Name: Ontwikkeling van een In Vitro Assay om contractiele functie van mesenchymale Cellen die Onderging-mesenchymale transitie Evalueer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Leer een gelcontractie-assay om contractiliteit van mesenchymale cellen na EMT te evalueren met A-549 longepitheelcellen. Deze methode vereist geen gespecialiseerde apparatuur en biedt reproduceerbare resultaten voor ontstekingsonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Dr. Tadashi Koyama voor technische hulp. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door JSPS KAKENHI Grant Nummers 23249045, 15K09211, 15K19172; een subsidie aan de Respiratory Failure Research Group van het Ministerie van Volksgezondheid, Arbeid en Welzijn, Japan; een subsidie voor onderzoek naar allergische ziekten en immunologie, Japan.

1. Voorbereiding en Cultuur van longepitheelcellen <ol><li> Cultuur A549 humane long epitheelcellen (hechtende cellijn) in Dulbecco&#39;s Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 IE / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine. </li><li> Verwijder de celkweekmedia van kweekschaal en was eenmaal met 5-10 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Na wassen onmiddellijk zuig het PBS. </li><li> Voeg 2 ml trypsine / ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) (0,05%) en incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 3 minuten. </li><li> Verzamelen van de losgemaakte cellen in centrifugebuizen met celcultuurmedium Centrifugeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende 4 min bij 150 xg. </li><li> Resuspendeer pellet de cellen in 2 ml celkweekmedium en verwijderen van een monster voor celtelling. Tel het aantal cellen met een hemocytometer met trypan blauwe vlek cellevensvatbaarheid controleren. </li><li> Zaad A549 cellen op10 cm polystyreen platen bij een dichtheid van 0,5-1,0 x 10 6 cellen / schaal met 10 ml medium voor contractie gel assay. Zaad de cellen op platen met 6 putjes van polystyreen met een dichtheid van 0,5-1,0 x 10 5 cellen / putje met 2 ml medium voor EMT bevestiging. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur. </li></ol> 2. EMT Procedure <ol><li> Voeg 10 ul van TGF-β1 (5 ug / ml) en 10 pl TNF-α (10 ug / ml) aan het dienblad gel krimp test gezaaid in stap 1,6. Voeg 2 ul van TGF-β1 (5 ug / ml) en 2 pl TNF-α (10 ug / ml) aan het dienblad EMT bevestiging gezaaid in stap 1,6. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 48 uur. </li></ol> 3. Bevestiging van EMT Procedure met behulp van PCR en Western Blotting <ol><li> Bevestig verandering in morfologie (van geplaveide-achtige vorm te spindel) van de behandelde cellen met behulp van fase-contrast microscopie. Opmerking: Normal A549 cellen geplaveide-achtige en driehoekig uiterlijk dat karakteristiek is voor epitheelcellen, maar na stimulatie met TGF-β1 en TNF-α, de cellen lijken lange spoelvormige die vergelijkbaar is met mesenchymale cellen 14,15. </li><li> Evalueer de expressie van epitheliale merker, zoals E-cadherine en mesenchymale markers zoals N-cadherine, vimentine en α-gladde spier actine middels PCR of Western blotting. <ol><li> Extract totaal RNA uit de cellen gebruikmakend van RNA extractiekit 16 en het synthetiseren van cDNA met behulp van reverse transcriptase 17 volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Meet expressie van mRNA niveaus met behulp van real time PCR systeem 18 en monomere cyanine kleurstof PCR kit volgens instructies van de fabrikant. De specifieke primers voor GAPDH (glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase), ACTA2 (alfa-actine-2), CDH1 (cadherine-1, E-cadherine) en VIM (vimentine) getoond in Tabel 1 </strong&gt;. </li><li> Lyseren van de cellen met een lysis buffer (tabel 2) oplossing met 1% proteaseremmer cocktail. Meet de monstereiwit door gebruikmaking van een proteïne testkit 19,20 en dezelfde hoeveelheden eiwit toepassen op een polyacrylamidegel. <ol><li> Uitvoeren SDS gel-elektroforese en semi-droge overdracht van de eiwitten op PVDF-membraan 21. Incubeer het membraan met primaire antilichamen in blokkeerbuffer gedurende 1 - 2 uur. Na incubatie, was twee keer het membraan met wasbuffer en incubeer het membraan 1 uur met tweede antilichamen. Opmerking: zie de materialen / Apparatuur Tafel voor antilichamen en verdunningen gebruikt in deze studies. Zie tabel 2 voor de componenten van blokkerende buffer. </li><li> Was het membraan met wasbuffer tweemaal. Neem foto&#39;s van het membraan met de Western blotting detectie kit 22 met behulp van een koude CCD-camera 11,23. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Gel Contractie Assay voor het evalueren van EMT <ol><li> Zuig het geconditioneerde media uit de celkweek vat, en goed wassen met 5-10 ml PBS om de dode cellen te verwijderen. Na wassen onmiddellijk zuig het PBS. </li><li> Voeg 2 ml van 0,05% trypsine / EDTA en incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 3 minuten. </li><li> Verzamelen van de losgemaakte cellen in centrifugebuizen met DMEM aangevuld met trypsineremmer (1 mg / ml) Centrifugeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende 4 min bij 150 xg. </li><li> Meng Type 1 collageengel met gedestilleerd water, en 4 × geconcentreerd DMEM de volumes passen aan een collageen concentratie van 1,75 mg / ml te bereiken, en 1 x DMEM concentratie. Zorg ervoor dat de gel medium op ijs tijdens deze stap te houden. Opmerking: Uit 6 ml gel medium maken, meng goed 3,5 ml van type 1 collageen gel (3 mg / ml), 1,5 ml van 4 x geconcentreerde DMEM en 1 ml gedestilleerd water. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 500 pl PBS en verwijderen van een monster voor celtelling. tellenhet aantal cellen met een hemocytometer met trypan blauwe vlek cellevensvatbaarheid controleren. </li><li> Voeg de gel medium aan de hoeveelheid aan te passen tot een celdichtheid van 3,0 x 10 5 cellen / putje (6,0 x 10 5 cellen / ml) en voorzichtig bereiken maar snel mengen door pipetteren zonder gelering. </li><li> Verdeel 0,5 ml van het mengsel in elk putje van een 24-well niet-behandelde plaat snel en nauwkeurig nette cilindervorm maken. Wees voorzichtig niet toe te staan ​​eventuele luchtbellen naar de gels (Figuur 1A) besmetten. Opmerking: De gel medium dat de cellen viskeus en kan gemakkelijk geleren en vorm toenemende vorm in de put. </li><li> Incubeer de plaat gedurende 15 min in een cel incubator bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid volledig geleren. </li><li> Gels los van de plaat zonder dat door verplaatsing van het gesteriliseerde spatel op een wijze die een omtrek trekken in een richting. Met een spatel voorzichtig de gels 60 mm weefselkweekschalen overdragenbevattende 5 ml van DMEM / 1% FBS met of zonder TGF-β1 (5 ng / ml) en TNF-α (10 ng / ml). </li><li> Schud de gerechten om ervoor te zorgen gels drijven op het medium. Incubeer in een cel incubator bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid. </li></ol> 5. Meting van Gel Grootte <ol><li> Meet de collageengel grootte na 0, 24, 48 en 72 uur met een beeldanalysesysteem. <ol><li> Schakel de gel documentatiesysteem (Figuur 2A), en zet gerechten in het licht afschermende kast. Vervolgens neemt u het deksel van de gerechten in de kast. </li><li> Open de bijbehorende gel analysesoftware. Klik op de &quot;image overname knop&quot; in de menu-balk om het imago van de gels in de kast te laten zien. Klik vervolgens op &quot;verkrijgen&quot; in de menubalk om foto&#39;s van de gels (Figuur 2B) te nemen. </li><li> Klik op de &quot;opsporing knop&quot; in de menubalk (figuur 2C) en stel het meetgebied (gele cirkel in figuur 2C) door de muis te slepen. Klik vervolgens op de &quot;auto-detect knop&quot; in de menubalk (zie de knop in figuur 2D). De software detecteert automatisch de gels met een heatmap (figuur 2D). </li><li> Klik op &quot;OK&quot; om de omtrek van de gels door beeldverwerking te halen en naar gebieden, omringd door de omtrek (Figuur 2E) te berekenen. Nadat het gebied wordt berekend, wordt het berekende gebied weergegeven in een aparte pop-up venster. Let op: Als de gelen elkaar overlappen tijdens de beeldvorming, bewegen gels voorzichtig met behulp van een steriele pipet tip. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of fibrosis.</a> The Journal of pathology. 214, 199-214 (2008).</li>
<li>Hardie, W. D., Glasser, S. W., Hagood, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+the+pathogenesis+of+lung+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in the pathogenesis of lung fibrosis.</a> The American journal of pathology. 175, 3-16 (2009).</li>
<li>Kovacic, J. C., Mercader, N., Torres, M., Boehm, M., Fuster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+and+endothelial-to-mesenchymal+transition%3A+from+cardiovascular+development+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal and endothelial-to-mesenchymal transition: from cardiovascular development to disease.</a> Circulation. 125, 1795-1808 (2012).</li>
<li>Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transitions+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease.</a> Cell. 139, 871-890 (2009).</li>
<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> The Journal of clinical investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li>
<li>Forino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta1+induces+epithelial-mesenchymal+transition%2C+but+not+myofibroblast+transdifferentiation+of+human+kidney+tubular+epithelial+cells+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+experimental+pathology%22%5BJournal%5D)">TGFbeta1 induces epithelial-mesenchymal transition, but not myofibroblast transdifferentiation of human kidney tubular epithelial cells in primary culture.</a> International journal of experimental pathology. 87, 197-208 (2006).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Participation+of+miR-200+in+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Participation of miR-200 in pulmonary fibrosis.</a> The American journal of pathology. 180, 484-493 (2012).</li>
