Name: Laser-assisted Microdissection (LAM) als een tool voor Transcriptionele Profiling van individuele cel Types (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Leer laser-geassisteerde microdissectie om specifieke plantencellen te isoleren voor transcriptieanalyse. Deze methode richt zich op vrouwelijke kiemlijn in Boechera-soorten en levert hoogwaardig RNA op.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) voor het verstrekken van Boechera divaricarpa zaden en Sharon Kessler (University of Oklahoma) voor het kritische lezen en proeflezen. Werk aan celtype-specifieke transcriptoomanalyses om gametofyt ontwikkeling en apomixis in UG's laboratorium te bestuderen, wordt ondersteund door de Universiteit van Zürich, door een beurs van de "Deutsche Forschungsgemeinschaft" en het Marie Curie project IDEAGENA aan AS, door subsidies van de "Staatssekretariat für Bildung und Forschung" in het kader van COST action FA0903 (aan UG en AS) en de Zwitserse Nationale Stichting (aan UG).

<ol><li>Maheshwari, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaheshwari%2C+P+%22An+Introduction+to+the+Embryology+of+Angiosperms%22">An Introduction to the Embryology of Angiosperms</a>. , McGraw-Hill. New York. (1950).</li>
<li>Willemse, M. T. M., Van Went, J. L. The female gametophyte. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWillemse%2C+MTM+%22Embryology+of+Angiosperms%22">Embryology of Angiosperms</a>. Johri, B. M. , Springer-Verlag. Berlin. 159-196 (1984).</li>
<li>Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apomixis%3A+Molecular+strategies+for+the+generation+of+genetically+identical+seeds+without+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization.</a> Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).</li>
<li>Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apomixis+-+the+asexual+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Apomixis - the asexual revolution.</a> Science. 274, 1322-1323 (1996).</li>
<li>Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+future+for+apomixis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">A bright future for apomixis.</a> Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).</li>
<li>Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+germline+formation%3A+molecular+insights+define+common+concepts+and+illustrate+developmental+flexibility+in+apomictic+and+sexual+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction.</a> Development. 142, 229-241 (2015).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apomictic+and+sexual+germline+development+differ+with+respect+to+cell+cycle%2C+transcriptional%2C+hormonal+and+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+GENET%22%5BJournal%5D)">Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation.</a> PLOS GENET. 10, e1004476(2014).</li>
<li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarging+cells+initiating+apomixis+in+Hieractium+praealtum+transition+to+an+embryo+sac+program+prior+to+entering+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis.</a> Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).</li>
<li>Wuest, S. E., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+microdissection+applied+to+floral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted microdissection applied to floral tissues.</a> Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).</li>
<li>Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+expression+profiling+of+rare+cell+types+as+exemplified+by+its+impact+on+our+understanding+of+female+gametophyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development.</a> Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).</li>
<li>Wuest, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+female+gametophyte+gene+expression+map+reveals+similarities+between+plant+and+animal+gametes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes.</a> Curr Biol. 20, 1-7 (2010).</li>
<li>Cai, S., Lashbrook, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+plant+cells+from+tape-transferred+paraffin+sections+promotes+recovery+of+structurally+intact+RNA+for+global+gene+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling.</a> Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).</li>
<li>Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+the+Arabidopsis+megaspore+mother+cell+uncovers+the+importance+of+RNA+helicases+for+plant+germ+line+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+BIOL%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development.</a> PLOS BIOL. 9, e1001155(2011).</li>
<li>Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes%3A+laser-assisted+microdissection+and+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing.</a> PLOS ONE. 7, e29685(2012).</li>
<li>Mau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+apomicts+trapped+in+the+ecological+niches+of+their+sexual+ancestors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci.U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors.</a> Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).</li>
<li>Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+variation+in+transcriptionally+active+regions+of+sexual+and+apomictic+Boechera.+demonstrates+independently+derived+apomictic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages.</a> Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).</li>
<li>Corral, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+apomixis-specific+polymorphism+is+correlated+with+exclusive+exonuclease+expression+in+premeiotic+ovules+of+apomictic+boechera+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species.</a> Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).</li>
<li>Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Arabidopsis+thaliana.+phloem+RNAs+provides+a+search+criterion+for+phloem-based+transcripts+hidden+in+complex+datasets+of+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments.</a> Plant J. 55, 746-775 (2008).</li>
<li>Schmid, M. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Genome+Scale+Quantitative+Biology+in+Arabidopsis+thaliana%22">Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana</a>. , University of Zürich. PhD Thesis 40-104 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het protocol is geschikt voor verschillende cel- en weefseltechnologie Types LAM gecombineerd met transcriptoom analyse van microarrays of RNA-Seq is een waardevol instrument om inzicht te krijgen in de specifieke patronen van de activiteit van genen reguleren ontwikkelings- of fysiologische processen 7-11,13,14 krijgen. De geschiktheid van deze methode voor een bepaalde celtype kritisch afhankelijk structurele problemen. De cel moet duidelijk zichtbaar en ondubbe...

