Name: Exosomaal miRNA analyse in niet-kleincellige longkanker (NSCLC) patiënten Plasma Through qPCR: een haalbare Liquid biopsie Tool (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Leer exosoomisolatie uit plasma van NSCLC-patiënten met een dubbele enzymatische behandeling. Deze methode verwijdert niet-exosomale microRNA-bronnen voor betrouwbare biomarkeranalyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ook gefinancierd door MOCA (Multidisciplinair Oncologisch Centrum Antwerpen)-subsidie 2014.

1. exosome Isolation Opmerking: De isolatie van exosomes uit het plasma monsters werd uitgevoerd met een commerciële kit, volgens het protocol van de fabrikant en door toevoeging van RNAse behandeling: (al deze stappen moeten worden uitgevoerd met een persoonlijke en milieu beschermingsmiddelen en volgende specifieke juridische procedure voor het manipuleren van biologische monsters ). <ol><li> Neem 1 ml plasma van elk monster, opgeslagen bij -80 ° C, en plaats het op ijs. </li><li> Centrifugeer het monster bij 2000 xg gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur; Deze passage is verplicht om de cellen en resten te verwijderen. </li><li> Breng de supernatant dat het schone plasma naar een nieuwe 1,5 ml buis. </li><li> Centrifugeer de nieuwe buis bij 10.000 xg gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Breng de supernatant dat het schone plasma naar een nieuwe 1,5 ml buis. </li><li> Voeg 100 ng / ml RNAse aan het supernatant en incubeer de buis bij 37 ° C gedurende 10 min inOm degraderen circulerende RNAs. </li><li> Transfer alle behandelde plasma naar een nieuwe 2 ml buis en voeg 0,5 volume van 1x PBS. </li><li> Vortex het monster om de oplossingen te mengen. </li><li> Voeg 0,05 hoeveelheden proteïnase K oplossing (omsluiten in de kit) aan het monster. </li><li> Vortex het monster en incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Voeg 0,2 volume van exosome neerslag buffer om het monster en de oplossingen te mengen door inversie. </li><li> Incubeer het monster bij 2 ° C tot 8 ° C gedurende 30 minuten en centrifugeer het monster bij 10.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Zuig en gooi de supernatant. De pellet bevat het geïsoleerde exosomes. </li><li> Voeg geselecteerde buffer de exosome pellet om de exosomes resuspenderen. De keuze van de buffer afhankelijk van de stroomafwaartse analyse geplande, in dit geval: <ol><li> Voeg 100 ul 1X PBS om TEM analyse. </li><li> Voeg 346,5 ul specifieke lysis buffer voor RNA-extractie (uit commerciële kit) (LET OP: chemische gevaar). </li><li> Voeg 100 ul lysisbuffer voor eiwitextractie (Tris-HCl 50 mM pH 7,6 - 300 mM NaCl - Triton X-100 0,5% - 1 mM PMSF - leupeptine / aprotinine 10 ug / ml) teneinde Western Blotting analyse. (LET OP: chemische risico&#39;s). </li></ol></li><li> Bewaar de geresuspendeerde exosomes bij -20 ° C. </li></ol> 2. exosome karakterisering door Western Blot Analyse Let op: Met het oog op de geïsoleerde nanovesicles karakteriseren, is western blotting met antilichamen tegen ALIX en Tsg101 (bekende exosomaal markers) aanbevolen. <ol><li> Na resuspenderen van de pellet in exosome lysisbuffer, plaats het op ijs gedurende 1 uur om de exosomaal membraan oplossen. </li><li> Centrifugeer het lysaat bij 12.000 g gedurende 10 min en breng het supernatant naar een nieuwe buis zonder de pellet te verstoren. </li><li> Kwantificeren van de totale exosomaal eiwit content door Bradford Assay of andere methoden en de belasting 50 ug van eiwitten per putje in een Tris / Glycine SDS - 8% Polyacrylamide gel. (LET OP: chemische risico&#39;s). </li><li> Scheid de eiwitten (en een geschikt moleculair gewicht marker) in 8% SDS-PAGE gelelektroforese met loopbuffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,1% SDS) gedurende 1 uur en 30 minuten bij 120 V. (NB: chemische gevaren ). </li><li> Breng het eiwit aan een nitrocellulose membraan door elektroblotting bij 4 ° C koude overdracht buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% methanol) gedurende 1 uur bij een constante 50 V (NB: chemische gevaren). </li><li> Blokkeer de membraan 1 uur bij langzaam roeren met 5% vetvrije droge melk in 1 x TBS -Tween 0,1%. </li><li> Was het membraan 4 keer gedurende 5 minuten in een snelle beweging met 1x TBS - Tween 0,1%. </li><li> Voeg de primaire antilichamen tegen ALIX en Tsg101 (één per membraan) in geschikte buffer (dienovereenkomstig aan het antilichaam datasheet van de fabrikant) en incubeer het membraan O / N; In langzaam roeren. </li><li> Was het membraan 5 keer voor 5 min in een snelle beweging met 1x TBS - Tween 0,1% om overmatige antilichaam te verwijderen. </li><li> Voeg de juiste secundaire antilichaam in geschikte buffer (dienovereenkomstig aan het antilichaam datasheet van de fabrikant) en incubeer het membraan gedurende 1 uur in langzaam roeren. </li><li> Was het membraan 5 keer voor 5 min in een snelle beweging met 1x TBS - Tween 0,1% om overmatige antilichaam te verwijderen. </li><li> Detecteren de geselecteerde eiwit door chemiluminescentie analyse 11. </li></ol> 3. exosome Karakterisering door TEM Analyse Let op: Met het oog op de geïsoleerde exosomes visualiseren, werd TEM analyse (Transmission Electron Microscopy) uitgevoerd. <ol><li> Plaats ~ 10 ug (voorheen gekwantificeerd door Bradford test) monster van intacte exosomes geresuspendeerd in 1 x PBS op een parafilm en op het monster vallen een Formvar koolstof beklede nikkelen net voor 1 uur. </li> &lt;li&gt; Was het rooster 3 maal door het plaatsen van het op drie 40 ul 1x PBS daalt. </li><li> Was het net 5 keer door het plaatsen van het op vijf 30 ul ultrapuur water druppels. </li><li> Bevestig het monster door het toevoegen van een daling van 2,5% glutaraldehyde (LET OP: chemische gevaar) gedurende 10 min. </li><li> Was het rooster 3 maal door het plaatsen van het op drie 40 ul 1x PBS daalt. </li><li> Voeg een druppel 2% uranyl acetaat (WAARSCHUWING: chemische risico) en zet het rooster bovenop het voor 15 minuten om het monster contrast. </li><li> Insluiten het monster op een daling van 0,13% methylcellulose (NB: chemische risico) en 0,4% uranyl acetaat en incubeer het rooster bovenop de druppel gedurende 10 minuten. </li><li> Verwijder voorzichtig vloeibare overtollige met een absorberend papier en droog de grid voor 5 min met de gecoate kant naar boven. </li><li> Bestudeer het rooster door de transmissie-elektronenmicroscoop 12. </li></ol> 4. exosomaal RNA-extractie en kwantificering Let op: We hebben besloten om perfORM de totale RNA-extractie uit exosomaal monsters met behulp van een commerciële kit, volgens het protocol van de fabrikant: (LET OP: chemische gevaren, protocolbindingen en richtlijnen van de fabrikant). <ol><li> Na resuspensie van de exosome pellet in 346,5 ul lysisbuffer, voeg 3,5 ul van β-Mercaptoethanol (LET OP: chemische risico&#39;s) en vortex krachtig; Deze passage is verplicht om de lipide membranen te vernietigen. </li><li> Voeg het lysaat aan de waskolom in een verzamelbuis en centrifugeer bij 11.000 x g gedurende 1 min. Na centrifugeren gooi de kolom en breng het filtraat over in een nieuwe 1,5 ml RNase-vrije buis. </li><li> Voeg 350 ul van 70% ethanol (LET OP: chemische risico&#39;s) en meng door vortexen gedurende 5 sec. </li><li> Plaats het lysaat in het oplossend kolom en centrifugeer gedurende 30 seconden bij 8000 x g. Na centrifugeren, gooi de doorstroom en de overdracht van de kolom om een ​​nieuwe collectie buis. </li><li> Plaats 350 pl