Name: Geregisseerd Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Bibliotheek Creatie en Screening (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Leer hoe je mutantenbibliotheken bouwt en screent in Saccharomyces cerevisiae voor gerichte evolutie. Deze methode gebruikt computationele algoritmen om doelgebieden te selecteren voor mutagenese en recombinatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het project van de Europese Commissie Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; een Cost-Action CM1303-Systems Biocatalysis; en de nationale projecten Dewry [BIO201343407-R] en Cambios [RTC-2014-1777-3].

1. Mutant Bibliotheek Construction <ol><li> Kies de regio&#39;s moeten worden onderworpen aan MORPHING met behulp van algoritmes op basis van de beschikbare kristalstructuur of homologie modellen 18. <ol><li> Hier targeten twee gebieden van AAO van Pleurotus voor willekeurige mutagenese en recombinatie (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), terwijl de rest amplificeren van het gen (844 bp) van high-fidelity PCR (figuur 1). Opmerking: Meerdere segmenten kunnen worden bestudeerd door MORPHING op een onafhankelijke of gecombineerde manier 16. </li></ol></li><li> Versterken de doelgebieden door mutagene PCR. Maak overlappende gebieden tussen segmenten (~ 50 bp elk) door superpositie van PCR-reacties van de gedefinieerde regio&#39;s. <ol><li> Bereid mutagene PCR gerichte segmenten in een eindvolume van 50 pl bevattende DNA matrijs (0,92 ng / ul), 90 nM oligo zin (RMLN voor segment MI en AAO-BP segment M-II), 90 nM eenntisense primer (AAO-92C voor segment MI en RMLC voor segment M-II), 0,3 mM dNTPs (0,075 mM elk), 3% (v / v) dimethylsulfoxide (DMSO), 1,5 mM MgCl2, 0,05 mM MnCl2 en 0,05 U / ul Taq DNA polymerase. Primers sequenties zijn beschreven in figuur 1. </li><li> Gebruik de volgende PCR-programma: 95 ° C gedurende 2 min (1 cyclus); 95 ° C gedurende 45 seconden, 50 ° C gedurende 45 seconden, 74 ° C gedurende 45 seconden (28 cycli); en 74 ° C gedurende 10 min (1 cyclus). </li></ol></li><li> Versterken de niet-mutagene regio&#39;s met een ultra-high fidelity polymerase en omvatten de desbetreffende gebieden overlappen de mutagene segmenten en / of lineair vector overhangen. <ol><li> Bereid reactiemengsels in een eindvolume van 50 pl bevattende: DNA template (0,2 ng / ul), 250 nM oligo zin HFF, 250 nM oligo antisense HFR, 0,8 mM dNTPs (0,2 mM elk), 3% (v / v) dimethylsulfoxide (DMSO) en 0,02 U / pl iProof DNA polymerase. Primers sequenties worden beschreven in &lt;strong&gt; Figuur 1. </li><li> Gebruik de volgende PCR-programma: 98 ° C gedurende 30 sec (1 cyclus); 98 ° C gedurende 10 sec, 55 ° C gedurende 25 sec, 72 ° C gedurende 45 seconden (28 cycli); en 72 ° C gedurende 10 min (1 cyclus). Opmerking: Met de in 1.2 beschreven omstandigheden en 1,3 overlappingen van 43 bp (regio plasmide-M1); 46 bp (M1 regio-HF regio); 47 bp (HF regio-M2 gebied) en 61 bp (M2 regio- plasmide) worden gemaakt (Figuur 1) begunstigen in vivo in gist splicing. </li><li> Zuiveren de PCR-fragmenten (mutagene en niet-mutagene) met een commerciële gelextractiekit volgens het protocol van de fabrikant. </li></ol></li><li> Lineariseren de vector zodanig dat flankerende gebieden van ongeveer 50 bp worden gecreëerd die homoloog zijn aan de 5&#39;- en 3&#39;-uiteinden van het doelgen is. <ol><li> Bereid een linearisatie reactiemengsel dat 2 ug DNA, 7,5 U BamHI, 7,5 U XhoI, 20 ug BSA en 2 ui buffer Bam HI 10x in een eindvolume van 20 pl. </li><li> Incubeer het reactiemengsel bij 37 ° C gedurende 2 uur en 40 minuten. Daarna verder met inactivatie bij 80 ° C gedurende 20 min. </li></ol></li><li> Zuiver het gelineariseerde vector door agarose gel extractie om besmetting met de resterende circulair plasmide (figuur 2) te voorkomen. <ol><li> Laad de digestie reactiemengsel in de mega-putje van een semi-preparatieve laag smeltpunt agarose gel (0,75%, w: v) en een monster (5 pl) van het reactiemengsel in de aangrenzende en een reporter. </li><li> Run DNA elektroforese (5 V / cm tussen de elektroden, 4 ᵒC) en scheid de agarosegel die overeenkomt met de mega-goed en het op 4 ᵒC in 1x TAE. </li><li> Vlekken op de baan met het molecuulgewicht ladder en de verslaggever. Visualiseer de banden onder UV-licht. Nick de positie waar de gelineariseerde vector plaatsen. Opmerking: Als de kwaliteit van het gezuiverde gelineariseerde vector een critical factor voor een succesvolle recombinatie en assemblage in gist, vermijd gel kleuring voor semi-voorbereidende DNA elektroforese. Het gebruik van kleurstoffen en UV-belichting voor gelextractie kan de stabiliteit van de DNA vector beïnvloeden compromitteren de in vivo recombinatie efficiëntie. Als alternatief voor EtBr giftige kleurstoffen worden Gel Red en SYBR kleurstoffen gebruikt voor gel kleuring. </li><li> Bij afwezigheid van UV-licht, identificeren van de gelineariseerde vector in de mega-goed-fragment met behulp van de leiding van de inkepingen in het gebrandschilderde verslaggever rijbaan, zodat deze kunnen worden geïsoleerd. </li><li> Extraheer de gelineariseerde vector uit agarose en zuiveren met een commerciële gelextractiekit volgens het protocol van de fabrikant. Noot: Gebruik high-episomale shuttlevectoren met antibiotica en auxotrofie markers: In dit voorbeeld gebruikt