Name: De ontwikkeling van gevriesdroogde Loop-gemedieerde Isotherme Amplification reagentia voor de detectie van Coxiella burnetii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Leer een eenvoudige LAMP-methode met gevriesdroogde reagentia voor de detectie van Coxiella burnetii in patiëntmonsters. Deze aanpak vereenvoudigt opslag en is ideaal voor gebruik in gebieden met beperkte middelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gesteund door het Naval Medical Research Center, onderzoek werkeenheid 6000.RAD1.J.A0310. De standpunten in dit artikel zijn die van de auteurs en geven niet noodzakelijkerwijs het officiële beleid of de positie van het Ministerie van de Marine, Ministerie van Defensie, of de Amerikaanse regering. Wei-Mei Ching is een werknemer van de Amerikaanse overheid. Dit werk werd opgesteld in het kader van haar officiële taken. Titel 17 USC §105 bepaalt dat &quot;bescherming van het auteursrecht in het kader van deze titel is niet beschikbaar voor een werk van de Amerikaanse regering.&quot; Titel 17 USC §101 definieert een Amerikaanse regering werk als werk bereid door militaire dienst lid of werknemer van de Amerikaanse overheid in het kader van officiële taken van die persoon.

1. Bereid Plasmid DNA verdunningen als norm voor LAMP Reaction <ol><li> Gebruik een spectrofotometer om de optische dichtheid (OD) gemeten bij 260 nm aan het plasmide (bevattende doelwitgen IS1111a van C. burnetii RSA 493) DNA-concentratie te bepalen. Een OD 260 van 1 gelijk aan 50 ug / ul DNA. </li><li> Zetten de hoeveelheid plasmide DNA in het kopieaantal. Aangezien de grootte van het plasmide 6330 bp, het molecuulgewicht van dit plasmide is 4,1 x 10 6 g (6330 bp x 649 g / bp). De DNA-concentratie van het plasmide 34,2 ng / pl (zoals bepaald uit stap 1.1). 1 pl van deze DNA-monster bevat 34,2 ng plasmide-DNA, hetgeen neerkomt op 5 x 10 9 kopieën (34,2 x 10 -9 g / 4,1 x 10 6 GX 6.02 x 10 23) van DNA. </li><li> Voeg 10 ul van plasmide-DNA (5 x 10 9 kopieën / ul) aan 90 ul van water voor een 10-voudige verdunning van een DNA-monster van 5 x 10 8 kopieën / pl. </li><li> Herhaal stap 1,3 tot DNA-monsters van 5 x 10 7 bereiden, 5 x 10 6, 5 x 10 5, 5 x 10 4, 5 x 10 3, 5 x 10 2, 5 x 10 1, en ​​5 x 10 0 kopieën / pl. </li></ol> 2. Bereid Template DNA van Monsters voor LAMP Reaction <ol><li> Voer DNA extractie uit humaan plasma onder toepassing van een commerciële DNA Mini Kit volgens het protocol van de fabrikant. Met in totaal 200 gl monster voor extractie en elueren geëxtraheerde DNA in een 20 ui volume. </li></ol> 3. Maak 2x LAMP Reaction Buffer <ol><li> Meng 200 pl 10x Pol buffer, 320 pl 5 M trimethylglycine, 12 gl 1 M MgSO4, 280 ui dNTP mengsel (10 mM elk) en 188 gl water tot 1 ml 2x LAMP buffer maken. Mix van pulse-vortexen gedurende 10 sec. </li></ol> 4. Voer Standard LAMP Reaction <ol><li> Meng 12,5 pi 2x LAMP buffer (zoals bereid in stap 3; 40 mM Tris-HCl (pH 8,8), 20 