Name: Met behulp van Light Sheet fluorescentiemicroscopie met Afbeelding zebravis Eye Development (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: Leer lichtveld fluorescentiemicroscopie voor het bestuderen van oogontwikkeling bij zebrafishembryo's met hoge resolutie. Deze methode maakt real-time observatie van morfogenetische processen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Tobias Pietzsch bedanken voor het verstrekken van zijn krachtige open source software BigDataViewer. We danken de Light Microscopy Facility van het Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG), namelijk Jan Peychl, Sebastian Bundschuh en Davide Accardi voor technische assistentie, perfecte onderhoud van de microscopen die in het onderzoek zijn gebruikt en voor opmerkingen over het manuscript en H. Moon (MPI-CBG Scientific Computing Facility) voor de BigDataServer. We danken Julia Eichhorn voor het samenstellen van Movie 1. De Norden lab-leden en Svea Grieb gaven veel nuttige opmerkingen over het manuscript. Jaroslav Icha, Christopher Schmied en Jaydeep Sidhaye zijn leden van de International Max Planck Research School for Cell, Developmental and Systems Biology en doctoraalstudenten aan TU Dresden. Pavel Tomancak wordt ondersteund door de ERC Starting Grant: Quantitative Analysis of the Hourglass Model of Evolution of Development en Human Frontier Science Program Young Investigator grant RGY0093/2012. Caren Norden wordt ondersteund door de Human Frontier Science Program (CDA-00007/2011) en de German Research Foundation (DFG) [SFB 655, A25].

