Name: Methoden om Ontdek Alternatieve Promoter Gebruik en transcriptionele regulatie van Murine Bcrp1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Leer in-silico methoden om alternatieve promotorgebruik in murine Bcrp1 te detecteren met luciferase-reporterassays. Deze techniek helpt onderzoekers transcriptieregulatie in verschillende weefsels te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door Merit Beoordeling Awards Douglas D. Ross en Arif Hussain van het Department of Veterans &#39;Affairs.

1. In Silico Voorspelling van Alternative Eerste Exons van Bcrp1 Met behulp van BLAST analyse van de Muis EST Database Let op: Dit protocol beschrijft hoe u de muis expressed sequence tag (EST) databank voor EST&#39;s met sequentie-overeenkomst met exon 2 van Bcrp1 (die bevat de translationele startplaats) te zoeken en vervolgens hoe de matching EST-sequenties af te stemmen op genomische sequenties vast te stellen hun locatie in de muis Bcrp1 gen ten opzichte van het 5&#39;-uiteinde van exon 2 Bcrp1. <ol><li> Het verkrijgen van de sequentie voor muis Bcrp1 exon 2 door het invoeren van het mRNA referentie sequentie ID (NM_011920.3) in het zoekvenster van de Ensembl Genome Browser 17, klik op &quot;GO&quot;. In het volgende scherm selecteert u een sequentie van volledige lengte (bevat 16 exons): <ol><li> In het volgende scherm ( &quot;-Afschrift based display&quot;), selecteer &quot;16 Exons.&quot; Dit zal een scherm met de volgorde van alle exons van Bcrp1 weer te geven. Exon 2 van Bcrp1 zal lezen &quot;59; -AAAGGC ... TATCAA-3 &#39;&#39; De verkregen resultaten zijn vergelijkbaar met die getoond in referentie 18 zijn.. </li><li> Klik op de optie &#39;Download sequentie &quot;. In het volgende scherm kiest u de FASTA formaat, en klik vervolgens op &quot;Preview&quot;. In het volgende scherm, kopieert u de preview sequentie van exon 2 naar het klembord. </li></ol></li><li> Navigeer naar de BLAST homepage 19 op het National Center for Biotechnology Information (NCBI) website 20. <ol><li> Selecteer &quot;Muis&quot; genoom. Plak de exon 2-sequentie van het klembord in het zoekvak. </li><li> Selecteer &#39;EST&#39;s &quot;uit de database dropdown, optimaliseren voor&quot; zeer vergelijkbare sequenties, &quot;en kies dan&quot; BLAST. &quot; Run tijd zal een paar minuten duren. Wanneer de BLAST run is voltooid, wordt de &quot;Results&quot; pagina verschijnen. </li><li> Onder de &quot;Beschrijvingen&quot; onderverdeling van de &quot;Results&quot; pagina, selecteer &quot;ALL&quot; en vervolgens op &quot;Download&quot; en vervolgens &quot;FASTA (compleetvolgorde) &quot;in het dropdown-menu en kies dan&quot; Continue &quot;Een .txt bestand wordt weergegeven,. openen en kopieer het gehele bestand naar het klembord De .txt bestand bevat de sequenties van alle EST&#39;s met een hoge sequentie-overeenkomst met de muis Bcrp1 exon2. maar hun positie ten opzichte van exon 2 in het Bcrp1 gen. Opmerking: Een analyse uitgevoerd op 15 april 2015 geïdentificeerd 14 murine EST&#39;s die afgestemd Bcrp1 exon 2. Deze zijn in Tabel 1 opgesomd. </li></ol></li><li> Identificeer de locatie van de EST sequentie die 5 &#39;tot exon 2 in het Bcrp1 gen. De muis Bcrp1 gen is gelokaliseerd in het chromosoom 6 contig NC_000072.6 (GI: 372.099.104). <ol><li> Op de BLAST homepage onder de &quot;Specialized Blast&quot; onderverdeling, selecteer &quot;Lijn twee (of meer) sequenties met behulp van BLAST (bl2seq).&quot; </li><li> Plak de tekst bestand van het klembord in de zoekbalk en voer 372099104 in het vak onderwerp volgorde. Optimaliseren voor &quot;zeer vergelijkbare sequenties&quot; in het kader van het programmaselectie en voer BLAST. </li><li> Zodra het venster resultaten verschijnt, bekijk de rooilijnen grafisch door te klikken op &quot;Graphics&quot; in het venster &quot;Groeperingen&quot;. Gebruik de linker en rechter pijlen en zoom om zich te concentreren op Bcrp1 / ABCG2 en de volgorde uitlijning. </li><li> Sla de volgorde uitlijningen: selecteer &quot;ALL&quot; in het vak &quot;Beschrijvingen&quot;, dan onder de &quot;download&quot; dropdown selecteer &quot;Hit tabel (CSV),&quot; en klik vervolgens op &quot;voort te zetten.&quot; Dit bestand bevat de sequentie uitlijning van Bcrp1 exon 2 en de uitlijning van de EST-sequenties met sequentieovereenkomst Bcrp1 exon2 opzichte van de nummering van de nucleotiden in de muis chromosoom 6 contig. Elke volledige EST-sequentie uitlijningen kunnen meerdere spanning regio 5 &#39;en 3&#39; genereren met exon 2 inclusief de sequenties overlapt Bcrp1 exon 2. </li><li> De positie van het 5&#39;-uiteinde van exon 2 komt overeen met nucleotide 58.655.638 in het chromosoom 6 contig, wijzen deze als1, en vervolgens het berekenen van de positie van de partiële sequenties van elk EST 5 &#39;tot 58.655.638. De resultaten van de 14 EST&#39;s zijn vermeld in tabel 1. Opmerking: Wees voorzichtig om EST-sequenties die 5 &#39;to 1 (dat wil zeggen, hebben een negatieve nucleotide-waarde) als mogelijke eerste exons analyseren. Bijvoorbeeld in twee van de EST&#39;s die afgestemd Bcrp1 exon 2 in tabel 1 (AI647825 en AI664571) de resterende sequentie 3 &#39;tot exon 2. </li></ol></li></ol> 2. Evaluatie van