Geregisseerd Evolution Method in

Het algemene doel van dit protocol is om te laten zien hoe mutantbibliotheken in Saccharomyces Cerevisiae kunnen worden geconstrueerd en gescreend voor experimenten met gerichte evolutie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen bij de creatie in het laboratorium voor gerichte evolutie-experimenten, zoals het toewijzen van overlappende gebieden voor de assemblage en klonering. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de eenvoud en robuustheid, aangezien er in slechts één transformatiestap kwalitatief goede niveaus kunnen worden toegewezen.

Dit protocol voor het creëren en screenen van mutantenbibliotheken wordt gedemonstreerd voor een schimmelarilalcohol-oxidase of AAO. De regio's voor gerichte evolutie worden eerst gekozen met behulp van computationele algoritmen op basis van de beschikbare kristalstructuur of homologiemodellen van het enzym. Twee regio's van AAO zullen het doelwit zijn voor willekeurige mutagenese en recombinatie: de M1-regio en de M2-regio.

Mutagene PCR zal worden uitgevoerd om de doelgebieden te amplificeren. Om in vivo splicing in gist te bevorderen, zullen overlappende gebieden tussen segmenten van ongeveer 50 basenparen elk worden gecreëerd door PCR-reacties van de gedefinieerde regio's over elkaar heen te leggen. Bereid mutagene PCR-reacties van 50 µL voor, elk bestaande uit 46 ng DNA-template, 90 nM van zowel de sense- als antisense-primers, 0,3 mM dNTP's, 3% DMSO, 1,5 mM magnesiumchloride, 0,5 mM mangaanchloride en 0,5 units per µL Taq DNA-polymerase.

Gebruik het volgende PCR-programma: 95 °C gedurende twee minuten, 95 °C gedurende 45 seconden, 50 °C gedurende 45 seconden en 74 °C gedurende 45 seconden voor 28 cycli, en 74 °C gedurende 10 minuten. Het resterende deel van het AAO-gen, de HF-regio, zal worden geamplificeerd via high-fidelity PCR, waarbij de overeenkomstige gebieden die overlappen met de mutagenische segmenten en/of gelineariseerde vector-overhangs zijn opgenomen.

Bereid de high-fidelity PCR voor in een eindvolume van 50 µL bestaande uit 10 ng DNA-template, 250 nM van elk de sense- en antisense-primers, 0,8 mM dNTP's, 3% DMSO en 0,2 units per µL iProof ultra high-fidelity DNA-polymerase. Gebruik het volgende PCR-programma: 98 °C gedurende 30 seconden, gevolgd door 28 cycli van 98 °C gedurende 10 seconden, 55 °C gedurende 25 seconden en 72 °C gedurende 45 seconden, en een finale stap van 72 °C gedurende 10 minuten.

Alle PCR-fragmenten worden vervolgens gezuiverd met een commerciële gel-extractiekit volgens het protocol van de fabrikant. De volgende stap is het lineariseren van de vector om flankerende regio's van ongeveer 50 basenparen te creëren die homoloog zijn aan de 5'- en 3'-uiteinden van het doelgen. Bereid een linearisatiereactiemengsel van 20 µL voor met 2 µg DNA, 7,5 units BamH-I, 7,5 units Xho-I, 20 µg BSA en twee µL 10x BamH-I buffer.

Incubeer het reactiemengsel 2 uur en 40 minuten bij 37 °C. Inactiveer daarna de reactie door deze 20 minuten bij 80 °C te houden. Om de gelineariseerde vector te zuiveren en contaminatie met het resterende circulaire plasmide te voorkomen, wordt het digestiemengsel in de mega-well van een semi-preparatieve agarosegel met laag smeltpunt geladen.

Breng vijf µL van het reactiemengsel aan in de aangrenzende well als referentie. Voer DNA-elektroforese uit bij vier °C en vijf V/cm tussen de elektroden. Scheid vervolgens de agarosegel die overeenkomt met de mega-well en bewaar deze bij vier °C in één XTAE.

Kleur de baan met de moleculaire gewichtsmarker en de reporter. Visualiseer de banden onder UV-licht en markeer de positie waar de gelineariseerde vector zich bevindt. Identificeer in afwezigheid van UV-licht, met behulp van de markeringen in de gekleurde reporterbaan, de gelineariseerde vector in het mega-well fragment en snijd deze uit.