de uracil onafhankelijke en ampicillineresistentie pJRoC30 vector, onder controle van de gist GAL1 promoter. </li></ol></li><li> Bereid een equimolaire mixture van de PCR-fragmenten en meng dit met de gelineariseerde vector met een 2: 1 verhouding van niet minder dan 100 ng gelineariseerde plasmide (test verschillende verhoudingen van equimolaire bibliotheek / openen vector voor transformatie goede opbrengst te bereiken). <ol><li> Meet de absorptie van de PCR-fragmenten en de lineair gemaakte vector bij 260 nm en 280 nm voor de concentratie en zuiverheid te bepalen. </li></ol></li><li> Transformeren gist competente cellen met het DNA-mengsel met een commerciële gist transformatie kit (zie Tabel voor leveringen) volgens de instructies van de fabrikant. <ol><li> Hier, gebruik dan een protease deficiënt URA3 en - afhankelijk van S. cerevisiae stam, BJ5465. Transformeer de cellen met de parentale gecirculariseerde vector als interne standaard bij screening (zie hieronder). Bovendien, controleer dan de achtergrond door het transformeren van de gelineariseerde vector in de afwezigheid van PCR-fragmenten. Opmerking: In het geval van het detecteren van de eerste laag secretie niveaus, gebruiken S.cerevisiae protease deficiënte stammen BJ5465 zoals de accumulatie van actieve eiwitten in kweeksupernatanten bevorderen. Als het doel enzym ondergaat hyperglycosylering, het gebruik van glycosylering-deficiënte stammen (bijvoorbeeld Δ kre2 dat alleen kan hechten kleinere mannose oligomeren) kan een geschikte optie. </li></ol></li><li> Plaat de getransformeerde cellen op SC drop-out platen en incubeer ze op 30 ° C gedurende drie dagen. Plaat (op SC drop-out platen, aangevuld met uracil) URA3 - S. cerevisiae cellen zonder het plasmide als een negatieve controle voor screening (zie hieronder). </li></ol> 2. High-throughput screeningstest (figuur 3) <ol><li> Vul een passend aantal steriele 96-putjesplaten (23 platen een bibliotheek van 2000 klonen analyseren) met 50 ul minimaal medium per putje met behulp van een robot pipetteren. </li><li> Pick individuele kolonies van de SC-uitval platen en overbrengen naar de 96-well platen. <ol><li> In elke plaat, te enten kolom nummer 6 met de ouderlijke soort als een interne standaard en goed H1 met URA3 - S. cerevisiae cellen (SC in medium aangevuld met uracil) zonder plasmide als een negatieve controle. Opmerking: Nou H1 is speciaal gevuld met drop-out media, aangevuld met uracil. Een blanco putje medium zonder cellen kunnen ook worden bereid als extra controle steriliteit. </li></ol></li><li> Bedek de platen met hun deksels en wikkel ze in Parafilm. Incubeer de platen gedurende 48 uur bij 30 ° C, 225 rpm en 80% relatieve vochtigheid in een vochtige shaker. </li><li> Verwijder de Parafilm, voeg 160 pl expressie medium aan elk putje met behulp van de robot pipetteren, bedek de platen en incubeer ze nog eens 24 uur. Let op: minimaal medium en expressie medium worden bereid als elders 19 gerapporteerd. Uitscheidingsniveaus kan afhankelijk van het gen bestudeerde variëren en dienovereenkomstig tHij incubatietijden geoptimaliseerd moet worden telkens de celgroei synchroniseren alle putjes. </li><li> Centrifugeer de platen (meesterplaten) bij 2800 x g gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Overdracht 20 ul van de supernatant uit de putjes in de moederplaat de replica plaat met een vloeistofverwerking robot meerdere stations. Opmerking: Om enzym secretie bevorderen verdient het aanbeveling het natieve signaalpeptide van het doelwiteiwit te vervangen door signaalpeptiden gebruikt voor heterologe expressie in gist (bijvoorbeeld de α-factor prepro-leader, de leider van de K 1 killer toxine van S. cerevisiae, of chimère versies van beide peptiden 13). Als alternatief kan het natieve signaalpeptide uitsluitend ontwikkeld voor uitscheiding in gist. </li><li> Voeg 20 ul van 2 mM p -methoxybenzylalcohol in 100 mM natriumfosfaatbuffer pH 6,0 met behulp van de robot pipetteren. Roer de platen kort met een 96-well plaat mixer en incubeer ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Het pipetteren robot, voeg 160 ul van de FOX reagens aan elke replica plaat en roer kort met de mixer (eindconcentratie van FOX mengsel in de put: 100 uM xylenol oranje, 250 uM Fe (NH4) 2 (SO4) 2 en 25 mM H 2 SO 4). <ol><li> Voeg enkele additieven voor reagens gevoeligheid, zoals organische hulpoplosmiddelen (DMSO, ethanol, methanol) of sorbitol 17 verbeteren. Hier, versterken de reactie door toevoeging van sorbitol tot een uiteindelijke concentratie van 100 mM (Figuur 4). </li></ol></li><li> Lees de platen (end-point mode, t 0) bij 560 nm op een plaatlezer. </li><li> Incubeer de platen bij RT tot de kleurontwikkeling en opnieuw meten van de absorptie (t 1). <ol><li> Bereken de relatieve activiteit van het verschil tussen de waarde na incubatie Abs en die van de eerste meting in dat van de parental soort voor elke plaat (At 1 - t 0). </li></ol></li><li> Betreft de beste mutant hits op twee opeenvolgende re-screenings uit te sluiten valse positieven. Opmerking: Meestal opnieuw screenings omvatten plasmide isolatie van gist, amplificatie en zuivering van Escherichia coli, gevolgd door transformatie van verse gistcellen met plasmide 19. Elke geselecteerde kloon wordt opnieuw gescreend pentaplicate. </li></ol>