Bcrp1 Alternative Promoter Functie <ol><li> Het ontwerp van de reporter constructen voor Bcrp1 E1U, E1A, E1B en E1C promotors <ol><li> Met de sequentie van E1U verkregen uit het doorzoeken van de EST gegevensbank, wijzen de eerste 5 &#39;nucleotide van E1U als 1. </li><li> Verkrijgen van een bacterieel kunstmatig chromosoom (BAC) kloon van muis chromosoom 6 dat de Bcrp1 / ABCG2 gensequentie en de sequentie ten minste 100 kb stroomopwaarts van de bevatBcrp1 / ABCG2 gen (zie lijst van materialen en apparatuur). <ol><li> Identificeer een geschikte reporter vector zoals luciferase reporter plasmide pGL3-Basic. </li><li> Bepaal de meervoudige kloneringsplaatsen in de reporter vector. Kpnl, Sacl, Mlu1, NheI, Smal, XhoI, BglII en HindIII de restrictie endonuclease plaatsen in de meervoudige kloneringsplaats van de vector pGL3-Basic, in de 5 &#39;tot 3&#39; oriëntatie. Opmerking: De sequentie van het digestieplaatsen is verkrijgbaar product catalogi van bedrijven die de restrictie-enzymen. </li><li> Identificeer alle spijsvertering sites in de E1U exon en de 2 kb regio 5 &#39;van E1U gebruik van software programma&#39;s zoals DFNA5. Identificeer ten minste twee digestieplaatsen in de pGL3-Basic meervoudige kloneringsplaats die niet zijn gevonden in E1U of 2 kb stroomopwaartse gebied. Opmerking: Zorg ervoor dat een meervoudige kloneringsplaats restrictieplaats voor de voorwaartse primer die stroomopwaarts van de gekozen omgekeerde primer kiezen zodat het inzetstuk will in de juiste oriëntatie. </li></ol></li><li> Bereid voorwaartse en achterwaartse primers voor PCR die sequenties voor de geselecteerde pGL3-basic meervoudige kloneringsplaats restrictie-endonucleaseplaatsen gebruik van commerciële gen / primer synthese diensten of primer selectie software (zie lijst van materialen en apparatuur) bevatten. Selecteer een voorwaartse primer gelegen ~ 2 kb stroomopwaarts van de E1U sequentie en een reverse primer binnen de sequentie E1U. De primers gebruikt in de auteurs eerdere werk opgenomen van een SacI-plaats in de voorwaartse primer, en een Nhel-plaats in de omgekeerde primer, en versterkt de genomische regio van ongeveer -1.906-64 met de eerste 5 &#39;nucleotide van E1U opgegeven als + 1 (zie stap 2.1.1 hierboven), en worden gegeven in referentie 16. <ol><li> PCR versterken de E1U genomische regio met behulp van deze primers, 0,01 tot 1 ug van het BAC, en PCR Master Mix die high-fidelity Taq polymerase (zie de lijst van materialen en apparatuur) met denaturerende op95 ° C gedurende 30 seconden, vervolgens 35 tot 40 cycli van PCR, met verlenging bij 72 ° C (2 min) en annealing en smelttemperaturen basis van de smelteigenschappen van de gebruikte primers. Opmerking: Het gebruik van high-fidelity Taq polymerasen essentieel voor sequencing promotergebieden die hoge GC inhoud. Bij gebruik van grote genomische DNA-fragmenten zoals een BAC als de matrijs, kan de secundaire structuur van het genomische DNA moeilijk voor PCR primers binden maken. Als dit probleem zich voordoet, kan beter PCR resultaten worden verkregen als de lange genomische DNA matrijs zachtjes afgeschoven door sonicatie voor de PCR-reactie. </li><li> Controleer de lengte van het geamplificeerde PCR-product door vergelijking met een 1 kb DNA ladder bij 0,8% TAE agarose gelelektroforese. </li></ol></li><li> Digest het verkregen PCR-product en de pGL3-Basic vector, met de restrictie-endonucleasen specifiek voor de restrictiedigestie plaatsen geïntroduceerd in de voorwaartse en achterwaartse primers volgens instructions met de restrictie verteringsenzymen geleverd. <ol><li> Zuiver het spijsvertering reacties met behulp van commerciële SV Gel en PCR Clean-Up Systems kit (zie de lijst van materialen en apparatuur), naar aanleiding van de kit protocol 21. <ol><li> Verifiëren spijsvertering en linearisatie van de vector een vergelijking tegen de ongesneden vector middels agarosegelelektroforese knip en zuiveren gedigereerde vector-DNA band. Meet de concentratie van het gezuiverde PCR-product en het gezuiverde vector met behulp van UV-spectrometrie (zie lijst van materialen en apparatuur). </li></ol></li></ol></li><li> Bereid de E1U reporter construct door ligatie van het gezuiverde, restrictie-enzym geknipte PCR product en pGL3-Basic vuurvlieg luciferase reporter vector (in de verslaggever testkit, zie Lijst van materialen en apparatuur) op insert: vector verhoudingen van 11, 21 en 31, met &quot;T4 DNA ligase snel ligation kit&quot; kit volgens de instructies 22, om daardoor de E1U reporter construct, genaamd pGL3-E1U. <ol><li> Gebruik de pGL3-E1U plasmide om bacteriën te transformeren naar klonaal uitbreiden pGL3-E1U volgens de instructies in de TA-klonen kit (zie de lijst van materialen en apparatuur). </li><li> Bevestig de oriëntatie en de trouw van het inzetstuk door sequentie-analyse. </li></ol></li><li> Bereid reporter constructen voor E1A, E1B en E1C toepassing van soortgelijke methodologie voor E1U. Bevestig de trouw van de inserts door sequentiebepaling zoals in paragraaf 2.1.5.2. Opmerking: De promoter inzetstukken voor E1A, E1B en E1C moet ongeveer -1875 / + 10, -1847 / + 60 en -1904 / + 83 ten opzichte van de eerste 5 &#39;nucleotide (aangeduid als 