Name: Visualisatie van Twitching Beweeglijkheid en karakterisering van de rol van de PilG in Xylella fastidiosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Leer de twitching-beweeglijkheid van Xylella fastidiosa visualiseren met een nano-microfluidische stroomkamer. Deze methode onthult cruciale inzichten in bacteriële pathogenese en genfunctie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door de United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service. Handelsnamen of commerciële producten in deze publicatie zijn uitsluitend genoemd voor het verstrekken van specifieke informatie en impliceert niet aanbeveling of goedkeuring door het Amerikaanse ministerie van Landbouw. USDA is een gelijke kans provider en werkgever.

1. De Peripheral Fringe van Bacteriële Colony <ol><li> Grow X. fastidiosa (Xf) Temecula wildtype 22, pilG deletiemutant Xf ΔpliG (middels eerder beschreven deletie strategie 23), en de aanvullende XfΔpliG -C (middels eerder beschreven chromosoom gebaseerde genetische complementatie strategie 24) op PD2 medium agarplaten 25 bij 28 ° C gedurende 5-7 dagen. </li><li> Autoclaaf cellofaan (1 x 1 cm 2) in water bij 121 ° C (249 ° F) gedurende 15 min. Pick-up een stuk van cellofaan, laat het water door het aanraken van een hoek van cellofaan op een lege petrischaal voorzichtig lag het cellofaan meer dan 15% van de agar oppervlak en de lucht drogen. </li><li> Pick-up individuele X. fastidiosa kolonies met steriele tandenstokers en ronde vlek cellen aseptisch op een gesteriliseerde vel cellofaan overlay op de 15% agar oppervlak in de agarplaten. Incubeer de plaats bij 28 ° C gedurende 2-3 dagen. </li><li> Bestudeer de rand morfologie van de kolonies met behulp van een dissectie microscoop met een 2X objectief en een 10x oculair lens. Fotografeer de perifere rand rond kolonies. </li></ol> 2. Microscopie en microfluïdische Flow Chambers <ol><li> Fabriceren microfluïdische apparaten met fotolithografische procedures zoals die eerder beschreven 5,18. Ontwerp van de vier parallelle kanalen met computergestuurde design software op de master silicium wafer met behulp van standaard lithografische methoden 26. </li><li> Maak de microfluïdische kamers van silicium wafer master met polydimethylsiloxaan (PDMS). Pour gepolymeriseerd PDMS via siliciumwafel kapitein en genezen bij 60 ° C gedurende 1 uur. Trek het PDMS replica van de wafer-master en trim de PDMS replica met een mes in een 22 mm x 40 mm als dezelfde grootte van een glas dekglaasje. </li><li> Blootstellen PDMS replica, een glazen dekglaasje (22 x 40 mm2), en een Microscope slide (51 x 76 mm 2) aan de lucht plasma bij 30 W gedurende 2 min 27. Sandwich de PDMS lichaam tussen het glas dekglaasje en het glas microscoop om de micro fl uidic kamer te bouwen. </li><li> Een gat (5,5 mm diameter) door het PDMS aan elk uiteinde van het patroon-kanaal. Snijd de siliconen rubber slang in 12-20 cm lang. Verbind dan de siliconen rubber buis (5,1 mm buitendiameter, 2,1 mm binnendiameter, 0,8 mm wall) in elk uiteinde van de opening van de kanalen PDMS replica en verzegelt het met gepolymeriseerde PDMS bij 60 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Sluit andere uiteinde van de slang aan het einde van weerhaken plastic luer connectoren. Wikkel de verzamelde microfluïdische kamers met aluminiumfolie en autoclaaf ze gedurende 20 min. </li><li> Verzamel bacteriecellen X. fastidiosa wild type, mutant Xf ΔpliG, en complementaire XfΔpliG -C via schrapen, met behulp van disposable entogen van PD2 medium platen. Pas celdichtheidtot een optische dichtheid van 0,05 bij 600 nm in PD2 bouillon zoals eerder 23 beschreven. Verzamel de bacteriële cel oplossing in een 1 ml spuit Gasdichte. </li><li> Monteer