<ol><li>Jäckel, C., Hilvert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalysts+by+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biocatalysts by evolution.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21 (6), 753-759 (2010).</li>
<li>Bornscheuer, U. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+third+wave+of+biocatalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineering the third wave of biocatalysis.</a> Nature. 485 (7397), 185-194 (2012).</li>
<li>Renata, H., Wang, Z. W., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+enzyme+universe%3A+accessing+non-natural+reactions+by+mechanism-guided+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Expanding the enzyme universe: accessing non-natural reactions by mechanism-guided directed evolution.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54 (11), 3351-3367 (2015).</li>
<li>Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22AIChE+J%22%5BJournal%5D)">Directed evolution: past, present and future.</a> AIChE J. 59 (5), 1432-1440 (2013).</li>
<li>Abatemarco, J., Hill, A., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+metabolic+engineering+toolbox+with+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Expanding the metabolic engineering toolbox with directed evolution.</a> Biotechnol. J. 8 (12), 1397-1410 (2013).</li>
<li>Pourmir, A., Johannes, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution%3A+selection+of+the+host+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Struct+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Directed evolution: selection of the host organism.</a> Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), e201209012(2012).</li>
<li>Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+for+yeast+metabolic+engineering%3A+lessons+from+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Opportunities for yeast metabolic engineering: lessons from synthetic biology.</a> Biotechnol J. 6 (3), 262-276 (2011).</li>
<li>Gonzalez-Perez, D., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+in+directed+evolution%3A+an+efficient+tool+to+improve+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae in directed evolution: an efficient tool to improve enzymes.</a> Bioeng Bugs. 3, 172-177 (2012).</li>
<li>Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+protocols+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+In+Vivo+Overlap+Extension%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis protocols in Saccharomyces cerevisiae by In Vivo Overlap Extension.</a> Methods Mol. Biol. 634, 3-14 (2010).</li>
<li>Bulter, T., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+libraries+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparing libraries in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods. Mol. Biol. 231, 17-22 (2003).</li>
<li>Ostrov, N., Wingler, L. M., Cornish, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+assembly+and+combinatorial+libraries+in+S.+cerevisiae+via+reiterative+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene assembly and combinatorial libraries in S. cerevisiae via reiterative recombination.</a> Methods. Mol. Biol. 978, 187-203 (2013).</li>
<li>Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+assembler%2C+an+in+vivo+genetic+method+for+rapid+construction+of+biochemical+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways.</a> Nucleic Acids Res. 37 (2), e16(2009).</li>
<li>Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+ligninolytic+enzyme+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering the ligninolytic enzyme consortium.</a> Trends Biotechnol. 33 (3), 155-162 (2015).</li>
<li>Garcia-Ruiz, E. Directed evolution of ligninolytic oxidoreductases: from functional expression to stabilization and beyond. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarcia-Ruiz%2C+E+%22Cascade+Biocatalysis%3A+integrating+stereoselective+and+environmentally+friendly+reactions%22">Cascade Biocatalysis: integrating stereoselective and environmentally friendly reactions</a>. , Wiley-VCH. 1-22 (2014).</li>
<li>Hernandez-Ortega, A., Ferreira, P., Martinez, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+aryl-alcohol+oxidase%3A+a+peroxide-producing+flavoenzyme+involved+in+lignin+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fungal aryl-alcohol oxidase: a peroxide-producing flavoenzyme involved in lignin degradation.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (4), 1395-1410 (2012).</li>
<li>Gonzalez-Perez, D., Molina-Espeja, P., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenic+organized+recombination+process+by+homologous+in+vivo+grouping+%28MORPHING%29+for+directed+enzyme+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mutagenic organized recombination process by homologous in vivo grouping (MORPHING) for directed enzyme evolution.</a> PLoS One. 9, e90919(2014).</li>
<li>Rhee, S. G., Chang, T., Jeong, W., Kang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Detection+and+Measurement+of+Hydrogen+Peroxide+Inside+and+Outside+of+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Methods for Detection and Measurement of Hydrogen Peroxide Inside and Outside of Cells.</a> Mol. Cells. 29 (6), 539-549 (2010).</li>
<li>Sebestova, E., Bendl, J., Brezovsky, J., Damborsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+tools+for+designing+smart+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computational tools for designing smart libraries.</a> Methods. Mol. Biol. 1179, 291-314 (2014).</li>
<li>Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Ferreira, P., Martinez, A. T., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+directed+evolution+of+aryl-alcohol+oxidase+in+yeast+using+chimeric+signal+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Focused directed evolution of aryl-alcohol oxidase in yeast using chimeric signal peptides.</a> Appl. Environ. Microbiol. , (2015).</li>
<li>Gay, C., Collins, J., Gebicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroperoxide+Assay+with+the+Ferric-Xylenol+orange+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Hydroperoxide Assay with the Ferric-Xylenol orange Complex.</a> Anal. Biochem. 273 (2), 149-155 (1999).</li>
<li>Reetz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalysis+in+organic+chemistry+and+biotechnology%3A+Past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biocatalysis in organic chemistry and biotechnology: Past, present, and future.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).</li>
<li>Mate, D. M., Gonzalez-Perez, D., Mateljak, I., Gomez de Santos, P., Vicente, A. I., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pocket+manual+of+directed+evolution%3A+Tips+and+tricks%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+of+Microbial+Enzymes%3A+Production%2C+Biocatalysis+and+Industrial+Applications%22%5BJournal%5D)">The pocket manual of directed evolution: Tips and tricks.</a> Biotechnology of Microbial Enzymes: Production, Biocatalysis and Industrial Applications. , Elsevier. Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Chao, R., Yuan, Y., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+DNA+assembly+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances in DNA assembly technologies.</a> FEMS Yeast Res. 15, 1-9 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit artikel hebben we samengevat het grootste deel van de tips en trucs die werkzaam zijn in ons laboratorium om enzymen ingenieur door gerichte evolutie in S. cerevisiae (met AAO ter illustratie) zodat ze kunnen worden aangepast voor gebruik met vele andere eukaryote enzymsystemen door simpelweg na de gemeenschappelijke benadering beschreven. Qua bibliotheek schepping MORPHING is een snel-pot methode te introduceren en recombineren willekeurige mutaties in kleine stukjes eiwit t...