van ontzouten buffer en centrifugeer bij 11.000 x g gedurende 1 min. Na centrifugeren, gooi de doorstroom en de terugkeer van de kolom in dezelfde collectie buis. </li><li> Voeg 95 ul DNase I reactiemengsel (10 pi gereconstitueerde DNase I + 90 gl DNase buffer voor elk monster) op het silica membraan van de kolom en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. (LET OP: chemische gevaar) </li><li> Voeg 200 pl wasbuffer (LET chemisch gevaar) aan de kolom en centrifugeer bij 11.000 x g gedurende 1 min. Plaats de kolom in een nieuwe collectie buis. </li><li> Voeg 600 pl wasbuffer aan de kolom en centrifugeer bij 11.000 x g gedurende 1 min. Na centrifugeren, gooi doorstroom en plaats de kolom in dezelfde collectie buis. </li><li> Voeg 250 pl wasbuffer aan de kolom en centrifugeer bij 11.000 x g gedurende 2 minuten. Plaats de kolom in een 1,5 ml RNAse-vrij buis. </li><li> Elueer het RNA in 40 ul RNAse-vrij water en centrifugeer bij 11.000<html> 5; g gedurende 1 min, teneinde een hoog RNA-concentratie in het klein volume hebben. </li><li> Plaats onmiddellijk geëlueerde RNA op ijs mogelijke afbraak of bewaar bij -80 ° C te voorkomen. </li><li> Kwantificeren van de RNA inhoud. Opmerking: Hier werd het RNA kwantisatie uitgevoerd met 1 pl monster door spectrofotometer. </li></ol> 5. Retrotrascription van exosomaal miRNAs Opmerking: Door de beschreven beperkte hoeveelheid miRNAs inhoud exosomes, werd besloten om de reverse transcriptie van geselecteerde miRNAs voeren een commerciële kit assay gebruikmakend van een individueel voor elke miRNA, volgens het protocol van de fabrikant. Voor elk monster werden 8 miRNAs gecorreleerd met NSCLC-status geselecteerd (miR-30b, miR-30c, miR-103, miR-122, miR-195, miR-203, miR-221, miR-222 en miR-1228- 3p als endogene controle). <ol><li> Bereid de Reverse transcriptie master mix (RT mix). Voor elke reactie bereiden 7 pl RT mix, zoals beschreven inhttps://www.jove.com/files/ftp_upload/53900/Table1.xlsx&quot;&gt;Table 1 (klik hier om te downloaden) (LET OP: chemische gevaar). Opmerking: In dit experiment werden 9 verschillende RT mix Voor elk monster. </li><li> Meng voorzichtig en bewaar de RT mix op ijs. Voeg 7 ul van RT mix per reactie buis. </li><li> Voeg 5 ul van het monster RNA (10 ug totaal RNA) per reageerbuisje en meng voorzichtig. </li><li> Voeg 3 ul van de 5x reverse transcriptie primers (LET OP: chemische gevaar) van elke set in de overeenkomstige reactie buis test. </li><li> Meng langzaam, sluit de buis en incubeer op ijs gedurende 5 minuten. </li><li> Laad de reactiebuis in de thermische cycler en start de reverse transcriptiereactie met het volgende parameterwaarden (HOLD bij 16 ° C gedurende 30 min, houden op 42 ° C gedurende 30 min, houden op 85 ° C gedurende 5 min; HOLD ∞ 4 ° C). </li></ol> 6. Real Time PCR analyse van exosomaal miRNAs Opmerking: Deze analyse wasuitgevoerd met een commerciële kit voor Real Time PCR (qPCR), drie biologische en technische replicaten per monster. <ol><li> Voor elke reactie, voor te bereiden 17,67 pi Real Time PCR-mix (10 pi PCR Master Mix + 7,67 pi van Nuclease-vrij water), meng het en op ijs gezet. (LET OP: chemische gevaar) </li><li> Voeg 1 ui, voor elke PCR-buis, van 20x qPCR primers (LET OP: chemische gevaar). </li><li> Plaats 18.67 ul van de qPCR mix in elk putje-plaat. </li><li> Voeg 1,33 ul van de reverse transcriptie product in de correspondent goed plaat. </li><li> Sluit de plaat en draai het (300 GX 5 sec). </li><li> Plaats de plaat in een real-time PCR-systeem en start de run met behulp van de volgende PCR voorwaarden: HOLD bij 95 ° C gedurende 10 min; 40 cycli van 15 sec bij 95 ° C en 60 sec bij 60 ° C. Werkwijze en gegevens normaliseren volgens de formule 2 - 13 ΔΔct. </li></ol>

