Met behulp van Light Sheet fluorescentiemicroscopie met Afbeelding zebravis Eye Development
10 april 2016
Lichtbladfluorescentiemicroscopie is een uitstekend hulpmiddel voor het beeldvormen van embryonale ontwikkeling. Het maakt het mogelijk om lange time-lapse films van levende embryo's op te nemen in bijna fysiologische omstandigheden. We demonstreren de toepassing ervan voor het beeldvormen van de oogontwikkeling van zebravissen over brede ruimtelijk-temporele schalen en presenteren een pijplijn voor het samenvoegen en deconvolutie van multiview datasets.
Het algemene doel van dit experimentele protocol is om de ontwikkeling van het oog van het Zebravis-embryo in de lichtbladmicroscoop te beeldvormen en de verworven multiview-dataset in Figi te verwerken via de multiview-reconstructietoepassing plug-in. Deze methode kan u helpen om morfogenetische gebeurtenissen in de ontwikkeling van dieren te begrijpen. Het grootste voordeel van deze methode is dat u morfogenetische gebeurtenissen in het zich ontwikkelende intacte embryo met hoge ruimtelijke en temporele resolutie kunt observeren.
Het grootste voordeel van lichtbladmicroscopie is de lage fototoxiciteit van de methode, de snelle verwervingstijd waarmee u het monster kunt beeldvormen en dat u het monster vanuit verschillende hoeken, zogenaamde weergaven, kunt beeldvormen. Het vastleggen van het monster vanuit verschillende weergaven stelt ons in staat om de degradatie van het signaal en de ingestelde as te overwinnen. Deze verschillende beelden kunnen vervolgens worden gebruikt en geregistreerd met behulp van fluorescente microsferen rond het monster.
We kunnen het driedimensionale volume reconstrueren dat de isotrope resolutie bereikt. Hoewel we het gebruik van lichtbladfluorescentiemicroscopie voor Zebravisoogontwikkeling demonstreren, kan deze methode ook worden gebruikt om verschillende vragen in de ontwikkelingsbiologie en neurowetenschappen te beantwoorden met behulp van verschillende modelorganismen. Om te beginnen, schroeven de detectieobjectief in de microscoop terwijl de verlichtende objectieven bedekt blijven.
Vervolgens verwijdert u de objectieven en schuift u de monsterschaal voorzichtig in de microscoop. Bevestig de kamer door de schroef vast te draaien. Verbind vervolgens de temperatuursensor en het peltierblok met de microscoop.
De twee buizen die het koelvloeistof circuleren voor het peltierblok zijn compatibel met beide connectoren en kunnen in beide richtingen werken. Gebruik vervolgens een spuit om de kamer door de spuit met oplossing tot aan de bovenrand van de kamervensters te laden en controleer op lekken. Schakel nu de microscoop, de computer en de incubatie in.
Start de microscoopbedieningssoftware en stel de incubatietemperatuur in op 28,5 graden Celsius. Terwijl de temperatuur gedurende een uur wordt aangepast, bereidt u het monster voor. Begin met het voorbereiden van de agarose.
Smelt een voorbereide milliliter 1% lage smeltpunt agarose in E drie medium op 70 graden Celsius. Na ongeveer 15 minuten, brengt u 600 microliter gesmolten agarose over in een verse 1,5 milliliter buis en voegt u 250 microliter E drie medium, 50 microliter 0,4% MS 222 en 25 microliter vortex fluorescente kralen stockoplossing toe. Plaats de buis in een verwarmingsblok op ongeveer 39 graden Celsius om de agarose zijn geleerde punt te laten benaderen.
Druk vervolgens teflon-tipped zuigers naar de bodem van een glas capillair met een binnendiameter van één millimeter. Bereid er vijf van voor. Vorm nu kort de agarosemixtuur en breng vervolgens vijf embryo's met de minimale hoeveelheid vloeistof erin over.
Breng vervolgens een capillair in en aspireer een embryo hoofd voor. Het hoofd moet binnenkomen voordat de staart en er mogen geen luchtbellen zijn. Trek voldoende oplossing op zodat er ongeveer twee centimeter agarose boven het embryo en een centimeter agarose eronder is.
Breng één embryo in elke capillair aan voordat u verder gaat. Deze stap vereist enige oefening om onder de knie te krijgen. Bereid u erop voor met niet-waardevolle embryo's.
Wanneer de agarose volledig is gestold, bewaar de monsters in E drie medium door de capillairen te ondersteunen op een bekerwand met plasticine met de onderste opening in oplossing. Monteer nu de monsterhouder. Plaats eerst twee plastic hulzen van de juiste maat tegen elkaar in de spil.
De sleuven op de hulzen moeten naar buiten wijzen. Bevestig vervolgens een klemschroef. En steek de capillair door de houder totdat de zwarte kleurband aan de andere kant zichtbaar wordt.
Rak de zuiger niet aan. Draai vervolgens de klemschroef vast. Druk vervolgens een centimeter agarose uit de capillair en snijd het af.
Breng vervolgens de spil in de monsterhouder schijf. Controleer voordat u de monsterschijf laadt of de trap in de controlesoftware op de bovenste positie staat. Gebruik vervolgens geleiderails om de houder en het monster in de microscoop te glijden.
Beeld nu het gekozen monster af zoals beschreven in de tekstprotocol. De gegevensverwerking gebeurt in Figi. Het is een distributie van ImageJ.
Voordat u begint, moet Figi worden bijgewerkt. Sla de verworven beeldgegevensset op in een enkele map. De tussenbestanden van de beeldverwerking worden opgeslagen in dezelfde map.