Gerichte moleculaire evolutie is een robuuste, snelle en betrouwbare methode om enzymen ontwerpen 1, 2. Door iteratieve ronden van willekeurige mutatie, recombinatie en screening, verbeterde versies van enzymen kan worden gegenereerd die inwerken op nieuwe substraten in nieuwe reacties, in niet-natuurlijke omgevingen of zelfs de cel te helpen nieuwe metabole doelen 3-5 bereiken. Onder de gastheren gebruikt in gerichte evolutie, van de brouwer gist Saccharomyces cerevisiae heeft een repertoire van oplossingen voor de functionele expressie van complexe eukaryote eiwitten die anders niet beschikbaar in prokaryotische tegenhangers 6,7 zijn. Uitvoerig gebruikt in celbiologische Dit kleine eukaryotische model heeft vele voordelen in termen van posttranslationele modificaties, gemakkelijke manipulatie en transformatie-efficiëntie, die allemaal belangrijke eigenschappen om enzymen te construeren door gerichte evolutie 8. Bovendien is de hoogfrequentevan homologe DNA recombinatie in S. cerevisiae gekoppeld aan een efficiënte proof-leesapparaat opent een breed scala aan mogelijkheden voor de bibliotheek creatie en gen-assemblage in vivo, het bevorderen van de ontwikkeling van verschillende systemen van enkele enzymen om complexe kunstmatige paden 9-12. Ons laboratorium heeft de afgelopen tien jaar van het ontwerp gereedschappen en strategieën voor de moleculaire evolutie van verschillende ligninasen in gist (oxidoreductases betrokken bij de afbraak van lignine in het hout verval) 13-14. In deze mededeling, presenteren we een gedetailleerd protocol voor te bereiden en het scherm mutant bibliotheken in S. cerevisiae een model flavooxidase, -aryl-alcohol oxidase (AAO 15) -, welke gemakkelijk vertalen vele andere enzymen. Het protocol gaat om een gerichte-evolutie methode (MORPHING: Mutageen Organized Recombinatie Process door homologe in vivo Groepering) bijgestaan ​​door het gistcel apparaat 16, eenda zeer gevoelige screening assay gebaseerd op de Fenton reactie om AAO activiteit afgescheiden in het kweekmedium 17 te detecteren.