1) van E1A, E1B, of E1C, respectievelijk. </li></ol></li><li> Reporter testmethoden Opmerking: Algemene strategie reporter assays: de vermeende promotor (5 &#39;stroomopwaartse gebied) van een gen wordt in de meervoudige kloneringsplaats van een lege &quot;reporter&quot; vector die een &quot;reporte bevat ingevoegdr-gen &quot;(bijvoorbeeld vuurvlieg luciférase) stroomafwaarts van de meervoudige kloneringsplaats. Vervolgens wordt de vector getransfecteerd in eukaryotische cellen die het gen van belang tot expressie. De trans-werkende factoren die expressie van het gen van belang in deze cellen te bevorderen moet activeren promoter in getransfecteerde reporter vector, waardoor expressie van vuurvlieg luciferase, die gemakkelijk kan worden gekwantificeerd met een luminescentie assay. <ol><li> Selecteer de geschikte cellijn gebruiken voor de reporter assay. Opmerking: Om de activiteit van de E1U alternatieve promotor reporter construct evalueren, is het nodig dat transfecteren construct in cellen die Bcrp1 expressie onder controle van de promoter E1U. De TM4 muizen Sertoli cellijn (zie lijst van materialen en apparatuur) drukt Bcrp1 eiwit en Bcrp1 mRNA bevatten E1U, evenals E1A, E1B en E1C 5. Als een negatieve controle, overweeg dan het gebruik van een cellijn die niet Bcrp1 eiwit of mRNA expressie brengt. </li><li> Cultuur van de TM4 cells in 24-wells platen bij een initiële dichtheid van 200.000 cellen / putje in een 1: 1 mengsel van Ham&#39;s F12 medium en gemodificeerd Eagle&#39;s medium Dulbecco&#39;s met 1,2 g / L natriumbicarbonaat, 15 mM HEPES aangevuld met 5% paardenserum, 2,5% foetaal runderserum, penicilline (100 IU / ml) en streptomycine (100 ug / ml) bij 37 ° C, 5% CO2, 5 zoals eerder beschreven. </li><li> Zes uur na het plaatsen van de cellen in kweek te transfecteren de cellen met 0,2 pg pGL3-basic lege vector of met 0,2 ug pGL3 vector die het -1906 / + 64 E1U of -1875 / + 10 E1A of -1847 / + 60 E1B of -1904 / + 83 E1C Bcrp 1 deletieconstruct samen met 4 ng pRL-TK (een Renilla-luciferase tot expressie vector) als interne controle, met behulp van een commerciële DNA-transfectie kit en protocol van de fabrikant 23 (zie lijst van materialen en apparatuur) . </li><li> 30 uur na transfectie, verwijder de groeimedia van de Cultured getransfecteerde cellen. Was de cellen eenmaal met 200 pi PBS, verwijder vervolgens de wasoplossing. <ol><li> Meet vuurvlieg en Renilla luciferase-activiteit met behulp van een commerciële kit volgens de protocollen van de fabrikant 24. </li></ol></li><li> Drukken de activiteit voor elke buis als de verhouding van vuurvlieg luciferase activiteit gedeeld door de interne (Renilla luciférase) controle; algemene resultaten worden gewoonlijk uitgedrukt als de activiteit van elke reporter construct opzichte van dat van cellen die met de lege vector pGL3 basis, waarbij een waarde van 1 wordt gegeven. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversification+of+transcriptional+modulation%3A+large-scale+identification+and+characterization+of+putative+alternative+promoters+of+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes.</a> Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).</li>
<li>Doyle, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multidrug+resistance+transporter+from+human+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15665-15670 (1998).</li>
<li>Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+breast+cancer+resistance+protein+%28BCRP%2FABCG2%29+in+cancer+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance.</a> Biochem Pharmacol. 83 (8), 1084-1103 (2012).</li>
<li>Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+resistance+protein+%28Bcrp%29+and+the+testis--an+unexpected+turn+of+events%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis--an unexpected turn of events.</a> Asian J Androl. 15 (4), 455-460 (2013).</li>
<li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcrp1+transcription+in+mouse+testis+is+controlled+by+a+promoter+upstream+of+a+novel+first+exon+%28E1U%29+regulated+by+steroidogenic+factor-1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1.</a> Biochim Biophys Acta. 1829 (12), 1288-1299 (2013).</li>
<li>Maliepaard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+and+distribution+of+the+breast+cancer+resistance+protein+transporter+in+normal+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues.</a> Cancer Res. 61 (8), 3458-3464 (2001).</li>
<li>Fetsch, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+ABCG2+mitoxantrone+resistance-associated+protein+in+normal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues.</a> Cancer Lett. 235 (1), 84-92 (2006).</li>
<li>Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localisation+of+breast+cancer+resistance+protein+in+microvessel+endothelium+of+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain.</a> Neuroreport. 13 (16), 2059-2063 (2002).</li>
<li>Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+ABCB1+and+ABCG2+in+human+placental+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue.</a> Drug Metab Dispos. 33 (4), 524-529 (2005).</li>
