Name: Gecombineerde optogenetische en Freeze-fractuur Replica immunokleuring Input-specifieke Regeling van glutamaatreceptoren in de Mouse amygdala Onderzoek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Ontdek hoe optogenetica gecombineerd met freeze-fractuur replica immunokleuring (FRIL) de dichtheid van ionotrope glutamaatreceptoren in de muisamygdala analyseert. Deze methode biedt inzicht in de structureel-functionele eigenschappen van synapsen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De financiering werd verstrekt door de Austrian Science Fund FWF-subsidie nr. P-22969-B11 aan F. Ferraguti, en door de Charitable Hertie Foundation en het Werner Reichardt Centrum voor Integratieve Neurowetenschappen en door de DFG (CIN-Exc. 307) aan I. Ehrlich.

<ol><li>Fujimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDS-digested+freeze-fracture+replica+labeling+electron+microscopy+to+study+the+two-dimensional+distribution+of+integral+membrane+proteins+and+phospholipids+in+biomembranes%3A+practical+procedure%2C+interpretation+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SDS-digested freeze-fracture replica labeling electron microscopy to study the two-dimensional distribution of integral membrane proteins and phospholipids in biomembranes: practical procedure, interpretation and application.</a> Histochem Cell Biol. 107 (2), 87-96 (1997).</li>
<li>Masugi-Tokita, M., Shigemoto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+quantitative+visualization+of+glutamate+and+GABA+receptors+at+central+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">High-resolution quantitative visualization of glutamate and GABA receptors at central synapses.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 387-393 (2007).</li>
<li>Rash, J. E., Yasumura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+immunogold+labeling+of+connexins+and+aquaporin-4+in+freeze-fracture+replicas+of+liver%2C+brain%2C+and+spinal+cord%3A+factors+limiting+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Direct immunogold labeling of connexins and aquaporin-4 in freeze-fracture replicas of liver, brain, and spinal cord: factors limiting quantitative analysis.</a> Cell Tissue Res. 296 (2), 307-321 (1999).</li>
<li>Emes, R. D., Grant, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+synapse+complexity+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evolution of synapse complexity and diversity.</a> Annu Rev Neurosci. 35, 111-131 (2012).</li>
<li>Matsuzaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+geometry+is+critical+for+AMPA+receptor+expression+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine geometry is critical for AMPA receptor expression in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Nat Neurosci. 4 (11), 1086-1092 (2001).</li>
<li>Rollenhagen, A., Lübke, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphology+of+excitatory+central+synapses%3A+from+structure+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">The morphology of excitatory central synapses: from structure to function.</a> Cell Tissue Res. 326 (2), 221-237 (2006).</li>
<li>Tarusawa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Input-specific+intrasynaptic+arrangements+of+ionotropic+glutamate+receptors+and+their+impact+on+postsynaptic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Input-specific intrasynaptic arrangements of ionotropic glutamate receptors and their impact on postsynaptic responses.</a> J Neurosci. 29 (41), 12896-12908 (2009).</li>
<li>Nusser, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+and+pathway+dependence+of+synaptic+AMPA+receptor+number+and+variability+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus.</a> Neuron. 21 (3), 545-559 (1998).</li>
<li>Nyìri, G., Stephenson, F. A., Freund, T. F., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+variability+in+synaptic+N-methyl-D-aspartate+receptor+density+on+interneurons+and+a+comparison+with+pyramidal-cell+spines+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Large variability in synaptic N-methyl-D-aspartate receptor density on interneurons and a comparison with pyramidal-cell spines in the rat hippocampus.</a> Neuroscience. 119 (2), 347-363 (2003).</li>
<li>Nicholson, D. A., Geinisman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axospinous+synaptic+subtype-specific+differences+in+structure%2C+size%2C+ionotropic+receptor+expression%2C+and+connectivity+in+apical+dendritic+regions+of+rat+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Axospinous synaptic subtype-specific differences in structure, size, ionotropic receptor expression, and connectivity in apical dendritic regions of rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> J Comp Neurol. 512 (3), 399-418 (2009).</li>
<li>Millhouse, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intercalated+cells+of+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The intercalated cells of the amygdala.</a> J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).</li>
<li>Busti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+fear+states+engage+distinct+networks+within+the+intercalated+cell+clusters+of+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala.</a> J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).</li>
<li>Amano, T., Unal, C. T., Paré, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+correlates+of+fear+extinction+in+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic correlates of fear extinction in the amygdala.</a> Nat Neurosci. 13 (4), 489-494 (2010).</li>
<li>Duvarci, S., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+microcircuits+controlling+learned+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Amygdala microcircuits controlling learned fear.</a> Neuron. 82 (5), 966-980 (2014).</li>
<li>Jüngling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+S-mediated+control+of+fear+expression+and+extinction%3A+role+of+intercalated+GABAergic+neurons+in+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide S-mediated control of fear expression and extinction: role of intercalated GABAergic neurons in the amygdala.</a> Neuron. 59 (2), 298-310 (2008).</li>
<li>Asede, D., Bosch, D., Lüthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+inputs+to+intercalated+cells+provide+fear-learning+modulated+inhibition+to+the+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala.</a> Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).</li>
<li>Maren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+Pavlovian+fear+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of Pavlovian fear conditioning.</a> Annu Rev Neurosci. 24, 897-931 (2001).</li>
<li>Pape, H. C., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastic+synaptic+networks+of+the+amygdala+for+the+acquisition%2C+expression%2C+and+extinction+of+conditioned+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear.</a> Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).</li>
<li>Sigurdsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+in+the+amygdala%3A+a+cellular+mechanism+of+fear+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning and memory.</a> Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).</li>
<li>Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex-vivo+optogenetic+dissection+of+fear+circuits+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex-vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices.</a> J. Vis. Exp. (110), e53628(2016).</li>
<li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+application+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The development and application of optogenetics.</a> Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).</li>
<li>Bienvenu, T. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+intercalated+neurons+of+amygdala+relay+noxious+sensory+information%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large intercalated neurons of amygdala relay noxious sensory information.</a> J. Neurosci. 35 (5), 2044-2057 (2015).</li>
<li>Sandri, C., Akert, K., Livingston, R. B., Moor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+aggregations+at+specialized+sites+in+freeze-etched+postsynaptic+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Particle aggregations at specialized sites in freeze-etched postsynaptic membranes.</a> Brain Res. 41 (1), 1-16 (1972).</li>
<li>Likhtik, E., Popa, D., Apergis-Schoute, J., Fidacaro, G. A., Paré, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+intercalated+neurons+are+required+for+expression+of+fear+extinction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Amygdala intercalated neurons are required for expression of fear extinction.</a> Nature. 454 (7204), 642-645 (2008).</li>
<li>Fukazawa, Y., Shigemoto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-synapse-type+and+inter-synapse-type+relationships+between+synaptic+size+and+AMPAR+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Intra-synapse-type and inter-synapse-type relationships between synaptic size and AMPAR expression.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 446-452 (2012).</li>
<li>Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogold+cytochemistry+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Immunogold cytochemistry in neuroscience.</a> Nat Neurosci. 16 (7), 798-804 (2013).</li>
<li>Fukazawa, Y., Masugi-Tokita, M., Tarusawa, E., Hagiwara, A., Shigemoto, R. SDS-digested Freeze-fracture replica labelling (SDS-FRL). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFukazawa%2C+Y+%22Handbook+of+Cryo-Preparation+Methods+for+Electron+Microscopy%22">Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy</a>. Cavalier, A., et al. , CRC Press. Boca Raton. 567-586 (2007).</li>