mM KCl, 16 mM MgSO4, 20 mM (NH 4) 2 SO 4, 0,2% Triton X-100, 1,6 M trimethylglycine, 1,4 mM dNTP mengsel), 1,2 pl primer mix, 1 ui Bst DNA polymerase (8 U / pl) en 5,3 pi water reactiemengsel (20 ui) in een 0,2 ml PCR buis maken. </li><li> Voeg 5 pl DNA (van stap 1 en 2) naar de 20 pi reactiemengsel en meng goed. </li><li> Afsluiten buis en incubeer bij 60 ° C gedurende 60 min in een waterbad of verwarmingsblok. Dit is de optimale reactietemperatuur vooraf bepaald. </li><li> Voeg 5 ui 10X gelbeladingsbuffer om de reactie te beëindigen. </li><li> Belasting 5 pi reactieproducten tot een 2% agarosegel gekleurd met intercalerende nucleïnezuur vlek. </li><li> Run gel bij 100 V gedurende 35 minuten in 1 x TBE buffer. </li><li> Visualiseer de resultaten door UV-licht. </li></ol> 5. Voer LAMP Reactie met Gereconstitueerdreagentia <ol><li> Meng 125 gl 10x Pol buffer, 200 pl 5 M trimethylglycine, 7,5 gl 1 M MgSO4, 667,5 ui water 1 ml buffer reconstitutie maken. Mix van pulse-vortexen gedurende 10 sec. </li><li> Verwijder buizen die gevriesdroogde reagentia uit de verzegelde aluminiumfoliezak bevatten. Laat de buizen als de aluminiumfolie zak niet is afgedicht gebruikt of als het beschadigd is. </li><li> Voeg 20 ul van reconstitutie buffer in elke buis opnieuw te suspenderen gevriesdroogde reagentia. </li><li> Meng door pipetteren buffer op en neer 5 keer. Neem een ​​kijkje om te controleren of de gevriesdroogde reagentia volledig opnieuw opgeschort. Het witte poeder moet verdwijnen in de buis. </li><li> Voeg 5 ui DNA-matrijs (van stap 1 en 2) om het opgeloste reagentia en meng goed. </li><li> Afsluiten buis en incubeer bij 60 ° C gedurende 60 min in een waterbad of verwarmingsblok. </li><li> Voeg 5 ui 10X gelbeladingsbuffer om de reactie te beëindigen. </li><li> Belasting 5 gl reactiemengselproducten om een ​​2% agarosegel gekleurd met intercalerende nucleïnezuur vlek. </li><li> Run gel bij 100 V gedurende 35 minuten in 1 x TBE buffer. </li><li> Visualiseer de resultaten door UV-licht. </li></ol> 6. Voer LAMP Reactie met Reconstitution Buffer bevattende HNB of Fluorescent intercalerende Dye <ol><li> Meng 125 gl 10x Pol buffer, 200 pl 5 M trimethylglycine, 7,5 gl 1 M MgSO4, 7,5 ui 20 mM HNB (of 12,5 pl 100x fluorescerende intercalerende kleurstof) en 660 gl (of 655 pl) van water maak 1 ml reconstitutie buffer. Mix van pulse-vortexen gedurende 10 sec. </li><li> Gebruik de bereide buffer bereid in hoofdstuk 6 om de stappen te herhalen 5.2 - 5.6. </li><li> Visualiseren van de resultaten met het blote oog (reactie die HNB) of UV licht (reactie die intercalerende fluorescente kleurstof). </li></ol> 7. Voer Real-time LAMP Reactie met Tube Scanner <ol><li> Voeg 5 ul DNA de reconstituted reagentia met fluorescerende intercalerende kleurstof, dicht buis en voeg deze aan de buis scanner. </li><li> Stel incubatietemperatuur bij 60 ° C. Meet de fluorescentie bij 520 nm gedurende 60 min. </li></ol>