<ol><li>Pantazis, P., Supatto, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+whole-embryo+imaging%3A+a+quantitative+transition+is+underway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 327-339 (2014).</li>
<li>Truong, T. V., Supatto, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+high-content%2Fhigh-throughput+imaging+and+analysis+of+embryonic+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Toward high-content/high-throughput imaging and analysis of embryonic morphogenesis.</a> Genesis. 49 (7), 555-569 (2011).</li>
<li>Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Morphogenesis%3A+Technological+Advances+and+Biological+Insights%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging Morphogenesis: Technological Advances and Biological Insights.</a> Science. 340 (6137), 1234168-1234168 (2013).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal-plane+fluorescence+optical+sectioning%3A+three-dimensional+imaging+of+macroscopic+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens.</a> J Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).</li>
<li>Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+phototoxicity+during+the+development+of+a+zebrafish+craniofacial+bone+using+confocal+and+light+sheet+fluorescence+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophoton%22%5BJournal%5D)">Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques.</a> J Biophoton. 6 (11-12), 920-928 (2012).</li>
<li>Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+quantitative+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology.</a> Nat Meth. 12 (1), 23-26 (2015).</li>
<li>Chen, B. C., Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+light-sheet+microscopy%3A+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).</li>
<li>Keller, P. J., Ahrens, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Whole-Brain+Activity+and+Development+at+the+Single-Cell+Level+Using+Light-Sheet+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Visualizing Whole-Brain Activity and Development at the Single-Cell Level Using Light-Sheet Microscopy.</a> Neuron. 85 (3), 462-483 (2015).</li>
<li>Pampaloni, F., Chang, B. -J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet-based+fluorescence+microscopy+%28LSFM%29+for+the+quantitative+imaging+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM) for the quantitative imaging of cells and tissues.</a> Cell Tissue Res. 360 (1), 129-141 (2015).</li>
<li>Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Light sheet microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeber%2C+M+%22Quantitative+Imaging+in+Cell+Biology%22">Quantitative Imaging in Cell Biology</a>. , Elsevier Inc. 193-215 (2014).</li>
<li>Strobl, F., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+long-term+fluorescence+live+imaging+of+Tribolium+castaneum+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos.</a> Development. 141 (11), 2361-2361 (2014).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li>
<li>Maizel, A., von Wangenheim, D., Federici, F., Haseloff, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+live+imaging+of+plant+growth+in+near+physiological+bright+conditions+using+light+sheet+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">High-resolution live imaging of plant growth in near physiological bright conditions using light sheet fluorescence microscopy.</a> Plant J. 68 (2), 377-385 (2011).</li>
<li>Swoger, J., Muzzopappa, M., Lòpez-Schier, H., Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4D+retrospective+lineage+tracing+using+SPIM+for+zebrafish+organogenesis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophoton%22%5BJournal%5D)">4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies.</a> J Biophoton. 4 (1-2), 122-134 (2010).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li>
<li>Wu, Y., Ghitani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+%28iSPIM%29+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (43), 17708-17713 (2011).</li>
<li>Sarov, M., Barz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+resource+for+the+analysis+of+protein+localisation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila.</a> bioRxiv. , 028308(2015).</li>
<li>Amat, F., Lemon, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+accurate+reconstruction+of+cell+lineages+from+large-scale+fluorescence+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data.</a> Nat Meth. 11 (9), 951-958 (2014).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nat Meth. 7 (6), 418-419 (2010).</li>
<li>Preibisch, S., Rohlfing, T., Hasak, M. P., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaicing+of+single+plane+illumination+microscopy+images+using+groupwise+registration+and+fast+content-based+image+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22SPIEMed+Imaging%22%5BJournal%5D)">Mosaicing of single plane illumination microscopy images using groupwise registration and fast content-based image fusion.</a> SPIEMed Imaging. 6914, 69140E(2008).</li>
<li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nat Meth. 12 (1), 30-34 (2015).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Scanned+Laser+Light-Sheet+Fluorescence+Microscopy+%28DSLM%29+of+Zebrafish+and+Drosophila+Embryonic+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Digital Scanned Laser Light-Sheet Fluorescence Microscopy (DSLM) of Zebrafish and Drosophila Embryonic Development.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (10), (2011).</li>
<li>Pinto-Teixeira, F., Muzzopappa, M., Swoger, J., Mineo, A., Sharpe, J., Lòpez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+hair-cell+development+and+regeneration+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of hair-cell development and regeneration in the zebrafish.</a> Front Neuroanat. , (2013).</li>
<li>Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+zebrafish+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22METHODS%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of zebrafish embryogenesis.</a> METHODS. , 1-11 (2013).</li>
<li>Pitrone, P. G., Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenSPIM%3A+an+open-access+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform.</a> Nat Meth. 10 (7), 598-599 (2013).</li>
<li>Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijò, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenSpinMicroscopy%3A+an+open-source+integrated+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform.</a> Nat Meth. 10 (7), 599-600 (2013).</li>
<li>Martinez-Morales, J. R., Rembold, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ojoplano-mediated+basal+constriction+is+essential+for+optic+cup+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ojoplano-mediated basal constriction is essential for optic cup morphogenesis.</a> Development. 136 (13), 2165-2175 (2009).</li>
<li>Strzyz, P. J., Lee, H. O., Sidhaye, J., Weber, I. P., Leung, L. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interkinetic+Nuclear+Migration+Is+Centrosome+Independent+and+Ensures+Apical+Cell+Division+to+Maintain+Tissue+Integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Interkinetic Nuclear Migration Is Centrosome Independent and Ensures Apical Cell Division to Maintain Tissue Integrity.</a> Dev Cell. 32 (2), 203-219 (2015).</li>
<li>Young, L. K., Jarrin, M., Saunter, C. D., Quinlan, R., Girkin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+SPIM+to+track+the+development+of+the+focal+power+of+the+zebrafish+lens%5BTitle%5D)+AND+%22SPIE+BiOS%22%5BJournal%5D)">Using SPIM to track the development of the focal power of the zebrafish lens.</a> SPIE BiOS. 9334, 933408(2015).</li>
<li>Preibisch, S., Amat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Bayesian-based+multiview+deconvolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Efficient Bayesian-based multiview deconvolution.</a> Nat Meth. 11 (6), 645-648 (2014).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BigDataViewer%3A+visualization+and+processing+for+large+image+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets.</a> Nat Meth. 12 (6), 481-483 (2015).</li>
<li>Brown, M., Lowe, D. G. Invariant Features from Interest Point Groups. Proceedings of the British Machine Vision Conference. , BMVA Press. 23.1-23.10 (2002).</li>
<li>Saalfeld, S., Fetter, R., Cardona, A., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+volume+reconstruction+from+series+of+ultra-thin+microscopy+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Elastic volume reconstruction from series of ultra-thin microscopy sections.</a> Nat Meth. 9 (7), 717-720 (2012).</li>
<li>Fischler, M. A., Bolles, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+sample+consensus%3A+a+paradigm+for+model+fitting+with+applications+to+image+analysis+and+automated+cartography%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+ACM%22%5BJournal%5D)">Random sample consensus: a paradigm for model fitting with applications to image analysis and automated cartography.</a> Commun ACM. 24 (6), 381-395 (1981).</li>
<li>Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. -B., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+and+orientation+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo.</a> Neural Dev. 1 (1), 2(2006).</li>
<li>Stepanova, T., Slemmer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+%28end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> J Neurosci. 23 (7), 2655-2664 (2003).</li>
<li>Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+Mounting+for+Long-term+Light+Sheet+Microscopy+of+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish.</a> J Vis Exp. (84), e51119(2014).</li>
<li>Udan, R. S., Piazza, V. G., Hsu, C. W., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+cell+dynamics+in+mouse+embryos+using+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy.</a> Development. 141 (22), 4406-4414 (2014).</li>
<li>Ichikawa, T., Nakazato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+and+quantitative+analysis+of+gastrulation+in+mouse+embryos+using+light-sheet+microscopy+and+3D+tracking+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging and quantitative analysis of gastrulation in mouse embryos using light-sheet microscopy and 3D tracking tools.</a> Nat Protoc. 9 (3), 575-585 (2014).</li>
<li>Schmied, C., Stamataki, E., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+solutions+for+SPIMage+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Open-source solutions for SPIMage processing.</a> Methods Cell Biol. 123, 505-529 (2014).</li>
<li>Schmied, C., Steinbach, P., Pietzsch, T., Preibisch, S., Tomancak, P. An automated workflow for parallel processing of large multiview SPIM recordings. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://arxiv.org/abs/1507.08575">http://arxiv.org/abs/1507.08575</a> (2015).</li>
<li>Amat, F., Höckendorf, B., Wan, Y., Lemon, W. C., McDole, K., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+processing+and+analysis+of+large-scale+light-sheet+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1679-1696 (2015).</li>
<li>Schmid, B., Shah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+panoramic+light-sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nat Commun. 4, 1-10 (2013).</li>
<li>Gualda, E. J., Pereira, H., Vale, T., Estrada, M. F., Brito, C., Moreno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIM-fluid%3A+open+source+light-sheet+based+platform+for+high-throughput+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">SPIM-fluid: open source light-sheet based platform for high-throughput imaging.</a> Biomed Opt Express. 6 (11), 4447-4456 (2015).</li>
<li>McGorty, R., Liu, H., Kamiyama, D., Dong, Z., Guo, S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-top+selective+plane+illumination+microscope+for+conventionally+mounted+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens.</a> Opt Express. 23 (12), 16142-16153 (2015).</li>
<li>Jemielita, M., Taormina, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Features+of+the+Growth+of+a+Bacterial+Species+Colonizing+the+Zebrafish+Gut%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Features of the Growth of a Bacterial Species Colonizing the Zebrafish Gut.</a> mBio. 5 (6), e01751-14-8(2014).</li>
</ol>

Publicatie van deze video-artikel wordt ondersteund door Zeiss.