Transcriptionele studies uitgevoerd op het weefsel niveau worden de transcriptomes zeer gespecialiseerde maar zeldzame celtypen vaak gemaskeerd door overvloediger omringende cellen. Een voorbeeld van zo&#39;n gespecialiseerde celtypes zijn de cellen van de vrouwelijke reproductieve lijn (kiembaan) in planten. Het vrouwtje kiemlijn wordt opgegeven binnen de ontwikkeling van eitjes, de voorlopers van zaden binnen de gynoecium van de bloem 1,2. De megaspore moedercel (MMC) is de eerste cel van de vrouwelijke kiemlijn. Ondergaat meiosis een viertal verminderde megasporen vormen. Gewoonlijk slechts één van deze megaspores overleeft en scheidt mitotisch zonder cytokinese, dat wil zeggen in een syncytium. Deze mitosen worden gevolgd door cellularization aan de rijpe gametophyte, die meestal bestaat uit vier soorten cellen vormen: drie antipodals, twee synergid cellen, het ei, en de centrale cel. Het ei en de centrale cellen zijn de vrouwelijke gameten die krijgen bevrucht door twee zaadcellen tijdens double bevruchting aanleiding geven tot het embryo en endosperm van de zich ontwikkelende zaad 1,2 geven. In de seksuele modelsysteem Arabidopsis thaliana, alleen ~ 50 zaden ontwikkelen per bloem terwijl ongeveer 50-80 zaden ontwikkelen per bloem in het nauw verwante geslacht Boechera. Dus de vrouwelijke kiemlijn bestaat uit slechts enkele zeer gespecialiseerde celtypen, waardoor het een uitstekend model voor ontwikkelingsprocessen, zoals celspecificatie en differentiatie te bestuderen. Bovendien kan inzicht in het gen regulerende processen die reproductie planten van de toegepaste waarde. In planten, kan zowel geslachtelijke en ongeslachtelijke voortplanting door middel van zaden (apomixis) optreden. Terwijl geslachtelijke voortplanting genereert genetische diversiteit in een populatie, apomixis leidt tot de vorming van klonale nakomelingen die genetisch identiek aan de moederplant. Daarom apomixis heeft een groot potentieel voor toepassingen in de landbouw en de productie van zaaizaad, want zelfs complexe moeder genotypen kanover meerdere generaties 3,4,5 ongewijzigd worden gehandhaafd. Omdat apomixis niet van nature voorkomt in alle belangrijke soorten gewassen, de engineering van apomixis in gewassen is van groot belang 3,4,5. Echter, deze lange-termijn doel is moeilijk te bereiken, omdat de onderliggende genetische en moleculaire basis van apomixis niet begrepen wordt in voldoende detail 6. Om inzicht in de transcriptie basis betreffende apomictische reproductie, celtype-specifieke transcriptie profiling met behulp van laser-assisted microdissectie (LAM) en next generation sequencing (NGS) te krijgen is een zeer krachtige benadering 7,8. LAM eerst is vastgesteld voor dieren en biomedisch onderzoek. In de afgelopen jaren LAM is ook toegepast om te planten biologie 6,9,10. In tegenstelling tot andere systemen die een beoordeling van afzonderlijke cellen en weefseltypes, is LAM niet het genereren van markeerlijnen 6,9,10 vereisen. Daarom kan het