<li>Xiong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCG2+is+upregulated+in+Alzheimer%27s+brain+with+cerebral+amyloid+angiopathy+and+may+act+as+a+gatekeeper+at+the+blood-brain+barrier+for+Abeta%281-40%29+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ABCG2 is upregulated in Alzheimer's brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides.</a> J Neurosci. 29 (1-40), 5463-5475 (2009).</li>
<li>Woodward, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+urate+transporter%2C+ABCG2%2C+with+a+common+functional+polymorphism+causing+gout%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10338-10342 (2009).</li>
<li>Huls, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+breast+cancer+resistance+protein+transporter+ABCG2+is+expressed+in+the+human+kidney+proximal+tubule+apical+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane.</a> Kidney Int. 73 (2), 220-225 (2008).</li>
<li>Nakanishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+5%27+untranslated+region+variants+of+BCRP+mRNA+are+differentially+expressed+in+drug-selected+cancer+cells+and+in+normal+human+tissues%3A+implications+for+drug+resistance%2C+tissue-specific+expression%2C+and+alternative+promoter+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Novel 5' untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage.</a> Cancer Res. 66 (10), 5007-5011 (2006).</li>
<li>Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gene+expression+by+alternative+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Regulation of gene expression by alternative promoters.</a> FASEB J. 10 (4), 453-460 (1996).</li>
<li>Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+mouse+Abcg2+mRNA+during+hematopoiesis+is+regulated+by+alternative+use+of+multiple+leader+exons+and+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters.</a> J Biol Chem. 281 (40), 29625-29632 (2006).</li>
<li>Natarajan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+major+alternative+promoter+regulating+Bcrp1%2FAbcg2+expression+in+the+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine.</a> Biochim Biophys Acta. 1809 (7), 295-305 (2011).</li>
<li>Ensembl Genome Browser. , 
 <a target="_blank" href="http://Ensembl.org">http://Ensembl.org</a> (2015).</li>
<li>Transcript-based Display from Ensembl. , 
 <a target="_blank" href="http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Exons?db=core;g=ENSMUSG00000029802;r=6:58584523-58692869;t=ENSMUST00000031822">http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Exons?db=core;g=ENSMUSG00000029802;r=6:58584523-58692869;t=ENSMUST00000031822</a> (2015).</li>
<li>Basic Logical Alignment Search Tool (BLAST) homepage. , 
 <a target="_blank" href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome</a> (2015).</li>
<li>National Center for Biotechnology Information (NCBI). , 
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov">http://www.ncbi.nlm.nih.gov</a> (2015).</li>
<li>Promega. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Wizard%C2%AE+SV+Gel+and+PCR+Clean-Up+System+-+INSTRUCTIONS+FOR+USE+OF+PRODUCT%22">Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System - INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT</a>. , (2009).</li>
<li>New_England_Biolabs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Quick+Ligation+Kit+Protocol+-+M2200S%22">Quick Ligation Kit Protocol - M2200S</a>. , (2014).</li>
<li>Roche. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22XtremeGENE+HP+DNA+Transfection+Reagent+Protocol+-+Manual+version+1.0%29%22">XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol - Manual version 1.0)</a>. , (2010).</li>
<li>Promega. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Quick+Protocol+for+the+use+of+the+Dual-Luciferase+Reporter+Assay%22">Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay</a>. , (2009).</li>
<li>Carninci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+landscape+of+the+mammalian+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The transcriptional landscape of the mammalian genome.</a> Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).</li>
<li>VanBuren, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly%2C+verification%2C+and+initial+annotation+of+the+NIA+mouse+7.4K+cDNA+clone+set%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set.</a> Genome Res. 12 (12), 1999-2003 (2002).</li>
<li>Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+and+subtraction%3A+two+approaches+to+facilitate+gene+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery.</a> Genome Res. 6 (9), 791-806 (1996).</li>
<li>Okazaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+mouse+transcriptome+based+on+functional+annotation+of+60%2C770+full-length+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs.</a> Nature. 420 (6915), 563-573 (2002).</li>
<li>Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+controls%3A+the+role+of+alternative+promoters+in+mammalian+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes.</a> Trends Genet. (11), 640-648 (2009).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Bulun, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aromatase+expression+in+breast+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue.</a> Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).</li>
</ol>