Morfogenese is het proces dat het embryo en vormen samen met de groei en differentiatie drijft de ontogenie van een bevruchte eicel tot een volwassen meercellig organisme. Het morfogenetische processen tijdens dierlijke ontwikkeling kan het best worden geanalyseerd door beeldvorming van intacte levende exemplaren 1-3. Dit is omdat dergelijke gehele embryo beeldvorming behoudt alle componenten die drijven en ontwikkeling reguleren inclusief gradiënten van signaalmoleculen, extracellulaire matrix, vaatstelsel, innervatie en mechanische eigenschappen van het omringende weefsel. Om de weegschaal, waarbij morfogenese optreedt overbruggen, de snelle subcellulaire gebeurtenissen moeten worden vastgelegd op een minuut tijdschaal in het kader van de ontwikkeling van het hele weefsel dan uren of dagen. Om al deze eisen te voldoen, een moderne uitvoering 4 van de orthogonale vliegtuig verlichting microscoop 5 werd ontwikkeld. Oorspronkelijk werd het genoemd de Selectieve Plane Verlichting Microscopy (SPIM) 4; nu een allesomvattende term Light Sheet fluorescentiemicroscopie (LSFM) wordt meestal gebruikt. LSFM maakt beeldvorming met een hoge tijdsresolutie, terwijl het induceren van minder fototoxiciteit dan laser scanning of draaiende schijf confocale microscoop 6,7. Tegenwoordig zijn er al veel implementaties van de basis lichtwaaier verlichting principe en het is gebruikt om een grote verscheidenheid van monsters en processen voorheen ontoegankelijke onderzoekers 8-11. We zouden graag eerst een aantal belangrijke voordelen van LSFM ten opzichte van conventionele confocale microscopie benaderingen te benadrukken: Zinvolle resultaten van levende microscopische beeldvorming experimenten te verkrijgen, is het belangrijk dat de waarneming slechts minimaal het monster beïnvloedt. Veel organismen zoals zebravis zijn zeer gevoelig voor blootstelling aan laserlicht, waardoor het moeilijk om deze afbeelding in een confocale microscoop met hoge tijdsresolutie zonder fototoxiciteit effecten zoals vastgelopen of vertraagde ontwikkeling 6,7. LSFM is momenteel de fluorescentie beeldvormende techniek met de minste verstoring van de het monster 7. Aangezien de dunne plaat laserlicht belicht alleen het gedeelte van het specimen dat wordt afgebeeld op een bepaald tijdstip, het licht plaat microscoop gebruikt fotonen zeer efficiënt. Bijgevolg is de lage blootstelling aan licht zorgt voor een langere time-lapse observaties van gezonder exemplaren, bijvoorbeeld 12-17. Verder dankzij de minimale invasiviteit van LSFM, het aantal verkregen beelden wordt niet meer bepaald door hoeveel licht het monster kan verdragen, maar door de hoeveelheid gegevens kan worden verwerkt en opgeslagen. In dezelfde lijn van het houden van het model in de buurt van fysiologische omstandigheden, LSFM komt met alternatieve monster montage strategieën goed geschikt voor live-embryo&#39;s. In LSFM technieken worden de embryo&#39;s gewoonlijk ingebed in een dunne kolom lage percentage agarose. de mounting agarose in cilinders maakt de volledige vrijheid van rotatie, zodat het monster kan worden waargenomen vanaf de perfecte hoek (in LSFM aangeduid als view) en vanuit verschillende aanzichten tegelijk. De multiview imaging en de daaropvolgende multiview fusie is vooral gunstig voor grote, verstrooiing exemplaren en maakt het vastleggen van hen met een hoge, isotrope resolutie. Een overzicht van de andere mogelijke LSFM montage strategieën kunnen worden gevonden in de officiële microscoop handleiding, in het hoofdstuk over monstervoorbereiding geschreven door het lab van E. Reynaud. Het verdient aanbeveling lezen, vooral wanneer het doel is om het verschillende monsters als hier beschreven. Het beeld acquisitie in LSFM is breed veld, camera-gebaseerde, in tegenstelling tot laser scanning confocale microscoop. Dit resulteert in een hogere signaal-ruisverhouding (SNR) voor de verkregen beelden en kan zeer snel zijn (tientallen tot honderden frames per seconde). De hoge gevoeligheid van LSFM maakt verdere beeldvorming van zwak fluorescerende samples, zoals transcriptiefactoren geuit op endogene niveaus 18 of, in de nabije toekomst, endogene eiwitten gelabeld met behulp van CRISPR / Cas9. De hoge SNR is ook belangrijk voor een succesvolle downstream beeldanalyse. De hoge snelheid is niet alleen noodzakelijk om snelle intracellulaire processen te vangen, maar ook het gehele beeld embryo uit meerdere weergaven snel genoeg. Een naadloze fusie van de verschillende standpunten kan alleen worden bereikt als de waargenomen verschijnsel niet veranderen tijdens verwerving van deze verschillende z stacks afkomstig van aparte uitzicht. De voordelen van LSFM meestal niet ten koste van de beeldkwaliteit. De laterale resolutie van LSFM is iets slechter dan de resolutie van een confocale microscoop. Dit komt doordat de detectie doelen voor LSFM lagere numerieke apertuur (gewoonlijk 1,0 of minder) ten opzichte van 1,2-1,3 water of silicium immersie doelstellingen op standaard confocale setups. Bovendien, als gevolg van het brede veld detectie in LSFM (afwezigheid opce van een pinhole), is er meer out-of-focus licht in vergelijking met een confocale microscoop. Het bedrag van de out-of-focus licht wordt bepaald door het licht plaatdikte. Desalniettemin worden de nadelen gecompenseerd door de hogere SNR in LSFM. In de praktijk resulteert dit in soortgelijke kwaliteitsbeelden vergelijking met bijvoorbeeld draaiende schijf confocale acquisitie 15. Bijgevolg is dit maakt betrouwbare extractie van functies, zoals celmembranen of kernen, bijvoorbeeld voor cellijn tracing 15,19. De axiale resolutie van LSFM wordt bepaald, naast de detectie doel, door het licht plaatdikte. De axiale resolutie kan LSFM in sommige gevallen overtreffen de resolutie van de confocale microscoop. Ten eerste, de verbetering van de resolutie komt wanneer de lichtwaaier dunner is dan de axiale resolutie van het detectiesysteem doel is meestal het geval voor grote preparaten afgebeeld met een doelstelling lage vergroting. De tweede manier, waarop de LSFM kan ACHieve betere axiale resolutie, is de multiview fusie, waarbij de hoge resolutie xy informatie vanuit verschillende standpunten wordt gecombineerd tot één beeld stack. De resulterende samengevoegde stapel heeft een isotrope resolutie naderen de waarden van de resolutie in de dwarsrichting 20,21. De strategie voor het registreren van de meerdere beelden op elkaar hier beschreven is gebaseerd op het gebruik van fluorescerende polystyreenkorrels als fiduciaire markers ingebed in agarose rond het monster 20,21. Door de LSFM commercialisering deze techniek nu onder grote groepen wetenschappers 22. Daarom is de motivatie voor het schrijven van dit protocol is om deze technologie toegankelijk te maken ontwikkelingsstoornissen biologen weinig praktijkervaring in LSFM te maken en om deze wetenschappers begonnen met het gebruik van deze technologie met hun monsters. Ons protocol maakt gebruik van de commerciële licht plaat microscoop, die een conceptueel eenvoudige microscoop t vormthoed is eenvoudig te bedienen. We willen bovendien graag vermelden andere recente protocollen voor het afbeelden van de zebravis met zelfgebouwde LSFM setups, die geschikt zijn om bepaalde vragen te beantwoorden 23-25 ​​zou kunnen zijn. Een andere optie om toegang LSFM zijn de open platforms 26,27, waarbij het ​​open access principes gebruiken om het licht plaat microscopie om een bredere gemeenschap. De documentatie van zowel de hardware als de software aspecten is te vinden op http://openspim.org en https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/. In dit protocol gebruiken we de beenvissen zebravis als een modelsysteem voor de ontwikkelingsprocessen met LSFM bestuderen. Morfogenese van de zebravisoog is een voorbeeld dat veel van de voordelen van LSFM onderstreept. LSFM is reeds in het verleden gebruikt om te onderzoeken ontwikkeling oog in medaka 28 en in de zebravis 29,30. In een vroeg ontwikkelingsstadium oog is ingewikkeld om het embryo juiste richting conventionele microscopie,als de omvangrijke dooier staat niet toe dat de embryo om aan de kant te liggen met zijn ogen geconfronteerd met de doelstelling. Echter, met LSFM inbouw in een agarose kolom, kan het monster reproduceerbaar gepositioneerd worden. Bovendien, bij de overgang van optische vesikel aan de optische kop fase het oog ingrijpende morfogenetische herschikkingen gepaard met groei, die vereist het vastleggen van een grote stapel z en een groot gezichtsveld. Ook voor deze uitdagingen LSFM superieur aan conventionele confocale beeldvorming. Het proces van vorming optische kop driedimensionaal, daarom is het moeilijk te begrijpen en uitsluitend visualiseren beeldvorming van een oog. Dit maakt multiview beeldvorming met isotrope resolutie gunstig. Na vorming optische kop, de retina steeds gevoeliger voor laserbelichting. Dus de lage fototoxiciteit geassocieerd met LSFM is een groot voordeel voor langdurige beeldvorming. Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor beeldvorming van 1-3 dagen oude zebravis embryo eennd larven met de nadruk op het oog ontwikkeling. Onze methode maakt het vastleggen van time-lapse filmpjes met betrekking tot 12-14 uur met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Belangrijker laten we ook een pijpleiding voor gegevensverwerking, die een essentiële stap in LSFM, aangezien deze techniek altijd genereert grote datasets, vaak terabytes bereik.