appgelogen om een ​​cel of weefsel type, zonder voorafgaande moleculaire kennis. Een ander voordeel van LAM is dat het kan worden toegepast op elk celtype mits de cel droge delen te herkennen op basis van de positie en / of structurele kenmerken. LAM heeft als bijkomend voordeel dat gefixeerde weefsels worden toegepast, waarbij afwijkingen van de transcriptionele profiel voorkomt tijdens de verwerking. Het weefsel van belang, bijvoorbeeld bloemen weefsel wordt gefixeerd in een niet-verknopende fixatief voorafgaand aan inbedding in paraffine. Inbedding in paraffine kan handmatig worden gedaan, na vastgestelde protocollen 9,11. Het gebruik van een geautomatiseerde weefselprocessor voor dehydratatie en infiltratie van de was resulteert in het algemeen in hogere reproduceerbaarheid in termen van het behoud van kwaliteit en RNA weefselmorfologie. De alternatieve strategie voor het inbedden van weefsels in hars is ook met succes toegepast voor celtype-specifieke analyses van LAM 8. Het gebruik van een automated weefselprocessor voor het inbedden in was zeer tijdbesparend, zoveel monsters tegelijkertijd de vereiste minimale hands-tijdig kan verwerken. Hoewel meestal geen significant verlies van kwaliteit RNA optreedt tijdens fixatie en inbedding, de bereiding van dunne secties met de microtoom en in het bijzonder de montage op de frameslides voor LAM blijft een kritische stap voor het behoud van RNA kwaliteit. Dit werd eerder opgemerkt en het gebruik van een tape transfersysteem is beschreven leiden tot een betere kwaliteit RNA bij deze stap 12. Echter, dit geeft een additionele tijdrovende stap tijdens de bereiding van de glijbanen en vereist ook speciale apparatuur. De geoptimaliseerde protocol hieronder beschreven produceert reproduceerbaar RNA dat is van voldoende kwaliteit voor de transcriptie profilering met GeneChips en Next Generation Sequencing (NGS) benaderingen 7,11,13,14. Bovendien, met de laser microdissectie microscoop gebruikt, een hoge zuiverheid van de geïsoleerde celtypes is routinely geproduceerd 7,11,13,14. Het geslacht Boechera is een uitstekend model voor het bestuderen van de belangrijkste stappen van apomictische reproductie. In Boechera, hebben verschillende seksuele en apomictische toetredingen geïdentificeerd en kunnen worden gebruikt voor vergelijkende analyses 15,16,17. In een vergelijking van celtype-specifieke transcriptomes van cellen van de vrouwelijke kiemlijn van seksuele Arabidopsis en apomictische Boechera, we geïdentificeerde genen en van de wegen die differentieel uitgedrukt, waardoor nieuwe aspecten van de regulerende processen te identificeren met betrekking tot apomixis 7. Daarnaast is deze studie bevestigde de geschiktheid van LAM voor celtype-specifieke transcriptionele analyses van kleine en zeldzame celtypen. We hebben stond met het protocol voor de analyse van diverse celtypen in verschillende plantensoorten, maar soort- en weefsel-specifieke modificaties aan het protocol in bepaalde gevallen nodig.