<li>Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-fracture+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Freeze-fracture electron microscopy.</a> Nat Protoc. 2 (3), 547-576 (2007).</li>
<li>Tanaka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+and+density+of+AMPA+receptors+in+single+synapses+in+immature+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Number and density of AMPA receptors in single synapses in immature cerebellum.</a> J Neurosci. 25 (4), 799-807 (2005).</li>
<li>Mansouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+subsynaptic+localization+of+type+1+metabotropic+glutamate+receptors+at+glutamatergic+and+GABAergic+synapses+in+the+rodent+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct subsynaptic localization of type 1 metabotropic glutamate receptors at glutamatergic and GABAergic synapses in the rodent cerebellar cortex.</a> Eur J Neurosci. 41 (2), 157-167 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Freeze-breuk elektronenmicroscopie is een belangrijke techniek in de ultrastructurele onderzoek al meer dan 40 jaar. Echter, het gebrek aan effectieve middelen om de moleculaire samenstelling van membranen bestuderen een significante daling in het gebruik. Onlangs is er een grote opleving vries-breuk elektronenmicroscopie als gevolg van de ontwikkeling van effectieve manieren om integrale membraaneiwitten openbaren door immunogold labeling 1, 2, namelijk de FRIL techniek. De FRIL techniek bezit een aantal voordelen ten opzichte van andere immunogoud ultrastructurele methoden. Eerst, eiwitten gemakkelijk toegankelijk voor antilichamen verhogen van de gevoeligheid. Tweede blootstelling van groot deel van plasmamembraan specialisaties zoals de postsynaptische membraan op het tweedimensionale oppervlak van de replica maakt de controle van de ruimtelijke verdeling en de fysieke nabijheid van moleculen van interesse zonder omslachtige en tijdrovende reconstructie van serial ultradunne secties. Ten derde, de beschikbaarheid van beide helften van de plasmamembraan verhoogt het aantal eiwitten die voor elke individuele structuur kan worden gemerkt, mits geschikte antilichamen beschikbaar. Na breken wordt het hydrofobe oppervlak van het gesplitste membraan beklede koolstof bevatten platina eiwitdomeinen die achterblijft op het breukvlak verschanst. Dit voorkomt toegang van antilichamen tegen antigenen in deze domeinen. Bijvoorbeeld op P-gezicht van een replica enige epitopen tegenover het protoplasma ruimte kan worden gedetecteerd met antilichamen, terwijl de E-gezicht alleen epitopen tegenover de exoplasmatische ruimte kan worden gebonden door antilichamen (zie figuur 2). Anderzijds, de FRIL techniek lijdt ook onder bepaalde beperkingen 2. Breuken willekeurige plaatsen, kan het moeilijk zijn om specifieke cellen of structuren te richten. Dit kan ook leiden tot een steekproef bias, bijvoorbeeld in synaps collectie, gezien de verschillende waarschijnlijkheid van fracturing langs het membraan structuren met verschillende kromming (bijvoorbeeld stekels versus assen). Bovendien is de verdeling van membraaneiwitten naar een van de twee vlakken is onvoorspelbaar. Daarom is de verdeling van een eiwit aan het P-face of E-face, in het bijzonder voor kwantitatieve studies moet zorgvuldigheid worden aangepakt met behulp van antilichamen reactief intracellulaire en extracellulaire domeinen. Tenslotte de identificatie in de replica van bepaalde structuren, zoals axon presynaptische terminals, kan moeilijk zijn indien alleen op morfologische kenmerken. Het gebruik van specifieke antilichamen voor marker proteïnen of transductie van gemerkte integrale membraaneiwitten of kanalen met virale vectoren biedt extra hulpmiddelen voor de identificatie van de gebroken membranen vergemakkelijken. Bijvoorbeeld, deze studie maakten gebruik van de transductie van ChR2-YFP in thalamische neuronen om hun axonen afferenten te identificeren in de amygdala en de etikettering van μ-opioïde receptoren postsynaptische me onthullenmbranes van ITC neuronen. Met het oog op de FRIL techniek succes uit te voeren, moet bijzondere zorg worden genomen met betrekking tot weefsel fixatie. Sterke fixatie van het weefsel (&gt; 2% paraformaldehyde) kan leiden tot een hoge mate van cross-breuken en een afname van labeling gevoeligheid. Anderzijds, zwakke fixaties maken het weefsel hanteren en de bewerking (bijvoorbeeld snijden van profielen) moeilijk. Het is ook belangrijk om te controleren of de dikte van de getrimde blokken overeenkomt met de dikte van het dubbelzijdige plakband. Indien de dikte van het monster lager is dan die van de band, zou het oppervlak van het weefsel niet hechten aan het oppervlak van de twee metalen dragers, wordt derhalve het bevroren monster niet gebroken. Als het weefsel dikker is, wordt deze gecomprimeerd onvermijdelijke structurele vervormingen wanneer de sandwich van de twee koperen dragers gemaakt. De temperatuur waarbij het monster is gebroken (in dit protocol, -115 ° C) speelt ook een belangrijke rolde structuur van de replica. Hogere temperaturen kunnen een hoger percentage van artefacten produceren zoals condensatie van waterdamp op het oppervlak van het weefsel voor of tijdens verdamping. Lagere temperaturen (&lt;-125 ° C) kan het risico van splitsing te verhogen off van materiaal tijdens het breken. Dit materiaal kan vallen op het oppervlak van het monster of blijven aangesloten. Deze vlokken van het materiaal zijn ook gecoat en contrast produceren van donkere vlekken op de afbeelding. Breken bij lagere temperaturen kan ook invloed hebben op de frequentie van de cross-breuken in het bijzonder voor kleine fijne structuren zoals dendritische. Een verdere belangrijke stap bij de bereiding van replica&#39;s is het detergens-digestie. Als de vertering onvolledig is, de onverteerd weefsel verschijnt als donkere vlekken aan de replica verstorende de analyse van de structuur van de TEM. Bovendien onverteerd weefsel kan niet-specifiek vangen of te binden antilichamen, waardoor de achtergrond labeling. Anderzijds, het gebruik van detergenss voor weefsel spijsvertering kan de moleculen geassocieerd met de replica veranderen van hun secundaire en tertiaire structuren denatureren. Daarom is voor bepaalde antigenen, nodig kan zijn om geleidelijk verdunnen van de concentratie van SDS extra wasstappen. Voor immunokleuring, de beschikbaarheid van verschillende maten gouddeeltje geconjugeerde secundaire antilichamen maakt het mogelijk om sporen tegelijk, maar kwalitatief verschillende eiwitten, ook in bepaalde microdomeinen van het plasmamembraan, zoals de postsynaptische specialisatie. Echter, als gevolg van sterische hindering, kwantitatieve studies meestal beperkt tot het opsporen van één molecuul. De grootte van de goud deeltjes kunnen ook invloed hebben op de etikettering werkzaamheid. Voor de interpretatie van de etikettering in FRIL, moet er rekening mee dat de immunogoud deeltje overal kan worden geplaatst binnen een halve bol met een straal van 20-25 nm van het antigeen worden gehouden vanwege de flexibele complexe vormed door de primaire en secundaire antilichaam 26. Voor meer informatie over de theorie en praktijk van FRIL en aanverwante technieken, verwijzen wij de lezer ook naar andere methodologische artikelen 27, 28. De FRIL techniek is recentelijk voor hoge resolutie kwantitatieve analyses van glutamaat receptor lokalisatie in diverse synaps populaties 29, 30. Bovendien, de detectiegevoeligheid van de FRIL techniek voor AMPA-Rs geschat zo hoog als een immuno- deeltje per één functionele AMPA -R kanaal 29. Daarom is deze benadering is algemeen zeer nuttig te kwantificeren en het patroon van postsynaptische expressie van AMPA-R&#39;s en NMDA-Rs bij de centrale synapsen analyseren. Hier hebben we aangetoond dat de toepasbaarheid bij PIN / MGN-ITC synapsen, een site het meest waarschijnlijk van belang zijn voor het doorgeven van de VS informatie tijdens angst conditionering. Toepassing van een antilichaam opgewekt tegen het extracellulaire sterk geconserveerde aminozuurresiduen van de AMPA receptor subunits GluA1-GluA4, vonden we een gelijkmatige verdeling van gouddeeltjes binnen IMP clusters gevonden volgens postsynaptische membraan specialisaties. De dichtheid van AMPA-R&#39;s in ITC stekels was significant hoger in vergelijking met de as synapsen doelwit van PIN / MGN thalamus afferenten. Zowel wervelkolom en schacht synapsen, een positieve correlatie tussen etikettering van AMPA-Rs en postsynaptische gebied werd gedetecteerd, een gemeenschappelijk kenmerk van andere glutamaat synapsen 25. De lage variatie in dichtheid van AMPA-R&#39;s in PIN / MGN-ITC synapsen duidt op een homogene verdeling vergelijkbaar met andere synapsen gevormd door thalamic afferenten 7, maar verschillend van corticale synapsen 25. Omgekeerd is de dichtheid van NMDA-Rs was variabeler en verschilde niet tussen de ruggengraat en de as synapsen suggereren een andere regeling dan AMPA-Rs. In de toekomst, zullen de hoge reproduceerbaarheid van het FRIL techniek niet alleen toe om de basale moleculaire samenstelling van centrale synapsen beoordelen, maar kan detectie van c gemakkelijkerijzigingen in ionotrope glutamaat receptor nummers en subsynaptic distributie na angst leren, als aanvulling op ex-vivo opnames van pre- en postsynaptische eigenschappen van deze ingangen. Concluderend kan deze benadering worden gebruikt door andere onderzoekers inzichten in de structuur-functie relaties van de input-specifieke exciterende synapsen krijgen in veel andere neurale circuits waarin ontwarren de oorsprong van de ingangen en de aard en samenstelling van postsynaptische elementen cruciaal maar problematisch .