Douglas D. Ross en de Universiteit van Maryland, Baltimore houden patentrechten voor de menselijke BCRP.

De meeste van de methoden en representatieve resultaten die zijn beschreven in eerdere werk getiteld &quot;B CRP1 transcriptie in muizen testis wordt gecontroleerd door een promoter stroomopwaarts van een nieuwe eerste exon (E1U) gereguleerd door steroïdogene factor-1 &#39;, die in 2013 5 gepubliceerd . Naast de representatieve resultaten hier weergegeven, de vorige Stortbak voor schattingen van alternatieve eerste exon gebruik middels 5&#39;-RACE PCR en RT-PCR methode. Verder in-silico iden...

Meer dan de helft van de menselijke genen worden gereguleerd door alternatieve promoters 1. Elke alternatieve promoter kan regulerende elementen die verschillen van die in andere alternatieve promoters kunnen zijn. De promoter (s) toegepast in een weefsel kan verschillen van die welke in een ander weefsel. Zo is het mogelijk dat activatie van een bepaalde signaalweg alternatieve promotor voor een gen gebruikt in een weefsel kan veroorzaken, maar hebben geen effect op of onderdrukken een aparte alternatieve promotor voor hetzelfde gen dat wordt gebruikt in een ander weefsel. Expressie van het Bcrp1 gen wordt beheerst door alternatieve promotors. Bcrp1 is de muizen ortholoog van het menselijk Breast Cancer Resistance Protein (BCRP) gen. BCRP is een ATP-bindende cassette (ABC) transporter, formeel aangewezen ABCG2 2, 3. Als apicale plasmamembraan eiwit BCRP / Bcrp1 functies uiteenlopende natuurlijke en xenobiotische substraten uitstromen <sup&gt; 3, 4. Bij mensen en muizen, wordt BCRP / Bcrp1 hoog tot expressie in farmacologisch relevante organen zoals lever (galcanaliculi), darm en nier, en organen met bloed-weefselbarrières zoals placenta, hersenen en testis 2, 5-12. Expressie van BCRP / Bcrp1 in hematopoietische en andere stamcellen, waaronder kanker stamcellen kunnen weerstand van deze cellen verlenen tegen xenobiotica en kanker chemotherapeutica 3. In vroege werk de regeling van BCRP expressie in normale en neoplastische cellen te begrijpen, 5 &#39;snelle amplificatie van cDNA-uiteinden (5&#39;-RACE) analyse van BCRP mRNA werd uitgevoerd om de precieze transcriptionele startplaats 13 bepalen. Niet alleen waren meerdere transcriptie startplaatsen gevonden; ook ondervonden werden drie verschillende vormen van het eerste exon, die BCRP is onvertaald. Deze alternatieve eerste exons - aangewezen E1a, E1b, E1C - zijn verschillend tot expressie gebracht in diverse menselijke weefsels. Twee extra eerste exon varianten werden ontdekt in een BLAST-onderzoek van de menselijke EST-gegevensbank met het tweede exon van BCRP 13. Vier wedstrijden onthulde een eerste exon&gt; 70 kb stroomopwaarts van exon 2 die zijn aangewezen E1u; vier andere wedstrijden bleek BCRP mRNA dat een eerste exon geheel ontbrak, die werden aangeduid N1- 13. De aanwezigheid van alternatieve exons leader wordt beschouwd als een manifestatie van alternatieve promoter gebruik 14 zijn. Bij muizen, worden vier alternatieve eerste exons van Bcrp1 beschreven die kunnen overeenkomen met alternatieve promotors die bepalen Bcrp 1 transcriptie in verschillende muis weefsels; deze exons / promotoren zijn aangewezen E1U, E1A, E1B en E1C en zijn zich ongeveer 70, 58, 15 en 5 kb stroomopwaarts van exon 2 Bcrp1 5, 15. De E1A mRNA isovorm werd gevonden overheersende in Murin te zijne hematopoietische stamcellen, hart, long, milt en hersenen, terwijl de E1B isovorm muizendarm, foetale levercellen en erythroïde voorlopercellen werd tot expressie gebracht in beenmerg 5, 15. De promoter stroomopwaarts van E1B bleek de belangrijkste alternatieve promoter betreffende Bcrp1 transcriptie in muizendarm zijn gereguleerd althans gedeeltelijk, door fosfo-cyclisch-AMP respons element bindend eiwit (p-CREB) en een CREB responselement uniek dat alternatieve Bcrp1 promotor 16. De E1C mRNA isovorm wordt voornamelijk tot expressie gebracht in volwassen muizen lever en nieren 5. De E1U isovorm niet detecteerbaar in de meeste geteste behalve muizen testis, waar de overheersende isovorm tot expressie 5 weefsels. Bcrp1 uitgedrukt in rat testes is te vinden in zowel somatische (endotheel krappe kruispunten, peritubulaire myoid cellen en Sertoli-cellen) en kiemcellen (in de seminiferous endotheel, waar het kan beschermen laat stadium spermatiden 4). de region stroomopwaarts van E1U bevat een functionele respons element voor steroïdogene factor-1 (SF-1) 5. Bcrp1 mRNA en eiwit aanzienlijk verminderd in de testes van Sertoli celspecifieke SF-1 knockout muizen, wat suggereert dat Bcrp1 expressie in muis Sertoli cellen wordt gecontroleerd door SF-1 5. De protocollen detail gepresenteerd methoden alternatieve eerste exons van Bcrp1 detecteren in-silico, en luciferase-gebaseerde reporter assays voor putatieve promotors vast stroomopwaarts van de eerste alternatieve exons geïdentificeerd.