<table><tbody><tr><td>1. Cultuur media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin natriumzout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>CAS N&ordm; 69-52-3 M.W. 371.39</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Cloramfenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td>CAS N&ordm; 56-75-7 M.W. 323.13</td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td>CAS N&ordm; 59-23-4 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>CAS N&ordm; 50-99-7 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-Raffinose pentahydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83400</td><td>CAS N&ordm; 17629-30-0 M.W. 594.51</td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Difco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat monobasicum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>CAS N&ordm; 7778-77-0 M.W. 136.09</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U1128</td><td></td></tr><tr><td>Gist Extract</td><td>Difco</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base zonder aminozuren</td><td>Difco</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements zonder uracil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1501</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>2. PCR-reacties</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP-mix</td><td>Agilent genomics</td><td>200415-51</td><td>25 mM elk</td></tr><tr><td>iProof High-Fidelity DNA polymerase</td><td>Bio-rad</td><td>172-5301</td><td></td></tr><tr><td>Mangaan(II)chloride tetrahydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td>CAS N&ordm; 13446-34-9 M.W. 197.91</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4545</td><td>Voor foutgevoelige PCR</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>3. Plasmide linearisatie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI restrictie-enzym</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI restrictie-enzym</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Not I restrictie-enzym</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Gel Red</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Voor het kleuren van DNA</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>4. FOX-assays</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium ijzer(II)sulfaat hexahydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3754</td><td>CAS N&ordm; 7783-85-9 M.W. 392.14</td></tr><tr><td>Anysil Alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W209902</td><td>CAS N&ordm; 105-13-5 M.W. 138.16</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td>CAS N&ordm; 50-70-4 M.W. 182.17</td></tr><tr><td>Waterstofperoxide 30%</td><td>Merck Millipore</td><td>1072090250</td><td>FOX standaardcurve</td></tr><tr><td>Xylenol Orange dinatriumzout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52097</td><td>CAS N&ordm; 1611-35-4 M.W. 716.62</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>5. Agarose gel materiaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Norgen</td><td>28035</td><td>CAS N&ordm; 9012-36-6</td></tr><tr><td>Gel Red</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>DNA-analysekleurstof</td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td>DNA M.W. standaard</td></tr><tr><td>Loading Dye 6x</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Laagsmeltende agarose</td><td>Bio-rad</td><td>161-3112</td><td>CAS N&ordm; 39346-81-1</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>6. Kits en cellen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae stam BJ5465</td><td>LGC Promochem</td><td>ATTC 208289</td><td>Protease-deficiënte stam met genotype: MAT&alpha; ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL</td></tr><tr><td>E. coli XL2-Blue competente cellen</td><td>Agilent genomics</td><td>200150</td><td>Voor plasmide-zuivering en amplificatie</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel en PCR Clean-up Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,609,250</td><td>DNA gel extractie</td></tr><tr><td>NucleoSpin Plasmid Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,588,250</td><td>Column miniprep Kit</td></tr><tr><td>Yeast Transformation Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>YEAST1-1KT</td><td>Inclusief DNA carrier (Salmon testes)</td></tr><tr><td>Zymoprep yeast plasmid miniprep I</td><td>Zymo research</td><td>D2001</td><td>Plasmidecodextractie uit gist</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>7. Platen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well platen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>Helder, niet-steriele, polystyreen (voor activiteitsmetingen)</td></tr><tr><td>96-well platen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655161</td><td>Helder, steriele, polystyreen (voor microfermentaties)</td></tr><tr><td>96-well platen deksel</td><td>Greiner Bio-One</td>

geregisseerd evolution method in<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em&gt;: mutant bibliotheek creatie en screening

