Een gecombineerde 3D Weefselmanipulatieproducten
6 april 2016
We presenteren een driedimensionaal (3D) longkankermodel gebaseerd op een biologisch collageenscaffold om gevoeligheid voor op non-kleincellige-longkanker-(NSCLC)-gerichte therapieën te bestuderen. We demonstreren verschillende meettechnieken om de proliferatie-index, apoptose en epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) status te bepalen. Verzamelde gegevens worden geïntegreerd in een in silico model voor voorspelling van drugsgevoeligheid.
De algemene doelen van dit gecombineerde In Vitro/In Silico Longkankermodel zijn om de gevoeligheid van gerichte therapieën voor niet-kleincellige longkanker te bestuderen en om de werkzaamheid van nieuwe stoffen te voorspellen. Dit 3D-modelsysteem maakt het mogelijk om celspecifieke reacties op gerichte behandelingen of directe combinaties te monitoren. Het grote voordeel van deze techniek is dat de met in Silico voorspellingen bedekte gebieden preklinisch geneesmiddeltesten in een meer fysiologisch relevante omgeving kunnen vergemakkelijken.
De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van verschillende tumorentiteiten, omdat het kan worden gebruikt om voorspellingen over geneesmiddelreacties te optimaliseren op basis van specifieke mutatieachtergrond. De procedure wordt gedemonstreerd door Franziska Schmitt, een onderzoeksassistent, van ons laboratorium. Om een dynamische cultuur op te zetten, begint u met het kweken van het tumormodel onder statische kweekcondities, in een celkroon op 37 graden Celsius en 5%CO2, in een conventionele incubator.
Na drie dagen monteert u een geautoclaveerde bioreactor en plaatst u een gezaaide biologische submucoso-plus-mucosa submucosa in het systeem. Voeg vervolgens 45 milliliter RPMI, aangevuld met de juiste hoeveelheid FCS, toe aan een fles en sluit u het naaldvrije monsterapparaat aan op het leidingsysteem tussen de bioreactor en de fles met medium. Plaats de bioreactor in de incubator en sluit deze aan op de pomp om het tumormodel gedurende nog eens 14 dagen te kweken, met een constante mediumstroom van drie milliliter per minuut.
Om een statisch tumormodel te behandelen met, Gefitinib, op dag 11 van de cultuur in de conventionele incubator, gebruikt u eerst een pasteurpipet om het oude medium uit de putjes te verwijderen. Voeg vervolgens een milliliter vers bereid, RPMI, aangevuld met FCS en Gefitinib, toe aan de binnenkant van elke celkroon en 1,5 milliliter aan de bodem van elke put. Om Elisa-monsters uit een dynamische cultuur te verzamelen, op dagen 11 tot en met 14 van de cultuur, bevestigt u de spuit aan het monsterapparaat en verwijdert u een milliliter medium uit het bioreactorsysteem.
Bewaar vervolgens de monsters bij min 80 graden Celsius totdat de Elisa wordt uitgevoerd. Om het aantal Ki67-positieve kernen te bepalen, gebruikt u eerst een omgekeerde microscoop om vijf DAPI- en vijf Ki67-kleuringsfluorescentiebeelden van 2D-culturen bij een 20-voudige vergroting van elke conditie te verkrijgen, van niet-overlappende secties van het specimen. Om de Ki67-positieve kernen handmatig te tellen, opent u het opgekomen beeld in Fiji en selecteert u Plugins en Cell Counter, klikt u vervolgens op initialiseren, selecteert u een countertype en klikt u op elke Ki67-positieve kern.
Het aantal aangeklikte cellen verschijnt naast het geselecteerde countertype. Voor automatische celtelling van het totale aantal kernen in de 2D-beelden, start u de macrorecorder, opent u een DAPI-beeld en klikt u op beeld, type en 8-bit, klikt u vervolgens op contrast verbeteren en stelt u de verzadigde parameter in op één en normaliseert u. Om het beeld scherper te maken, stelt u de onscherpe masker in met een straal van één en een masker van 60.
Om het beeld te binderen, klikt u op automatisch drempelwaarde en kiest u de, Reny/Entropy-methode met witte objecten op zwarte achtergrond. Klik vervolgens op Plugins, gevolgd door BioVoxxel en watershed onregelmatige functie, met een erodeerstraal van vijf om de cellen te scheiden. Klik op analyseren en analyseer deeltjes en stel de grootte in op 02 oneindig en vink aan samenvatten.
Het aantal cellen wordt in de samenvattingstabel weergegeven als tellingen. Klik vervolgens op maken om de macro op te slaan om automatische tellingen van kernen in verdere 2D-celcultuurbeelden mogelijk te maken. Nadat u bekende databases heeft gebruikt om een tumornetwerk te genereren, opent u de juiste netwerkanalysesoftware, klikt u op bestand en nieuw en voert u jove tumormodellen in.