de microfluïdische apparaat op een omgekeerde microscoop podium. Sluit een inlaatbuis aan de 5 ml Gasdichte spuit met PD2 bouillon. Breng de 5 ml Gasdichte spuit met de spuit pompen. </li><li> Sluit de afvoerbuis naar een afvalreservoir. Handhaaf een gemiddelde stroomsnelheid van 0,2 gl -1 min gedurende 30 min om het te stabiliseren. </li><li> Sluit side-inlaatbuizen een 1 ml spuit met Gasdichte de bacteriële cel oplossing. Spoel de bacteriële cel oplossing door de rubber slang totdat het kanaal is bereikt. Handhaven van een gemiddeld debiet van 0,2 pl min -1 voor nog eens 30 minuten om ongebonden cellen van de kamer voorafgaand aan het vastleggen van beelden te spoelen. </li><li> Monteer de microscoop sluiter onder het veld aangepast deel van de microscoop om het licht te controleren. Sluit op de ontspanknop om de sluiter control systeem en sluit de sluiter besturingssysteem op de computer. </li><li> Monteer een digitale camera aan op de video-poort van de microscoop en sluit deze aan op de computer. Voer de time-lapse-opname software, selecteer de &quot;shutter&quot; functie in het menu, en herkent automatisch de geïnstalleerde sluiter als standaard in de software om verbindingen tot stand om de sluiter met de software. </li><li> Selecteer de functie &quot;digitale camera&quot; in het menu van de time-lapse-opname software voor de digitale camera herkent automatisch als standaard opname-apparaat in de software en de communicatie met de digitale camera met de software. </li><li> Zoek de bacteriële cellen in een van de kanalen met behulp van 20X fase-contrast optiek, schakel dan over naar de 40X objectief voorafgaand aan het vastleggen van beelden. </li><li> Voer de time-lapse-opname software, selecteert u de functie &quot;beeldacquisitie&quot; met behulp van standaard parameters in het menu om de beelden van de microscoop te verwerven.Open vervolgens de functie &quot;Acquire time-lapse&quot; en stel het tijdsinterval tot 30 sec 5,18,28 voor de duur van 6-24 uur, afhankelijk van het experiment moest trillen beweeglijkheid van X. te observeren fastidiosa 5,18,28. Klik op &quot;OK&quot; om de time-lapse-opname te starten. Klik op &quot;Stack functie&quot; van het menu, selecteer &quot;opslaan als&quot; om de afbeeldingen in de doelmap stack op de computer na het beëindigen van de opname. </li><li> Voor meerdere kanalen, vastleggen time-lapse beelden van het eerste kanaal om de 30 sec voor 6 uur. Verplaats de objectieflens van de microscoop naar het volgende kanaal aan de doelcellen te lokaliseren. Herhaal de time-lapse functie zoals hierboven beschreven om beelden in elk van de vier kanalen achtereenvolgens onderscheppen experiment opgezet om vier kanalen te gebruiken. Voortzetting van de time-lapse beeld vast te leggen voor zo lang als drie opeenvolgende dagen. Alle experimenten werden uitgevoerd bij kamertemperatuur (23 ± 2 ° C). </li><li> Compile de time-lapse beelden in eenvideobestand met behulp van de time-lapse-opname imaging software. Run time-lapse-opname software, klikt u op &quot;Stack functie &#39;in het menu en selecteer&#39; open stack functie&quot; om de gestapelde bestanden van de computer. </li><li> Start de functie &quot;Maak film&quot; van de stapel module, het selecteren van alle beelden en het kiezen van de &quot;AVI&quot; output formaat. Klik op &quot;opslaan als&quot; om het videobestand op te slaan in de doelmap op de computer. </li><li> Selecteer de gecompileerde films van de doelmap op de computer en speel ze. Dan, let op de beweeglijkheid van de afzonderlijke cellen door middel van de resulterende visualisatie van de trekkingen beweeglijkheid activiteit van bacteriën cellen in de gegenereerde videobestanden. </li></ol>