<table><tbody><tr><td>Lightsheet Z.1 microscoop</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose met laag smeltpunt</td><td>Roth</td><td>6351.1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose met laag smeltpunt</td><td>Sigma</td><td>A4018 of A9414</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat (MESAB/MS-222/Tricaine)</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>N-Fenylthioureum (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>500 nm rode fluorescente kralen F-Y 050</td><td>Millipore (Estapor)</td><td>80380495</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu;l (1&nbsp;mm binnendiameter, zwart gemarkeerd) capillaire buisjes</td><td>Brand</td><td>701904</td><td>verkocht als reserveonderdeel voor transferpettor</td></tr><tr><td>Teflon tip zuigers voor 20&nbsp;&mu;l capillaire buisjes</td><td>Brand</td><td>701932</td><td>verkocht als reserveonderdeel voor transferpettor</td></tr><tr><td>Ronde glazen dekglasjes diameter 18 mm, geselecteerde dikte 0.17&nbsp;mm</td><td>Thermo scientific (Menzel-Glaser)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O-ringen voor kamervensters 17&times;1.5 mm</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pincet, model 55</td><td>Dumont</td><td>0209-55-PO</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Luer-Lock spuiten</td><td>Becton Dickinson</td><td>300865</td><td></td></tr><tr><td>150 cm verlengkabel voor infusie compatibel met Luer-Lock spuiten</td><td>Becton Dickinson</td><td>397400</td><td></td></tr><tr><td>Links</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Link 1 Multiview reconstructie applicatie</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration">https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration</a> <a href="http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction">http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction</a></td></tr><tr><td>Link 2 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer">https://github.com/bigdataviewer</a></td></tr><tr><td>Link 3 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td><a href="http://fiji.sc/BigDataViewer">http://fiji.sc/BigDataViewer</a></td></tr><tr><td>Link 4 Multiview reconstructie applicatie-problemen</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues">https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues</a></td></tr><tr><td>Link 5 BigDataViewer-problemen</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues">https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues</a></td></tr><tr><td>Link 6 BigDataServer</td><td></td><td></td><td><a href="http://fiji.sc/BigDataServer">http://fiji.sc/BigDataServer</a></td></tr></tbody></table>

met behulp van light sheet fluorescentiemicroscopie met afbeelding zebravis eye development