<ol><li>Anderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+Q+fever+United+States%2C+2013%3A+recommendations+from+CDC+and+the+Q+Fever+Working+Group%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Recomm.+Rep%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group.</a> MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).</li>
<li>Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+ratio+of+serum+doxycycline+concentration+to+MIC+and+rapid+decline+of+antibody+levels+during+treatment+of+Q+fever+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+and+Chemother%22%5BJournal%5D)">Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis.</a> Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).</li>
<li>Fournier, P. E., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+PCR+and+serology+assays+for+early+diagnosis+of+acute+Q+fever%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever.</a> J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).</li>
<li>Schneeberger, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+with+serum+samples+is+indispensable+for+early+diagnosis+of+acute+Q+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever.</a> Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).</li>
<li>Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+acute+Q+fever+by+PCR+on+sera+during+a+recent+outbreak+in+rural+South+Australia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N+Y+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia.</a> Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).</li>
<li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).</li>
<li>Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+rapid+and+sensitive+detection+of+Orientia+tsutsugamushi.+by+loo-isothermal+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+R.+Soc.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification.</a> Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).</li>
<li>Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHuber%2C+E+%22J.+Med.+Microb.+Diagn%22">J. Med. Microb. Diagn</a>. 1 (112), (2012).</li>
<li>Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+sensitive+detection+of+the+ompB+gene+of+spotted+fever+group+rickettsiae+by+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification.</a> BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).</li>
<li>Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+by+turbidity+derived+from+magnesium+pyrophosphate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).</li>
<li>Qiao, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+for+rapid+detection+of+Bacillus+anthracis.spores%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores.</a> Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).</li>
<li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).</li>
<li>Thekisoe, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+Loop-Mediated+Isothermal+Amplification+%28LAMP%29+reagents+and+its+amplification+efficiency+on+crude+trypanosome+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vet.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates.</a> J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).</li>
<li>Chen, H. W., Ching, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+loop-mediated+isothermal+amplification+assays+for+rapid+and+easy+detection+of+Coxiella+Burnetii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii.</a> J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+In-House+Real-Time+LAMP+Assays+with+a+Commercial+Assay+for+the+Detection+of+Pathogenic+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria.</a> Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Eerder hebben we een gevoelige en specifieke test gericht op de LAMP inbrengorgaan IS1111a 14. De IS1111 element werd gekozen omdat het sterk geconserveerd onder de verschillende stammen van C. burnetii en het hoge aantal kopieën (7-110) in de bacteriën (Klee 2006). Onze resultaten toonden dat LAMP ongeveer 25 kopieën van IS1111 element, die correleren met slechts een chromosomale kopie van Coxiella DNA kan detecteren. In deze studie, Bst DNA polymerase, L...

De kleine Gram-negatieve bacterie Coxiella burnetii is de verwekker van Q-koorts, die wereldwijd zoönose. Als gevolg van de wereldwijde distributie Q-koorts en de hoge infectiviteit van C. burnetii, de VS militair en civiel personeel in het buitenland ingezet lopen het risico van besmetting in de endemische gebieden. Q-koorts manifesteert zich in twee vormen: acute en chronische infecties. Acute Q-koorts presenteert zich met griepachtige symptomen, hepatitis, of longontsteking, en is meestal een self-limiting ziekte met een lage sterfte. Chronische Q-koorts, terwijl minder gangbaar, resulteert vaak in endocarditis, die een veel hogere sterftecijfer heeft indien onbehandeld 1,2. Daarom, vroege diagnose te begeleiden een passende behandeling is van cruciaal belang voor de patiëntenzorg. Polymerase kettingreactie (PCR) en kwantitatieve real time PCR (qPCR) assays ontwikkeld voor het detecteren C. burnetii DNA in celculturen en klinische monsters 3-5 &lt;/ Sup&gt;. Zowel PCR en qPCR zijn duur en vaak niet direct beschikbaar in resource-constrained gebieden voor routinewerk. Oorspronkelijk beschreven door Notomi 6-loop gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) biedt een alternatieve DNA-amplificatie methode. LAMP gebruikt Bst DNA polymerase voor strengverplaatsing DNA-synthese met speciaal ontworpen primersets die ten minste zes onafhankelijke gebieden van het doelgen herkennen. Het belangrijkste voordeel van LAMP is dat amplificatie plaats onder isotherme omstandigheden. Daarom wordt slechts een waterbad, verwarming blok of een incubator vereist. Deze methode werd gebruikt om verschillende rickettsia ziekteverwekkers 7-9 detecteren. Visualisatie van geamplificeerde DNA-producten door gelelektroforese is de meest accurate methode die terecht positieve valse positieven kunnen differentiëren door niet-specifieke amplificatie. Maar de bij gelelektroforese procedures niet praktisch voor beperkte middelen arEAS. Verschillende alternatieve methoden ontwikkeld om de reactieproducten gedetecteerd. Deze alternatieve zoals troebelheid afgeleid van magnesiumpyrofosfaat formatie 10 of met een fluorescerende intercalerende kleurstof onder UV-licht 11,12 worden gevisualiseerd gunstiger dan het draaien van een gel. De LAMP reagentia waren een maand stabiel indien bewaard bij 25 ° C en 37 ° C, waarbij omgevingstemperatuur in tropische en subtropische landen waarin Q-koorts endemisch 13. Een LAMP assay werd ontwikkeld in ons laboratorium om de aanwezigheid van sporen C. burnetii in 14 plasmamonsters. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor de bereiding van de LAMP reactiemengsel uit de gevriesdroogde reagentia. De gevriesdroogde reagentia een maand stabiel indien bewaard bij kamertemperatuur. In combinatie met een eenvoudige visualisatiemethode is dit een ideale methode te gebruiken voor het detecteren C. burnetii in een beperkte middelen setting.