<ol><li>Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).</li>
<li>Rolfo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+therapeutic+strategies+for+patients+with+NSCLC+that+do+not+respond+to+treatment+with+EGFR+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Rev%22%5BJournal%5D)">Novel therapeutic strategies for patients with NSCLC that do not respond to treatment with EGFR inhibitors.</a> Cancer Treat Rev. 40, 990-1004 (2014).</li>
<li>Rolfo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsies+in+lung+cancer%3A+the+new+ambrosia+of+researchers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers.</a> Biochim Biophys Acta. 1846, 539-546 (2014).</li>
<li>Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+composition%2C+biogenesis+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nat Rev Immunol. 2, 569-579 (2002).</li>
<li>Fontana, S., Saieva, L., Taverna, S., Alessandro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+proteomics+to+understanding+the+role+of+tumor-derived+exosomes+in+cancer+progression%3A+state+of+the+art+and+new+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Contribution of proteomics to understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and new perspectives.</a> Proteomics. 13 (10-11), 1581-1594 (2013).</li>
<li>Taverna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+shuttling+of+miR-126+in+endothelial+cells+modulates+adhesive+and+migratory+abilities+of+chronic+myelogenous+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomal shuttling of miR-126 in endothelial cells modulates adhesive and migratory abilities of chronic myelogenous leukemia cells.</a> Mol Cancer. 11, (2014).</li>
<li>Taverna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+inhibits+in+vitro+and+in+vivo+chronic+myelogenous+leukemia+cells+growth%3A+a+possible+role+for+exosomal+disposal+of+miR-21%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21.</a> Oncotarget. , (2015).</li>
<li>Garofalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+signatures+of+TRAIL+resistance+in+human+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer.</a> Oncogene. 27, 3845-3855 (2008).</li>
<li>Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+microRNA%3A+a+diagnostic+marker+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer.</a> Clin Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+miR-1228+as+a+stable+endogenous+control+for+the+quantification+of+circulating+microRNAs+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Human miR-1228 as a stable endogenous control for the quantification of circulating microRNAs in cancer patients.</a> Int J Cancer. 135 (5), 1187-1194 (2014).</li>
<li>Alessandro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+carboxyamidotriazole+on+in+vitro+models+of+imatinib-resistant+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of carboxyamidotriazole on in vitro models of imatinib-resistant chronic myeloid leukemia.</a> J Cell Physiol. 215, 111-121 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+Derived+from+Human+Umbilical+Cord+Mesenchymal+Stem+Cells+Relieve+Acute+Myocardial+Ischemic+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Relieve Acute Myocardial Ischemic Injury.</a> Stem Cells Int. 2015, (2015).</li>
<li>Yoko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+MDR%271and+induction+of+doxorubicin+resistance+by+histone+deacetylase+inhibitor+depsipeptide+%28FK228%29+and+ATRA+in+acute+promyelocytic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of MDR'1and induction of doxorubicin resistance by histone deacetylase inhibitor depsipeptide (FK228) and ATRA in acute promyelocytic leukemia cells.</a> Blood. 107 (4), 1546-1554 (2006).</li>
</ol>