De definitie van de functionele architectuur van biomembranen op nanometerschaal is de laatste jaren uitgedaagd door de ontwikkeling van een aantal immunokleuring technieken geschikt voor transmissie elektronenmicroscopie. Maar deze technieken, bijvoorbeeld voor en na de inbedding immunogold, hebben een aantal belangrijke beperkingen, die slechte detectie van antigenen en / of beperkte kwantitatieve beoordeling van membraangebonden eiwitten bevatten. Deze beperkingen worden bijzonder kritisch bij het onderzoek van de fijnstructuur van het zenuwstelsel, die wordt gekenmerkt door een hoge mate van cel- diversiteit en heterogeniteit synaps. Deze heterogeniteit resultaten van beide structurele en functionele diversiteit bepaald door de pre- en postsynaptische elementen en de differentiële expressie, verrijking, of interactie van signalering eiwitten, bijvoorbeeld receptoren, transporters en effectormoleculen. Een nieuwe aanpak voor de directe immunolabeling van integrale of verknoopte membraaneiwitten in detergens gesolubiliseerde vries-breuk replica (FRIL) werd oorspronkelijk geïntroduceerd door Fujimoto twintig jaar geleden 1. Deze originele methode heeft echter een aantal beperkingen, dat wil zeggen, ernstige fragmentatie replica die betekenisvolle correlaties van gelabelde moleculen met individueel toegewezen cellen in complexe weefsels zoals de hersenen belemmerd. Ongeveer 10 jaar geleden, en Shigemoto Fukazawa geleidelijk de techniek 2 verbeterd. Dit ging gepaard met inzet van een andere groep wetenschappers bij Boulder laboratoria van de Colorado State University, die ook aanzienlijk de techniek verbeterd, met name voor de studie van gap junctions 3. De verbetering in vorst-breken protocollen en machines, alsmede de invoering van snel invriezen (onder hoge druk), kan nu onderzoekers replica ononderbroken produceren van specimens van relatief grote omvang en high kwaliteit beelden van de meeste cellulaire componenten zonder de beperkingen en artefacten geproduceerd door sterke chemische fixaties. De FRIL techniek biedt het grote voordeel van een zeer kwantitatieve in situ identificatie van één of meer eiwitten (gelijktijdig) in kaart gebracht histologisch en cytologisch geïdentificeerde cellen in complex weefsels zoals de hersenen, met als bijkomend voordeel een bovenaanzicht van pre- en postsynaptische elementen in een replica. Daarom is de FRIL techniek, ondanks de vele technische obstakels, belooft een aantal zeer belangrijke wetenschappelijke doorbraken, met name voor de correlatie van de structurele en functionele eigenschappen van individuele synapsen. Gedurende de laatste decennia, heeft een groot deel van de informatie is verkregen over de structuur, de moleculaire make-up, en de fysiologische functie van synapsen; Nog synapsen morfologisch en moleculair zeer divers afhankelijk van de pre- en postsynaptische pahuur neuronen 4. Alleen voor een handvol synaps types waren structuur-functie studies tot nu toe 5-7 bereikt. Dit was vooral te wijten aan technische beperkingen die een nauwkeurige identificatie van de aard van de pre- en postsynaptische elementen voorkomen. Ultrastructurele analyse kritische inzichten opgeleverd in de variabiliteit van postsynaptische membraan specialisaties over verschillende synaptische contacten zowel qua synaptische omvang en inhoud neurotransmitterreceptoren 6, die een grote invloed op de sterkte en de plasticiteit van synaptische transmissie. Verder is een groot aantal onderzoeken blijkt dat het aantal ionotrope glutamaatreceptoren uitgedrukt op verschillende soorten synaps is geregeld in een afferent- en target-afhankelijke manier 7-10. Hier wordt een methode geschetst dat de analyse van de structuur en de samenstelling van de receptor postsynaptische membraan specialisaties mogelijk maakt met definiërend presynaptische elementen en functie. Deze benadering maakt gebruik van presynaptische expressie van recent ontwikkelde lichtgevoelige algen eiwitten, zoals Channelrhodopsin2 (ChR2), en de FRIL techniek om het patroon van postsynaptische expressie van α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic analyseren zuur (AMPA-R&#39;s) en N-methyl-D-aspartaat (NMDA-R&#39;s) glutamaatreceptoren. Dit blijkt bij synapsen gevormd door axonen afkomstig van het achterste mediale geniculate thalamische kernen (PIN / MGN) op neuronen van de geïntercaleerde celmassa&#39;s van de amygdala (ITC). ITC neuronen zijn klein stekelige GABAergic cellen georganiseerd in clusters rond het basolaterale amygdalae complex (BLA) 11, 12. ITC neuronen is bekend dat prikkelende input te ontvangen van BLA hoofdsom neuronen en te richten op de centrale kern (CEA), waardoor het als een remmende gate voor de informatiestroom tussen de BLA en Cea 12-15. Onlangs hebben we aangetoond dat hetC neuronen gelegen in het medio-dorsale cluster tussen BLA en CEA krijgen ook direct en convergente prikkelende input van sensorische thalamus en temporale corticale gebieden, die worden aangepast aan het leren van angst tijdens Pavlov auditieve vreesconditionering 16. Vreesconditionering is één van de best begrepen vormen van associatief leren qua hersenen mechanismen. In vreesconditionering, een aanvankelijk neutraal geconditioneerde stimulus (CS, bijvoorbeeld een toon) is gekoppeld aan een aversieve ongeconditioneerde stimulus (US, bijvoorbeeld een milde voet shock) resulteert in een CS-Amerikaanse vereniging en geconditioneerde angstreactie 17, 18. Prikkelende inbreng van zowel thalamische en neocortical gebieden, die representeert de KS en VS dragen, respectievelijk, waren bekend te convergeren op piramidale neuronen van de laterale nucleus van de amygdala (LA) en plasticiteit 19 ondergaan. Onze eerdere werk is gebleken dat zintuiglijke informatie is ook in parallel doorgegeven aan ITC neuronen <sup&gt; 16. Als eerste stap op weg naar een mechanistische moleculaire analyse van individuele zintuiglijke input synapsen op ITC neuronen, gebruikten we een adeno-geassocieerd virus (AAV) uit te drukken ChR2 gelabeld met de gele fluorescerende eiwit (YFP). De AAV werd geïnjecteerd in de PIN / MGN en de axon terminals werden geïdentificeerd door hun expressie van ChR2-YFP. We gebruikten beide vlakken die door de FRIL techniek om de dichtheid van postsynaptische AMPA-R&#39;s en NMDA-Rs beoordeeld op synapsen gevormd met ITC neuronen PIN / MGN axon terminals.

