Ontwikkeling van een In Vitro Assay om contractiele functie van mesenchymale Cellen die Onderging-mesenchymale transitie Evalueer

Het algemene doel van deze procedure is om de contractiliteit te evalueren van mesenchymale cellen die in vitro zijn onderworpen aan door inflammatoire cytokinen geïnduceerde epitheliale mesenchymale overgang, of EMT. Dit mesenchymal is een variatie van de basisfunctie van cellen na EMT geïnduceerd door inflammatoire immuunreacties zoals tijdens idiopathische pulmonale fibrose of luchtwegremodellering bij ernstig astma. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het geen specifieke apparaten vereist en dat het een hoge inhoud toont. Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Hideyuki Takeshima en Kosuke Makita, afgestudeerde studenten uit mijn laboratorium.

Begin door een cultuur van A-549 menselijke longepitheelcellen te wassen met vijf tot tien milliliter PBS. Vervolgens de aangehechte cellen losmaken met twee milliliter trypsin-EDTA bij 37 graden Celsius en vijf procent koolstofdioxide. Na drie minuten, breng de cellensuspensie over in conische buisjes met celkweekmedium en centrifugeer de cellen in een centrifuge.

Resuspendeer de pellets in twee milliliter celkweekmedium, en bewaar een kleine aliquot voor het tellen. Zaai vervolgens 0,5 tot 1 maal 10 tot de 6de cellen in tien milliliter medium per tien centimeter polyestereen schaaltje en incubeer de celculturen gedurende 24 uur. Voor EMT-inductie, behandel de cellen de volgende dag met 10 microliter TGF beta 1 en TNF alfa, en plaats de schalen terug in de incubator voor nog eens 48 uur.

Op dag vier, was de EMT-geïnduceerde culturen met vijf tot tien milliliter PBS, vervolgens losmaken van de cellen met trypsin-EDTA zoals net gedemonstreerd. Vervolgens centrifugeer de cellensuspensies in DMEM aangevuld met tryspsin-remmer en resuspendeer de pellets in 500 microliter PBS. Tel vervolgens de cellen en voeg vers bereid geelmedium toe tot een dichtheid van 3 maal 10 tot de 5de cellen per putje, voorzichtig maar snel de oplossing mengen door pipetteren voordat het geel aanmaakt.

Snel, maar voorzichtig, verdeel 0,5 milliliter cellen in nette, cilindrische vormen in elke put van een niet-behandelde 24-wells plaat. Plaats vervolgens de plaat in een cellenkweekincubator gedurende 15 minuten. Wanneer het geel volledig is gestold, beweeg een gesteriliseerde spatel in een cirkel rond de buitenkant van elk geel in één richting, om de gels los te maken van de platen zonder te breken.

Wanneer het geel wordt verwijderd, zorg ervoor dat de spatel niet heen en weer wordt bewogen in de put. Gebruik vervolgens de spatel om de gels voorzichtig over te brengen naar individuele 16 millimeter weefselkweekschaaltjes bevattende vijf milliliter DMEM aangevuld met één procent FBS, met of zonder TGF beta 1 en TNF alfa. Schud ten slotte voorzichtig de schalen om ervoor te zorgen dat de gels drijvend zijn op het medium, en plaats de gels terug in de cellenkweekincubator.

Onbehandelde a541-cellen vertonen een kasseien-achtige en driehoekige vorm, kenmerkend voor epitheelcellen. Na hun stimulatie met TGF beta 1 en TNF alfa, vertonen de cellen echter een lange spindelvorm, vergelijkbaar met die waargenomen voor mesenchymale cellen. QRTCPR van de epitheel- en mesenchymale markerexpressie vóór en na EMT laat zien dat A541-cellen behandeld met inflammatoire cytokinen gedurende 48 uur een significant verminderde expressie van CDH1 en significant verhoogde expressies van VIAM en ACTA2 vertonen.

Bovendien verzwakt stimulatie met deze cytokinen de E-cadherine-expressie zoals bepaald door westerse bloedanalyse, terwijl de expressies van vimentine N-cadherine en alfa gladde spieractine worden geïnduceerd. In een gelcontractie-assay, na 48 uur, zijn de gels bevattende TGF beta 1 en TNF alfa behandelde cellen kleiner dan de gecontroleerde gels bevattende cellen behandeld met PBS. Inderdaad, na 72 uur, is de grootte van de gels bevattende de cytokine-behandelde gels significant verminderd, vergeleken met de gecontroleerde gels zoals gemeten door een gel-analyzer.

Zoals waargenomen, kunnen de gelcontractie-stappen in drie uur worden voltooid als ze goed worden uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om te bevestigen dat de EMT succesvol is geïnduceerd voordat de gelcontractie-assay wordt uitgevoerd. Na observatie, biedt deze techniek een manier om de EMT-proces te variëren tijdens een inflammatoire toestand zoals fibrose of longremodellering.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u cellen die EMT hebben, in een type cuagenter moet uitstoten en ze in medium moet laten schuimen.