Alle auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Met deze gecombineerde protocol was het mogelijk om een ​​analyse uit te voeren exosomaal miRNA in plasma van patiënten met NSCLC. Deze gegevens kunnen de ziekte status weer te geven, maar dit dient te worden bevestigd door verdere studie. Het protocol in dit artikel is gebaseerd op een commerciële kit voor exosome isolatie. De reden was dat de andere bekende isolatieprocedures (bv., Dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie) vereist manuele procedures, wat leidt tot een beperkte standa...

De lage overlevingskans in NSCLC (niet-kleincellige longkanker) van de patiënten is voornamelijk te wijten aan de beperkte effectiviteit van behandelingen in gevorderde ziekte en slechte vroege opsporing 1. Activerende mutaties in het EGFR-gen, die zijn ontdekt in een subpopulatie van NSCLC patiënten is bekend dat gevoeligheid voor kinaseremmers (TKI) tyrosine verlenen. Helaas zijn de meeste EGFR NSCLC gemuteerd patiënten ontwikkelen resistentie TKI 2. Vooral in dit verband een juiste diagnose is verplicht. In het algemeen, door lokalisatie van tumoren, verkregen biopsie weefsel in NSCLC is niet altijd uitvoerbaar. Daarom verscheidene studies worden uitgevoerd dat de niet-invasieve methoden om deze biologische gegevens te verkrijgen. Exosomes beschreven als vloeibare biopsie componenten die kunnen worden onderzocht om diagnostische en prognostische waarden met niet-invasieve technieken 3 te verkrijgen. Exosomes zijn nanovesicles (40-100 nm diameter) van de endocytic oorsprong die zijn uitgebracht door verschillende celtypes, zowel in fysiologische en pathologische omstandigheden 4. Ze kunnen dragen eiwitten, vetten, mRNA en microRNAs. Bovendien suggereren verscheidene studies een pleiotrope rol van tumor afgeleide exosomes, die de groei en overleving van tumorcellen, angiogenese, en stromale extracellulaire matrix remodeling en geneesmiddelresistentie 5 kunnen beïnvloeden. MicroRNAs (miRNAs) kort niet-coderende RNA die betrokken zijn bij post-transcriptionele regulatie, binding van het 3&#39;-UTR van het doelwit mRNA en leidt het mRNA afbraak of een niet-vertaling 6. Selectief sorteren van miRNAs in exosomes is beschreven. In dit verband onlangs aangetoond in vitro en in vivo, een selectieve verpakking van miR-21 (een bekende miRNA met oncogene effecten) in exosomes vrijgegeven door chronische myeloïde leukemie cellijnen na behandeling curcumin 7. Deexosomaal miRNA profiel is vergelijkbaar met het miRNA profiel van de primaire tumor en deze functie kan worden benut vroege diagnose en prognose 3. Concreet bestaat de mogelijkheid te karakteriseren door real-time PCR, geselecteerd miRNAs gecorreleerd met de moleculaire profiel van de ziekte, bijv., EGFR mutaties oa 8. Hier is de analyse van een panel van geselecteerde NSCLC-gecorreleerde miRNAs 8-9 beschreven die zijn geïsoleerd uit exosomes vrijgegeven in het bloed van patiënten met NSCLC. Na het verkrijgen van de toestemming rapport op de hoogte van de patiënten, plasma van 12 NSCLC patiënten en 6 gezonde controles, werden geanalyseerd. De exosoom isolatie werd uitgevoerd met commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant. Voordat exosoom isolatie, werden plasmamonsters behandeld met RNAse, teneinde verontreiniging circulerende miRNAs degraderen. We besloten om deze analyse met een commerciële kit voeren vanwege de beperkte normalisatie van andere tech-wachtrijen (bv., ultracentrifugatie) wat vooral van belang bij het ​​werken met klinische monsters. Deze kit bevat een Proteinase K behandeling, die de RNAse zal degraderen, en vermindert zo het risico op exosomaal miRNAs degraderen na exosome lysis. MicroRNA analyse werd uitgevoerd door gevoelige en specifieke real-time PCR-analyse; mir-1228-3p werd gebruikt als endogene controle en de gegevens werden genormaliseerd volgens de formule 2 - ΔΔct. Controlewaarden worden als basislijn en resultaten worden getoond in een logaritmische schaal.