<ol><li>Purcell, A. H., Hopkins, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fastidious+xylem-limited+bacterial+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Fastidious xylem-limited bacterial plant pathogens.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 34, 131-151 (1996).</li>
<li>Purcell, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xylella+fastidiosa%2C+a+regional+problem+or+global+threat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Xylella fastidiosa, a regional problem or global threat.</a> J. Plant Pathology. 79, 99-105 (1997).</li>
<li>Hopkins, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xylella+fastidiosa%3A+Xylem-limited+bacterial+pathogen+of+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Xylella fastidiosa: Xylem-limited bacterial pathogen of plants.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 27, 271-290 (1989).</li>
<li>Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+pili+and+twitching+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Type IV pili and twitching motility.</a> Annu. Rev. Microbiol. 56, 289-314 (2002).</li>
<li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upstream+migration+of+Xylella+fastidiosa+via+pilus-driven+twitching+motility%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Upstream migration of Xylella fastidiosa via pilus-driven twitching motility.</a> J. Bacteriol. 187, 5560-5567 (2005).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+and+type+IV+pili+of+Xylella+fastidiosa+affect+twitching+motility%2C+biofilm+formation+and+cell-cell+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Type I and type IV pili of Xylella fastidiosa affect twitching motility, biofilm formation and cell-cell aggregation.</a> Microbiology. 153, 719-726 (2007).</li>
<li>Simpson, A. J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+the+plant+pathogen+Xylella+fastidiosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of the plant pathogen Xylella fastidiosa.</a> Nature. 406, 151-157 (2000).</li>
<li>Maier, B., Potter, L., So, M., Long, C. D., Seifert, H. S., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+pilus+motor+forces+exceed+100+pN%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Single pilus motor forces exceed 100 pN.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16012-16017 (2002).</li>
<li>Touhami, A., Jericho, M. H., Boyd, J. M., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+characterization+and+determination+of+adhesion+forces+of+Pseudomonas+aeruginosa+pili+by+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Nanoscale characterization and determination of adhesion forces of Pseudomonas aeruginosa pili by using atomic force microscopy.</a> J. Bacteriol. 188, 370-377 (2006).</li>
<li>Skerker, J. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+extension+and+retraction+of+type+IV+pili%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Direct observation of extension and retraction of type IV pili.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 6901-6904 (2001).</li>
<li>Brown, D. C., Larson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+to+parallel+plate+flow+chambers+to+reduce+reagent+and+cellular+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements.</a> BMC Immunol. 2, 9(2001).</li>
<li>Thomas, W. E., Nilsson, L. M., Forero, M., Sokurenko, E. V., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-dependent+%27stick-and-roll%27+adhesion+of+type+1+fimbriated+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shear-dependent 'stick-and-roll' adhesion of type 1 fimbriated Escherichia coli.</a> Mol. Microbiol. 53, 1545-1557 (2004).</li>
<li>Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+adhesion+to+target+cells+enhanced+by+shear+force%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force.</a> Cell. 109, 913-923 (2002).</li>
<li>Bahar, O., Fuente, D. L., Burdman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+adhesion%2C+biofilm+formation+and+motility+of+Acidovorax+citrulli+using+microfluidic+flow+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Assessing adhesion, biofilm formation and motility of Acidovorax citrulli using microfluidic flow chambers.</a> FEMS Microbiol. Lett. 312, 33-39 (2010).</li>
<li>Thomas, W. E. Using a laminar flow system to explain shear-enhanced bacterial adhesion. Proceedings of ICMM2005, Third International Conference on Microchannels and Mini-channels. Toronto, Ontario, Canada, , 751-759 (2005).</li>