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Evolutie in Saccharomyces cerevisiae biedt vele aantrekkelijke voordelen bij het ​​ontwerpen van enzymen voor biotechnologische toepassingen, een proces dat de constructie, klonering en expressie van mutante bibliotheken, gekoppeld met hoge frequentie homologe DNA recombinatie in vivo omvat. Hier presenteren we een protocol en het scherm mutante bibliotheken in gist hand van het voorbeeld van een schimmel aryl-alcohol oxidase (AAO) om haar totale activiteit verhogen creëren. Twee eiwitsegmenten werden onderworpen aan gerichte gerichte evolutie door willekeurige mutagenese en DNA in vivo recombinatie. Overhangen ~ 50 bp flankerend elk segment kon de juiste montage van de AAO-fusiegen in een gelineariseerde vector waardoor een volledig autonoom replicerend plasmide. Mutant bibliotheken verrijkt met functionele AAO varianten werden vertoond in S. cerevisiae supernatanten met een gevoelige high-throughput assay gebaseerd op de Fenton reactie. Het algemene proces vanbibliotheek bouw in S. cerevisiae beschreven kunnen gemakkelijk worden toegepast op vele andere eukaryote genen evolueren vermijden extra PCR reacties, in vitro DNA recombinatie en ligatiestappen.

AAO van P. eryngii is een extracellulair flavooxidase dat schimmel peroxidasen voorziet van H 2 O 2 beginnen aanvallen lignine. Twee segmenten van AAO werden onderworpen aan gerichte evolutie van MORPHING om de activiteit en de expressie in S. verbeteren 19 cerevisiae. Ongeacht de buitenlandse enzymen koesterde door S. cerevisiae, de meest kritieke punt bij de bouw mutant bibliotheken in gist betreft de engineering van ...

We presenteren een gedetailleerd protocol om mutantenbibliotheken te construeren en te screenen voor gerichte evolutiecampagnes in Saccharomyces cerevisiae.