<table><tbody><tr><td>Totaal exosome isolatiekit (uit plasma)</td><td>&nbsp;Invitrogen</td><td>4484450</td><td>Gebruik Proteinase K-behandeling</td></tr><tr><td>Ribonuclease A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>ALIX Antilichaam (3A9)</td><td>Cell Signaling</td><td>2171S</td><td></td></tr><tr><td>TSG-101 Antilichaam (C-2)</td><td>SantaCruz Biotecnology</td><td>SC-7964&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Muis HRP 1 ml&nbsp;&nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>7076P2</td><td></td></tr><tr><td>RNAspin Illustra mini kit 50</td><td>GE HealthCare</td><td>25-0500-71</td><td></td></tr><tr><td>Taqman MicroRNA Reverse Transcriptie Kit</td><td>Life Technologies</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>hsa-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay</td><td>Life Technologies</td><td>002919</td><td></td></tr><tr><td>hsa-miR-30b TaqMan MicroRNA assay</td><td>Life Technologies</td><td>000602</td><td></td></tr><tr><td>hsa-miR-30c TaqMan MicroRNA assay</td><td>Life Technologies</td><td>000419</td><td></td></tr><tr><td>hsa-miR-122 TaqMan MicroRNA assay</td><td>Life Technologies</td><td>002245</td><td></td></tr><tr><td>hsa-miR-195 TaqMan MicroRNA assay</td><td>Life Technologies</td><td>000494</td><td></td></tr><tr><td>hsa-miR-203 TaqMan MicroRNA assay</td><td>Life Technologies</td><td>000507</td><td></td></tr><tr><td>hsa-miR-103 TaqMan MicroRNA assay</td><td>Life Technologies</td><td>000439</td><td></td></tr><tr><td>hsa-miR-221 TaqMan MicroRNA assay</td><td>Life Technologies</td><td>000524</td><td></td></tr><tr><td>hsa-miR-222 TaqMan MicroRNA assay</td><td>Life Technologies</td><td>002276</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, geen UNG</td><td>Life Technologies</td><td>4440043</td><td></td></tr></tbody></table>

exosomaal mirna analyse in niet-kleincellige longkanker (nsclc) patiënten plasma through qpcr: een haalbare liquid biopsie tool

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

De ontdekking van veranderingen in de EGFR en ALK genen, onder andere, in NSCLC heeft de ontwikkeling van gerichte medicijntherapie met selectieve tyrosine kinase remmers (TKI's) gestimuleerd. Om het gebruik van deze TKI's te optimaliseren, is de ontdekking van nieuwe biomarkers voor vroege detectie en ziekteprogressie verplicht. Deze plasma-geïsoleerde exosomen kunnen worden gebruikt als een niet-invasieve en herhaalbare manier voor de detectie en follow-up van deze biomarkers. Eén ml plasma van 12 NSCLC patiënten, met verschillende mutaties en behandelingen (en 6 gezonde donoren als controles), werden gebruikt als exosomenbronnen. Na RNAse behandeling, om circulerende miRNA's te degraderen, werden de exosomen geïsoleerd met een commercieel kit en opnieuw gesuspendeerd in specifieke buffers voor verdere analyse. De exosomen werden gekarakteriseerd door western blotting voor ALIX en TSG101 en door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) analyse, de standaardtechnieken om biochemische en dimensionale gegevens van deze nanovesicles te verkrijgen. Totale RNA extractie werd uitgevoerd met een commercieel kit met hoge opbrengst. Vanwege het beperkte miRNA-gehalte in exosomen, besloten we retro-transcriptie PCR uit te voeren met een individueel assay voor elke geselecteerde miRNA. Een panel van miRNA's (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), allemaal gecorreleerd met NSCLC ziekte, werd geanalyseerd door gebruik te maken van de opmerkelijke gevoeligheid en specificiteit van Real-Time PCR analyse; mir-1228-3p werd gebruikt als endogene controle en gegevens werden verwerkt volgens de formule 2-ΔΔct 13. Controle waarden werden gebruikt als baseline en resultaten worden weergegeven op logaritmische schaal.