<table><tbody><tr><td>LAMP primers</td><td>Eurofins MWG operon</td><td>10 nmol, zout vrij</td><td>Door klant ontworpen sequentie</td></tr><tr><td>Bst DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0275L</td><td>8 eenheden/ml</td></tr><tr><td>10x Thermo pol buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B9004S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP-mengsel</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>10 mM elk</td></tr><tr><td>Betaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300</td><td>5 M, Trimethylglycine</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3409-1ML</td><td>1 M</td></tr><tr><td>10x Bluejuice</td><td>Invitrogen</td><td>10816-015</td><td>gel-laadbuffer</td></tr><tr><td>SYBR green</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td>10.000x, visualiseer producten in buizen</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Phenix Research Products</td><td>RGB-4103</td><td>10.000x, visualiseer producten in gels</td></tr><tr><td>Gelyofiliseerd reagens</td><td>Gene Reach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydroxynaftol blauw</td><td>Fluka</td><td>33936-10G</td><td></td></tr><tr><td>ESEQuant buisscanner</td><td>Qiagen</td><td></td><td>real-time detectie</td></tr></tbody></table>

de ontwikkeling van gevriesdroogde loop-gemedieerde isotherme amplification reagentia voor de detectie van<em&gt; coxiella burnetii</em

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, de agent waardoor Q-koorts, is een obligaat intracellulaire bacterie. PCR gebaseerde diagnostische testen ontwikkeld voor het detecteren C. burnetii DNA in celculturen en klinische monsters. PCR vereist gespecialiseerde apparatuur en uitgebreide training van eindgebruikers, en daarom niet geschikt voor routinematige werken vooral in een gebied met beperkte hulpbronnen. We hebben a-loop gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) test om de aanwezigheid van C. detecteren ontwikkeld burnetii in monsters van patiënten. Deze werkwijze wordt uitgevoerd bij een temperatuur rond 60 ° C in een waterbad of verwarmingsblok. De gevoeligheid van deze assay LAMP is vergelijkbaar met PCR met een detectielimiet van ongeveer 25 kopieën per reactie. Dit rapport beschrijft de bereiding van het reactiemengsel middels gevriesdroogde reagentia en visualisatie van resultaten via Hydroxynaftolblauw blauw (HNB) of een UV-lamp met fluorescerende intercalerende kleurstof in het reactiemengsel. De LAMP reagentia waren lyophilized en bewaard bij kamertemperatuur (KT) gedurende één maand zonder verlies van detectiegevoeligheid. Dit LAMP test is bijzonder robuust omdat het reactiemengsel preparaat geen complexe stappen omvatten. Deze methode is ideaal voor gebruik in beperkte middelen waar de Q-koorts endemisch is.

Het gevriesdroogde LAMP reagentia in de 0,2 ml buisje bevat Bst DNA polymerase, primers en dNTP&#39;s. 20 ui buffer reconstitutie wordt gebruikt om resuspendeer de gevriesdroogde reagentia. Figuur 1 toont de resultaten LAMP reactie op agarosegels met vers bereide reagentia en reagentia gevriesdroogd. Het gevriesdroogde reagens heeft geen activiteit te verminderen. LAMP reacties bereid door beide reagentia kan 25 kopieën van DNA-matrijs. Figuur 2...