<li>Reynolds, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+inflammation+and+fibrosis%3A+an+alveolar+macrophage-centered+perspective+from+the+1970s+to+1980s%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Lung inflammation and fibrosis: an alveolar macrophage-centered perspective from the 1970s to 1980s.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 171, 98-102 (2005).</li>
<li>Camara, J., Jarai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition+in+primary+human+bronchial+epithelial+cells+is+Smad-dependent+and+enhanced+by+fibronectin+and+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrogenesis+%26+tissue+repair%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition in primary human bronchial epithelial cells is Smad-dependent and enhanced by fibronectin and TNF-alpha.</a> Fibrogenesis & tissue repair. 3, 2(2010).</li>
<li>Kamitani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+stimulation+with+TGF-beta1+and+TNF-alpha+induces+epithelial+mesenchymal+transition+in+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+archives+of+allergy+and+immunology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous stimulation with TGF-beta1 and TNF-alpha induces epithelial mesenchymal transition in bronchial epithelial cells.</a> International archives of allergy and immunology. 155, 119-128 (2011).</li>
<li>Mikami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+beta+receptor+signaling+induces+IL-8+production+in+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin beta receptor signaling induces IL-8 production in human bronchial epithelial cells.</a> PloS one. 9, e114791(2014).</li>
<li>Yamauchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+enhances+both+epithelial-mesenchymal+transition+and+cell+contraction+induced+in+A549+human+alveolar+epithelial+cells+by+transforming+growth+factor-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+lung+research%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha enhances both epithelial-mesenchymal transition and cell contraction induced in A549 human alveolar epithelial cells by transforming growth factor-beta1.</a> Experimental lung research. 36, 12-24 (2010).</li>
<li>Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts%2C+myofibroblasts%2C+and+wound+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts, myofibroblasts, and wound contraction.</a> The Journal of cell biology. 124, 401-404 (1994).</li>
<li>Ramos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-1+reverts+epithelial-mesenchymal+transition+induced+by+TGF-%7Bbeta%7D1+through+MAPK%2FERK+kinase+pathway+%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">FGF-1 reverts epithelial-mesenchymal transition induced by TGF-{beta}1 through MAPK/ERK kinase pathway .</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 299, L222-L231 (2010).</li>
<li>Ren, Z. X., Yu, H. B., Li, J. S., Shen, J. L., Du, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suitable+parameter+choice+on+quantitative+morphology+of+A549+cell+in+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+reports%22%5BJournal%5D)">Suitable parameter choice on quantitative morphology of A549 cell in epithelial-mesenchymal transition.</a> Bioscience reports. 35, (2015).</li>
<li>Brinkmann, V., Kinzel, B., Kristofic, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR-independent+activation+of+human+CD4%2B+45RO-+T+cells+by+anti-CD28+plus+IL-2%3A+Induction+of+clonal+expansion+and+priming+for+a+Th2+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">TCR-independent activation of human CD4+ 45RO- T cells by anti-CD28 plus IL-2: Induction of clonal expansion and priming for a Th2 phenotype.</a> Journal of immunology. 156, 4100-4106 (1996).</li>
<li>Krug, M. S., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-strand+cDNA+synthesis+primed+with+oligo%28dT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">First-strand cDNA synthesis primed with oligo(dT).</a> Methods in enzymology. 152, 316-325 (1987).</li>
<li>Morozumi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+pathogens+in+clinical+samples+from+patients+with+community-acquired+pneumonia+by+real-time+PCR+with+pathogen-specific+molecular+beacon+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of pathogens in clinical samples from patients with community-acquired pneumonia by real-time PCR with pathogen-specific molecular beacon probes.</a> Journal of clinical microbiology. 44, 1440-1446 (2006).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay%3A+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Analytical biochemistry. 175, 231-237 (1988).</li>
<li>Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W., et al. Electroblotting from polyacrylamide gels. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aUrsitti%2C+JA+%22Current+protocols+in+protein+science%22">Current protocols in protein science</a>. Chapter 10, Unit 10.7(2001).</li>