Extraheer de gelineariseerde vector uit de agarose en zuiver deze met een commerciële gelextractiekit volgens het protocol van de fabrikant. Vervolgens wordt de gezuiverde gelineariseerde vector gemengd met de PCR-fragmenten en wordt dit DNA-mengsel gebruikt om competente gistcellen te transformeren met een commerciële kit volgens de instructies van de fabrikant. Plaats de getransformeerde cellen op SC-dropoutplaten en incubeer deze gedurende drie dagen bij 30 °C.

Ter voorbereiding op deze assay worden individuele kolonies van de SC-dropoutplaten gepickt en overgebracht naar 96-wells-platen die per well 50 µL minimaal medium bevatten. Inoculeer in elke plaat kolom zes met het oudertype als interne standaard. Als negatieve controle wordt well H-1, gevuld met SC-medium aangevuld met uracil, geïnoculeerd met URA3-negatieve ESI-viscerale cellen zonder plasmide.

Dek de platen af met hun deksels, wikkel ze in parafilm en incubeer ze gedurende 48 uur bij 30 graden Celsius in een bevochtigde shaker. Voeg na 48 uur 160 microliters expressiemedium toe aan elke well en sluit de platen opnieuw. Incubeer gedurende nog eens 24 uur.

Na het centrifugeren van de platen wordt een robotisch vloeistofbehandelingstation gebruikt om 20 µL van het supernatant uit de wells van elke plaat over te brengen naar een replicaplaat. Voeg 20 µL van 2 mM p-methoxybenzylalcohol en 100 mM natriumfosfaatbuffer pH 6,0 toe aan elke well. Meng de platen kort met een 96-well platenmenger en incubeer ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Voeg vervolgens 160 µL van het FOX-reagens toe aan elke replica-plaat en roer kort met de mixer. Lees de platen af bij 560 nm op een plaatlezer. Incubeer de platen bij kamertemperatuur totdat de kleur zich heeft ontwikkeld.

Meet de absorptie opnieuw. De relatieve activiteit wordt berekend uit het verschil tussen de absorptiewaarde na incubatie en die van de initiële meting, genormaliseerd naar het oudertype voor elke plaat. Deze representatieve gelafbeelding toont de gelineariseerde vector in baan twee, het M1 PCR-segment in baan drie, het M2 PCR-segment in baan vier, het HF PCR-segment in baan vijf en de in vivo geassembleerde vector gelineariseerd met NHE 1 in baan zes.

Deze volgende gel toont de plasmid mini-prep van de geassembleerde vector in baan twee, het plasmid gelineariseerd met NHE I in baan drie, het plasmid gelineariseerd met BamH I en Xho I in baan vier, en het gelineariseerde plasmid verkregen door gel-extractie en zuivering in baan vijf. De mutatiebelasting werd aangepast door mutantbibliotheken met verschillende landschappen te bemonsteren, waarbij het aantal klonen met minder dan 10% van de ouderlijke enzymactiviteit werd berekend, gevolgd door verdere verificatie door sequencing van een willekeurige steekproef van actieve en niet-actieve varianten. Een evaluatie van de detectielimiet van deze assay toonde aan dat de assay lineair was in de aanwezigheid van sorbitol, weergegeven door zwarte cirkels.

In afwezigheid van sorbitol, weergegeven door de witte vierkantjes, was de lineariteit hardnekkiger, maar was de respons zwakker. Er werd een lineaire correlatie waargenomen tussen de AAO-concentratie en de absorbantie. Er werd een mutantenbibliotheek van 2.000 klonen geconstrueerd en gescreend met deze assay.

Het gearceerde vierkant geeft de AAO-mutanten aan met een aanzienlijk verbeterde secretie en activiteit tegen P-methoxybenzylalcohol. Zodra de methode onder de knie is, kunnen mutantenbibliotheken in ongeveer vier uur worden gemaakt, mits dit correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met het toewijzen van juiste overlappende gebieden voor elke PCR-familie en gelineariseerde vector voor in vivo splicing en klonering in één enkele transformationele stap.

Volgens een soortgelijke benadering kunnen andere methoden, zoals in vivo DNA-bemonstering, verzadigingsmutagenese-bibliotheken of DNA-assemblage, worden uitgevoerd om mutantenbibliotheken en/of metabole routes te construeren. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de bio-engineering om activiteiten en stabiliteiten te onderzoeken, of zelfs om oneindig veel soorten interacties te bedenken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u dit Saccharomyces Cerevisiae-instrument kunt inzetten voor de constructie en screening van bibliotheken