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Lichtbladfluorescentiemicroscopie (LSFM) wint steeds meer aan populariteit als methode om de embryonale ontwikkeling te beeldhouwen. De belangrijkste voordelen van LSFM in vergelijking met confocale systemen zijn de lage fototoxiciteit, zachte montagestrategieën, snelle acquisitie met een hoog signaal-ruisverhouding en de mogelijkheid om monsters gedurende lange perioden vanuit verschillende hoeken (uitzichten) te beeldhouwen. Beeldvorming vanuit meerdere uitzichten ontsluit het volledige potentieel van LSFM, maar tegelijkertijd kan het datasets van terabyte-formaat creëren. Het verwerken van dergelijke datasets is de grootste uitdaging bij het gebruik van LSFM. In dit protocol schetsen we enkele oplossingen voor dit probleem. Tot voor kort werd LSFM meestal uitgevoerd in laboratoria die de expertise hadden om hun eigen lichtbladmicroscopen te bouwen en te bedienen. De laatste drie jaar zijn er echter verschillende commerciële implementaties van LSFM beschikbaar gekomen, die multifunctioneel en gemakkelijk te gebruiken zijn voor elke ontwikkelingsbioloog. Dit artikel is voornamelijk gericht op die onderzoekers, die geen LSFM-technologieontwikkelaars zijn, maar LSFM willen gebruiken als een hulpmiddel om specifieke vragen in de ontwikkelingsbiologie te beantwoorden.
Hier gebruiken we de beeldvorming van de ontwikkeling van het oog van de zebravis als voorbeeld om de lezer kennis te laten maken met LSFM-technologie en we demonstreren toepassingen van LSFM op meerdere ruimtelijke en temporele schalen. Dit artikel beschrijft een compleet experimenteel protocol, beginnend met het monteren van zebravis-embryo's voor LSFM. We schetsen vervolgens de opties voor beeldvorming met behulp van de commercieel verkrijgbare lichtbladmicroscoop. Belangrijk is dat we ook een pijplijn uitleggen voor de registratie en fusie van datasets met meerdere uitzichten met behulp van een open-sourceoplossing die is geïmplementeerd als een Fiji-plug-in. Hoewel dit protocol zich richt op het beeldhouwen van het zich ontwikkelende oog van de zebravis en het verwerken van gegevens van een specifiek beeldacquisitie-setup, zijn de meeste van de inzichten en suggesties voor probleemoplossing die hier worden gepresenteerd van algemeen nut en kan het protocol worden aangepast aan een verscheidenheid aan lichtbladmicroscopie-experimenten.