<li>Kricka, L. J., Voyta, J. C., Bronstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiluminescent+methods+for+detecting+and+quantitating+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Chemiluminescent methods for detecting and quantitating enzyme activity.</a> Methods in enzymology. 305, 370-390 (2000).</li>
<li>Noguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrative+analysis+of+the+tumorigenic+role+of+TAZ+in+human+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+cancer+research+%3A+an+official+journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">An integrative analysis of the tumorigenic role of TAZ in human non-small cell lung cancer.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 20, 4660-4672 (2014).</li>
<li>Kasai, H., Allen, J. T., Mason, R. M., Kamimura, T., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta1+induces+human+alveolar+epithelial+to+mesenchymal+cell+transition+%28EMT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+research%22%5BJournal%5D)">TGF-beta1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition (EMT).</a> Respiratory research. 6, 56(2005).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+type+II+TGF-beta+receptor+tyrosine+dephosphorylation+controls+SMAD-dependent+profibrotic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated type II TGF-beta receptor tyrosine dephosphorylation controls SMAD-dependent profibrotic signaling.</a> The Journal of clinical investigation. 124, 3295-3310 (2014).</li>
<li>Saito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+expression+profiling+reveals+target+genes+of+TGF-beta+and+TNF-alpha+possibly+mediated+by+microRNAs+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">An integrated expression profiling reveals target genes of TGF-beta and TNF-alpha possibly mediated by microRNAs in lung cancer cells.</a> PloS one. 8, e56587(2013).</li>
<li>Dvashi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+magnesium+dependent+1A+governs+the+wound+healing-inflammation-angiogenesis+cross+talk+on+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase magnesium dependent 1A governs the wound healing-inflammation-angiogenesis cross talk on injury.</a> The American journal of pathology. 184, 2936-2950 (2014).</li>
<li>Hallgren, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+ROCK1+dependent+contractility+in+fibroblast+from+chronic+obstructive+pulmonary+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Enhanced ROCK1 dependent contractility in fibroblast from chronic obstructive pulmonary disease patients.</a> Journal of translational medicine. 10, 171(2012).</li>
<li>Kobayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-9+activates+TGF-beta+and+stimulates+fibroblast+contraction+of+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-9 activates TGF-beta and stimulates fibroblast contraction of collagen gels.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 306, L1006-L1015 (2014).</li>
<li>Horie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+induces+human+lung+fibroblast-mediated+collagen+gel+contraction+via+histamine+H1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+lung+research%22%5BJournal%5D)">Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor.</a> Experimental lung research. 40, 222-236 (2014).</li>
<li>Kohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGD%282%29+modulates+fibroblast-mediated+native+collagen+gel+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">PGD(2) modulates fibroblast-mediated native collagen gel contraction.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 27, 375-381 (2002).</li>
<li>Muir, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophageal+epithelial+cells+acquire+functional+characteristics+of+activated+myofibroblasts+after+undergoing+an+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Esophageal epithelial cells acquire functional characteristics of activated myofibroblasts after undergoing an epithelial to mesenchymal transition.</a> Experimental cell research. 330, 102-110 (2015).</li>
<li>Zhong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endoplasmic+reticulum+stress+in+epithelial-mesenchymal+transition+of+alveolar+epithelial+cells%3A+effects+of+misfolded+surfactant+protein%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Role of endoplasmic reticulum stress in epithelial-mesenchymal transition of alveolar epithelial cells: effects of misfolded surfactant protein.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 45, 498-509 (2011).</li>
<li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cytokines+augments+TGF-beta1-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+A549+cells+by+up-regulating+TbetaR-I%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+motility+and+the+cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cytokines augments TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in A549 cells by up-regulating TbetaR-I.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 65, 935-944 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