We beschreven hier een eenvoudige loop-mediated isothermal amplification (LAMP) methode met behulp van gelyofiliseerd reagens voor de detectie van C. burnetii in monsters van patiënten.

De ontwikkeling van gevriesdroogde Loop-gemedieerde Isotherme Amplification reagentia voor de detectie van<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Het algemene doel van dit experiment is het ontwikkelen van een eenvoudige LAMP-methode met gebruik van gelyofiliseerde reagentia voor de detectie van C.burnetii in patiëntenmonsters. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat koeling niet vereist is voor de opslag van de reagentia. Deze methode is ideaal voor gebruik in omgevingen met beperkte middelen waar Q-koorts endemisch is.Tatiana, een laborant uit ons laboratorium, zal de procedure demonstreren. Bepaal, beginnend met DNA voor het doelgen IS1111a van C.burnetii RSA493, de plasmidconcentratie met een spectrofotometer bij 260 nanometers. Reken de plasmid-DNA-concentratie om naar kopie-aantallen met behulp van de volgende berekeningen, waarbij 6330 gelijk staat aan de lengte in baseparen van het plasmid, en 34,2 nanograms per microliter de concentratie van het plasmid is, zoals zojuist bepaald met de spectrofotometer.Bereid vervolgens seriële verdunningen van 8 tot 10 keer van het plasmide voor om het volgende aantal kopieën per microliter te verkrijgen. Om het DNA-template voor de LAMP-reactie voor te bereiden, begint u met 200 microliter menselijke plasmaproeven en extraheert u het DNA met de DNA miniprep kit volgens het protocol van de fabrikant. Verdun het uiteindelijke monster tot een volume van 20 microliter.Bereid 1 milliliter 2x LAMP-reactiebuffer door de volgende reagentia te combineren. Meng door 10 seconden kortstondig te vortexen. Om de standaard LAMP-reactie uit te voeren, mengt u in een 0,2 milliliter PCR-buis 12,5 microliter 2x LAMP-buffer, 1,2 microliter primermengsel, 1 microliter Bst DNA-polymerase en 5,3 microliter water.Voeg vervolgens 5 µL DNA toe aan de reactie van 20 µL en meng goed, en incubeer dit vervolgens 60 minuten bij 60 °C in een waterbad of verwarmingsblok. Beëindig na de incubatie de reactie door 5 µL 10x gel-laadbuffer aan de buis toe te voegen. Breng daarna 5 µL van de reactieproducten aan op een 2% agarosegel die is gekleurd met een intercalerende nucleïnezuurkleurstof.Voer de gel-elektroforese uit in 1x TBE bij 100 volt gedurende 35 minuten en gebruik vervolgens UV-licht om de resultaten te visualiseren. Om de LAMP-reactie met gereconstitueerde reagentia uit te voeren, bereidt u 1 milliliter reconstitutiebuffer door de volgende reagentia te combineren. Meng deze door 10 seconden kortstondig te vortexen.Verwijder vervolgens de buisjes met de gelyofiliseerde reagentia uit de verzegelde aluminiumfoliezak. Voor stap 4.2 is het zeer belangrijk om te controleren of de aluminiumfoliezak goed is verzegeld voordat deze wordt geopend. Gebruik de buisjes niet als de aluminiumzak niet is verzegeld of beschadigd is.Voeg 20 µL reconstitutiebuffer toe aan elke buis met reagentia en meng door vijf keer te pipetteren. Zorg ervoor dat de gelyofiliseerde reagentia volledig zijn gesuspendeerd. Voeg vervolgens 5 µL DNA-template toe aan de gereconstitueerde reagentia en meng goed.Incubeer 60 minuten bij 60 °C in een waterbad of heating block. Om de reactie na de incubatie te beëindigen, voegt u 5 µL 10x gel-laadbuffer toe. Breng vervolgens 5 µL van de reactieproducten aan op een 2% agarosegel die gekleurd is met een intercalerende nucleïnezuurkleurstof. Laat de gel 35 minuten lopen in 1x TBE-buffer bij 100 volt en visualiseer daarna de resultaten met UV-licht.Om de LAMP-reactie uit te voeren met hydroxynaphthol blue, of HNB, of een intercalerende kleurstof, bereid dan 1 milliliter reconstitutiebuffer voor door de volgende reagentia te combineren die HNB of een fluorescerende intercalerende kleurstof bevatten. Meng door 10 seconden kortstondig te vortexen. Voer de LAMP-reactie uit zoals zojuist beschreven en gebruik UV-licht of het blote oog om de resultaten te visualiseren.Om de LAMP-reactie met een buizenscanner uit te voeren, voegt u 5 µL DNA toe aan de gereconstitueerde reagentia die de fluorescerende intercalerende kleurstof bevatten, en plaatst u vervolgens de gesloten buis in de buizenscanner. Stel de incubatietemperatuur in op 60 °C en meet de fluorescentie bij 520 nm gedurende 60 minuten. Deze figuur toont de LAMP-reactieresultaten op agarosegels met vers bereide reagentia en gelyofiliseerde reagentia.Observeer dat het gelyofiliseerde reagens zijn activiteit behoudt. LAMP-reacties voorbereid met beide reagentia detecteerden 25 kopieën van het DNA-template. In deze figuur wordt de detectie van de reactieproducten met HNB of een fluorescerende intercalerende kleurstof in de reactie getoond.De toevoeging van HNB aan de reactie veroorzaakt een zichtbare kleurverandering, van paars naar blauw, bij de aanwezigheid van 25, 50 en 100 kopieën van het DNA-template in de reacties. Daarnaast vertoont de inclusie van een fluorescente intercalerende kleurstof in de reactie een sterk fluorescent signaal onder UV-licht wanneer vergelijkbare DNA-kopiegetallen aanwezig zijn. Hier worden de resultaten getoond van het gebruik van de buisenscanner om de fluorescente signalen in real-time te monitoren met de fluorescente intercalerende kleurstof.De fluorescentiesignalen liggen boven de basislijn na 14, 18, 21 en 23 minuten, met 10^6, 10^4, 10^3 en 100 kopieën van het DNA-sjabloon in de reacties. Zodra de procedure onder de knie is, kan deze in 90 minuten worden uitgevoerd. Na de ontwikkeling maakte deze assay de weg vrij voor een snelle diagnose van Coxiella burnetii-infecties in gebieden met beperkte middelen.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe gelyofiliseerde LAMP-reagentia moeten worden gereconstitueerd. Vergeet niet dat patiëntmonsters infectieus kunnen zijn en dat er altijd veiligheidsvoorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.

