Laser-assisted Microdissection (LAM) als een tool voor Transcriptionele Profiling van individuele cel Types

Het algemene doel van dit protocol voor LAM is het isoleren van specifieke plantencellen voor de generatie van RNA met een hoge integriteit voor transcriptionele analyse. De focus ligt op ontoegankelijke cellen, zoals eicellen, in seksuele en apomictische boechera-soorten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de plantontwikkelingsgenetica, zoals de transcriptionele basis die ten grond ligt aan de seksuele en aseksuele plantenreproductie via zaden.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat bepaalde specifieke stijlen kunnen worden uitgevoerd. Hiermee kan het effect van masking van transcripties van zeldzame celtypen bij de analyse van atherogenese-weefsels worden overwonnen. Om deze procedure te starten, vult u met behulp van het instortingsstation een voorverwarmde, nieuwe plastic balanceerschaal met gesmolten paraffine bij 56 °C.

Til het deksel van het paraffinebad op en pak telkens één cassette op. Breng een monster over naar de vloeibare paraffine-was van 56 °C in een weegschaalbakje. Werk snel om te voorkomen dat er was rond het monster stolt tijdens het hanteren van de cassette.

Positioneer vervolgens het monster volgens het experimentele ontwerp met behulp van een preparatienaal. Herhaal deze procedure totdat alle monsters zijn overgebracht. Om dunne coupes voor LAM voor te bereiden, verwijdert u op een lichttafel de paraffine uit een monster uit de plastic bak.

Snijd met een RNase-vrij scheermesje een waxblok uit dat het monster bevat, zoals een knop of bloem. Smelt vervolgens een kleine druppel paraffine op de punt van een spatel. Gebruik de warme wax om het blok met het ingebedde monster op de houder te fixeren.

Verwijder het overtollige was rondom het monster met een scheermesje en zorg ervoor dat het blok een vierkant oppervlak heeft met parallelle randen. Stel vervolgens de warmteplaat in op 42 graden Celsius. Bevestig het monster veilig in de microtoom.

Bereid coupes van zeven micrometer dikte voor van de cellen van de mature gametofyt van boechera. Plaats vervolgens de 10 tot 15 centimeter lange paraffine-linten in een plastic doos met zwart karton op de bodem voordat ze op de LAM-preparaten worden geplaatst. Om de preparaten voor LAM voor te bereiden, worden vijf tot tien metalen frame-preparaten op de warmteplaat geplaatst met de vlakke zijden naar boven gericht.

Pipetteer één tot twee milliliters RNase-vrij water op het plastic gedeelte van de objectglazen. Snijd met een scheermes de paraffinebanden in korte stukjes van ongeveer vier tot vijf centimeter. Lang genoeg om de plastic vensters van de objectglazen te overbruggen.

Gebruik vervolgens een pincet en een preparatienaald om de paraffine strips parallel aan elkaar op het plastic venster van de objectglaasjes te plaatsen. Til de objectglaasjes voorzichtig aan één uiteinde op om het water te verwijderen en plaats ze daarna terug. Bedek de verwarmingsplaat met een plastic deksel zonder de objectglaasjes aan te raken, en zorg ervoor dat het plastic deksel luchtuitwisseling mogelijk maakt.

Droog de coupes een nacht lang bij 42 °C. Ontwas de coupes onder een zuurkast twee keer in xylol gedurende telkens 10 minuten. Zorg ervoor dat alleen het plastic gedeelte van de coupes wordt ondergedompeld en houd het bredere uiteinde van het metalen frame van elke coupe droog om ze gemakkelijk te kunnen verwijderen.

Laat de objectglazen 10 minuten drogen in de zuurkast voorafgaand aan LAM. Zet in deze procedure de computer en de microscoop voor LAM aan. Start vervolgens het programma waarmee de microscoop en de laser worden aangestuurd.