De in deze onderzoeksprotocol omvat twee stappen. De eerste stap wordt uitgevoerd om EMT induceren, terwijl de tweede stap is de gel samentrekking assay. Aangezien het belangrijk te bevestigen dat cellen ondergingen EMT, stap 2 een uitstekende aanvulling op de morfologische veranderingen en gen expressie. Eerdere studies toonden aan dat EMT van A549-cellen werd geïnduceerd met slechts 24 TGF-β1; echter, zoals we eerder hebben gemeld 10, TNF-α behandeling verbetert EMT en de overname van mesenchymal...

Fibrose is betrokken bij de pathogenese van verschillende chronische progressieve ziekten zoals interstitiële longziekte, cardiale fibrose, levercirrose, terminale nierinsufficiëntie, systemische sclerose en auto-immuunziekte 1. Onder interstitiële longziekten, idiopathische longfibrose (IPF) is een chronische progressieve ziekte en geeft een slechte prognose. Pathologische kenmerk van IPF is de ontwikkeling van fibroblastische foci bestaande uit geactiveerde fibroblasten en myofibroblasten die worden geassocieerd met de prognose. De oorsprong van deze pulmonaire fibroblasten voorgesteld kunnen worden uit verschillende mesenchymale cellen, zoals oorspronkelijk resident pulmonaire fibroblasten en circuleert fibrocytes uit beenmerg. Recentelijk heeft epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) voorgesteld worden geassocieerd met de vorming van mesenchymale cellen 2, en bijdragen aan de pathogenese van fibrotische aandoeningen. Er wordt gedacht dat EMT speelt een belangrijke rol in het proces van foetale ontwikkeling, wondgenezing en progressie van kanker, waaronder tumorinvasie en metastase 3. Na het proces van EMT, epitheelcellen verkrijgen het vermogen van mesenchymale cellen door verlies van epitheliale merkers, zoals E-cadherine, en expressie van mesenchymale merkers zoals vimentine en α-gladde spier actine (SMA) 4,5. Eerdere studies toonden het bewijs dat EMT proces is geassocieerd met de ontwikkeling van weefsel fibrose in de nier en de longen 6 7. Bovendien, chronische ontsteking bevordert fibrotische ziekte 8; Bovendien, zoals inflammatoire cytokinen zoals tumornecrosefactor superfamilieelement 14 (TNFSF14, LIGHT), tumornecrosefactor (TNF) -α, en interleukine-1β, is aangetoond EMT 9-12 verbeteren. Collageengel contractie assay, een collageen gebaseerde celcontractie assay waarin fibroblasten zijn ingebed in type Icollageengel driedimensionaal, ideaal in vitro model voor de evaluatie van de contractiliteit. Contractiliteit is een van de karakteristieke functies van fibroblasten en draagt ​​bij normale wondgenezing en fibrose 13. Bij deze test wordt aangenomen dat de hechting van fibroblasten aan type I collageen door middel van integrine-afhankelijke mechanismen zou moeten mechanische spanning produceren onder bepaalde omstandigheden, en derhalve leiden tot weefselsamentrekking. Hier wordt de ontwikkeling van de gel contractie assay gemeld worden aangepast aan de verwerving van contractiele functie uitwerkt in de cellen die EMT ondergingen. Dit rapport toont aan dat dit gewijzigde test is geschikt voor het evalueren van de contractiliteit in mesenchymale cellen die EMT ondergingen.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>sigma aldrich</td><td>11965-092</td><td>Voor A549 medium</td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>Transforming Growth Factor-&beta;1, Human, recombinant</td><td>Wako Laboratory chemicals</td><td>209-16544</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human TNF-&alpha;</td><td>R&amp;D systems</td><td>210-TA/CF</td><td></td></tr><tr><td>E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#3195</td><td>1:3.000 verdunning</td></tr><tr><td>Vimentin (D21H3) Rabbit mAb</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#5741</td><td>1:3.000 verdunning</td></tr><tr><td>Anti-&alpha;-Tubulin antibody</td><td>sigma aldrich</td><td>T9026</td><td>1:10.000 verdunning</td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-Actin, &alpha;-Smooth Muscle antibody&nbsp;</td><td>sigma aldrich</td><td>A5228</td><td>1:10.000 verdunning</td></tr><tr><td>Anti-N-cadherin antibody</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>#610920</td><td>1:1.000 verdunning</td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (secondary antibody)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-100UL</td><td>1:20.000 verdunning</td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey (secondary antibody)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL</td><td>1:20.000 verdunning</td></tr><tr><td>Blocking reagent</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN418</td><td>2% in TBS-T</td></tr><tr><td>6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid</td><td>corning</td><td>#353046</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Cell culture dish</td><td>TPP</td><td>#93100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, powder</td><td>life technologies</td><td>12100-046</td><td>Voor 4&times; DMEM</td></tr><tr><td>Type 1 collagen gel</td><td>Nitta gelatin</td><td>Cellmatrix type I-A</td><td></td></tr><tr><td>24 Well cell culture plate</td><td>AGC TECHNO GLASS</td><td>1820-024</td><td></td></tr><tr><td>Gel Documentation System&nbsp;</td><td>ATTO</td><td>AE-6911FXN</td><td>Gel imager</td></tr><tr><td>Gel analyzing software</td><td>ATTO</td><td>Densitograph, ver. 3.00</td><td>analysesoftware gebundeld met AE-6911FXN</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), phenol red</td><td>life technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>24 Well Plates, Non-Treated</td><td>IWAKI</td><td>1820-024</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4%</td><td>life technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>RNA extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Reverse transcriptase</td><td>life technologies</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Real time PCR system</td><td>Stratagene</td><td>Mx-3000P</td><td></td></tr><tr><td>SYBR green PCR kit</td><td>Qiagen</td><td>204145</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail (100x)</td><td>life technologies</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membrane</td><td>ATTO</td><td>2392390</td><td></td></tr><tr><td>Protein assay kit</td><td>bio-rad</td><td>5000006JA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Polyacrylamide gel</td><td>ATTO</td><td>2331810</td><td></td></tr><tr><td>Western blotting detection reagent</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>Cold CCD camera</td><td>ATTO</td><td>Ez-Capture MG/ST</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin inhibitor</td><td>sigma aldrich</td><td>T9003-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylene (20)Sorbitan Monolaurate</td><td>Wako Laboratory chemicals</td><td>163-11512</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylene (9) octyiphenyl ether</td><td>Wako Laboratory chemicals</td><td>141-08321</td><td></td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van een<em&gt; in vitro</em&gt; assay om contractiele functie van mesenchymale cellen die onderging-mesenchymale transitie evalueer