Geregisseerd Evolution Method in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliotheek Creatie en Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Het algemene doel van dit protocol is om te laten zien hoe mutantbibliotheken in Saccharomyces Cerevisiae kunnen worden geconstrueerd en gescreend voor experimenten met gerichte evolutie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen bij de creatie in het laboratorium voor gerichte evolutie-experimenten, zoals het toewijzen van overlappende gebieden voor de assemblage en klonering. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de eenvoud en robuustheid, aangezien er in slechts één transformatiestap kwalitatief goede niveaus kunnen worden toegewezen.Dit protocol voor het creëren en screenen van mutantenbibliotheken wordt gedemonstreerd voor een schimmelarilalcohol-oxidase of AAO. De regio's voor gerichte evolutie worden eerst gekozen met behulp van computationele algoritmen op basis van de beschikbare kristalstructuur of homologiemodellen van het enzym. Twee regio's van AAO zullen het doelwit zijn voor willekeurige mutagenese en recombinatie: de M1-regio en de M2-regio.Mutagene PCR zal worden uitgevoerd om de doelgebieden te amplificeren. Om in vivo splicing in gist te bevorderen, zullen overlappende gebieden tussen segmenten van ongeveer 50 basenparen elk worden gecreëerd door PCR-reacties van de gedefinieerde regio's over elkaar heen te leggen. Bereid mutagene PCR-reacties van 50 µL voor, elk bestaande uit 46 ng DNA-template, 90 nM van zowel de sense- als antisense-primers, 0,3 mM dNTP's, 3% DMSO, 1,5 mM magnesiumchloride, 0,5 mM mangaanchloride en 0,5 units per µL Taq DNA-polymerase.Gebruik het volgende PCR-programma: 95 °C gedurende twee minuten, 95 °C gedurende 45 seconden, 50 °C gedurende 45 seconden en 74 °C gedurende 45 seconden voor 28 cycli, en 74 °C gedurende 10 minuten. Het resterende deel van het AAO-gen, de HF-regio, zal worden geamplificeerd via high-fidelity PCR, waarbij de overeenkomstige gebieden die overlappen met de mutagenische segmenten en/of gelineariseerde vector-overhangs zijn opgenomen.Bereid de high-fidelity PCR voor in een eindvolume van 50 µL bestaande uit 10 ng DNA-template, 250 nM van elk de sense- en antisense-primers, 0,8 mM dNTP's, 3% DMSO en 0,2 units per µL iProof ultra high-fidelity DNA-polymerase. Gebruik het volgende PCR-programma: 98 °C gedurende 30 seconden, gevolgd door 28 cycli van 98 °C gedurende 10 seconden, 55 °C gedurende 25 seconden en 72 °C gedurende 45 seconden, en een finale stap van 72 °C gedurende 10 minuten.Alle PCR-fragmenten worden vervolgens gezuiverd met een commerciële gel-extractiekit volgens het protocol van de fabrikant. De volgende stap is het lineariseren van de vector om flankerende regio's van ongeveer 50 basenparen te creëren die homoloog zijn aan de 5'- en 3'-uiteinden van het doelgen. Bereid een linearisatiereactiemengsel van 20 µL voor met 2 µg DNA, 7,5 units BamH-I, 7,5 units Xho-I, 20 µg BSA en twee µL 10x BamH-I buffer.Incubeer het reactiemengsel 2 uur en 40 minuten bij 37 °C. Inactiveer daarna de reactie door deze 20 minuten bij 80 °C te houden. Om de gelineariseerde vector te zuiveren en contaminatie met het resterende circulaire plasmide te voorkomen, wordt het digestiemengsel in de mega-well van een semi-preparatieve agarosegel met laag smeltpunt geladen.Breng vijf µL van het reactiemengsel aan in de aangrenzende well als referentie. Voer DNA-elektroforese uit bij vier °C en vijf V/cm tussen de elektroden. Scheid vervolgens de agarosegel die overeenkomt met de mega-well en bewaar deze bij vier °C in één XTAE.Kleur de baan met de moleculaire gewichtsmarker en de reporter. Visualiseer de banden onder UV-licht en markeer de positie waar de gelineariseerde vector zich bevindt. Identificeer in afwezigheid van UV-licht, met behulp van de markeringen in de gekleurde reporterbaan, de gelineariseerde vector in het mega-well fragment en snijd deze uit.Extraheer de gelineariseerde vector uit de agarose en zuiver deze met een commerciële gelextractiekit volgens het protocol van de fabrikant. Vervolgens wordt de gezuiverde gelineariseerde vector gemengd met de PCR-fragmenten en wordt dit DNA-mengsel gebruikt om competente gistcellen te transformeren met een commerciële kit volgens de instructies van de fabrikant. Plaats de getransformeerde cellen op SC-dropoutplaten en incubeer deze gedurende drie dagen bij 30 °C.Ter voorbereiding op deze assay worden individuele kolonies van de SC-dropoutplaten gepickt en overgebracht naar 96-wells-platen die per well 50 µL minimaal medium bevatten. Inoculeer in elke plaat kolom zes met het oudertype als interne standaard. Als negatieve controle wordt well H-1, gevuld met SC-medium aangevuld met uracil, geïnoculeerd met URA3-negatieve ESI-viscerale cellen zonder plasmide.Dek de platen af met hun deksels, wikkel ze in parafilm en incubeer ze gedurende 48 uur bij 30 graden Celsius in een bevochtigde shaker. Voeg na 48 uur 160 microliters expressiemedium toe aan elke well en sluit de platen opnieuw. Incubeer gedurende nog eens 24 uur.Na het centrifugeren van de platen wordt een robotisch vloeistofbehandelingstation gebruikt om 20 µL van het supernatant uit de wells van elke plaat over te brengen naar een replicaplaat. Voeg 20 µL van 2 mM p-methoxybenzylalcohol en 100 mM natriumfosfaatbuffer pH 6,0 toe aan elke well. Meng de platen kort met een 96-well platenmenger en incubeer ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens 160 µL van het FOX-reagens toe aan elke replica-plaat en roer kort met de mixer. Lees de platen af bij 560 nm op een plaatlezer. Incubeer de platen bij kamertemperatuur totdat de kleur zich heeft ontwikkeld.Meet de absorptie opnieuw. De relatieve activiteit wordt berekend uit het verschil tussen de absorptiewaarde na incubatie en die van de initiële meting, genormaliseerd naar het oudertype voor elke plaat. Deze representatieve gelafbeelding toont de gelineariseerde vector in baan twee, het M1 PCR-segment in baan drie, het M2 PCR-segment in baan vier, het HF PCR-segment in baan vijf en de in vivo geassembleerde vector gelineariseerd met NHE 1 in baan zes.Deze volgende gel toont de plasmid mini-prep van de geassembleerde vector in baan twee, het plasmid gelineariseerd met NHE I in baan drie, het plasmid gelineariseerd met BamH I en Xho I in baan vier, en het gelineariseerde plasmid verkregen door gel-extractie en zuivering in baan vijf. De mutatiebelasting werd aangepast door mutantbibliotheken met verschillende landschappen te bemonsteren, waarbij het aantal klonen met minder dan 10% van de ouderlijke enzymactiviteit werd berekend, gevolgd door verdere verificatie door sequencing van een willekeurige steekproef van actieve en niet-actieve varianten. Een evaluatie van de detectielimiet van deze assay toonde aan dat de assay lineair was in de aanwezigheid van sorbitol, weergegeven door zwarte cirkels.In afwezigheid van sorbitol, weergegeven door de witte vierkantjes, was de lineariteit hardnekkiger, maar was de respons zwakker. Er werd een lineaire correlatie waargenomen tussen de AAO-concentratie en de absorbantie. Er werd een mutantenbibliotheek van 2.000 klonen geconstrueerd en gescreend met deze assay.Het gearceerde vierkant geeft de AAO-mutanten aan met een aanzienlijk verbeterde secretie en activiteit tegen P-methoxybenzylalcohol. Zodra de methode onder de knie is, kunnen mutantenbibliotheken in ongeveer vier uur worden gemaakt, mits dit correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met het toewijzen van juiste overlappende gebieden voor elke PCR-familie en gelineariseerde vector voor in vivo splicing en klonering in één enkele transformationele stap.Volgens een soortgelijke benadering kunnen andere methoden, zoals in vivo DNA-bemonstering, verzadigingsmutagenese-bibliotheken of DNA-assemblage, worden uitgevoerd om mutantenbibliotheken en/of metabole routes te construeren. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de bio-engineering om activiteiten en stabiliteiten te onderzoeken, of zelfs om oneindig veel soorten interacties te bedenken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u dit Saccharomyces Cerevisiae-instrument kunt inzetten voor de constructie en screening van bibliotheken

directed-evolution-method-saccharomyces-cerevisiae-mutant-library

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier laten we zien een eenvoudig protocol om een ​​willekeurige mutant bibliotheek te creëren voor een bepaalde doelsequentie. We laten zien hoe deze methode, die in vivo uitgevoerd in Escherichia coli, kan worden gecombineerd met functionele selecties van nieuwe enzymatische activiteiten evolueren.

