenschappen.
- Demonstratie van de robuustheid van het protocol.
- Inzichten in het gerichte evolutieproces voor AAO.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor studies naar gerichte evolutie.
- Targeten van specifieke regio's verbetert de efficiëntie van mutagenese.
- Deze aanpak kan worden toegepast op verschillende eiwitten buiten AAO.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Directed evolution in yeast enables rapid generation of functional enzyme variants for biotechnological applications, reducing reliance on in vitro steps and accelerating protein engineering timelines. This approach supports target validation by linking genetic modifications to measurable activity improvements in a eukaryotic host. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing quantitative, secretion-linked activity readouts relevant to industrial enzyme production.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of structure-guided regions (M1, M2) to clarify functional contributions to enzyme activity.
- Operational Value: Uses overlapping ~50 bp homology arms for seamless in vivo reassembly, minimizing cloning steps and transformation burden.
- Scientific Value: Screens mutant libraries in yeast supernatants using a Fenton-based assay, directly correlating genotype with secreted enzyme function.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Employs a high-throughput, sensitive assay based on P-methoxybenzyl alcohol oxidation to quantify aryl-alcohol oxidase activity in 96-well format.
- Operational Value: Normalizes activity to parental type and uses internal controls (parental strain, negative control) to ensure assay robustness across plates.
- Scientific Value: Detects improved secretion and activity, enabling identification of variants with enhanced performance under screening conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates linearity of assay response with enzyme concentration, supporting reliable quantification across mutant libraries.
- Operational Value: Confirms assay performance in presence/absence of sorbitol, defining working range for accurate hit selection.
- Scientific Value: Validates hits through sequencing of active and non-active clones, linking phenotype to genotype for downstream characterization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates library construction and functional screening into a discovery workflow from target region selection to hit identification, enabling iterative enzyme optimization campaigns.
- Discovery Biology: Uses computational algorithms to select mutagenesis sites based on AAO structure, focusing evolution on functionally relevant regions.
- Screening: Delivers quantitative, supernatant-based activity readouts that support reproducible, plate-to-plate comparison of mutant function.
- Analytics: Measures relative activity via absorbance shift at 560 nm, normalized to parental strain, enabling objective variant ranking.
- Translational Research: Secretion-linked screening in yeast provides early insight into expressibility and function, relevant for biologics and industrial enzyme development.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to other eukaryotic genes, avoiding repeated optimization of PCR, recombination, and screening steps.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking targeted mutagenesis to measurable changes in enzyme activity and secretion.
- Operational Value: Achieves library construction and screening in ~4 hours post-transformation, enabling rapid design-build-test cycles.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enriching libraries with functional variants and minimizing false negatives through sensitive detection.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying mutants with improved activity, guiding investment toward promising enzyme candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast molecular biology, PCR optimization, and agarose gel purification for linearized vector preparation.
- Dependent on thermocyclers, gel electrophoresis systems, plate readers, and liquid-handling robots for supernatant transfer and reagent addition.
- Necessitates standardization of overlapping regions (~50 bp) and transformation efficiency to ensure consistent in vivo reassembly across projects.
- Adaptation to other genes may require re-evaluation of homology arm length, mutagenic conditions, and assay compatibility with target enzyme activity.
- Practical limitation: Assay sensitivity depends on substrate choice and buffer conditions; optimization may be needed for enzymes with low activity or alternative reaction mechanisms.