<li>Fuente, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+adhesion+forces+of+type+I+and+type+IV+pili+of+Xylella+fastidiosa+bacteria+by+use+of+a+microfluidic+flow+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessing adhesion forces of type I and type IV pili of Xylella fastidiosa bacteria by use of a microfluidic flow chamber.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 2690-2696 (2007).</li>
<li>DeLange, P. A., Collins, T. L., Pierce, G. E., Robinson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PilJ+localizes+to+cell+poles+and+is+required+for+type+IV+pilus+extension+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PilJ localizes to cell poles and is required for type IV pilus extension in Pseudomonas aeruginosa.</a> Curr Microbiol. 55, 389-395 (2007).</li>
<li>Fuente, D. L., Burr, T. J., Hoch, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+type+I+and+type+IV+pilus+biosynthetic+genes+affect+twitching+motility+rates+in+Xylella+fastidiosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Mutations in type I and type IV pilus biosynthetic genes affect twitching motility rates in Xylella fastidiosa.</a> J. Bacteriol. 189, 7507-7510 (2007).</li>
<li>Ferandez, A., Hawkins, A. C., Summerfield, D. T., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cluster+II+che+genes+from+Pseudomonas+aeruginosa+are+required+for+an+optimal+chemotactic+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cluster II che genes from Pseudomonas aeruginosa are required for an optimal chemotactic response.</a> J. Bacteriol. 184, 4374-4383 (2002).</li>
<li>Cursino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+Operon%2C+Pil-Chp%2C+That+Controls+Twitching+Motility+and+Virulence+in+Xylella+fastidiosa%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Identification of an Operon, Pil-Chp, That Controls Twitching Motility and Virulence in Xylella fastidiosa.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 10, 1198-1206 (2011).</li>
<li>Hazelbauer, G. L., Falke, J. J., Parkinson, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+chemoreceptors%3A+High-performance+signaling+in+networked+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bacterial chemoreceptors: High-performance signaling in networked arrays.</a> Trends Biochem. Sci. 33, 9-19 (2008).</li>
<li>Costa, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+hosts+of+Xylella+fastidiosa+in+and+near+southern+California+vineyards%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis%22%5BJournal%5D)">Plant hosts of Xylella fastidiosa in and near southern California vineyards.</a> Plant Dis. 88, 1255-1261 (2004).</li>
<li>Shi, X. Y., Dumenyo, C. K., Hernandez-Martinez, R., Azad, H., Cooksey, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+regulatory+pathways+in+Xylella+fastidiosa%3A+genes+and+phenotypes+controlled+by+algU%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of regulatory pathways in Xylella fastidiosa: genes and phenotypes controlled by algU.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 6748-6756 (2007).</li>
<li>Matsumoto, A., Young, G. M., Igo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome-Based+Genetic+Complementation+System+for+Xylella+fastidiosa%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chromosome-Based Genetic Complementation System for Xylella fastidiosa.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1679-1687 (2009).</li>
<li>Davis, M. J., Purcell, A. H., Thomson, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+Media+for+the+Pierce%27s+Disease+Bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Isolation Media for the Pierce's Disease Bacterium.</a> Phytopathology. 70, 425-429 (1980).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Mater.+Sci%22%5BJournal%5D)">Soft lithography.</a> Annu. Rev. Mater. Sci. 28, 153-184 (1998).</li>
<li>Chaudhury, M. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+interfacial+interactions+between+semispherical+lenses+and+flat+sheets+of+poly-%28dimethylsiloxane%29+and+their+chemical+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of interfacial interactions between semispherical lenses and flat sheets of poly-(dimethylsiloxane) and their chemical derivatives.</a> Langmuir. 7, 1013-1025 (1991).</li>
<li>Cruz, L. F., Parker, J. K., Cobine, P. A., De La Fuente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-enhanced+twitching+motility+in+Xylella+fastidiosa+is+linked+to+a+single+PilY1+homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-enhanced twitching motility in Xylella fastidiosa is linked to a single PilY1 homolog.</a> Appl. Environ. Microbiol. 80, 7176-7196 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