<table><tbody><tr><td colspan="4">COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS:</td></tr><tr><td>First Choice RLM-RACE kit</td><td>Ambion Inc., Austin, TX, momenteel verkrijgbaar via Life Technologies</td><td>AM1700</td><td>5'-RACE PCR-kit</td></tr><tr><td>TOPO TA-klonering kit</td><td>Life Technologies</td><td>K450001</td><td>Deze kit bevat de TOP10 chemisch competente E. coli bacteriën.</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase snelle ligatie kit</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200</td><td></td></tr><tr><td>Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase</td><td>Sigma-Aldrich/Roche</td><td>3553400001/RMB-4738284001&nbsp;</td><td>Bevat een high-fidelity Taq polymerase enzymblend</td></tr><tr><td>XtremeGENE HP DNA transfectiereagens</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td></td></tr><tr><td>Dual-luciferase reporter assay kit</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td>Bevat de pGL3-basic lege reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expresserende vector, en andere controlevectoren.</td></tr><tr><td>QIAprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Voor plasmide miniprep - isolatie en zuivering van plasmide DNA uit bacteriekolonies</td></tr><tr><td>pCR2.1 vector</td><td>onderdeel van de TOPO TA-klonering kit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pGL3-basisluciferase bevattende vector</td><td>Promega</td><td>E1751</td><td></td></tr><tr><td>pRL-TK Renilla luciferase expresserende vector</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>Bacterieel kunstchromosoom</td><td>BACPAC Resources Center, Children&rsquo;s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA</td><td>RP23-285A12 en RP24-314E24</td><td>http://bacpac.chori.org/clones.htm</td></tr><tr><td colspan="4">REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Wizard&reg; SV Gel en PCR Clean-Up System&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>Bruikbaar voor het zuiveren van PCR-producten na vertering met restrictie-endonucleases</td></tr><tr><td>CRYOVIALS</td><td>Denville Scientific</td><td>V9012</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">SOFTWARE:</td></tr><tr><td>Ensembl software</td><td>Ensembl project</td><td>http://Ensembl.org&nbsp;</td><td>Het Ensembl-project produceert genoomdatabases voor gewervelden en andere eukaryote soorten, en maakt deze informatie vrij beschikbaar online.</td></tr><tr><td>Blast software</td><td>NCBI</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&amp;PAGE_TYPE=BlastHome</td><td></td></tr><tr><td>Primer 3 software</td><td>Simgene</td><td>http://simgene.com/Primer3</td><td>Bruikbaar voor het ontwerpen van primers voor 5'-RACE PCR</td></tr><tr><td>NCBI Nucleotide database</td><td>NCBI</td><td>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">CELL LINES:</td></tr><tr><td>TM4 muis Sertoli cellen</td><td>ATCC, Manassas, Virginia</td><td>CRL-1715&trade;</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">INSTRUMENTS:</td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Turner Biosystems</td><td>TD-20/20</td><td>Dit is een relatief goedkope, handmatig bediende luminometer. Geautomatiseerde systemen zijn ook verkrijgbaar bij dezelfde fabrikant die 96-well platen gebruiken.</td></tr><tr><td>NanoDrop spectrofotometers</td><td>Thermo Scientific, Inc.</td><td>NanoDrop 2000</td><td>Spectrofotometer kan zeer kleine hoeveelheden monster gebruiken</td></tr><tr><td>DU 800 UV/VIS spectrofotometer en Nucleic Acid Analysis II software</td><td>BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA</td><td>DU 800</td><td></td></tr></tbody></table>