Een totaal van 12 plasma van NSCLC patiënten en 6 gezonde controles werden verwerkt met commerciële kit voor exosome isolatie uit plasma. Elk monster werd verwerkt door Western Blot analyse om de exosomaal markers ALIX (96 kDa) en Tsg101 (43 kDa) te evalueren. Een voorbeeld van deze resultaten getoond voor monsters 3 in figuur 1, wat aangeeft dat exosome isolatie van plasmamonsters haalbaar met dit protocol. O...

Dit protocol beschrijft de haalbaarheid om miRNA-profilering uit te voeren in exosomen, vrijgegeven in plasma van NSCLC-patiënten, door middel van een commerciële exosome-isolatiekit met Proteinase K en RNAse-behandelingen, om circulatie van miRNA-besmetting te voorkomen en hun biomerkerfuncties in NSCLC te evalueren.

Exosomaal miRNA analyse in niet-kleincellige longkanker (NSCLC) patiënten Plasma Through qPCR: een haalbare Liquid biopsie Tool

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective ...

Het algemene doel van deze procedure is om exosomen te isoleren uit het plasma van NSCLC-patiënten die vrij zijn van niet-exosomale microRNA-bronnen, zoals vrij circulerende microRNAse, door middel van een dubbele enzymatische behandeling voorafgaand aan de exosoomisolatie. Deze methode kan de analyse van microRNA-lipidbiopten beperken tot het exosoomcompartiment, wat zal helpen bij het verduidelijken van hun gebruik als biomarkers. Het belangrijkste voordeel van deze procedure is de enzymatische voorbehandeling, die niet-exosomale bronnen van microRNA elimineert die de analyse zouden kunnen beïnvloeden.Begin met het ontdooien van een plasmaproef van 1 mL op ijs. Keer de buis na het ontdooien enkele keren om om eventuele cryoprecipitaten die zijn gevormd te disaggregeren. Centrifugeer het plasma vervolgens 20 minuten bij 2.000 G bij kamertemperatuur om cellen en debris te verwijderen.Verzamel de supernatant en centrifugeer het plasma opnieuw, nu bij 10,000 G's gedurende 20 minuten. Verzamel opnieuw de plasmasupernatant en voeg nu 10 µL RNase toe. Incubeer het plasma gedurende 10 minuten bij 37 °C in een thermoblock-verwarmer.We hebben de stap met RNase-behandeling toegevoegd aan he

exosomal-mirna-analysis-non-small-cell-lung-cancer-nsclc-patients

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

MicroRNAs (miRNAs) are tissue specific, small, non-coding RNAs regulating gene expression, and could represent ideal candidates for early detection of lung cancer. In the featured protocol, we will isolate microRNA from patient blood samples for early lung cancer screening.

miRNA Extraction: A Method to Extract miRNA from Plasma Sample

The plasma-isolated exosomes can be used as a non-invasive and repeatable way for the detection and follow-up of the biomarkers for early detection and disease progression. This video describes the protocol for the separation of exosomes from the plasma samples of non-small cell lung cancer patients, which could be used for DNA and protein extractions.

Exosome Isolation: A Technique to Separate Exosomes from the Plasma of Non-small Cell Lung Cancer Patients

This video describes the extraction of circulating microRNA from plasma samples of colorectal cancer patients using organic extraction followed by glass-fiber column enrichment. miRNAs are stable in biological fluids such as serum and plasma, which renders them ideal circulating biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, and treatment decision-making and monitoring. This method will help identify new circulating biomarkers capable of predicting clinical outcomes in patients.