<table><tbody><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>1.009.861,000</td><td>absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP</td></tr><tr><td>15 ml falcon centrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>62406-200</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>Applichem</td><td>A3686,2500</td><td>100% Molecular biology grade</td></tr><tr><td>Ambion Nuclease free water</td><td>life technologies</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>ASP200 S</td><td>Leica</td><td>14048043624</td><td>tissue processor&nbsp;</td></tr><tr><td>black cardboard</td><td></td><td></td><td>can be purchased in special paper shops</td></tr><tr><td>DNA- and RNAse-free Frame Slides</td><td>Micro Dissect GmbH</td><td></td><td>1, 4 &micro;m PET-membrane; can also be purchased from Leica</td></tr><tr><td>Dumond Forceps</td><td>Actimed</td><td>0208-5SPSF-PS</td><td></td></tr><tr><td>ethanol lamp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>exsiccator</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z354074-1EA</td><td>Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment</td></tr><tr><td>filter tips 10&nbsp;&micro;l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60010</td><td>can be replaced by similar tips</td></tr><tr><td>filter tips 1.000&nbsp;&micro;l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60010</td><td>can be replaced by similar tips</td></tr><tr><td>filter tips 20&nbsp;&micro;l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60020</td><td>can be replaced by similar tips</td></tr><tr><td>filter tips 200&nbsp;&micro;l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60200</td><td>can be replaced by similar tips</td></tr><tr><td>forceps precision</td><td>VWE</td><td>232-1221</td><td></td></tr><tr><td>glass slide holder</td><td>Huber &amp; Co.AG</td><td>10.0540.01</td><td>F&auml;rbek&auml;sten nach Hellendahl</td></tr><tr><td>glass staining trough</td><td>Huber &amp; Co.AG</td><td>10.0570.01</td><td>F&auml;rbekasten</td></tr><tr><td>Heated Paraffin Embedding Module Leica</td><td>Leica</td><td>Leica EG 1150 H</td><td>blocking station, similar devises are suitable</td></tr><tr><td>Heating and Drying Table</td><td>Medax</td><td>15501</td><td>other models and/or suppliers are suitable</td></tr><tr><td>ice bucket</td><td>VWR ice bucket with lid&nbsp;</td><td>10146-184</td><td>similar buckets equally suitable</td></tr><tr><td>light table</td><td>UVP An Analytical Jena Company</td><td>TW-26&nbsp;</td><td>white light transluminator</td></tr><tr><td>microscope slide</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143562CE</td><td>cut edges</td></tr><tr><td>microtome blade</td><td>Thermo Scientific</td><td>FEAHS35</td><td>S35 microtome blade disposable</td></tr><tr><td>MMI Cell Cut Plus Instrument</td><td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2 ml</td><td>life technologies</td><td>AM12475</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast X-TRA</td><td>Roth</td><td>X882.2</td><td>for histology</td></tr><tr><td>PicoPure RNA Isolation Kit</td><td>life technologies</td><td>KIT0204</td><td>Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit</td></tr><tr><td>plastic balancing trays</td><td>Semadeni AG</td><td>2513</td><td></td></tr><tr><td>plastic box</td><td>Semadeni AG</td><td>2971</td><td>Plastikdose PS</td></tr><tr><td>plastic lid for heating plate</td><td></td><td></td><td>homemade</td></tr><tr><td>preparation needle</td><td>VWR</td><td>631-7159</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>RNAse free microfuge tubes</td><td>life technologies</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>RNAse ZAP Decontamination Solution</td><td>life technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Semi-automated Rotary Microtome&nbsp;</td><td>Leica</td><td>RM2245</td><td>similar devices are equally suitable</td></tr><tr><td>Tissue Loc Histo Screen Cassettes</td><td>Thermo Scientific</td><td>C-1000_AQ</td><td>similar cassettes of other suppliers are suitable</td></tr><tr><td>Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 &micro;l&nbsp;</td><td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td><td>50204</td><td></td></tr><tr><td>Xylol (Isomere) ROTIPURAN</td><td>VWR</td><td>4436.2</td><td>min. 99%, p.a., ACS, ISO SP</td></tr><tr><td>process embedding cassettes</td><td>Leica</td><td>14039440000</td><td>Leica Jet Cassette I without lid</td></tr><tr><td>Universal Oven</td><td>Memmert</td><td>UF55</td><td>other models and/or suppliers are suitable</td></tr></tbody></table>