In deze studie hebben we karakteriseerde de beweging gedrag van X. fastidiosa PilG mutant Xf ΔpilG en zijn complementaire XfΔpilG- C-stammen in nieuw ontworpen meerdere parallelle-nano-kanaals micro fl uidic kamers. De nieuw ontworpen micro fl uidic kamers kunnen maximaal vier parallelle kamers met 100 micrometer nano-kanaal in de breedte ten opzichte van eerdere modellen met slechts een enkele 50 micrometer breed kanaal 18. De verbeterde brede nano-kanaal vergemak...

Xylella fastidiosa is een Gram-negatieve non-gegeseld, pathogene bacterie die een aantal economisch belangrijke gewassen ziekten, waaronder de ziekte van Pierce in wijnstok (Vitis vinifera L.) 1,2, 3 veroorzaakt. Deze bacterie is beperkt tot de watervoerende xyleem vaartuigen. Infectie van grapevine zorgt ervoor dat de blokkade van de houtvaten en resulteert in het water stress en voedingstekorten 3. Succesvolle kolonisatie is afhankelijk van het vermogen van de bacterie om van de oorspronkelijke plaats van infectie aan de rest van de plant 3. Spiertrekkingen beweeglijkheid is een middel om flagellaire-onafhankelijke bacteriële beweging door de uitbreiding, gehechtheid, en intrekken van de polaire type IV pili 4 die gekenmerkt is in X. fastidiosa 5,6,7. De spiertrekkingen beweeglijkheid is waargenomen door laser pincet en atomic force microscopie (AFM) 8,9,10. Met behulp van deze technieken, tbeheksen motilities gegenereerd door type IV pilus van N. gonorrhoeae en P. aeruginosa werden gekenmerkt door fl uorescently etikettering pili en het vastleggen van hun bewegingen microscopisch. Hoewel beide methoden de kleefkracht van individuele bacteriën beschreven, de procedures ingewikkeld en tijdrovend 9,10. De micro fl uidic kamers werden gebruikt voor lange afstand migratie van afzonderlijke cellen en kleine aggregaten van bacteriecellen 5,6 waarnemen. Deze kamers zijn ontworpen als een microfabricated-nano-kanaal in een plaat geïntegreerd met een time-lapse beeldopname systeem 11,12,13,14. Micro fl uidic kamer apparaten bieden verschillende voordelen voor het bestuderen van verplaatsingsgedrag en cel-cel interacties bacteriën: (i) biedt een geïntegreerd platform meerkanaals vermogens; (Ii) het kan de bewegingen en combinaties van enkele cellen in de nano-schaal kenmerken van bacteriën te onderzoeken; (Iii) het zorgt voor directe microscopic beeldopname van bacteriële cellen en time-lapse analyse, (iv) indien langdurig ruimtelijke en temporele waarnemingen van afzonderlijke en / of populaties van bacteriën in een micro-omgeving; (V) de stroomsnelheid van kweekmedium in een kanaal kan nauwkeurig worden geregeld en (vi) in een zeer klein volume (1 ml) kweekmedium vereist voor elk experiment. Onlangs heeft de micro fl uidic stroming systeem toegepast om het gedrag van bacteriële cellen onder verschillende micro-omgevingen 14,15,16 onderzoeken. De hechting en de bevestigingsoppervlak E. coli 15 X. fastidiosa 16 en Acidovorax citrulli 14 tot glasoppervlakken werden beoordeeld met behulp van micro fl uidic kamers. De vorming aggregatie en bio fi lm gemedieerd door type IV pili van Acidovorax citrulli werden geanalyseerd 14. Bovendien is de beweging van A. citrulli waargenomen onder fl ow caarden aangetoond dat de type IV pili een belangrijke rol kunnen spelen in de kolonisatie en de verspreiding van A. citrulli in houtvaten onder sap fl ow omstandigheden. De spiertrekkingen motilities van Pseudomonas aeruginosa en X. fastidiosa cellen werden met succes waargenomen tegen een vloeistof stroom in een microfabricated stromingskamer 5,6,17. Type IV pilus tekort pilB en pilQ mutanten van X. fastidiosa bleken de snelheid van spiertrekkingen motiliteit onder stroming omstandigheden micro fl uidic apparaten 5,6,18 ingrijpend gewijzigd. De onderzoeken uitgevoerd op bacteriële hechting en beweeglijkheid in micro fl uidic apparaten aangegeven dat de micro fl uidic kamers zijn bijzonder geschikt voor het analyseren van de twitching beweeglijkheid en migratie van pili-gemedieerde bacteriën in vitro. Deze resultaten verklaren de-spiertrekkingen gemedieerde migratie mechanisme dat cel-cel hechting, aggregatie en kolonisatie binnen faciliteertde gastheer, uiteindelijk leiden tot een systemische infectie. Pil-Chp operon van X. fastidiosa bevat pilG, Pili, pilJ, pil, chpB en WKKC die coderen voor signaaltransductie 20. De transmembraan chemoreceptors binden chemische stimuli in de periplasmatische domein en activeert een signalerende cascade in hun cytoplasma deel om uiteindelijk onder controle bacteriële trillen beweeglijkheid. In de Pil-Chp operon van X. fastidiosa, een fosfo-shuttle eiwit PilG is een homoloog te CheY. In E. coli en P. aeruginosa, CheY is het antwoord regulator in chemotaxis systemen die interageren met de flagella motor-eiwitten 19, 21. Hoewel de bijdragen van de Pil-Chp operon in de richting van virulentie in X. fastidiosa zijn onlangs onderzocht 20, de rol van pilG in chemotaxis operon in reactie op de signalen uit de omgeving en gereguleerd / motor type IV pili X. fastidiosa is uncLear. Het inzicht van chemotaxis regulator pilG verhelderen de activiteit van twitching beweeglijkheid van X. fastidiosa, is een micro fl uidic kamer gebruikt om het trillen beweeglijkheid van X. beoordelen fastidiosa. De pilG van X. fastidiosa wordt gekenmerkt door het vergelijken van de fenotypes van een deletie mutant Xf ΔpliG, complementaire stam XfΔpliG -C en de wild-type in vitro. De resultaten benadrukken de rol van pilG in het trillen beweeglijkheid van X. fastidiosa.

