De ontwikkeling van gevriesdroogde Loop-gemedieerde Isotherme Amplification reagentia voor de detectie van Coxiella burnetii

Het algemene doel van dit experiment is om een eenvoudige LAMP-methode te ontwikkelen met gelyofiliseerd reagens voor de detectie van C.burnetii in monsters van patiënten. Het grote voordeel van dit protocol is dat er geen coaching nodig is voor de opslag van de reagens. Deze methode is ideaal voor gebruik in regio's met beperkte middelen waar Q-koorts endemisch is.

Tatiana, een technicus uit ons laboratorium, zal de procedure demonstreren. Begin met DNA voor het doelgen IS1111a van C.burnetii RSA493, bepaal de concentratie van het plasmide met een spectrofotometer bij 260 nanometer. Zet de concentratie van het plasmide-DNA om in kopienummer met behulp van de volgende berekeningen, waarbij 6330 gelijk is aan de lengte en basenparen van het plasmide, en 34,2 nanogram per microliter is de concentratie van het plasmide, zoals zojuist bepaald met behulp van de spectrofotometer.

Bereid vervolgens 8-tot 10-voudige seriële verdunningen van het plasmide om tot het volgende aantal kopieën per microliter te komen. Om de DNA-sjabloon voor de LAMP-reactie voor te bereiden, begin met 200 microliter humaan plasmamonster en extraheer het DNA volgens het protocol van de fabrikant met de DNA-miniprep-kit. Verdun het eindmonster tot een volume van 20 microliter.

Bereid 1 milliliter 2x LAMP-reactiebuffer voor door de volgende reagentia te combineren. Meng door 10 seconden pulse-vortex te gebruiken. Om de standaard LAMP-reactie uit te voeren, meng in een PCR-buisje van 0,2 milliliter 12,5 microliter 2x LAMP-buffer, 1,2 microliter primermix, 1 microliter Bst DNA-polymerase en 5,3 microliter water.

Voeg vervolgens 5 microliter DNA toe aan de 20 microliter reactie en meng goed, en incubeer vervolgens 60 minuten bij 60 graden Celsius in een waterbad of verwarmingsblok. Na de incubatie beëindig de reactie door 5 microliter 10x gel-laadbuffer toe te voegen aan de buis. Laad vervolgens 5 microliter van de reactieproducten op een 2% agarosegel die is gekleurd met intercalating nucleïnezuurkleurstof.

Laat de gel 35 minuten lopen in 1x TBE bij 100 volt en gebruik UV-licht om de resultaten te visualiseren. Om de LAMP-reactie uit te voeren met gereconstitueerde reagens, bereid 1 milliliter reconstitutiebuffer voor door de volgende reagentia te combineren. Meng door 10 seconden pulse-vortex te gebruiken.

Verwijder vervolgens de buisjes die de gelyofiliseerd reagens bevatten uit de verzegelde aluminiumfoliezak. Voor stap 4.2 is het erg belangrijk om ervoor te zorgen dat de aluminiumfoliezak goed is verzegeld voordat u hem opent. Gebruik de buisjes niet als de aluminiumzak niet is verzegeld of beschadigd is.

Voeg 20 microliter reconstitutiebuffer toe aan elk buisje met reagens en meng door vijf keer op en neer te pipetten. Zorg ervoor dat de gelyofiliseerd reagens volledig is opgehangen. Voeg vervolgens 5 microliter DNA-sjabloon toe aan de gereconstitueerde reagens en meng goed.

Incubeer 60 minuten bij 60 graden Celsius in een waterbad of verwarmingsblok. Om de reactie na de incubatie te beëindigen, voeg 5 microliter 10x gel-laadbuffer toe, en voeg vervolgens 5 microliter van de reactieproducten toe aan een 2% agarosegel die is gekleurd met intercalating nucleïnezuurkleurstof. Laat de gel 35 minuten lopen in 1x TBE-buffer bij 100 volt en visualiseer vervolgens de resultaten met UV-licht.

Om de LAMP-reactie uit te voeren met hydroxynaftolblauw, of HNB, of intercalating kleurstof, bereid 1 milliliter reconstitutiebuffer voor door de volgende reagentia te combineren die HNB of een fluorescerende intercalating kleurstof bevatten. Meng door 10 seconden pulse-vortex te gebruiken. Voer de LAMP-reactie uit zoals zojuist beschreven en gebruik UV-licht of het blote oog om de resultaten te visualiseren.

Om de LAMP-reactie uit te voeren met een buisscanner, voeg 5 microliter DNA toe aan de gereconstitueerde reagens die de fluorescerende intercalating kleurstof bevat, en plaats de gesloten buis in de buisscanner. Stel de incubatietemperatuur in op 60 graden Celsius en meet de fluorescentie bij 520 nanometer gedurende 60 minuten. Deze figuur toont de LAMP-reactieresultaten op agarosegels met versbereide reagens en gelyofiliseerd reagens.

Observeer dat het gelyofiliseerd reagens zijn activiteit behoudt. LAMP-reacties bereid met beide reagentia detecteerden 25 kopieën van DNA-sjabloon. In deze figuur wordt de detectie van de reactieproducten met HNB of fluorescerende intercalating kleurstof in de reactie getoond.

De toevoeging van HNB aan de reactie produceert een visuele kleurverandering, van paars naar blauw, met 25, 50 en 100 kopieën van DNA-sjabloon in de reacties. Bovendien toont de opname van fluorescerende intercalating kleurstof in de reactie een sterk fluorescerend signaal bij UV-licht wanneer vergelijkbare DNA-kopienummers aanwezig zijn. Hier worden de resultaten getoond van het gebruik van de buisscanner om de fluorescerende signalen in real-time te monitoren met fluorescerende intercalating kleurstof.

De fluorescerende signalen zijn boven de baseline na 14, 18, 21 en 23 minuten, met 10^6, 10^4, 10^3 en 100 kopieën van DNA-sjabloon in de reacties. Eenmaal onder de knie, kan deze procedure in 90 minuten worden uitgevoerd. Na de ontwikkeling ervan, heeft deze test de weg gebaand voor een snelle diagnose van Coxiella burnetii-infectie in gebieden met beperkte middelen.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u gelyofiliseerd LAMP-reagens reconstitueert. Vergeet niet dat monsters van patiënten besmettelijk kunnen zijn en dat veiligheidsmaatregelen altijd moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.