LSFM is een ideale methode voor het afbeelden van ontwikkelingsprocessen over schalen. Verscheidene toepassingen worden hier opgesteld waarbij zowel korte als lange termijn beeldvorming van intracellulaire structuren, alsook cellen en volledige weefsels. Deze voorbeelden tonen ook dat LSFM is een nuttig instrument op verschillende stadia van oogontwikkeling van optische formatie cup neurogenese in de retina. Film 1 dient ter illustratie van de algemene LSFM benadering, eerst met een uitgezoomd aanzicht van een intacte embryo in de inbedding in agarose cilinder helderveld en later toont een gedetailleerde weergave van het netvlies in het kanaal fluorescentie. <img alt="film 1" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie1.jpg" /> Film 1:. LSFM van de zebravis netvlies Om de LSFM aanpak te illustreren, deze film toont voor het eerst in de helderveld dat het embryo intact is afgebeeld in de agarose cilinder voordat u naar fluorescentie. Later is aangetoond dat het grote gezichtsveld maakt waarneming van de hele retina. Vervolgens wordt de film toont een vergroot klein gebied van het netvlies aan de goede subcellulaire resolutie te markeren. Een Ath5: gap-GFP 37 transgene zebravis embryo werd gebruikt voor de beeldvorming. Deze transgene labels verschillende neuronen in het netvlies (voornamelijk ganglioncellen en fotoreceptoren voorlopers). De fluorescentie deel van de film werd vastgelegd als één weergave opname met dubbelzijdige belichting met behulp van de 40X / 1.0 W objectief met intervallen van 5 min. De maximale intensiteit projectie van een 30 pm dikke volume wordt getoond. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie1.mp4" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a> Film 2 laat zien, hoe zeer snel intracellulaire gebeurtenissen kunnen worden vastgelegd met een hoge resolutie; in dit geval de groei van microtubulihun plus eindigt de retinale neuronale progenitorcellen. De informatie in de film informatie maakt het mogelijk voor het bijhouden en kwantificering van microtubuli plus einde groei. <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie2.jpg" /> Movie 2:. Dynamiek van microtubuli in één cel Deze film vangt groeiende plus tips van microtubuli gelabeld door de plus fooi marker eiwit EB3-GFP 38. Het eiwit wordt tot expressie gebracht in een enkele retinale voorlopercel. De microtubuli worden voornamelijk groeien in de richting van apicale basale (van boven naar beneden). De gemiddelde snelheid van de EB3 kometen werd gemeten als 0,28 ± 0,05 um / sec. Het lichtpuntje aan de apicale kant van de cel vertoont hoge microtubule nucleatie activiteit is de centrosome. De wild-type embryo geïnjecteerd met hsp70: EB3-GFP plasmide-DNA. De film werd verkregen 4 uur na hitteschok (15 min bij 37 ° C) en ongeveer 28 hrpost meststofatie (HPF) als een enkele weergave opname met enkelzijdige verlichting met behulp van de 63x / 1.0 W objectieve en 1 sec tijdsintervallen. De enkele cel werd bebouwd van een gezichtsveld voor de meerderheid van de retina. De maximale intensiteit projectie van twee sneetjes wordt getoond. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie2.mp4" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a> Figuur 3 toont, hoe intracellulaire structuren te volgen gedurende vele uren. Hier wordt het centrosoom in translokatie retinale ganglioncellen (RGC&#39;s) gevangen. <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig3.jpg" /> Figuur 3:. Centrosome lokalisatie in de retinale ganglioncellen translocatie Deze montage van een time-lapse experiment toont de positie van het centrosoom gehele retinale ganglioncellen (RGC) rijping.In de neuronale voorlopercellen de centrosome is gelokaliseerd in het uiterste puntje van de apicale proces (01:00). Tijdens de celdeling, de twee centrosomes dienen als palen voor de mitotische spindel (02:25). Deze divisie levert een dochter cel die differentieert in een RGC en een tweede dochter cel die een fotoreceptorcel voorloper wordt. Na deling, het cellichaam van de RGC zich naar de basale zijde van de retina, terwijl de apicale proces aan de apicale zijde bevestigd blijft. Zodra de RGC de basale kant bereikt, zijn apicale proces los en het centrosoom reist mee (06:15). De centrosome kan worden gevolgd, terwijl geleidelijk aan samen met de apicale proces (06:50, 07:20, 08:10) terugtrekken. In het laatste frame (08:55) de ganglion cel groeit een axon van zijn basale kant, terwijl de centrosome nog apicaal is gelokaliseerd. Het mozaïek expressie werd bereikt door het plasmide DNA injectie in wild-type embryo in één cel stadium. De cellen worden gevisualiseerd door de Ath5: GFP-CAAX (groen) construct, die RGC en andere neuronen labels. De centrosomes (pijlpunten) worden gelabeld door Centrin-tdTomato 29 expressie (magenta). De apicale kant van het netvlies is bovenaan van de afbeelding en de basale zijde onderaan. De maximale intensiteit projectie van een 30 pm dikke volume wordt getoond. De beelden werden bebouwd van een film die het hele netvlies. De film begint bij ongeveer 34 uur na de bevruchting (HPF). Een z stack werd overgenomen om de 5 min met de 40X / 1.0 W doelstelling. Tijd wordt in hh: mm. Schaal balk vertegenwoordigt 10 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> In figuur 4 is weergegeven, hoe enkele cel gedrag kan uit gegevens registreren van het gehele weefsel worden geëxtraheerd, zoals in film 1. Transplantaat van een RGC gemakkelijk worden gevolgd en de apicale en basale proceses gevolgd. <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig4.jpg" /> Figuur 4:. Transplantaat van een retinale ganglioncellen De RGC translocatie van apicale basale zijde van de retina optreedt nadat de terminal mitose zoals beschreven in figuur 3 de RGC gelabeld door expressie van de Ath5. Gap-GFP 37 transgen. De maximale intensiteit projectie van een 30 pm dikke volume wordt getoond. De beelden werden bebouwd van een film die het hele netvlies. De film begint bij ongeveer 34 HPF. Een z stack werd overgenomen om de 5 min met de 40X / 1.0 W doelstelling. Tijd wordt in hh: mm. Schaal balk vertegenwoordigt 5 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Figuur 5 toont het vermogen van multiview LSFM om weefsel sc vangenale morfogenetische processen cellulaire resolutie over het voorbeeld van optische kop morfogenese, waarbij optische vesikel transformeert in een optische kop. De beeldkwaliteit kan sterk worden verbeterd door multiview beeldvorming, wanneer het uiteindelijke beeld wordt gecombineerd uit de gegevens van 5 verschillende aanzichten (in dit geval) in een z-stack met isotrope resolutie. Dit cijfer illustreert de verbetering van de beeldkwaliteit na gewogen gemiddelde fusie en de verdere toename in het contrast en de resolutie na multiview deconvolutie. De figuur toont twee optische schijfjes in verschillende oriëntaties door de dataset. Daarnaast is er een montage van de deconvolved dataset toont de optische kop morfogenese loop van de tijd. Alle tijdstippen worden vervolgens getoond in Movie 3. <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig5.jpg" /> Figuur 5: Vergelijking van de beeldkwaliteit tussen enkele weergave en twee methoden van multiview fusie. (A) Een optische schijfje enkele weergave gegevens blijkt uit zijaanzicht en (B) dorsaal aanzicht. Streep artefacten en degradatie van het signaal dieper in de steekproef zijn duidelijk zichtbaar. Ook een deel van het beeld zichtbaar in het gefuseerde data (CF) werd niet meegenomen in dit aanzicht. (C) Dezelfde optische schijfje, nu net zo multiview gefuseerd data blijkt uit zijaanzicht en (D) dorsaal aanzicht. Merk op dat stripe artefacten onderdrukt en structuren diep in het monster beter opgelost. (E) De dezelfde optische schijfje nu net zo multiview deconvolved data blijkt uit zijaanzicht en (F) dorsaal aanzicht. Let op de verhoogde contrast en de resolutie, zodat de individuele celmembranen en kernen goed kunnen worden onderscheiden. De resolutie is niet verslechtert met name dieper in het monster. De dataset is verworven met dubbelzijdige belichting vanaf 5 keer bekeken ongeveer 20 graden van elkaar. De z-stacks van abuit 100 urn met 1,5 micrometer stapgrootte werden verworven bij elke weergave in 10 minuten intervallen gedurende 10 uur met de 20X / 1.0 W doelstelling. Input beelden voor het multiview fusion en deconvolutie werden naar beneden bemonsterd 2 × het versnellen van de beeldverwerking. 15 herhalingen van de multiview deconvolutie werden uitgevoerd. (G) De montage toont een bijgesneden gedeelte van de dorsale uitzicht vanaf de deconvolved gegevens naar de morfogenetische gebeurtenissen tijdens de vroege ontwikkeling oog van de optische blaasjes aan de optische kop podium te markeren. De twee lagen van het optische vesikel, die aanvankelijk vergelijkbare kolomvormige epitheel zijn, differentiëren in verschillende celpopulaties. Het distale laag nabij de epidermis wordt het netvlies neuroepithelium (RN) en de proximale laag nabij de neurale buis wordt het retinale pigmentepitheel (RP). De cellen in de RN langwerpige en invaginate aan de optische kop (1:40-05:00) te vormen; op hetzelfde moment de RP cellen plat. Het oppervlak ectoderm wordt geïnduceerd een lens (01:40) vormen, which invaginates later (05:00). De film begint om 17 HPF. Tijd wordt in hh: mm. Alle cellulaire membranen worden gelabeld door de β-actine Ras-GFP-transgen en de kernen worden gelabeld door de hsp70: H2B-RFP transgen. Schaal bar vertegenwoordigt 30 micrometer. FB voorhersenen, LE lens, OP olfactorische placode, RN retinale neuroepithelium, RP netvliespigmentepitheel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie3.jpg" /> Movie 3: Optic kop morfogenese getoond met één oog en twee methoden van multiview fusion De time-lapse film illustreert het volledige proces van de optische kop morfogenese van de optische blaasjes aan de optische kop podium.. Het toont een enkele optische segment van de zijaanzicht (boven) en een optische segment van de dorsaal aanzicht (onder). De cellen van de ontwikkeling van optische vesikel ondergaan complexe herschikkingen om uiteindelijk vormen de hemisferische optische kop met de binnenste en buitenste netvlies neuroepithelium retinaal pigment epitheel. Een lens gevormd door het oppervlak ectoderm. Het invaginates samen met de neuro-epitheel en zit in de optische kop. Alle cellulaire membranen worden gelabeld door expressie van het β-actine Ras-GFP (groen) transgen en de kernen worden gemerkt met hsp70: H2B-RFP (magenta). De film begint bij ongeveer 17 HPF. De dataset is verworven met dubbelzijdige belichting vanaf 5 keer bekeken ongeveer 20 graden van elkaar en az stapels van ongeveer 100 urn werden elke 10 min is opgedaan met de 20X / 1.0 W doelstelling. Tijd wordt in hh: mm. Schaal bar vertegenwoordigt 50 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie3-final.mp4" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Lichtbladfluorescentiemicroscopie is een uitstekend hulpmiddel voor het beeldvormen van embryonale ontwikkeling. Het maakt het mogelijk om lange time-lapse films van levende embryo's op te nemen in bijna fysiologische omstandigheden. We demonstreren de toepassing ervan voor het beeldvormen van de oogontwikkeling van zebravissen over brede ruimtelijk-temporele schalen en presenteren een pijplijn voor het samenvoegen en deconvolutie van multiview datasets.