<table><tbody><tr><td>Biologie materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type</td><td></td><td></td><td>Costa, H. S., et al., 2004 22</td></tr><tr><td>pilG deletie mutant Xf&Delta;pliG</td><td></td><td></td><td>Shi, X. Y., et al., 2007 26</td></tr><tr><td>pilG complementaire stam Xf&Delta;pliG-C&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Davis, M. J., et al. 1998 23</td></tr><tr><td>Fysiek materiaal en apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inoculating loops voor eenmalig gebruik</td><td>VWR international, Radnor, PA</td><td>#22-363-607</td><td>kwantitatieve procedures zoals bacterie-collectie</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>#0002709226</td><td>Sylgard 184 siliconen elastomerische kits</td></tr><tr><td>AmScope MD2000 digitale camera</td><td>AmScope, Irvine, CA</td><td>SE305R-AZ-E</td><td>Beeld-, video-opname en meting&nbsp;</td></tr><tr><td>Buisjeslijn</td><td>Edgewood, NY</td><td>#T4300</td><td>Verbonden met de spuit en de microfluïdische kamer</td></tr><tr><td>Kunststof luer-aansluitingen</td><td>Edgewood, NY</td><td></td><td>Verbonden met de spuit en de microfluïdische kamer</td></tr><tr><td>Spuitpompen</td><td>Pico Plus, Harvard Apparatus, MA</td><td>#702209</td><td>De stroomsnelheid kan worden aangepast terwijl de pomp draait.</td></tr><tr><td>Spuiten</td><td>Gastight, Hemilton Company, Reno, NV</td><td>#1005</td><td>Zorgt voor het stromende bouillon</td></tr><tr><td>Omgekeerde Olympus IMT-2 microscoop</td><td>Olympus</td><td>IMT-2 FLuoro PHase</td><td>Beeldobservatie en -opname</td></tr><tr><td>SPOT-RT digitale camera</td><td>Diagnostic Instruments, Inc., MI</td><td>RT230</td><td>Beeld-, video-opname en meting</td></tr><tr><td>Microscoopluiken</td><td>De UNIBLITZ, US</td><td>#LS2T2</td><td>Stuur de belichtingstijd van de camera</td></tr><tr><td>Microscoopluiken controlesysteem</td><td>De UNIBLITZ, US</td><td>VCM-D1</td><td>VCM-D1 Single Channel CE/UL/CSA Approved Shutter Driver</td></tr><tr><td>MetaMorph Image software</td><td>Universal Imaging Corp., PA</td><td></td><td>Real-time super-resolutie beeldverwerking&nbsp;</td></tr></tbody></table>

visualisatie van twitching beweeglijkheid en karakterisering van de rol van de<em&gt; pilg</em&gt; in<em&gt; xylella fastidiosa</em