<table><tbody><tr><td>Chirurgie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereotactische frame</td><td>Stoelting, USA</td><td>51670</td><td>kan worden vervangen door andere stereotactische frame voor muizen</td></tr><tr><td>Stereotactische frame muis adapter</td><td>Stoelting, USA</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Gasanesthesiemasker voor muizen</td><td>Stoelting, USA</td><td>50264</td><td>niet langer beschikbaar, vervangen door artikelnr. 51609M</td></tr><tr><td>Drukapparaat, Toohey Spritzer</td><td>Toohey Company, USA</td><td>T25-2-900</td><td>andere drukapparaat (bijv. Picospritzer) kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Kwik Fill glazen capillairen</td><td>World Precision Instruments, Germany</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesie apparaat, IsoFlo</td><td>Eickemeyer, Germany</td><td>213261</td><td></td></tr><tr><td>DC Temperatuurregelaar en verwarmingspad</td><td>FHC, USA</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Horizontaal Micropipet Puller Model P-1000</td><td>Sutter Instruments, USA</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisch instrument sterilisator, Sterilizator 75</td><td>Melag, Germany</td><td>08754200</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)</td><td>Penn Vector Core, USA</td><td>AV-9-26973P</td><td></td></tr><tr><td>fast green</td><td>Roth, Germany</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraangeest, Isofuran CP (1 ml/ml)</td><td>CP Pharma, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antisepticum, Betadine (providon-jodium)</td><td>Purdure Products, USA</td><td>BSOL32</td><td>kan worden vervangen door andere ontsmettingsmiddelen</td></tr><tr><td>Pijnstiller, Metacam Solution (5 mg/ml meloxicam)</td><td>Boehringer Ingelheim, Germany</td><td></td><td>kan worden vervangen door andere pijnstillers</td></tr><tr><td>Bepanthen oogzalf</td><td>Bayer, Germany</td><td>0191</td><td>kan worden vervangen door andere oogzalven</td></tr><tr><td>Boor NM3000 (SNKG1341 en SNIH1681)</td><td>Nouvag, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutranox Naald</td><td>Fine Science Tools, Germany</td><td>12050-01</td><td></td></tr><tr><td>Gevlekte zijdedraad</td><td>Fine Science Tools, Germany</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Weefselvoorbereiding</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd EM graad</td><td>Agar Scientific Ltd., United Kingdom</td><td>AGR1018</td><td></td></tr><tr><td>Verzadigde picrinezuur oplossing</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P6744-1GA</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4-2H20</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4-2H2O&nbsp;</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>1063451000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>4N NaOH</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>T198.1</td><td></td></tr><tr><td>Thiopental</td><td>Sandoz, Austria</td><td>5,133</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>GenPure ultrapuur watersysteem</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>50131235</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltiekpomp</td><td>ISMATEC, Germany</td><td>ISM 930C</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>MACHEREY-NAGEL, Germany</td><td>MN 615 1/4</td><td></td></tr><tr><td>Vibroslicer, VT1000S</td><td>Leica Microsystems, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oogheelkundig scalpel</td><td>Alcon Laboratories, USA</td><td></td><td>kan worden vervangen door andere oogheelkundige scalpels</td></tr><tr><td>Perfusiecanule</td><td>Vieweg, Germany</td><td>F560088-1</td><td>kan worden vervangen door soortgelijke items van andere bedrijven</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Hogedruk&nbsp; Bevriezing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koper dragers</td><td>Engineering Office M. Wohlwend, CH</td><td>528</td><td></td></tr><tr><td>Sidol Polish</td><td>Henkel, Germany</td><td></td><td>kan worden vervangen door hetzelfde item van andere bedrijven</td></tr><tr><td>Gezeide huid</td><td>Huishoudelijke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naadmachine, 1,5mm</td><td>Stubai, Austria</td><td></td><td>kan worden vervangen door hetzelfde item van andere bedrijven</td></tr><tr><td>Gedenatureerde ethanol</td><td>Donauchem, Austria</td><td></td><td>kan worden vervangen door hetzelfde item van andere bedrijven</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Roth, Germany</td><td>9372.5</td><td>VOORZICHTIG!</td></tr><tr><td>Hogedruk Bevriezing Machine HPM 010</td><td>BalTec, CH; nu Leica Microsystems</td><td>HPM010</td><td>niet meer geproduceerd, vervangen door LeicaEM HPM100</td></tr><tr><td>Stereo-microscoop</td><td>Olympus, Japan</td><td>SZX10</td><td></td></tr><tr><td>Vloeibare stikstof</td><td></td><td></td><td>VOORZICHTIG!</td></tr><tr><td>Cryo-vialen</td><td>Roth, Germany</td><td>E309.1</td><td>kan worden vervangen door hetzelfde item van andere bedrijven</td></tr><tr><td>CryoCane</td><td>Nalge Nunc International,USA</td><td>5015-0001</td><td>kan worden vervangen door hetzelfde item van andere bedrijven</td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Nalge Nunc International,USA</td><td>5016-0001</td><td>kan worden vervangen door hetzelfde item van andere bedrijven</td></tr><tr><td>Vloeibare stikstof opslagvat</td><td>Cryopal, France</td><td>GT38</td><td>kan worden vervangen door hetzelfde item van andere bedrijven</td></tr><tr><td>Niet-ionisch detergent (Lavocid)</td><td>Werner &amp; Mertz Professional, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Freeze-fracture en Replicatie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sandblaster, Mikromat 200-1</td><td>JOKE Joisten &amp; Kettenbaum, Germany</td><td>SANDURET 2-K</td><td>kan worden vervangen door hetzelfde item van andere bedrijven</td></tr><tr><td>Siliciumcarbid SIC 360, korrelgrootte 25 - 21&micro;</td><td>JOKE Joisten &amp; Ketten