Met behulp van Light Sheet fluorescentiemicroscopie met Afbeelding zebravis Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Het algemene doel van dit experimentele protocol is om de ontwikkeling van het oog van het Zebravis-embryo in de lichtbladmicroscoop te beeldvormen en de verworven multiview-dataset in Figi te verwerken via de multiview-reconstructietoepassing plug-in. Deze methode kan u helpen om morfogenetische gebeurtenissen in de ontwikkeling van dieren te begrijpen. Het grootste voordeel van deze methode is dat u morfogenetische gebeurtenissen in het zich ontwikkelende intacte embryo met hoge ruimtelijke en temporele resolutie kunt observeren.Het grootste voordeel van lichtbladmicroscopie is de lage fototoxiciteit van de methode, de snelle verwervingstijd waarmee u het monster kunt beeldvormen en dat u het monster vanuit verschillende hoeken, zogenaamde weergaven, kunt beeldvormen. Het vastleggen van het monster vanuit verschillende weergaven stelt ons in staat om de degradatie van het signaal en de ingestelde as te overwinnen. Deze verschillende beelden kunnen vervolgens worden gebruikt en geregistreerd met behulp van fluorescente microsferen rond het monster.We kunnen het driedimensionale volume reconstrueren dat de isotrope resolutie bereikt. Hoewel we het gebruik van lichtbladfluorescentiemicroscopie voor Zebravisoogontwikkeling demonstreren, kan deze methode ook worden gebruikt om verschillende vragen in de ontwikkelingsbiologie en neurowetenschappen te beantwoorden met behulp van verschillende modelorganismen. Om te beginnen, schroeven de detectieobjectief in de microscoop terwijl de verlichtende objectieven bedekt blijven.Vervolgens verwijdert u de objectieven en schuift u de monsterschaal voorzichtig in de microscoop. Bevestig de kamer door de schroef vast te draaien. Verbind vervolgens de temperatuursensor en het peltierblok met de microscoop.De twee buizen die het koelvloeistof circuleren voor het peltierblok zijn compatibel met beide connectoren en kunnen in beide richtingen werken. Gebruik vervolgens een spuit om de kamer door de spuit met oplossing tot aan de bovenrand van de kamervensters te laden en controleer op lekken. Schakel nu de microscoop, de computer en de incubatie in.Start de microscoopbedieningssoftware en stel de incubatietemperatuur in op 28,5 graden Celsius. Terwijl de temperatuur gedurende een uur wordt aangepast, bereidt u het monster voor. Begin met het voorbereiden van de agarose.Smelt een voorbereide milliliter 1% lage smeltpunt agarose in E drie medium op 70 graden Celsius. Na ongeveer 15 minuten, brengt u 600 microliter gesmolten agarose over in een verse 1,5 milliliter buis en voegt u 250 microliter E drie medium, 50 microliter 0,4% MS 222 en 25 microliter vortex fluorescente kralen stockoplossing toe. Plaats de buis in een verwarmingsblok op ongeveer 39 graden Celsius om de agarose zijn geleerde punt te laten benaderen.Druk vervolgens teflon-tipped zuigers naar de bodem van een glas capillair met een binnendiameter van één millimeter. Bereid er vijf van voor. Vorm nu kort de agarosemixtuur en breng vervolgens vijf embryo's met de minimale hoeveelheid vloeistof erin over.Breng vervolgens een capillair in en aspireer een embryo hoofd voor. Het hoofd moet binnenkomen voordat de staart en er mogen geen luchtbellen zijn. Trek voldoende oplossing op zodat er ongeveer twee centimeter agarose boven het embryo en een centimeter agarose eronder is.Breng één embryo in elke capillair aan voordat u verder gaat. Deze stap vereist enige oefening om onder de knie te krijgen. Bereid u erop voor met niet-waardevolle embryo's.Wanneer de agarose volledig is gestold, bewaar de monsters in E drie medium door de capillairen te ondersteunen op een bekerwand met plasticine met de onderste opening in oplossing. Monteer nu de monsterhouder. Plaats eerst twee plastic hulzen van de juiste maat tegen elkaar in de spil.De sleuven op de hulzen moeten naar buiten wijzen. Bevestig vervolgens een klemschroef. En steek de capillair door de houder totdat de zwarte kleurband aan de andere kant zichtbaar wordt.Rak de zuiger niet aan. Draai vervolgens de klemschroef vast. Druk vervolgens een centimeter agarose uit de capillair en snijd het af.Breng vervolgens de spil in de monsterhouder schijf. Controleer voordat u de monsterschijf laadt of de trap in de controlesoftware op de bovenste positie staat. Gebruik vervolgens geleiderails om de houder en het monster in de microscoop te glijden.Beeld nu het gekozen monster af zoals beschreven in de tekstprotocol. De gegevensverwerking gebeurt in Figi. Het is een distributie van ImageJ.Voordat u begint, moet Figi worden bijgewerkt. Sla de verworven beeldgegevensset op in een enkele map. De tussenbestanden van de beeldverwerking worden opgeslagen in dezelfde map.Start nu de multiview-reconstructietoepassing. Definieer vervolgens een nieuwe gegevensset. Selecteer de optie Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset LOCI Bioformats en maak een naam voor het uitvoergegevensbestand.Selecteer vervolgens het eerste CZI-bestand van de gegevensset. De metagegevens worden automatisch geladen. Controleer in de beeldmetagegevens nogmaals of het aantal hoeken, de kanalen, de verlichtingen en de voxelgrootte allemaal correct zijn ingesteld.Na het indrukken van OK, worden een logvenster, het venster van de viewset up explorer en een consolevenster geopend. De viewset up explorer biedt een gebruiksvriendelijke interface. Selecteer de bestanden die moeten worden verwerkt en druk op de rechtermuisknop.Er wordt een nieuw venster geopend met de verschillende verwerkingsstappen zoals deze worden uitgevoerd. In de rechterbovenhoek bevinden zich de knoppen info en opslaan. Info geeft een samenvatting weer van de inhoud van het opgeslagen gegevensbestand en door op opslaan te drukken, worden de verwerkingsresultaten opgeslagen.Het programma slaat anders de resultaten van de verwerkingsstappen niet op. Om de volledige gegevensset opnieuw op te slaan, selecteert u eerst alle bestanden door op Ctrl+A te drukken en met een klik op de rechtermuisknop. Selecteer vervolgens Gegevensset opnieuw opslaan en Als HDF5.Een bevestiging van de opnieuw opslaage actie moet vervolgens worden afgevinkt. Na een paar minuten, voor el