laser-assisted microdissection (lam) als een tool voor transcriptionele profiling van individuele cel types

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Het begrip van ontwikkelingsprocessen op moleculair niveau vereist inzichten in transcriptionele regulatie, en dus het transcriptoom, op het niveau van individuele celtypen. Hoewel de hier beschreven methoden over het algemeen toepasbaar zijn op een breed scala aan soorten en celtypen, richt ons onderzoek zich op plantenreproductie. Plantencultuur en zaadproductie is van cruciaal belang voor de menselijke en dierlijke voeding. Een gedetailleerd begrip van de regulatoire netwerken die de vorming van de reproductieve lijn (kiemlijn) en uiteindelijk zaden beheersen, is een voorwaarde voor de gerichte manipulatie van plantenreproductie. Met name de engineering van apomixis (asexuele reproductie door zaden) in gewasplanten belooft grote verbeteringen, omdat het leidt tot de vorming van klonale zaden die genetisch identiek zijn aan de moederplant. Bijgevolg zijn de celtypen van de vrouwelijke kiemlijn van groot belang voor het begrijpen en ontwerpen van apomixis. Echter, aangezien de corresponderende cellen diep ingebed zijn in de bloemweefsels, zijn ze erg moeilijk toegankelijk voor experimentele analyses, inclusief celtype-specifieke transcriptomics. Om deze beperking te overwinnen, kunnen secties van individuele cellen worden geïsoleerd door laser-ondersteunde microdissectie (LAM). Hoewel LAM in combinatie met transcriptioneel profilering de identificatie van genen en paden mogelijk maakt die actief zijn in elk celtype met hoge specificiteit, kan het vaststellen van een geschikt protocol een uitdaging zijn. Specifiek kan de kwaliteit van RNA verkregen na LAM worden aangetast, vooral wanneer kleine, enkele cellen worden gericht. Om dit probleem te omzeilen, hebben we een workflow voor LAM opgesteld die reproduceerbaar resulteert in hoge RNA-kwaliteit die goed geschikt is voor transcriptomics, zoals hier geëxemplifieerd door de isolatie van cellen van de vrouwelijke kiemlijn in apomictische Boechera. In dit protocol worden procedures beschreven voor weefselvoorbereiding en LAM, ook met betrekking tot RNA-extractie en kwaliteitscontrole.

Monstervoorbereiding en LAM worden gedaan in opeenvolgende stappen Een aantal opeenvolgende stappen vereist RNA bereiden transcriptionele analyse van geselecteerde celtypen door LAM (figuur 1). Dit begint met de oogst van de bloemen en onmiddellijke fixatie dat de RNA populatie ongewijzigd blijft na de oogst. Het weefsel is ingebed, coupes, en gemonteerd op dia&#39;s. Hierdoor kan de isolatie ...

Hier presenteren we een protocol voor laser-geassisteerde microdissectie van specifieke plantencellen voor transcriptioneel profileren. Hoewel het protocol geschikt is voor verschillende soorten en celtypen, is de focus op zeer ontoegankelijke cellen van de vrouwelijke kiemlijn die belangrijk zijn voor seksuele en apomictische reproductie in het kruisbloemigengeslacht Boechera.