gecombineerde optogenetische en freeze-fractuur replica immunokleuring input-specifieke regeling van glutamaatreceptoren in de mouse amygdala onderzoek

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Freeze-breuk elektronenmicroscopie is een belangrijke techniek in de ultrastructurele onderzoek al meer dan 40 jaar. Echter, het gebrek aan effectieve middelen om de moleculaire samenstelling van membranen bestuderen een significante daling in het gebruik. Onlangs is er een grote opleving vries-breuk elektronenmicroscopie dankzij de ontwikkeling van effectieve manieren om integrale membraaneiwitten openbaren door immunogold labeling geweest. Eén van deze werkwijzen is bekend als detergens gesolubiliseerde Freeze-breuk Replica immunokleuring (FRIL). De combinatie van de FRIL techniek optogenetics laat een gecorreleerde analyse van de structurele en functionele eigenschappen van de centrale synapsen. Met deze aanpak kan men identificeren en karakteriseren van zowel pre- en postsynaptische neuronen door hun expressie van een gelabeld channelrhodopsin en specifieke moleculaire merkers. De opvallende verschijning van de postsynaptische membraan specialisatie van glutamaterge synapsen maakt verder, bij het kenmerken van ionotrope glutamaatreceptoren, te kwantificeren en analyseren intrasynaptic verdeling van deze receptoren. Hier geven we een stap-voor-stap beschrijving van de vereiste om gepaarde replica&#39;s en hoe ze te immunolabel bereiden procedures. We zullen ook praten over de valkuilen en de beperkingen van de FRIL-techniek, met name die in verband met potentiële sampling vooroordelen. De hoge reproduceerbaarheid en veelzijdigheid van de FRIL techniek in combinatie met optogenetics, biedt een zeer krachtige benadering voor de karakterisering van de verschillende aspecten van synaptische transmissie bij die neuronale microcircuits in de hersenen. Hier geven we een voorbeeld hoe deze benadering werd gebruikt om inzicht in de structuur-functie relatie van exciterende synapsen krijgen op neuronen van de geïntercaleerde celmassa&#39;s van de muis amygdala. In het bijzonder hebben we de expressie van ionotrope glutamaatreceptoren onderzocht op geïdentificeerde ingangen ofiginated van de thalamus posterior intra-laminaire en mediale geniculate kernen. Deze synapsen werden getoond aan zintuiglijke informatie doorgeven die relevant zijn voor angst leren en om plastische veranderingen op angst conditionering ondergaan.