Klik op ok om een nieuw netwerk te genereren, klik vervolgens op vierkant dichtbij Noord en ok om de receptor in een dubbele membraan te visualiseren. Om de knooppunten als rechthoeken weer te geven, klikt u op generiek eiwit, vervolgens EGFR, vervolgens Ok. Om de knooppunten in het netwerk te labelen, klikt u met de rechtermuisknop om kleur en vorm te wijzigen en stelt u de knooppuntkleurcodes in zoals aangegeven. Om de uitlezingsparameters als zeshoekjes weer te geven, selecteert u fenotype, voert u proliferatie in en klikt u op ok.
Klik vervolgens met de rechtermuisknop en selecteer opnieuw kleur en vorm om de kleurcode in te stellen op 255, 204, 204. Om de randen van knooppuntinteracties te visualiseren, klikt u op statusovergang voor activeringspijlen en remming voor stompe remmingspijlen. Klik vervolgens op bestand en opslaan als en sla het gegenereerde signaalnetwerk op als jove tumormodellen.xml.
Voor steady-state-analyse van het systeembezwaring, opent u de SQUAD-software, klikt u op netwerk laden en uploadt u het jove tumormodellen. xml-bestand. Klik op analyse uitvoeren.
Om een simulatieprotocol te schrijven, klikt u op geavanceerd en pertubator, klikt u vervolgens op protocol bewerken om de anit-EGFR-resistentie te simuleren. Klik vervolgens op pertubatie en selecteer de standaardbegintoestand gelijk aan steady-state vier. Klik op toevoegen om de nieuwe constante puls toe te voegen, selecteer vervolgens de statusparameter en stel het doel in op FLIP, de tijd op nul en de waarde op 4.
Klik op ok en stel de toestanden voor c-MET en Gefitinib op dezelfde manier in. Om een statuswaarde in te stellen voor de actieve EGFR-knoop, klikt u op actieve knoop, klikt u vervolgens op bewerken. Stel de status in op 8 en klik op ok.
Klik op ok om het protocol op te slaan. Om de specifieke curven weer te geven, selecteert u onder het optiepaneel EGF-EGFR, ster EGF-EGFR, ster Mek, caspases, PI3K, Gegitinib, apoptose, proliferatie, MEk-remmer en PI3K-remmer. Klik vervolgens op initialiseren en
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een 3D-longkankermodel dat gebruikmaakt van een biologisch collageen-steunweefsel om de gevoeligheid van therapieën voor niet-kleincellige longkanker (NSCLC) te onderzoeken. Het model integreert in vitro en in silico benaderingen om de voorspellingen van de medicatierespons te verbeteren.
Belangrijkste Componenten van het Onderzoek
Wetenschapsgebied
- Oncologie
- Farmacologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Niet-kleincellige longkanker is een veelvoorkomende vorm van longkanker.
- Doelgerichte therapieën zijn essentieel voor een effectieve behandeling.
- 3D-modellen bieden een fysiologisch relevantere omgeving voor het testen van geneesmiddelen.
- In silico-modellen kunnen de effectiviteit van geneesmiddelen voorspellen op basis van tumorطkenmerken.
Doel van de studie
- Om de gevoeligheid van NSCLC voor gerichte therapieën te evalueren.
- Om de effectiviteit van nieuwe therapeutische stoffen te voorspellen.
- Om drugresponsvoorspellingen te optimaliseren op basis van mutationele achtergronden.
Gebruikte methoden
- Ontwikkeling van een 3D-longkankermodel met gebruik van een collageensteiger.
- Monitoring van cel-specifieke reacties op behandelingen.
- Integratie van in silico voorspellingen met experimentele data.
- Statische kweekcondities voor de opzet van het tumormodel.
Belangrijkste resultaten
- Verschillende reacties van NSCLC op doelgerichte therapieën zijn aangetoond.
- Er is een correlatie vastgesteld tussen in vitro resultaten en in silico voorspellingen.
- Er zijn inzichten verschaft in de optimalisatie van protocollen voor geneesmiddelentesten.
- De toepasbaarheid van het model op andere tumortypen is benadrukt.
Conclusies
- Het 3D-longkankermodel is effectief voor het bestuderen van druggevoeligheid.
- In silico voorspellingen verhogen de relevantie van preklinisch onderzoek.
- Deze aanpak kan worden aangepast voor diverse kankertypes om de behandelresultaten te verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Dit gecombineerde 3D in vitro/in silico longtumormodel voorziet in de behoefte aan fysiologisch relevante preklinische systemen die medicijnresponsen vastleggen die specifiek zijn voor de mutationele achtergrond. Door de architectuur van de extracellulaire matrix te integreren met computationele simulaties van signaleringsnetwerken, verbetert deze aanpak het voorspellend vertrouwen bij doelwitvalidatie en lead-identificatie voor EGFR-gemuteerd NSCLC. Het model ondersteunt mechanistische risicoreductie door fenotypische uitkomsten (proliferatie, apoptose, EMT) te koppelen aan in silico simulaties van resistentiemechanismen, waardoor beter geïnformeerde go/no-go-beslissingen in de vroege ontdekkingsfase mogelijk worden.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken in EGFR-mutante versus KRAS-mutante NSCLC-contexten met behulp van isogene cellijnparen.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerd protocol van 14 dagen voor het genereren van kunstmatig tumorweefsel op gedecellulariseerde scaffolds met een gedefinieerde ECM-compositie.