methoden om ontdek alternatieve promoter gebruik en transcriptionele regulatie van murine bcrp1

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Genexpressie in verschillende weefsels wordt vaak gecontroleerd door alternatieve promotors die resulteren in de synthese van mRNA met unieke - meestal onvertaald - eerste exons. Bcrp1 (ABCG2), de muizen ortholoog van de ABC transporter Breast Cancer Resistance Protein (BCRP, ABCG2), heeft ten minste vier alternatieve promoters die door de bijbehorende vier alternatieve eerste exons geproduceerd worden aangeduid: E1U, E1A, E1B en E1C. Hierin, in-silico protocollen worden alternatieve promoter gebruik voorspellen Bcrp1. Verder zijn reporter assay werkwijzen beschreven reporter constructen alternatieve promotors te produceren en de functionaliteit van putatieve promotors stroomopwaarts van de eerste alternatieve exons die geïdentificeerd bepalen.

Identificatie van Bcrp 1 alternatieve promotor gebruik in de muis testis door analyse van leider exons Wanneer de EST gegevensbank bij NCBI werd geprobed (april 2015) met de stappen in Protocol 1, de EST gevonden dat grenst aan het 5 &#39;uiteinde van exon 2 in Bcrp waren 1 mRNA worden weergegeven in Tabel 1, samen met hun positie in genomisc...

De muizen ABC transporter Bcrp1 (ABCG2) als voorbeeld, in-silico protocollen worden alternatieve promoter gebruik detecteren genen tot expressie gebracht in muizenweefsels en de functionaliteit van de alternatieve promotors geïdentificeerd onder toepassing reporter assays te evalueren.

Methoden om Ontdek Alternatieve Promoter Gebruik en transcriptionele regulatie van Murine Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

Het algemene doel van deze set protocollen is het detecteren van alternatieve eerste exonen in het mRNA van een gen zoals Bcrp1 en het opzetten van luciferase-gebaseerde reporterassays voor de vermeende promotoren stroomopwaarts van de geïdentificeerde alternatieve eerste exonen. De gebruikte in-silico methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van transcriptie en regulatie, zoals de wijze waarop mRNA-expressie in verschillende weefsels wordt gecontroleerd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er gebruik wordt gemaakt van publiek beschikbare genetische data om alternatieve eerste exonen in het mRNA van het gen van belang te identificeren, wat duidt op het gebruik van alternatieve promotoren.Deze methode voor het prepareren van reporterconstructen en het uitvoeren van reporterassays kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van genregulatie, zoals de functionele activiteit van vermeende alternatieve promotoren. Om deze procedure te starten, verkrijgt u de sequentie voor muis Bcrp1 exon 2 door de mRNA-referentiesequentie-ID in het zoekvenster van de Ensembl-genoombrowser in te voeren en op Go te klikken. Selecteer

methods-to-discover-alternative-promoter-usage-transcriptional

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier presenteren we een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) procedure voor genoom-brede locatie analyse van eiwit-isovormen die verschillen in een histon-bindend domein. We zijn toe te passen op ChIP-Seq analyse om de doelstellingen van het KDM5A/JARID1A/RBP2 histon demethylase te identificeren.