De FRIL techniek in combinatie met expressie van optogenetic actuators microbieel 21, dat wil zeggen, kanalen geïntegreerd in het plasmamembraan en effectief anterogradely meegevoerd axonen, maakt het mogelijk om kwantitatief onderzoek de postsynaptische expressie van AMPA-R&#39;s en NMDA-Rs op een gedefinieerde subgroep synapsen. Deze is hier te zien voor de axonen afkomstig van verschillende thalamuskernen (bijvoorbeeld PIN / MGN) op ITC neuronen in de amygdala. Deze benadering maakt een moleculaire analyse van individuele sensorische neuronen synapsen op ITC, een groep cellen die tot dusver refractair zijn een gedetailleerde anatomische en moleculaire karakterisering. Vier weken na stereotactische injectie van de rAAV-ChR2-YFP in de PIN / MGN ChR2-YFP-positieve axonen dichtbevolkte geprikkeld de LA, de amygdalostriatal overgangsgebied (Astria) en de mediale paracapsular I<html> TC cluster in de amygdala, een patroon volledig in overeenstemming met eerdere studies tracing 16, 22. We hebben ook ontdekt intense goud immunokleuring voor ChR2-YFP op de P-face axonen en terminals in vries-breuk replica van rAAV-ChR2-YFP- geïnjecteerde muizen (Figuur 5A), maar niet in replica&#39;s van niet-geïnjecteerde muizen. De postsynaptische membraan specialisatie glutamaat synapsen in een replica kan worden waargenomen als een cluster van intramembrane deeltjes (GMP) op het E-vlak van het plasmamembraan 2, 23, en gaat vaak gepaard met de P-zijde van de presynaptische plasma membraan 7 (Figuur 5B-C). Deze kenmerken maken de postsynaptische specialisatie van glutamaat synapsen gevormd door PIN / MGN axon aansluitklemmen (figuur 5 en 6). We gemerkte AMPA-R met een antilichaam dat alle vier subeenheden (GluA1-4) herkent, terwijl NMDA-R&#39;s werden gedetecteerd onder toepassing van een antilichaam tegen het essentiële NR1 subeenheid. ntent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Vanwege het ontbreken van instrumenten voor het opsporen van dezelfde replica of deze synapsen waren met dendritische of schachten van ITC neuronen gelabeld we de overeenkomstige replica gezicht μ opioide receptoren, zoals ITC neuronen tot expressie postsynaptisch hoge niveaus van deze receptoren 24. Dit vereist de identificatie van hetzelfde postsynaptische profielen in beide replica&#39;s (Figuur 5C-F en Figuur 6A-D) met een strategie die plekken die werkzaam (Figuur 4E) . <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig5.jpg" /> Figuur 5. Detectie van ChR2-YFP en ionotrope glutamaatreceptoren op Replica door immunogold Particles. (A) Een cross-gebroken axon terminal (lichtblauw) en kleine porties van de P-face gemerkt met 15 nm gouddeeltjes detecteren ChR2-YFP. In de terminal, het membraan of tal synaptische blaasjes kan worden waargenomen (sv). Let op de specificiteit van de immunokleuring grotendeels beperkt tot de plasmamembraan. Etikettering van ChR2 identificeert de terminal als afkomstig van de PIN / MGN. De terminal vormt een asymmetrisch synaps met een kern. De postsynaptische membraan specialisatie (PSD) op de E-gezicht toont een karakteristieke cluster van intramembrane deeltjes en gelabeld met 5 nm gouddeeltjes onthullen AMPA-Rs. (B) De P-gezicht van een ChR2 expressie axon (gemerkt met 15 nm gouddeeltjes) weergegeven grenst twee dendrieten, waarvan er twee bezit PSD gelabeld met 5 nm gouddeeltjes onthullen NMDA-Rs. (CD) Tegenover gezichten van de pre- en postsynaptische membranen van een PIN / MGN-ITC synaps. (C) De P-zijde van de terminal tot expressie ChR2 (gemerkt met 15 nm gouddeeltjes) en zich uitstrekt over het E-vlak van twee dendritische assen, waarvan er met twee PSD gelabeld voor AMPA-Rs (5 nm gouddeeltjes). ( <strong&gt; D) De overeenkomstige P-gezicht van de twee dendrieten bestemd is voor μ-opioïdereceptoren (10 nm gouddeeltjes). (EF) Vergrote uitzicht op de geschetst door de stippellijnen gebieden. Schaal bars. 500 nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53853/53853fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Immunoparticles voor AMPA-R&#39;s in de PIN / MGN-ITC synapsen werden over de hele IMP cluster gevonden, hetgeen duidt op een homogene verdeling binnen de postsynaptische specialisatie (Figuur 5E). Een significant hoger (ongepaarde t-test p &lt;0,018) dichtheid van AMPA-R labeling werd waargenomen in PIN / MGN synapsen op ITC stekels (715 ± 38 gouddeeltjes / um 2, n = 32) vergeleken met synapsen op ITC dendrieten (590 ± 44 gouddeeltjes / um 2, n = 32). Kortom, de dichtheid van AMPA-R&#39;s in PIN / MGN-ITC synapsen toonde een betrekkelijk lagevariantie (Coëfficiënt van variatie, CV = 0,37) in overeenstemming met een homogene verdeling. Immunoparticles voor NMDA-R&#39;s in de PIN / MGN-ITC synapsen werden vaak waargenomen ongelijk verdeeld binnen postsynaptische IMP clusters (Figuur 5B). De dichtheid van NMDA-R labeling was vergelijkbaar (ongepaarde t-test p = 0,39) tussen Pin / MGN synapsen op ITC stekels (1070 ± 153 gouddeeltjes / um 2, n = 8) en ITC dendrieten (812 ± 183 gouddeeltjes / 2 um, n = 9). In tegenstelling tot wat werd waargenomen voor AMPA-R&#39;s, de dichtheid van NMDA-R&#39;s in PIN / MGN-ITC synapsen een hoge variabiliteit (CV = 0,54). <img alt="figuur 6" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig6.jpg" /> Figuur 6. AMPA-r&#39;s en NMDA-Rs immunokleuring bij Identified PIN / MGN-ITC Synapses. (AB) Tegenover gezichten van de pre- en postsynaptische membranen van een PIN / MGN-ITCsynaps gemaakt op een dendritische spine waarin de P-zijde van de terminal tot expressie ChR2 (gemerkt met 15 nm gouddeeltjes) en de PSD op een dendritische spine bestemd is voor AMPA-Rs (5 nm gouddeeltjes). (CD) Vergrote uitzicht op de geschetst door de onderbroken lijn gebieden. Deze gebieden zijn gedraaid ongeveer 45 ° tegen de klok in om een ​​beter beeld van de PSD toe te staan. (E) spreidingsdiagrammen het aantal AMPA-R deeltjes versus synaptische gebied ITC stekels en dendrieten. In beide structuren heeft een positieve correlatie waargenomen. (F) spreidingsdiagrammen het aantal NMDA-R deeltjes tegen synaptische gebied ITC stekels en dendrieten. Een significante positieve correlatie werd alleen gedetecteerd in dendritische. Schaal bars. 500 nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53853/53853fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Omdatde P-zijde van de presynaptische plasmamembraan vaak bedekt gedeeltelijk de postsynaptische GMP cluster, kunnen we de synaptische oppervlakte van slechts 30% van de synapsen schatten (stekels gemiddelde oppervlakte 0,032 um 2, gamma: 0,007-0,063 um 2, n = 8; dendrieten: 0,047 micrometer 2, bereik: 0,024-0,166 um 2, n = 11). Deze waren in een vergelijkbare reeks als eerder geanalyseerd telencephalic glutamaat synapsen 25. Zowel stekels en dendrieten, werd het aantal gouden immunoparticles voor AMPA-Rs in individuele synapsen positief gecorreleerd met de synaptische gebied (Spearman, stekels: r = 0,88, dendrieten: r = 0,60, p &lt;0,0001) (figuur 6E). Omgekeerd, het aantal gouden immunoparticles voor NMDA-R bleek te correleren met de synaptische gebied stekels (Spearman, stekels: r = 0,90, p &lt;0,002), maar niet in dendrieten (r = 0,21, p = 0,29) (Figuur 6F ).