Circulating miRNA Extraction: A Method to Isolate miRNA from Plasma Samples Via Organic Extraction and Small RNA Enrichment

Hier presenteren we het gedetailleerde protocol vastgesteld in de BioMILD screening proces de circulerende microRNA handtekening classificatie als test wilt uitvoeren voor de vroegtijdige opsporing van long kanker.

MicroRNA gebaseerde vloeibare biopsie: De ervaring van de Plasma miRNA handtekening classificatie (MSC) voor Lung Cancer Screening

Detectie van circulerende RNA acid (cRNA) van bloed is een unmet behoefte in klinische diagnostiek. Hier beschrijven we methoden die kenmerkend zijn voor cRNA van niet-kleincellige longkanker kankerpatiënten met behulp van gevoelige en specifieke digitale polymerase-kettingreactie. De tests voldoen aan ontwerp te detecteren fusion varianten binnen 72 uur.

Een bloed-gebaseerd testen voor de detectie van ROS1 en RET Fusion Transcripts from circulerende RNA zuur met behulp van digitale Polymerase-kettingreactie

Presenteren we een protocol om te evalueren van de expressie niveaus van circulerende microRNA (miRNAs) in plasma monsters van kankerpatiënten. In het bijzonder, hebben we gebruikt een verkrijgbare kit voor circulerende miRNA extractie en omgekeerde transcriptie. Ten slotte, geanalyseerd wij een panel van 24 geselecteerde miRNAs met behulp van real-time vooraf gevlekte sonde aangepaste platen.

Detectie van een circulerende MicroRNA Custom Panel bij patiënten met uitgezaaide darmkanker

De klinische vertaling van exosoom biomarkers voor zieke en kwaadaardige cellen wordt belemmerd door het ontbreken van snelle en accurate kwantificatie methoden. Dit rapport beschrijft het gebruik van low-vergroting Dark-Field Microscoop beelden te kwantificeren specifieke exosoom subtypen in kleine volume serum of plasma monsters.

Met behulp van Nanoplasmon-Enhanced verstrooiing en low-vergroting Microscoop Imaging te kwantificeren tumor-afgeleide Exosomes

Therapie resistentie ontwikkelt zich vaak bij patiënten met gevorderde prostaatkanker, en in sommige gevallen vordert kanker naar een dodelijk subtype genaamd neuro-endocriene prostaatkanker. Beoordeling van de kleine niet-codering RNA-gemedieerde moleculaire veranderingen die deze overgang vergemakkelijken zou leiden tot een betere stratificatie van de ziekte en identificatie van causale mechanismen die leiden tot de ontwikkeling van neuro-endocriene prostaatkanker.

Sequentiëren van klein niet-coderende RNA van Formalin-vaste weefsels en van serum afgeleide Exosomen van castratie bestendige prostaatkanker patiënten

Het protocol beschrijft een tandem-immunofluorescentiehybridisatietest met in formaline gefixeerd in paraffine ingebed weefsel om microRNA en gemultiplexte eiwitten tegelijkertijd te detecteren en te kwantificeren.

MicroRNA-amplificatie en -herkenning door middel van locked-nucleic-acid in situ hybridisatie als een nieuwe detectie- en kwantificeringsmethode

Een uitgebreid overzicht van de technieken die betrokken zijn bij het genereren van een muismodel van orale kanker en kwantitatieve controle van de tumor invasie in de tong door middel van multi-foton microscopie van gelabelde cellen wordt gepresenteerd. Dit systeem kan dienen als een nuttig platform voor de moleculaire beoordeling en werkzaamheid van het geneesmiddel van anti-invasieve verbindingen.

Multi-foton Imaging van de tumorcel invasie in een orthotope Muis Model van Oral plaveiselcelcarcinoom

Leer exosoomisolatie uit plasma van NSCLC-patiënten met een dubbele enzymatische behandeling. Deze methode verwijdert niet-exosomale microRNA-bronnen voor betrouwbare biomarkeranalyse.

Exosomaal miRNA analyse in niet-kleincellige longkanker (NSCLC) patiënten Plasma Through qPCR: een haalbare Liquid biopsie Tool

Meer video's verkennen