Start nu de multiview-reconstructietoepassing. Definieer vervolgens een nieuwe gegevensset. Selecteer de optie Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset LOCI Bioformats en maak een naam voor het uitvoergegevensbestand.
Selecteer vervolgens het eerste CZI-bestand van de gegevensset. De metagegevens worden automatisch geladen. Controleer in de beeldmetagegevens nogmaals of het aantal hoeken, de kanalen, de verlichtingen en de voxelgrootte allemaal correct zijn ingesteld.
Na het indrukken van OK, worden een logvenster, het venster van de viewset up explorer en een consolevenster geopend. De viewset up explorer biedt een gebruiksvriendelijke interface. Selecteer de bestanden die moeten worden verwerkt en druk op de rechtermuisknop.
Er wordt een nieuw venster geopend met de verschillende verwerkingsstappen zoals deze worden uitgevoerd. In de rechterbovenhoek bevinden zich de knoppen info en opslaan. Info geeft een samenvatting weer van de inhoud van het opgeslagen gegevensbestand en door op opslaan te drukken, worden de verwerkingsresultaten opgeslagen.
Het programma slaat anders de resultaten van de verwerkingsstappen niet op. Om de volledige gegevensset opnieuw op te slaan, selecteert u eerst alle bestanden door op Ctrl+A te drukken en met een klik op de rechtermuisknop. Selecteer vervolgens Gegevensset opnieuw opslaan en Als HDF5.
Een bevestiging van de opnieuw opslaage actie moet vervolgens worden afgevinkt. Na een paar minuten, voor el
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het beeldvormen van de oogontwikkeling van zebravissen met behulp van lichtbladfluorescentiemicroscopie. De methode maakt hoge-resolutie beeldvorming van levende embryo's mogelijk, waardoor onderzoekers morfogenetische gebeurtenissen in real-time kunnen observeren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Lichtbladfluorescentiemicroscopie biedt lage fototoxiciteit en snelle acquisitietijden.
- Deze techniek maakt beeldvorming vanuit meerdere hoeken mogelijk om de gegevenskwaliteit te verbeteren.
- Het is toepasbaar op verschillende modelorganismen buiten de zebravis.
Doel van het onderzoek
- Om de oogontwikkeling van zebravisembryo's te visualiseren en te analyseren.
- Om een pipeline voor het verwerken van multiview datasets te demonstreren.
- Om het begrip van ontwikkelingsprocessen in embryo's te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van zebravisembryo's in agarose voor beeldvorming.
- Gebruik van een lichtbladmicroscoop voor het vastleggen van beelden.
- Gegevensverwerking met behulp van Figi en de multiview reconstructietoepassing.
- Registratie van beelden met behulp van fluorescerende microspheres.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van de oogontwikkeling van zebravissen met hoge ruimtelijke en temporele resolutie.
- Reconstructie van driedimensionale volumes uit multiview datasets.
- Demonstratie van de veelzijdigheid van de methode voor verschillende vragen in de ontwikkelingsbiologie.
Conclusies
- Lichtbladmicroscopie is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van embryonale ontwikkeling.
- Het protocol kan worden aangepast voor verschillende modelorganismen en onderzoeksvragen.
- Deze methode verbetert ons begrip van morfogenetische gebeurtenissen in levende embryo's.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Light sheet fluorescence microscopy enables high-resolution, low-phototoxicity imaging of live zebrafish embryos, supporting real-time observation of morphogenetic events in developmental biology. This capability enhances target validation by providing quantitative, multi-scale phenotypic data from intact organisms, reducing reliance on endpoint assays. The method supports mechanistic de-risking in early discovery by allowing longitudinal tracking of cellular behaviors and tissue dynamics relevant to disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through visualization of morphogenetic processes in developing tissues.
- Operational Value: Supports functional target validation by linking genetic or pharmacological perturbations to phenotypic outcomes in vivo.
- Predictive Value: Improves confidence in target relevance by capturing dynamic, spatially resolved biological responses over time.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, multi-view datasets suitable for high-content analysis of developmental phenotypes.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible imaging workflows using commercial light sheet microscopes and open-source processing pipelines.
- Scalability: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream compound screening and target engagement studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides disease-relevant system insights by imaging conserved developmental pathways across model organisms.
- Mechanistic De-risking: Allows monitoring of intracellular structures and cell behaviors over extended periods, supporting preclinical validation of target modulation.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by enabling longitudinal assessment of therapeutic effects on tissue morphogenesis and cellular dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and phenotypic screening in vertebrate models, with outputs feeding into lead identification and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking through high-resolution, time-lapse imaging of developing tissues.
- Screening: Enables assay readiness via standardized embryo mounting, multi-view acquisition, and reproducible data processing using Fiji-based plugins.
- Analytics: Generates quantitative 3D reconstructions and isotropic voxel data that facilitate comparison of structural and dynamic phenotypes across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by imaging conserved processes such as optic cup formation and retinal ganglion cell migration relevant to human disease.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable imaging platform adaptable to diverse developmental biology and neuroscience questions beyond zebrafish eye development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in developmental phenotypes through direct visualization.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility via defined mounting, imaging, and multiview registration protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of phenotypic liabilities, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by providing longitudinal, quantitative readouts on target modulation in intact developing systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, agarose embedding, and fluorescent sample preparation.
- Dependent on access to commercial light sheet microscopes and computational resources for terabyte-scale multiview data processing.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters, file naming, and metadata handling for reproducible multi-view reconstruction.
- Involves adaptation considerations when transferring the protocol to other model organisms or tissue types due to variations in size, opacity, and developmental timing.
- Limited by storage and processing demands; requires advance planning for data management and pipeline scalability.