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrose is vaak betrokken bij de pathogenese van verschillende chronische progressieve ziekten, zoals interstitiële longziekte. Een pathologisch kenmerk is de vorming van fibroblastische foci, wat geassocieerd is met de ernst van de ziekte. Er wordt voorgesteld dat mesenchymale cellen die bestaan uit de fibroblastische foci afkomstig zijn van verschillende celbronnen, waaronder oorspronkelijk residente intrapulmonale fibroblasten en circulerende fibrocyten uit het beenmerg. Recentelijk is ook aangenomen dat mesenchymale cellen die een epitheel-mesenchymale overgang (EMT) hebben ondergaan, bijdragen aan de pathogenese van fibrose. Bovendien kan EMT worden geïnduceerd door transformatiegroeifactor β, en kan EMT worden versterkt door pro-inflammatoire cytokinen zoals tumornecrosefactor α. De gelcontractie-assay is een ideaal in vitro model voor de evaluatie van contractiliteit, wat een van de karakteristieke functies van fibroblasten is en bijdraagt aan wondherstel en fibrose. Hier wordt de ontwikkeling van een gelcontractie-assay gedemonstreerd voor het evalueren van de contractiele capaciteit van mesenchymale cellen die een EMT hebben ondergaan.

Tijdens EMT, epitheelcellen verliezen epitheliale merkers, zoals E-cadherine, en krijgen de expressie van mesenchymale markers, zoals vimentine en α-gladde spier actine 4,5. Incubatie van A549 humane long epitheelcellen met TGF-β1 en TNF-α induceert EMT. Het uiterlijk van normale A549 cellen zijn geplaveide achtige vorm en driehoekig dat karakteristiek is voor epitheliale cellen (Figuur 3A), maar na gestimuleerd met TGF-β1 en TNF-α, het uiterlijk veranderde vo...

Hier beschrijven we de ontwikkeling en toepassing van een gelcontractie-assay voor het evalueren van contractiele functie in mesenchymale cellen die een epitheel-mesenchymale overgang hebben ondergaan.

Ontwikkeling van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay om contractiele functie van mesenchymale Cellen die Onderging-mesenchymale transitie Evalueer