Dit artikel illustreert hoe de expressie van neurotransmitterreceptoren kan worden gekwantificeerd en het patroon geanalyseerd op synapsen met geïdentificeerde pre- en postsynaptische elementen door een combinatie van virale transductie van optogenetische hulpmiddelen en de freeze-fracture replica immunolabeling techniek.

Gecombineerde optogenetische en Freeze-fractuur Replica immunokleuring Input-specifieke Regeling van glutamaatreceptoren in de Mouse amygdala Onderzoek

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

Het doel van deze procedure, waarbij optogenetica wordt gecombineerd met de techniek van immuunlabeling van freeze-fracture replica's, is het analyseren van de dichtheid van ionotrope glutamaatreceptoren bij synapsen in de amygdala van de muis met geïdentificeerde pre- en postsynaptische elementen. De hoge reproduceerbaarheid en veelzijdigheid van deze freeze-fracture replica immuunlabelingstechniek biedt, in combinatie met optogenetica, een zeer krachtige benadering voor de gecorreleerde analyse van de structurele en functionele eigenschappen van synapsen. De belangrijkste voordelen van deze procedure zijn: het planaire zicht op de pre- en postsynaptische elementen en de kwantitatieve analyse van eiwitten in deze gespecialiseerde microdomeinen.Verschillende technieken kunnen worden aangepast aan een verscheidenheid aan weefsels om de distributie en organisatie van integrale membraaneiwitten te bestuderen. Over het algemeen is deze gecombineerde optogenetische FRIL-benadering uitdagend voor beginners vanwege het grote assortiment aan benodigde apparatuur en machines. Het is cruciaal om de modulatie met een andere methode te beginnen, aangezien sommige andere stappen moeilijk te leren zijn.Zoals het breken en repliceren van bevroren specimens. Om deze procedure te starten, lijmt u een coronaal blok van een muizenbrein op de houder van de vibrosnijder. Orienteer het weefselblok zodanig dat de neocortex naar het trilmes is gericht. Snijd vervolgens de coronale secties die de amygdala bevatten met een dikte van 140 micrometers in 0,1 M, ijskoud PB. Verzamel deze in een six-well plaat in dezelfde buffer.Trim onder een stereomicroscoop het interessegebied uit de coupes in een petrischaal die is gecoat met siliconenelastomeer en gevuld is met 0,1 M PB. Breng het getrimde blok vervolgens over naar de cryoprotectie-oplossing en bewaar dit gedurende de nacht bij 6 °C. Bereid in deze stap de koperen dragers voor gebruik in de volgende fasen van de FRIL-procedure door ze te polijsten met een lap chamoisleer om aanslag te verwijderen. Bevestig onder de microscoop een ring van dubbelzijdige tape aan de koperen drager, die zal dienen als houder voor het getrimde blok.Plaats vervolgens het getrimde blok met een platina draadlus in het gat van de dubbelzijdige tape. Verwijder overtollige cryoprotectie-oplossing met filterpapier of een penseel. Dek daarna de houder af met een andere drager.Zorg ervoor dat het weefselblok tussen de twee dragers is geplaatst. Om het preparaat te bevriezen, wordt de sandwich van dragers in de preparaathouder geplaatst. Plaats vervolgens de preparaathouder in de hoogdrukvriesunit.Start de vriescyclus door op de jet-auto knop te drukken, verwijder onmiddellijk de monsterhouder en dompel de tip onder in een geïsoleerde box met vloeibare stikstof. Verwijder vervolgens voorzichtig de carrier-sandwich uit de monsterhouder en plaats deze in een vooraf gekoelde cryovial. Bewaar de cryovials met de carriers in een cryotank tot aan de replicatie.Verwijder het schild met de afbuigplaat voordat u het elektronenstraal kan invoegt. Plaats de instelmaat voor het centreren van de gloeidraad via de onderste kathodedeksels in het boorcollet. Schuif vervolgens de nieuwe gloeidraad over de maat, totdat de drukplaten de uiteinden van de gloeidraad klemmen.Verwijder vervolgens de instelmaat en voeg de koolstofstaaf toe. Bevestig deze door het spanklemhouder van de verdampingsstaafhouder aan te draaien. Zorg ervoor dat de hoogte van het uiteinde van de staaf zich in het midden van de tweede spoel van onderen bevindt.Plaats daarna de afbuigplaat terug en voeg het elektronenstraalkanon toe aan de vriesbreukunit. Stel bij deze procedure de stroom en spanning voor verdamping in. Plaats vervolgens de bevroren carrier-sandwich in de dubbele replica-tafel in vloeibare stikstof.Plaats vervolgens de dubbele replica-tafel in het Dewar-vat en bevestig deze onder een hoek van 45 graden aan de ontvanger van de preparatietafel. Pak de dubbele replica-tafel op met een tafelmanipulator. Plaats deze in de vriesbreukeenheid op de koude tafel en wacht ongeveer 20 minuten zodat de temperatuur van de dubbele replica-tafel kan stabiliseren op -115 °C.Breng vervolgens het weefsel tot breuk door het wiel, dat verbonden is met de kap boven de dubbele replicatietafel, handmatig tegen de klok in te draaien. Wanneer de kap draait, wordt de dubbele replicatietafel gedwongen te openen, wat resulteert in het breken van het weefsel. Een laag koolstof wordt onder een hoek van 90 graden op de breukvlakken aangebracht.Verwijder vervolgens de gerepliceerde specimens van de dubbele-replicatietafel en breng deze over naar een keramische 12-wellplaat gevuld met TBS. Verwijder het gerepliceerde weefsel van de specimenhouder met behulp van een platinadraadlus. Breng voor SDS-digestie een replica over naar een glazen flesje van vier milliliter gevuld met één milliliter SDS-digestiebuffer.Laat het 18 uur digesten bij 80 graden Celsius onder schudden. Was voor immunolabeling de replica 10 minuten in verse SDS-digestiebuffer. Incubeer deze vervolgens met primaire en secundaire antilichamen, verdund in 2%BSA-TBS, in een bevochtigingskamer bij 15 graden Celsius gedurende 24 tot 72 uur.Monteer daarna de replica op een met formvar gecoate, parallelle bar-grid van 100 lijnen. Beeld de replica af met een transmissie-elektronenmicroscoop bij 80 of 100 kilovolt. Verwerf vervolgens de digitale beelden via een CCD-camera.Wanneer deze offline is, worden de overeenkomstige regio's op de afbeelding van de replica bepaald aan de hand van verschillende oriëntatiepunten. Vier weken na de AAV-injectie, om Channelrhodopsin-2 tot expressie te brengen in de posterieure thalamische kernengroep, wordt Channelrhodopsin-2 effectief anterograad getransporteerd langs de thalamische axonen om de intercalaire celmassa's van de amygdala te bereiken. De postsynaptische specialisatie van glutamaterge synapsen kan in een replica worden herkend als een cluster van intramembraanpartikels op de E-zijde van het plasmamembraan, en gaat vaak vergezeld door de P-zijde van het presynaptische element.Hier werden Channelrhodopsine-2 en glutamaatreceptoren gevisualiseerd met behulp van gouddeeltjes van verschillende groottes die geconjugeerd waren aan de secundaire antilichamen. Vanwege het gebrek aan structurele of moleculaire instrumenten om op dezelfde replica vast te stellen of het postsynaptische membraan toebehoorde aan de geïntercaleerde neuronen, werd de overeenkomstige replica gelabeld voor mu-opioïdreceptoren, een marker voor deze neuronen.Als voorbeeld van de kwantitatieve analyse van de glutamaatreceptor-dichtheid bij deze synapsen, volgen hier de spreidingsdiagrammen van het aantal goudpartikels voor AMPA-receptoren versus het synaptische oppervlak op spines en dendrieten. Deze tonen een positieve correlatie in beide structuren. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de individuele stappen sterk van elkaar afhankelijk zijn.Daarom kan een fout in een van de stappen de gehele procedure in gevaar brengen. Het bekijken van grote delen van specialisaties van het plasmamembraan op een tweedimensionaal oppervlak van de replica, maakt het mogelijk om de ruimtelijke distributie en fysieke continuïteit van moleculen van belang te inspecteren zonder arbeidsintensieve en tijdrovende reconstructie van seriële artrophine-secties. Deze aanpak kan door andere onderzoekers worden gebruikt om inzicht te krijgen in structuur-functierelaties van specifieke synapsen in neurale circuits.Het ontrafelen van de oorsprong van de input en de aard van de postsynaptische elementen is cruciaal, maar problematisch.