the-development-lyophilized-loop-mediated-isothermal-amplification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Domesle, K. J., et al. Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technique for detecting a target bacterial gene by amplifying DNA at a constant temperature. The reaction mixture is prepared by adding an isothermal master mix, specific primers for the target gene, and samples containing DNA templates. The...

Loop-Mediated Isothermal Amplification for Bacterial Gene Detection

This video demonstrates a method for assessing the intracellular growth of GFP-tagged Coxiella mutants within cultured epithelial cells. The mutant phenotype is visualized using immunostaining and epifluorescence microscopy, allowing the study of the effect of the mutation on intracellular growth.

Assessment of Intracellular Growth of Coxiella Mutants within Eukaryotic Cells

De diagnose van Eimeria-infectie bij kippen blijft veeleisend. Aanpakken gebaseerd op parasietenmorfologie en pathologie van de gastheer zijn vaak niet doorslaggevend, terwijl moleculaire benaderingen op basis van PCR veeleisend zijn gebleken in termen van kosten en expertise. Het doel van dit protocol is om lus-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) te vestigen als een eenvoudige moleculaire diagnose voor eimerian-infectie.

-Loop gemedieerde Isothermisch Amplification (LAMP) Testen voor de Species-specifieke detectie van<em&gt; Eimeria</em&gt; Dat Kippen infecteren

Er is een protocol gegeven voor het ontwikkelen van een real-time recombinase polymerase-amplificatietest om de initiële concentratie van DNA-monsters te kwantificeren met behulp van een thermische cycler of een microscoop en een stage-heater. Ook beschreven is de ontwikkeling van een interne positieve controle. Scripts zijn gegeven voor het verwerken van ruwe real-time fluorescentiegegevens.