Laser-assisted Microdissection (LAM) als een tool voor Transcriptionele Profiling van individuele cel Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Het algemene doel van dit protocol voor LAM is het isoleren van specifieke plantencellen voor de generatie van RNA met een hoge integriteit voor transcriptionele analyse. De focus ligt op ontoegankelijke cellen, zoals eicellen, in seksuele en apomictische boechera-soorten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de plantontwikkelingsgenetica, zoals de transcriptionele basis die ten grond ligt aan de seksuele en aseksuele plantenreproductie via zaden.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat bepaalde specifieke stijlen kunnen worden uitgevoerd. Hiermee kan het effect van masking van transcripties van zeldzame celtypen bij de analyse van atherogenese-weefsels worden overwonnen. Om deze procedure te starten, vult u met behulp van het instortingsstation een voorverwarmde, nieuwe plastic balanceerschaal met gesmolten paraffine bij 56 °C.Til het deksel van het paraffinebad op en pak telkens één cassette op. Breng een monster over naar de vloeibare paraffine-was van 56 °C in een weegschaalbakje. Werk snel om te voorkomen dat er was rond het monster stolt tijdens het hanteren van de cassette.Positioneer vervolgens het monster volgens het experimentele ontwerp met behulp van een preparatienaal. Herhaal deze procedure totdat alle monsters zijn overgebracht. Om dunne coupes voor LAM voor te bereiden, verwijdert u op een lichttafel de paraffine uit een monster uit de plastic bak.Snijd met een RNase-vrij scheermesje een waxblok uit dat het monster bevat, zoals een knop of bloem. Smelt vervolgens een kleine druppel paraffine op de punt van een spatel. Gebruik de warme wax om het blok met het ingebedde monster op de houder te fixeren.Verwijder het overtollige was rondom het monster met een scheermesje en zorg ervoor dat het blok een vierkant oppervlak heeft met parallelle randen. Stel vervolgens de warmteplaat in op 42 graden Celsius. Bevestig het monster veilig in de microtoom.Bereid coupes van zeven micrometer dikte voor van de cellen van de mature gametofyt van boechera. Plaats vervolgens de 10 tot 15 centimeter lange paraffine-linten in een plastic doos met zwart karton op de bodem voordat ze op de LAM-preparaten worden geplaatst. Om de preparaten voor LAM voor te bereiden, worden vijf tot tien metalen frame-preparaten op de warmteplaat geplaatst met de vlakke zijden naar boven gericht.Pipetteer één tot twee milliliters RNase-vrij water op het plastic gedeelte van de objectglazen. Snijd met een scheermes de paraffinebanden in korte stukjes van ongeveer vier tot vijf centimeter. Lang genoeg om de plastic vensters van de objectglazen te overbruggen.Gebruik vervolgens een pincet en een preparatienaald om de paraffine strips parallel aan elkaar op het plastic venster van de objectglaasjes te plaatsen. Til de objectglaasjes voorzichtig aan één uiteinde op om het water te verwijderen en plaats ze daarna terug. Bedek de verwarmingsplaat met een plastic deksel zonder de objectglaasjes aan te raken, en zorg ervoor dat het plastic deksel luchtuitwisseling mogelijk maakt.Droog de coupes een nacht lang bij 42 °C. Ontwas de coupes onder een zuurkast twee keer in xylol gedurende telkens 10 minuten. Zorg ervoor dat alleen het plastic gedeelte van de coupes wordt ondergedompeld en houd het bredere uiteinde van het metalen frame van elke coupe droog om ze gemakkelijk te kunnen verwijderen.Laat de objectglazen 10 minuten drogen in de zuurkast voorafgaand aan LAM. Zet in deze procedure de computer en de microscoop voor LAM aan. Start vervolgens het programma waarmee de microscoop en de laser worden aangestuurd.Zet de laserbedieningskast aan en schakel de laser in door op de