Mutagenese en functionele selectie Protocollen voor Gerichte ontwikkeling van eiwitten in E. coli</em

We hebben uitgebreide, onpartijdige genoom-brede schermen van gen-drugs-en gen-omgeving interacties te begrijpen. Methoden voor het screenen van deze mutant collecties worden gepresenteerd.

Concurrerende Genomische Schermen van streepjescode Gist Bibliotheken

Een nieuwe methode gerichte evolutie eigen aan de thermostabiliteit van techniek is ontwikkeld en dus gevalideerd voor bacteriolytische enzymen. Na een ronde van willekeurige mutagenese, een geëvolueerd bacteriolytische enzym PlyC 29C3, weergegeven groter is dan tweemaal de restactiviteit in vergelijking met het wild-type eiwit na incubatie verhoogde temperatuur.

Een nieuwe screeningsmethode voor de gerichte evolutie van thermostabiele Bacteriolytic Enzymen

Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methodologie voor willekeurige mutagenese van een target-gen in kernsplijting gist. Als voorbeeld, wij de doelstelling van rpt4 +, die codeert een subeenheid van de 19S proteasoom, en het scherm voor mutaties die heterochromatin te destabiliseren.

Gen-gerichte willekeurige mutagenese Heterochromatin-destabiliserende proteasoom mutanten in Fission gist selecteren

Dit artikel presenteert een paring gebaseerde methode om overexpressie screening in ontluikende gist met behulp van een gekleed plasmide-bibliotheek.

Paring gebaseerde overexpressie bibliotheek Screening in het gist

Wij presenteren een eenvoudige suppressor scherm protocol in kernsplijting gist. Deze methode is efficiënt, mutageen-vrije en selectieve voor mutaties die vaak bij een enkele genomic locus voorkomen.  Het protocol is geschikt voor het isoleren van suppressors die verlichten van gebreken van de groei in vloeibare cultuur die worden veroorzaakt door een mutatie of een drug.

Een Deep-sequencing-bijgewoonde, spontane Suppressor scherm in de kernsplijting gist Schizosaccharomyces pombe

De endonucleases van de beperking met nieuwe opeenvolgingsspecificiteit kunnen van enzymen worden ontwikkeld die een gedeeltelijk gedegenereerde opeenvolging erkennen. Hier bieden we een gedetailleerd protocol dat we met succes gebruikt om de volgorde specificiteit van NlaIV enzym te veranderen. De belangrijkste ingrediënten van het protocol zijn de in vitro compartimentering van de transcriptie/vertaalreactie en selectie van varianten met nieuwe sequentiespecifiekekenmerken.

In Vitro Gerichte Evolutie van een beperking Endonuclease met strengere specificiteit

Dit werk beschrijft een protocol voor een multicopy suppressor genetische screening in Schizosaccharomyces pombe. Dit scherm maakt gebruik van een genoombrede plasmidebibliotheek om suppressorkloon (en) van een functieverliesfenotype geassocieerd met een querymutantenstam te identificeren. Nieuwe genetische onderdrukkers van de ell1 null-mutant werden geïdentificeerd met behulp van dit scherm.

Genetische screening voor identificatie van multicopy suppressors in Schizosaccharomyces pombe

De interacties van biomoleculen, zoals eiwit-eiwitinteracties, vormen de moleculaire basis van biologische functies. Als interactie-nulle/gestoorde mutanten die specifiek de relevante interactie missen, kunnen worden geïsoleerd, zullen ze enorm helpen om de functie(s) van deze interactie te begrijpen. Dit artikel presenteert een efficiënte manier om interactie-null/verminderde mutanten te isoleren.

Isoleren van interactie-null/aangetaste mutanten met behulp van de gist-twee-hybride test

Dit protocol beschrijft de essentiële stappen voor het uitvoeren van selectiecampagnes voor gistoppervlakken om eiwitvarianten te verrijken die binden aan een interessant antigeen.

Eiwittechniek door gist Surface Display

Leer hoe je mutantenbibliotheken bouwt en screent in Saccharomyces cerevisiae voor gerichte evolutie. Deze methode gebruikt computationele algoritmen om doelgebieden te selecteren voor mutagenese en recombinatie.

Geregisseerd Evolution Method in

Meer video's verkennen