Ontwikkeling van een kwantitatieve Recombinase Polymerase Amplificatie test met een interne positieve controle

Coxiella burnetii is een obligaat intracellulaire Gram-negatieve bacterie die verantwoordelijk is voor de zoönose Q-koorts. Hier beschrijven we werkwijzen voor het genereren van Coxiella fluorescent transposon mutanten en de geautomatiseerde identificatie en analyse van de verkregen internalisatie, replicatie en cytotoxische fenotypes.

Generatie en Multi-fenotypische High-inhoud Screening van<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling en validatie van een kwantitatieve PCR-methode die wordt gebruikt voor de detectie en kwantificering van EHV-2 DNA in ademhalingsvloeistoffen van paarden. Het validatieprotocol voor EHV-2 qRT-PCR omvat een drieledige procedure: ontwikkeling, karakterisering van de qRT-PCR-test alleen en karakterisering van de volledige analytische methode.

Ontwikkeling en validatie van een kwantitatieve PCR-methode voor equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Onderzoek naar de interactie tussen bacteriële pathogenen en hun gastheren is een belangrijk gebied van biologisch onderzoek. Hier beschrijven we de noodzakelijke technieken om effector translocatie door Coxiella burnetii tijdens siRNA gene silencing behulp blam substraat te meten.

Aanbrengen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) naar Effector Translocatie Efficiency Onderzoek door<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Tijdens siRNA Silencing

Dit protocol beschrijft de fabricage van een kleine, kant-en-klare cassette die kan worden toegepast voor visuele detectie van meerdere nucleic zuren in een enkele, test die is eenvoudig te bedienen. In deze benadering werd een capillaire matrix gebruikt voor multiplex en zeer efficiënte opsporing van GGO-doelstellingen.

Visuele detectie van meerdere Nucleic Acids in een capillaire matrix

Loopgemedieerde isothermale versterking (LAMP) is een isothermische nucleïnezuurversterkingstest (iNAAT) die brede belangstelling heeft getrokken voor het detectieveld van ziekteverwekkers. Hier presenteren we een multilaboratorium gevalideerd Salmonella LAMP-protocol als een snelle, betrouwbare en robuuste methode voor het screenen van Salmonella in dierlijk voedsel en het bevestigen van vermoedelijke Salmonella uit cultuurisolatie.

Lusgemedieerde isothermale versterking voor het screenen van salmonella in dierlijk voedsel en het bevestigen van Salmonella uit cultuurisolatie

Het huidige werk beschrijft de stappen voor het produceren van kant-en-klare qPCR voor T. cruzi DNA-detectie die vooraf op het reactievat kan worden geladen en gedurende enkele maanden in de koelkast kan worden bewaard.

Kant-en-klare qPCR voor detectie van DNA van Trypanosoma cruzi of andere pathogene organismen

Verschillende bacteriële ziekteverwekkers kunnen luchtweginfecties veroorzaken en tot ernstige gezondheidsproblemen leiden als ze niet nauwkeurig worden gedetecteerd en onmiddellijk worden behandeld. Snelle en nauwkeurige detectie van deze ziekteverwekkers via lusgemedieerde isotherme amplificatie zorgt voor een effectief beheer en controle van luchtweginfecties in klinische omgevingen.

Snelle detectie van bacteriële pathogenen die infecties van de onderste luchtwegen veroorzaken via op microfluïdische-chips gebaseerde lus-gemedieerde isotherme amplificatie

Leer een eenvoudige LAMP-methode met gevriesdroogde reagentia voor de detectie van Coxiella burnetii in patiëntmonsters. Deze aanpak vereenvoudigt opslag en is ideaal voor gebruik in gebieden met beperkte middelen.

De ontwikkeling van gevriesdroogde Loop-gemedieerde Isotherme Amplification reagentia voor de detectie van

Meer video's verkennen