combined-optogenetic-freeze-fracture-replica-immunolabeling-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

The video demonstrates the generation of tilted amygdala slices from a mouse brain. The brain is positioned at an angle on the vibratome specimen stage to obtain slices containing the amygdala and axons from the medial prefrontal cortex that form synaptic connections with the amygdala. The brain slices are maintained at the physiological temperature to preserve the tissue for further experiments.

Generation of Tilted Amygdala Slices from a Mouse Brain

This video demonstrates the preparation of thin coronal brain slices from a murine brain, exposing the amygdala regions rich in synaptic connections from the medial prefrontal cortex. The slices are then recovered in oxygenated artificial cerebrospinal fluid to maintain neuronal viability.

Generating a Coronal Brain Slice Exposing the Amygdala Regions from a Mouse Brain

This video demonstrates a procedure for analyzing synaptic connectivity between medial prefrontal cortex (mPFC) and amygdala neurons using acute amygdala brain slices from mice. The mPFC neurons in these mice express channelrhodopsin fused to a fluorescent protein. The channelrhodopsins facilitate ion influx and action potential generation in the mPFC neurons upon light activation. Consequently, mPFC neurons release neurotransmitters that bind to postsynaptic amygdala neurons, triggering...

Visualization and Mapping of Neuronal Pathways in an Amygdala Brain Slice

Source: Schönherr, S., et. al. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the immunolabelling of freeze-fractured replicas of mouse brain tissue for electron microscopy. The fractured and coated replicas are digested to expose receptors. Primary and gold-tagged secondary antibodies are added to label specific neuronal membrane receptors. The replica...

Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

Optogenetische benaderingen worden wijd gebruikt om neurale activiteit te manipuleren en de gevolgen voor hersenfunctie beoordelen. Hier, wordt een techniek beschreven die bij in vivo expressie van het optische activator Channelrhodopsin, maakt de ex vivo analyse van synaptische eigenschappen specifieke lange afstand en lokale neurale verbindingen in angst gerelateerde circuits.

Ex Vivo optogenetische Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Dit protocol biedt een workflow op hoe te combineren met kunstmatige microRNA-gemedieerde RNA-interferentie met optogenetics te stimuleren specifiek presynaptische los met verminderde expressie van selectieve gene(s) binnen intact neuronale circuits.

Optogenetics combineren met kunstmatige microRNAs te karakteriseren van de effecten van Gene Knockdown op presynaptische functie binnen Intact neuronale Circuits

We presenteren een protocol om de balans te evalueren tussen glutamaatafgifte en klaring bij enkele corticostriatale glutamatge synapsen in acute plakjes van volwassen muizen. Dit protocol maakt gebruik van de fluorescerende sensor iGluu voor glutamaat detectie, een sCMOS camera voor signaal verwerving en een apparaat voor brandpuntslaser verlichting.

Enkele Synapse indicatoren van glutamaat release en opname in acute hersenen plakjes van normale en Huntington muizen

Met optogenetische manipulatie van specifieke neuronale populaties of hersengebieden kan gedrag worden gewijzigd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie bij vrij bewegende dieren. Door het gebruik van verschillende optogenetische tools in combinatie met chronisch geïmplanteerde optische vezels, kan een verscheidenheid aan neuronale modulaties en gedragstesten worden uitgevoerd.

Optogenetische manipulatie van neuronale activiteit om gedrag te moduleren in vrij bewegende muizen

In vivo micro-endoscopische calciumbeeldvorming is een onschatbaar hulpmiddel dat real-time monitoring van neuronale activiteiten bij vrijdragende dieren mogelijk maakt. Het toepassen van deze techniek op de amygdala was echter moeilijk. Dit protocol is bedoeld om een nuttige richtlijn te bieden voor het succesvol richten op amygdalacellen met een geminiaturiseerde microscoop bij muizen.

Succesvolle In vivo Calcium Imaging met een Head-Mount Miniaturized Microscope in de Amygdala van Freely Behaving Mouse

Hier presenteren we een protocol dat virale transductie van discrete hersengebieden beschrijft met optogenetische constructies om synapsspecifieke elektrofysiologische karakterisering in acute hersenplakken van knaagdieren mogelijk te maken.

Ex Vivo | Optogenetische ondervraging van synaptische transmissie en plasticiteit op lange afstand van mediale prefrontale cortex naar laterale entorhinale cortex

Hier beschrijven we een protocol dat adeno-geassocieerde virusinjectie combineert met craniale raamimplantatie voor gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamiek en neuronale activiteit bij wakkere muizen.

Gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen

Ontdek hoe optogenetica gecombineerd met freeze-fractuur replica immunokleuring (FRIL) de dichtheid van ionotrope glutamaatreceptoren in de muisamygdala analyseert. Deze methode biedt inzicht in de structureel-functionele eigenschappen van synapsen.

Gecombineerde optogenetische en Freeze-fractuur Replica immunokleuring Input-specifieke Regeling van glutamaatreceptoren in de Mouse amygdala Onderzoek (Video) | JoVE Journal

Gecombineerde optogenetische en Freeze-fractuur Replica immunokleuring Input-specifieke Regeling van glutamaatreceptoren in de Mouse amygdala Onderzoek

Meer video's verkennen