Zet de laserbedieningskast aan en schakel de laser in door op de overeenkomstige knop op de bedieningskast te drukken. Plaats vervolgens een dop in de dophouder. Plaats de LAM-preparaatglasplaat op een glazen microscopisch objectglas en zorg ervoor dat het vlakke oppervlak van de plaat waaraan de weefsels zijn bevestigd, naar het objectglas is gericht.

Plaats vervolgens het objectglas in het instrument met het glazen dekglas eronder. Positioneer tot slot de dophouder met de dop in het instrument. Selecteer het 4x objectief.

Zet in het programma de dop in de bovenste positie. Maak vervolgens een scan van het preparaat. Doorzoek het preparaat en identificeer de structuren van belang.

Bepaal de posities nauwkeurig en sla deze op de slide op, zodat er kan worden teruggekeerd naar de exacte positie voor de snijstap. Selecteer vervolgens een geschikt objectief. Verifieer de laserpositie door eenmaal op de knop voor de laserschot te drukken.

Bij voorkeur in een deel van het membraan zonder weefsel. Gebruik de handpen-tool, met de dop in de neerwaartse positie, om de grenzen van het celtype of weefsel van belang te markeren. Bijvoorbeeld de eicel.

Disseceer het met de laser door op Cut te drukken. Om individuele cellen te isoleren, is het van cruciaal belang dat deze in de juiste secties duidelijk worden geïdentificeerd. Daarnaast moeten de cellen een diameter van ten minste 8 µm hebben om een celtype-specifieke transcriptieanalyse haalbaar te maken.

Let op dat het snijden herhaald moet worden als de rand rond de cel niet volledig is gedisseceerd, wat doorgaans op het scherm zichtbaar is. In dat geval wordt aanbevolen om de software standaard zo in te stellen dat er automatisch twee herhalingen van de sectie worden uitgevoerd. Til daarna de dop op en ga naar de volgende opslagpositie met een structuur van belang en disseceer de volgende celsectie totdat alle relevante cellen van één objectglas zijn verzameld.

Zorg ervoor dat de dop zodanig is gepositioneerd dat de nieuwe sectie hecht aan een lege positie op de dop. Nadat de relevante celtypen van alle slides zijn geïsoleerd, wordt de slide uit het instrument verwijderd. Zet de dophouder in de neerwaartse positie en inspecteer het dopoppervlak visueel.

Gebruik de 4x objectief om aspecifieke contaminaties van het monster uit te sluiten. Sluit vervolgens de dop. Vries de droge coupes in bij -80 °C tot aan verder gebruik.

Hier is de schematische tekening van de volwassen vrouwelijke gametofyt. Dit zijn dunne coupes door zaadknopjes met vrouwelijke gametofyten in boechera divaricarpa, waarin eicellen duidelijk identificeerbaar zijn vanwege de karakteristieke morfologie van de vrouwelijke gametofyt. Er werd een vergelijkbare RNA-kwaliteit verkregen bij de analyse van de eicelcoupes in vergelijking met de grotere weefselgebieden die van dezelfde coupes als controles waren geoogst.

De bereikte RNA-kwaliteit was geschikt voor celtype-specifieke RNA-sequencing, wat leidde tot de identificatie van 236 genen die tot expressie komen in de apomictische eicel, maar niet in de apomictische centrale cel, synergentencel of apomictische initiële cel. Ook niet in de cellen van de rijpe seksuele gametofyt van arabidopsis thaliana. Andere cel- en weefseltypen van verschillende soorten kunnen worden geprofileerd om aanvullende vragen over ontwikkelingsgenetica te beantwoorden.

Zoals de moleculaire basis van imprinting in het endosperm en embryo's van plantenzaden. Na de ontwikkeling van deze techniek wordt de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de ontwikkelingsgenetica en plantenreproductie om de transcriptionele basis van apomictische reproductie in het geslacht Boechera te verkennen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u RNA van goede kwaliteit verkrijgt voor celtype-specifieke transcriptie-analyses met behulp van laser-geassisteerde microdissectie.