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Het algemene doel van deze procedure is om de contractiliteit te evalueren van mesenchymale cellen die in vitro zijn onderworpen aan door inflammatoire cytokinen geïnduceerde epitheliale mesenchymale overgang, of EMT. Dit mesenchymal is een variatie van de basisfunctie van cellen na EMT geïnduceerd door inflammatoire immuunreacties zoals tijdens idiopathische pulmonale fibrose of luchtwegremodellering bij ernstig astma. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het geen specifieke apparaten vereist en dat het een hoge inhoud toont. Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Hideyuki Takeshima en Kosuke Makita, afgestudeerde studenten uit mijn laboratorium.Begin door een cultuur van A-549 menselijke longepitheelcellen te wassen met vijf tot tien milliliter PBS. Vervolgens de aangehechte cellen losmaken met twee milliliter trypsin-EDTA bij 37 graden Celsius en vijf procent koolstofdioxide. Na drie minuten, breng de cellensuspensie over in conische buisjes met celkweekmedium en centrifugeer de cellen in een centrifuge.Resuspendeer de pellets in twee milliliter celkweekmedium, en bewaar een kleine aliquot voor het tellen. Zaai vervolgens 0,5 tot 1 maal 10 tot de 6de cellen in tien milliliter medium per tien centimeter polyestereen schaaltje en incubeer de celculturen gedurende 24 uur. Voor EMT-inductie, behandel de cellen de volgende dag met 10 microliter TGF beta 1 en TNF alfa, en plaats de schalen terug in de incubator voor nog eens 48 uur.Op dag vier, was de EMT-geïnduceerde culturen met vijf tot tien milliliter PBS, vervolgens losmaken van de cellen met trypsin-EDTA zoals net gedemonstreerd. Vervolgens centrifugeer de cellensuspensies in DMEM aangevuld met tryspsin-remmer en resuspendeer de pellets in 500 microliter PBS. Tel vervolgens de cellen en voeg vers bereid geelmedium toe tot een dichtheid van 3 maal 10 tot de 5de cellen per putje, voorzichtig maar snel de oplossing mengen door pipetteren voordat het geel aanmaakt.Snel, maar voorzichtig, verdeel 0,5 milliliter cellen in nette, cilindrische vormen in elke put van een niet-behandelde 24-wells plaat. Plaats vervolgens de plaat in een cellenkweekincubator gedurende 15 minuten. Wanneer het geel volledig is gestold, beweeg een gesteriliseerde spatel in een cirkel rond de buitenkant van elk geel in één richting, om de gels los te maken van de platen zonder te breken.Wanneer het geel wordt verwijderd, zorg ervoor dat de spatel niet heen en weer wordt bewogen in de put. Gebruik vervolgens de spatel om de gels voorzichtig over te brengen naar individuele 16 millimeter weefselkweekschaaltjes bevattende vijf milliliter DMEM aangevuld met één procent FBS, met of zonder TGF beta 1 en TNF alfa. Schud ten slotte voorzichtig de schalen om ervoor te zorgen dat de gels drijvend zijn op het medium, en plaats de gels terug in de cellenkweekincubator.Onbehandelde a541-cellen vertonen een kasseien-achtige en driehoekige vorm, kenmerkend voor epitheelcellen. Na hun stimulatie met TGF beta 1 en TNF alfa, vertonen de cellen echter een lange spindelvorm, vergelijkbaar met die waargenomen voor mesenchymale cellen. QRTCPR van de epitheel- en mesenchymale markerexpressie vóór en na EMT laat zien dat A541-cellen behandeld met inflammatoire cytokinen gedurende 48 uur een significant verminderde expressie van CDH1 en significant verhoogde expressies van VIAM en ACTA2 vertonen.Bovendien verzwakt stimulatie met deze cytokinen de E-cadherine-expressie zoals bepaald door westerse bloedanalyse, terwijl de expressies van vimentine N-cadherine en alfa gladde spieractine worden geïnduceerd. In een gelcontractie-assay, na 48 uur, zijn de gels bevattende TGF beta 1 en TNF alfa behandelde cellen kleiner dan de gecontroleerde gels bevattende cellen behandeld met PBS. Inderdaad, na 72 uur, is de grootte van de gels bevattende de cytokine-behandelde gels significant verminderd, vergeleken met de gecontroleerde gels zoals gemeten door een gel-analyzer.Zoals waargenomen, kunnen de gelcontractie-stappen in drie uur worden voltooid als ze goed worden uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om te bevestigen dat de EMT succesvol is geïnduceerd voordat de gelcontractie-assay wordt uitgevoerd. Na observatie, biedt deze techniek een manier om de EMT-proces te variëren tijdens een inflammatoire toestand zoals fibrose of longremodellering.Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u cellen die EMT hebben, in een type cuagenter moet uitstoten en ze in medium moet laten schuimen.

development-an-vitro-assay-to-evaluate-contractile-function

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We beschrijven het gebruik van een muis ES-cel-gebaseerde test kritische tijdvensters voor de Wnt / β-catenine en BMP signaal activering tijdens cardiogene inductie te identificeren. De methode biedt een gestandaardiseerd platform dat betrouwbaar kwantificeert cardiogene efficiëntie, en het is van toepassing op de studie van andere cellijnen.

Gewijzigd muis embryonale stamcellen gebaseerde test voor het kwantificeren van Cardiogene Inductie Efficiency

De craniale mesenchym ondergaat dramatische morfogenische bewegingen die waarschijnlijk zorgt voor een drijvende kracht voor verhoging van de neurale...

Een Explantatie Assay voor het beoordelen van cellulair gedrag van de craniale mesenchym

Een eenvoudige werkwijze beschreven voor de inductie van epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) in verschillende celtypen. Methoden voor de analyse van cellen in EMT toestanden met immunocytochemie inbegrepen.