overeenkomstige knop op de bedieningskast te drukken. Plaats vervolgens een dop in de dophouder. Plaats de LAM-preparaatglasplaat op een glazen microscopisch objectglas en zorg ervoor dat het vlakke oppervlak van de plaat waaraan de weefsels zijn bevestigd, naar het objectglas is gericht.Plaats vervolgens het objectglas in het instrument met het glazen dekglas eronder. Positioneer tot slot de dophouder met de dop in het instrument. Selecteer het 4x objectief.Zet in het programma de dop in de bovenste positie. Maak vervolgens een scan van het preparaat. Doorzoek het preparaat en identificeer de structuren van belang.Bepaal de posities nauwkeurig en sla deze op de slide op, zodat er kan worden teruggekeerd naar de exacte positie voor de snijstap. Selecteer vervolgens een geschikt objectief. Verifieer de laserpositie door eenmaal op de knop voor de laserschot te drukken.Bij voorkeur in een deel van het membraan zonder weefsel. Gebruik de handpen-tool, met de dop in de neerwaartse positie, om de grenzen van het celtype of weefsel van belang te markeren. Bijvoorbeeld de eicel.Disseceer het met de laser door op Cut te drukken. Om individuele cellen te isoleren, is het van cruciaal belang dat deze in de juiste secties duidelijk worden geïdentificeerd. Daarnaast moeten de cellen een diameter van ten minste 8 µm hebben om een celtype-specifieke transcriptieanalyse haalbaar te maken.Let op dat het snijden herhaald moet worden als de rand rond de cel niet volledig is gedisseceerd, wat doorgaans op het scherm zichtbaar is. In dat geval wordt aanbevolen om de software standaard zo in te stellen dat er automatisch twee herhalingen van de sectie worden uitgevoerd. Til daarna de dop op en ga naar de volgende opslagpositie met een structuur van belang en disseceer de volgende celsectie totdat alle relevante cellen van één objectglas zijn verzameld.Zorg ervoor dat de dop zodanig is gepositioneerd dat de nieuwe sectie hecht aan een lege positie op de dop. Nadat de relevante celtypen van alle slides zijn geïsoleerd, wordt de slide uit het instrument verwijderd. Zet de dophouder in de neerwaartse positie en inspecteer het dopoppervlak visueel.Gebruik de 4x objectief om aspecifieke contaminaties van het monster uit te sluiten. Sluit vervolgens de dop. Vries de droge coupes in bij -80 °C tot aan verder gebruik.Hier is de schematische tekening van de volwassen vrouwelijke gametofyt. Dit zijn dunne coupes door zaadknopjes met vrouwelijke gametofyten in boechera divaricarpa, waarin eicellen duidelijk identificeerbaar zijn vanwege de karakteristieke morfologie van de vrouwelijke gametofyt. Er werd een vergelijkbare RNA-kwaliteit verkregen bij de analyse van de eicelcoupes in vergelijking met de grotere weefselgebieden die van dezelfde coupes als controles waren geoogst.De bereikte RNA-kwaliteit was geschikt voor celtype-specifieke RNA-sequencing, wat leidde tot de identificatie van 236 genen die tot expressie komen in de apomictische eicel, maar niet in de apomictische centrale cel, synergentencel of apomictische initiële cel. Ook niet in de cellen van de rijpe seksuele gametofyt van arabidopsis thaliana. Andere cel- en weefseltypen van verschillende soorten kunnen worden geprofileerd om aanvullende vragen over ontwikkelingsgenetica te beantwoorden.Zoals de moleculaire basis van imprinting in het endosperm en embryo's van plantenzaden. Na de ontwikkeling van deze techniek wordt de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de ontwikkelingsgenetica en plantenreproductie om de transcriptionele basis van apomictische reproductie in het geslacht Boechera te verkennen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u RNA van goede kwaliteit verkrijgt voor celtype-specifieke transcriptie-analyses met behulp van laser-geassisteerde microdissectie.