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa is een Gram-negatieve non-flagellen bacterie die een aantal economisch belangrijke ziekten bij planten veroorzaakt. De spiertrekkingen beweeglijkheid biedt X. fastidiosa een middel voor de lange afstand intra-fabriek beweging en kolonisatie, bij te dragen in de richting van pathogeniciteit in X. fastidiosa. Het trillen beweeglijkheid van X. fastidiosa wordt beheerd door type IV pili. Type IV pili van Xylella fastidiosa worden geregeld door pilG, een chemotaxis regulator in Pil-Chp operon dat codeert voor eiwitten die betrokken zijn bij signaaltransductie. Om de rol van pilG verhelderen in het trillen beweeglijkheid van X. fastidiosa, een pilG deficiënte mutant Xf ΔpilG en zijn complementaire stam XfΔpilG- C met inheemse pilG werden ontwikkeld. Een microfluïdische kamers geïntegreerd met een time-lapse beeldopname systeem werd gebruikt om spiertrekkingen beweeglijkheid observeren XfΔpILG XfΔpilG- C en de wild-type stam. Met behulp van deze opname systeem, het maakt het mogelijk de lange termijn ruimtelijke en temporele observaties van aggregatie, migratie van individuele cellen en populaties van bacteriën via trillen beweeglijkheid. X. fastidiosa wild type en complementaire XfΔpilG- C-stam toonde typische trillen beweeglijkheid kenmerken rechtstreeks waargenomen in de microfluïdische stroom kamers, terwijl mutant XfΔpliG tentoongesteld de spiertrekkingen deficiënt fenotype. Deze studie toont aan dat pilG bijdraagt ​​aan het trillen beweeglijkheid van X. fastidiosa. De microfluïdische stroom kamer wordt gebruikt als een middel voor het waarnemen twitching beweeglijkheid.

De aanwezigheid van een perifere rand kolonie indicatief type IV pilus-gemedieerde twitching beweeglijkheid, werd waargenomen in de kolonies van X. fastidiosa wildtype en complementaire Xf ΔpliG -C stam (figuur 1). Mutant XfΔpliG echter vertoonden geen franjes rond de omtrek van de kolonies (figuur 1). Time-lapse beeldvorming van bacteriële cellen in nano-microfluïdische stroom kamers bleek dat spiertrekkingen beweegli...

In deze studie werd een nano-microfluïdische stroom kamer gebruikt om te visualiseren en functioneel karakteriseren het trillen beweeglijkheid van Xylella fastidiosa, een bacterie die de ziekte van Pierce veroorzaakt in Grapevine.

Visualisatie van Twitching Beweeglijkheid en karakterisering van de rol van de<em&gt; PilG</em&gt; in<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Het overkoepelende doel van dit protocol is om de genen die verantwoordelijk zijn voor de twitching-motiliteit van bacteriën functioneel te karakteriseren met behulp van een nano-microfluïdische stroomkamer die is geïntegreerd met een time-lapse beeldregistratiesysteem. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over een bacterieel fenotype en de bijbehorende genfunctie, zoals de twitching-motiliteit van bacteriën. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een specifieke en getemperde observatie mogelijk maakt van de aggregatiemigratie van individuele cellen en populaties. Dr. Xiangyang Shi, een postdoc uit mijn laboratorium, zal deze procedure demonstreren. Kweek, met gebruik van een gestandaardiseerde deletiestrategie, Temecula wild-type Xylella fastidiosa, pilG-deletiemutanten en de complementaire stam, allen op PD2-medium agarplaten. Incubeer de bacteriën bij 28

visualization-twitching-motility-characterization-role-pilg-xylella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Opname Meercellige Gedrag in Myxococcus Xanthus Biofilms met Time-lapse Microcinematography

Prion-achtige verspreiding van eiwitaggregaten is recent naar voren gekomen als een factor die bij veel neurodegeneratieve ziekten betrokken is. Het doel van dit protocol is om te beschrijven hoe de rondworm C. elegans als modelsysteem kan worden gebruikt om eiwitverspreiding te volgen en prion-achtige fenomenen te onderzoeken.