Inductie en analyse van epitheliale naar mesenchymale transitie

Het is aangetoond dat de regulatie van alternatieve splicing bijdraagt aan de epitheel-mesenchymale overgang (EMT), een essentieel cellulair programma in verschillende fysiologische en pathologische processen. Hier beschrijven we een methode die gebruikmaakt van een induceerbaar EMT-model voor de detectie van alternatieve splicing tijdens EMT.

Detectie van alternatieve splicing Tijdens-mesenchymale transitie

Hier beschrijven we methoden voor het isoleren van primaire muis epicardiale cellen door middel van een uitgroei-kweektest en het beoordelen van de functionele migratie van epicardiale-afgeleide cellen (EPDC) met behulp van een ex vivo hartkweeksysteem. Deze protocollen zijn geschikt voor het identificeren van genetische en chemische modulatoren van epicardiale epitheel-naar-mesenchymale overgang (EMT) en mobiliteit.

Epicardiale uitgroei Cultuur en Assay<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Evaluatie van Epicardial-afgeleide Cell Migratie

Epitheliële naar mesenchymale overgang (EMT) maakt het mogelijk dat kankers invasief worden. Om EMT te onderzoeken, wordt een op neurale stamcellen (NSC) gebaseerd in vitro model beschreven dat vrij is van serum en enzymen. Dit gestandaardiseerde systeem maakt een kwantitatieve en kwalitatieve beoordeling van celmigratie, gen- en eiwitexpressie mogelijk. Het model is geschikt voor geneesmiddelontdekking.

Een enzym en Serum-free neurale stamcel Cultuur Model voor EMT Investigation Geschikt voor Drug Discovery

We presenteren een hoge doorvoer tractiekracht assay gefabriceerd met silicone rubber (PDMS). Deze nieuwe assay is geschikt voor het bestuderen van fysieke veranderingen in cel contractiliteit tijdens verschillende biologische en biomedische processen en ziekten. We demonstreren het nut van deze methode door het meten van een TGF-β afhankelijke toename van de contractiliteit tijdens de epitheel-naar-mesenchymale overgang.

Hoge doorvoer Tractiekracht microscopie met behulp van PDM'S onthult dosisafhankelijke effecten van het transformeren van groei factor-β op de epitheliale-naar-mesenchymale overgang

We beschrijven een systematische workflow om TGF-β signalering en TGF-β-geïnduceerde EMT te onderzoeken door de eiwit- en genexpressie te bestuderen die betrokken zijn bij deze signaleringsroute. De methoden omvatten western blotting, een luciferase reporter assay, qPCR, en immunofluorescentie vlekken.

TGF-β Signalering en TGF-β-geïnduceerde Epitheel-naar-mesenchymale overgang bij borstkanker en normale cellen bestuderen

We beschrijven methoden om TGF-β2-geïnduceerde EndMT in endotheelcellen te onderzoeken door celmorfologieveranderingen te observeren en de expressie EndMT-gerelateerde markerveranderingen te onderzoeken met behulp van immunofluorescentiekleuring. CRISPR/Cas9 genbewerking werd beschreven en gebruikt om het gen dat codeert voor Snail uit te putten om zijn rol in TGF-β2-geïnduceerde EndMT te onderzoeken.

TGF-β-gemedieerde Endotheel naar Mesenchymal Transition (EndMT) en de functionele beoordeling van EndMT-effectoren met crispr/cas9 genbewerking

Dit werk presenteert een flexibel protocol voor het gebruik van fluorescerend gelabelde elastomeer contracteerbare oppervlakken (FLECS) -technologie in microwell-formaat voor vereenvoudigde, hands-off kwantificering van contractiele krachten met één cel op basis van gevisualiseerde verplaatsingen van fluorescerende eiwitmicropatronen.

Vereenvoudigde, high-throughput analyse van eencellige contractiliteit met behulp van microgepatterde elastomeren

Dit protocol biedt methoden voor het genereren van 3D-gemanipuleerde hart- en skeletspierweefsels en beschrijft het gebruik ervan in preklinische screeningsmodaliteiten voor geneesmiddelen. De beschreven methoden maken gebruik van een magnetisch detectiesysteem om de gelijktijdige beoordeling van 24 weefsels parallel te vergemakkelijken.

Preklinische geneesmiddelentests in schaalbare 3D-gemanipuleerde spierweefsels

Leer een gelcontractie-assay om contractiliteit van mesenchymale cellen na EMT te evalueren met A-549 longepitheelcellen. Deze methode vereist geen gespecialiseerde apparatuur en biedt reproduceerbare resultaten voor ontstekingsonderzoek.

Ontwikkeling van een In Vitro Assay om contractiele functie van mesenchymale Cellen die Onderging-mesenchymale transitie Evalueer (Video) | JoVE Journal

Ontwikkeling van een

Meer video's verkennen