using-light-sheet-fluorescence-microscopy-to-image-zebrafish-eye

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit artikel beschrijft de monstervoorbereiding voor lichtbladfluorescentiemicroscopie. Het demonstreert ook een methode om levende zebravisembryo's te monteren voor langetermijnbeeldvorming, waardoor lange time-lapse-films van levende embryo's in bijna fysiologische omstandigheden kunnen worden opgenomen.

Light Sheet Microscopie Monstervoorbereiding: Montage van levende zebravisembryo's voor langdurige beeldvorming

De ontwikkeling van de zebravis kan over dagen met licht blad microscopie wanneer embryo's zijn ingebed in optisch heldere polymeer buizen met een lage concentratie agarose worden gevolgd.

Multilayer Montage voor langdurig licht Sheet Microscopie van zebravis

Het in beeld brengen van het dynamisch gedrag van organellen en andere subcellulaire structuren in vivo kan licht werpen op hun functie in fysiologische en ziektecondities. Hier presenteren we methoden voor het genetisch markeren van twee organellen, centrosomen en mitochondriën, en het in beeld brengen van hun dynamiek in levende zebravis-embryo's met behulp van breedveld- en confocale microscopie.

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

Hier presenteren we een protocol om te visualiseren ontwikkeling van harten in zebrafish in 4 dimensies (4-D). 4-D imaging, via licht-blad fluorescentie microscopie (LSFM), neemt de 3-dimensionale (3-D) beelden na verloop van tijd te reconstrueren ontwikkelende harten. Laten we kwalitatief en kwantitatief dat schuifspanning activeert endocardial Notch signalering tijdens de ontwikkeling van de zaal, die cardiale trabeculation bevordert.

Licht vel fluorescentie microscopie 4-dimensionale beelden van de gevolgen van het moduleren van Shear Stress op de ontwikkelingslanden Zebrafish hart

Dit protocol beschrijft een benadering voor in toto labeling en multidimensionale beeldvorming van zebravissen vroege oogontwikkeling. We beschrijven labeling, embedding en vierdimensionale (4D) beeldvorming met behulp van laserscannen confocale microscopie, en overwegingen voor het optimaliseren van de verwerving van datasets voor het ontleden van mechanismen van optische cupmorfogenese.

4-dimensionale beeldvorming van zebravis optic cup morfogenese

Hier wordt een protocol verstrekt voor time-lapse beeldvorming van oculaire morfogenese met behulp van een commercieel beschikbare lightsheet-microscoop en een beeldverwerkingswerkstation om de resulterende gegevens te analyseren. Dit protocol beschrijft de procedures voor embryo-anesthesie, inbedding in agarose bij lage smelttemperatuur, suspensie in de beeldvormingskamer, het instellen van de beeldvormingsparameters en ten slotte het analyseren van de beeldvormingsgegevens met behulp van...

Oculaire morfogenese visualiseren door Lightsheet Microscopie met behulp van rx3:GFP Transgene Zebravis

We beschrijven geoptimaliseerde hulpmiddelen om het hart van de zebravis in vivo te bestuderen met fluorescentiemicroscopie van lichtplaten. In het bijzonder stellen we heldere cardiale transgene lijnen voor en presenteren we nieuwe zachte inbeddings- en immobilisatietechnieken die ontwikkelings- en hartafwijkingen voorkomen. Een mogelijke data-acquisitie- en analysepijplijn aangepast aan cardiale beeldvorming wordt ook verstrekt.

Light Sheet Microscopie van snelle hartdynamica in zebravisembryo's

Dit protocol maakt gebruik van light-sheet beeldvorming om de contractiele functie van het hart bij zebravislarven te onderzoeken en inzicht te krijgen in de hartmechanica door middel van celtracking en interactieve analyse.

4D Light-sheet beeldvorming van hartcontractie van zebravissen

Er wordt een strategie voor de voorbereiding van monsters beschreven voor het afbeelden van vroege zebravisembryo's in een intact chorion met behulp van een light-sheet-microscoop. Het analyseert de verschillende oriëntaties die embryo's verwerven in het chorion in de 70% epiboly- en knopstadia en beschrijft beeldvormingsstrategieën voor het verkrijgen van resolutie op cellulaire schaal in het hele embryo met behulp van het light-sheet-systeem.

Light Sheet Microscopie, beeldvorming en montagestrategieën voor vroege zebravisembryo's

Eiwitniveaus in cellen en weefsels vaak zijn gereguleerd door het evenwicht van eiwitproductie en klaring. Met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP), kan de klaringskinetiek van eiwitten experimenteel worden gemeten in vivo.

Meten Eiwit Stabiliteit in Living zebravis embryo&#39;s met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP)

Leer lichtveld fluorescentiemicroscopie voor het bestuderen van oogontwikkeling bij zebrafishembryo's met hoge resolutie. Deze methode maakt real-time observatie van morfogenetische processen mogelijk.

Met behulp van Light Sheet fluorescentiemicroscopie met Afbeelding zebravis Eye Development

Meer video's verkennen