Onderzoek naar de verspreiding en de toxiciteit van Prion-achtige eiwitten met behulp van de Metazoan modelorganisme<em&gt; C. elegans</em

Coxiella burnetii is een obligaat intracellulaire Gram-negatieve bacterie die verantwoordelijk is voor de zoönose Q-koorts. Hier beschrijven we werkwijzen voor het genereren van Coxiella fluorescent transposon mutanten en de geautomatiseerde identificatie en analyse van de verkregen internalisatie, replicatie en cytotoxische fenotypes.

Generatie en Multi-fenotypische High-inhoud Screening van<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Effectortranslocatie naar gastcellen via een type III secretiesysteem is een veelvoorkomende virulentiestrategie bij gramnegatieve bacteriën. Een op beta-lactamase gebaseerde effectorfusie-assay voor kwantitatieve analyse van translocatie werd toegepast. In Yersinia geïnfecteerde cellen wordt de conversie van een FRET-reporter door de beta-lactamase gemonitord met behulp van laserscanemicroscopie.

Analyse van<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector Translocatie in gastheercellen met behulp van beta-lactamase Effector Fusions

Recente bevindingen suggereren dat bacteriële flagellaire motoren een verscheidenheid aan omgevingssignalen detecteren en als reactie hierop veranderen. De hier besproken bead-assays zullen naar verwachting helpen bij het verklaren van de rol van verandering in cellulaire aanpassing aan omgevingsstressors.

Biofysische karakterisering van flagellaire Motor Functies

In dit protocol, fluorescently geëtiketteerde T. cruzi werden ingespoten in transparante zebrafish larven en de beweeglijkheid van de parasiet werd waargenomen in vivo met licht blad fluorescentie microscopie.

Oprichting van larvale zebravis als Model van een dier te onderzoeken Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Bacteriële cellen zijn ruimtelijk zeer georganiseerd. Volg deze organisatie na verloop van tijd in traag groeiende Myxococcus xanthus cellen en werd een set-up voor fluorescentie live-cel beeldbewerking met hoge Spatio resolutie gedurende enkele generaties ontwikkeld. Met deze methode kon Spatio dynamiek van belangrijke eiwitten voor chromosoom segregatie en celdeling worden vastgesteld.

Fluorescentie Live-cel beeldvorming van de Complete vegetatieve celcyclus van de langzaam groeiende sociale bacterie Myxococcus xanthus

Beeldvorming van bacteriële cellen is een opkomende systeembiologiebenadering gericht op het definiëren van statische en dynamische processen die de functie van grote macromoleculaire machines dicteren. Hier wordt integratie van kwantitatieve live celbeeldvorming en cryo-elektronentomografie gebruikt om legionella pneumophila type IV secretiesysteemarchitectuur en -functies te bestuderen.

Live Cell Imaging en Cryo-Electron Tomography toepassen op Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Veel bacteriën gebruiken flagella-gedreven beweeglijkheid om door hun omgeving te navigeren en gunstige omgevingen te koloniseren, zowel individueel als als collectief. Hier wordt het gebruik aangetoond van drie gevestigde methoden die motiliteit als selectietool gebruiken om componenten / paden te identificeren die bijdragen aan zwem- en zwermmotiliteit.

Onderzoek naar flagella-gedreven beweeglijkheid in Escherichia coli door drie gevestigde technieken in een serie toe te passen

Een protocol voor het in beeld brengen van de dynamische microtubuli in vivo met behulp van fluorescerend gelabeld Eindbindend eiwit is gepresenteerd. We beschreven de methoden om de dynamische microtubuli in het posterieure laterale microtubuli (PLM) neuron van C. elegans te labelen,in beeld te geven en te analyseren .

In vivo Beoordeling van microtubule dynamica en oriëntatie in Caenorhabditis elegans neuronen

Dit protocol biedt een snelle en efficiënte methode voor het identificeren van genetische factoren die betrokken zijn bij verschillende soorten motiliteiten in Pseudomonas aeruginosa.

High-throughput methode voor het observeren van motiliteitsfenotypes in Pseudomonas aeruginosa

Leer de twitching-beweeglijkheid van Xylella fastidiosa visualiseren met een nano-microfluidische stroomkamer. Deze methode onthult cruciale inzichten in bacteriële pathogenese en genfunctie.

Visualisatie van Twitching Beweeglijkheid en karakterisering van de rol van de

Meer video's verkennen