Genoom-brede analyse met behulp van chip Isoform-specifieke Gene targets te identificeren

De genetische reportertest is een goed gevestigd en krachtig hulpmiddel voor het ontleden van de relatie tussen DNA-sequenties en hun gen-regulerende activiteiten. Het koppelen van kandidaat-regulerende elementen aan reportergenen die identificerende sequentietags dragen, maakt massale parallelisatie van deze tests mogelijk.

Massively Parallel Reporter Testen in gekweekte zoogdiercellen

De hier beschreven methode wordt gebruikt om de apoptotische signaleringskaskade te induceren in gedefinieerde stappen om de activiteit van een anti-apoptotisch bacterieel effector-eiwit te onderzoeken. Deze methode kan ook worden gebruikt voor inductieve expressie van pro-apoptotische of toxische eiwitten, of voor het onderzoeken van interferentie met andere signaalwegen.

Het toepassen van een induceerbare Expression Systeem om interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulaire signalering Studie

DNA regelgevende elementen, zoals versterkers, kwaliteitsbeheersing genexpressie door fysiek contact met target gene initiatiefnemers, vaak door middel van lange-afstands chromosomale interacties verspreid over grote genomic afstanden. Promotor vangen Hi-C (PCHi-C) identificeert belangrijke interacties tussen initiatiefnemers en distale regio's, waardoor de toewijzing van potentiële regulerende sequenties aan hun doelgenen.

Promotor Capture Hi-C: High-resolution, genoom-brede profilering van promotor interacties

Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling van een dominant-negatieve afleidbare systeem, waarin elk eiwit kan voorwaardelijk worden geïnactiveerd door omkeerbaar overexpressing een dominant-negatieve mutant versie van het.

Afleidbare en omkeerbare Dominant-negatief (DN) eiwit remming

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor het genereren van een modelsysteem waarin de transcriptie van een endogene gen van belang voorwaardelijk kan worden gecontroleerd in de levende dieren of cellen met behulp van verbeterde lac -onderdrukker en/of tet activator systemen.

In vivo toepassing van het systeem van de afstandsbediening voor de manipulatie van de endogene genexpressie

Directe levering van voorgemonteerde Cas9/gids RNA RiboNucleoProteïne-complexen is een snel en efficiënt middel voor genoom bewerking in hematopoietische cellen. Hier gebruiken we deze aanpak om een RUNX1 intronic geluiddemper te verwijderen en de transcriptionele responsen in OCI-AML3 leukemische cellen te onderzoeken.

Onderzoek naar de transcriptionele rol van een RUNX1 Intronic geluiddemper door crispr/Cas9 Ribonucleoprotein in acute myeloïde leukemie cellen

Hier beschrijven we een methode voor retrovirale overexpressie en adoptieoverdracht van murine B-1a cellen om in vivo B-1a celmigratie en lokalisatie te onderzoeken. Dit protocol kan worden uitgebreid voor diverse downstream functionele tests, waaronder kwantificering van donor B-1a cellokalisatie of analyse van donorcel-afgeleide gedesinteveneerde factoren na adoptieve overdracht.

Retrovirale overexpressie van CXCR4 op Murine B-1a Cellen en adoptieve overdracht voor gerichte B-1a celmigratie naar het beenmerg en igm productie

Dit protocol beschrijft een nieuwe rAAV-gebaseerde transient enhancer-reporter assay. Deze test kan worden gebruikt om enhancer-gedreven expressie in vivo in het muizenbrein te induceren.

AAV-implementatie van enhancer-gebaseerde expressieconstructies in vivo in muizenhersenen

Genexpressie wordt gereguleerd door interacties van genpromotors met distale regulerende elementen. Hier beschrijven we hoe low input Capture Hi-C (liCHi-C) de identificatie van deze interacties in zeldzame celtypen mogelijk maakt, die voorheen niet meetbaar waren.

Een geïntegreerde workflow om de promotor-centrische spatio-temporele genoomarchitectuur in schaarse celpopulaties te bestuderen

Leer in-silico methoden om alternatieve promotorgebruik in murine Bcrp1 te detecteren met luciferase-reporterassays. Deze techniek helpt onderzoekers transcriptieregulatie in verschillende weefsels te bestuderen.

Methoden om Ontdek Alternatieve Promoter Gebruik en transcriptionele regulatie van Murine Bcrp1

Meer video's verkennen