laser-assisted-microdissection-lam-as-tool-for-transcriptional

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Laser capture microdissectie van weefsel van zoogdieren

Laser microdissection werd toegepast op de gen expressie profilering te analyseren in specifieke compartimenten van Drosophila vleugel schijf onderworpen aan een gelokaliseerde...

Laser Microdissection Toegepast op gen expressie profilering van de subset van cellen uit de Drosophila Wing Disc

In dit artikel beschrijven we een eenvoudige methode voor het verzamelen van enkele cellen van rat primaire neuronale culturen en de daaropvolgende transcriptoom analyse met behulp van ARNA versterking. Deze aanpak is generaliseerbaar naar een willekeurige cel type.

Transcriptoom Analyse van de individuele cellen

This video describes the technique for obtaining a single cell from a heterogeneous cell population using laser capture microdissection. The single isolated cell can be used for further genomic studies or cancer research.

Single Cell Sampling Using Laser Capture Microdissection: A Technique to Harvest Target Cells from a Heterogeneous Cell Population

We beschrijven hoe laser capture microdissectie (LCM) om verrijkte populaties van hippocampale neuronen of afzonderlijke neuronen vastgezette gewonden rattenhersenen voor daaropvolgende analyse van genexpressie met kwantitatieve real time PCR en / of hele genoom microarrays verkrijgen.

Laser Capture Microdissection van Verrijkt populaties van neuronen of Single Neuronen voor de analyse van genexpressie na traumatisch hersenletsel

De isolatie van individuele dopamine neuronen of het ventrale tegmentale met directe of indirecte immunohistochemie wordt aangetoond met behulp van lasermicrodissectie. Parameters voor isolatie van weefsel uit een glasplaatje met een infrarood laser en van membraansystemen dia met de combinatie van infrarood en ultraviolet laser besproken.

Lasermicrodissectie - Een demonstratie van de Isolatie van individuele dopamineneuronen en de Gehele Ventral tegmentum

Genexpressie analyse van een subset van cellen in een specifiek weefsel vormt een grote uitdaging. In dit artikel wordt beschreven hoe u een hoge kwaliteit totaal RNA van een specifieke cel populatie te isoleren door het combineren van een snelle immunolabeling methode met lasermicrodissectie.

RNA isolatie van de Cel specifieke subpopulaties met behulp van laser-capture Microdissection Gecombineerd met Rapid immunolabeling

Het doel van dit protocol is om laser-capture micro-dissectie te gebruiken als een effectieve methode om pure populaties van celtypen te isoleren uit heterogene prostaatweefsels voor downstream RNA-analyse.

Laser-capture microdissectie van Human Prostatic Epithelium voor RNA-analyse

Dit protocol legt uit hoe je enkele neuronen, microglia's en astrocyten verzamelt uit de centrale kern van de amygdala met hoge nauwkeurigheid en anatomische specificiteit met behulp van lasercapture microdissectie. Daarnaast leggen we ons gebruik van microfluïdeRT-qPCR uit om een subset van het transcriptome van deze cellen te meten.

Laser Capture Microdissectie en Microfluidic qPCR combineren om transcriptieprofielen van enkele cellen te analyseren: een systeembiologiebenadering voor opioïdenafhankelijkheid

Er wordt een protocol beschreven dat lasermicrodissectie gebruikt om individuele nematodenweefsels te isoleren voor RNA-sequencing. Het protocol vereist geen soortspecifieke genetische toolkits, waardoor genexpressieprofielen kunnen worden vergeleken tussen verschillende soorten op het niveau van single-tissue monsters.

Laser microdissectie voor species-agnostische single-tissue toepassingen

Dit protocol beschrijft een high-throughput workflow voor kunstmatige intelligentie-gedreven segmentatie van pathologie-bevestigde gebieden van belang van gekleurde, dunne weefselsectiebeelden voor verrijking van histologie-opgeloste celpopulaties met behulp van lasermicrodissectie. Deze strategie omvat een nieuw algoritme dat de overdracht van afbakeningen die interessante celpopulaties aangeven, rechtstreeks naar lasermicroscopen mogelijk maakt.

Geïndustrialiseerde, kunstmatige intelligentie-geleide lasermicrodissectie voor proteomische analyse op microschaal van de tumormicro-omgeving

Leer laser-geassisteerde microdissectie om specifieke plantencellen te isoleren voor transcriptieanalyse. Deze methode richt zich op vrouwelijke kiemlijn in Boechera-soorten en levert hoogwaardig RNA op.

Laser-assisted Microdissection (LAM) als een tool voor Transcriptionele Profiling van individuele cel Types

Meer video's verkennen