- Voorspellende waarde: Correleert 3D-cultuurfenotypes met klinische proliferatiesnelheden, waardoor de translationele relevantie ten opzichte van 2D-modellen wordt verbeterd.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaar voor analyse: Ondersteunt kwantitatieve read-outs, waaronder de Ki67-proliferatie-index, M30-ELISA-apoptosedetectie en EMT-beoordeling via vimentine/pan-cytokeratine-kleuring.
- Reproduceerbaarheid: Maakt gebruik van flow-bioreactorperfusie bij 3 mL/min om fysiologische condities te handhaven en de consistentie van de weefselgeneratie te verbeteren.
- Screeningsnut: Maakt evaluatie mogelijk van de gevoeligheid voor tyrosinekinaseremmers (bijv. gefitinib), gestratificeerd naar mutationele achtergrond (HCC827 EGFR-mutant versus A549 KRAS-mutant).
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Recapituleert weefselspecifieke ECM-architectuur en kenmerken van het basaalmembraan op een scaffold van submucosa van varkensdunnedarm.
- Translationele continuïteit: Integreert dynamische drug-responsdata (apoptose, proliferatie, EMT) in een Boolean in silico-model om resistentie en combinatorische interventies te simuleren.
- Mechanistische risicoreductie: Demonstreert de omkeer van gefitinib-resistentie via gesimuleerde co-inhibitie van PI3K en MEK, waarbij in vitro-fenotypes worden gekoppeld aan adaptaties op netwerkniveau.
Integratie van Pipeline & Workflow
Het model slaat een brug tussen discovery biology en preklinische validatie door een mutatiestratificatieplatform te bieden voor het beoordelen van de effectiviteit van doelgerichte therapie vóór lead-optimalisatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van EGFR-afhankelijkheid en pathway-verduidelijking in NSCLC-modellen met gedefinieerde mutationele achtergronden.
- Screening: Levert assay-klare, reproduceerbaar 3D-weefsel met kwantitatieve metrieken voor proliferatie, apoptose en fenotypische transitie.
- Analytics: Genereert multiparametrische drugresponsdata die geschikt zijn als input voor computationele modellen die signaleringsnetwerkdynamiek en resistentie-evolutie simuleren.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt in vitro EMT-inductie en drugrespons met in silico simulaties van adaptieve pathway-activatie (bijv. MET, PI3K, MEK) die worden waargenomen bij verworven resistentie.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar framework voor het voorspellen van drug-effectiviteit in specifieke genetische contexten, aanpasbaar aan andere tumortypen en targeted agents.
Operationele en bedrijfskundige impact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door fenotypische drugresponsen te correleren met in silico voorspellingen van veranderingen in de netwerktoestand.
- Operationele waarde: Standaardiseert de generatie van tumormodellen met behulp van gedecellulariseerde scaffolds en perfusiecultuur, waardoor de reproduceerbaarheid tussen verschillende locaties wordt verbeterd.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go-besluitvorming door resistentiemechanismen te voorspellen en rationele combinatiestrategieën vroegtijdig in de ontdekkingsfase te identificeren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van de voorspelde werkzaamheid in biomarker-gedefinieerde subpopulaties.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in 3D-weefselkweek, het hanteren van gedecellulariseerde scaffolds en het bedienen van perfusiebioreactoren.
- Vereist instrumentatie voor statische en dynamische kweek, fluorescentiemicroscopie voor Ki67/vimentine-kleuring en ELISA-platforms voor de kwantificering van apoptose.
- Vraagt om standaardisatie tussen teams voor celkweek, beeldvorming en computationele biologie voor een geïntegreerde interpretatie van de gegevens.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het uitbreiden van het model naar andere tumortypes of ECM-bronnen buiten varkensscaffolds.
- Beperkt door de kweekperiode van 14 dagen en de afhankelijkheid van gedefinieerde mutationele achtergronden voor predictieve in silico modellering.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:00
Dynamic Culture Conditions and Static Tumor Model Gefitinib Treatment
2:35
ELISA Samples Collection and Proliferation Index Determination
5:21
In Silico Tumor Model Generation and Anti-EGFR Therapy Simulation in HCC827 Cells
7:13
In Silico Simulation Using SQUAD
10:32
Results: The Effects of Gefitinib Treatment on Cell Growth in Static and Dynamic Tumor Model Systems
12:42
Conclusion
