Cycloheximide Chase Analyse van de afbraak van eiwitten in

Het algemene doel van deze procedure is om de degradatie van de populatie in steady state van een specifiek eiwit in Saccharomyces cerevisiae te visualiseren. Deze methode kan worden gebruikt om de genetische vereisten voor, en milieueffecten op, de degradatie van een eiwit van belang te bepalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat radioactieve isotopen en langdurige immunoprecipitatiestappen niet nodig zijn, in tegenstelling tot pulse-chase technieken, die ook worden gebruikt om eiwitdegradatie te visualiseren.

Deze procedure kan worden gebruikt om zowel een endogeen gisteiwit als een eiwit dat vanuit een plasmide wordt tot expressie gebracht, te analyseren. Voor dat laatste wordt de giststam getransformeerd met een plasmide dat het eiwit van belang codeert, volgens een standaardprotocol voor gisttransformatie. Inoculeer de gist in vijf milliliter van het geschikte medium.

Incubeer overnacht bij 30 graden Celsius onder rotatie. Meet de volgende ochtend de optische dichtheid bij 600 nanometer, of OD600, van elke overnachtcultuur. Verdun de culturen tot een OD600 van 0,2 in 15 milliliter vers medium.

Incubeer bij 30 °C onder schudding tot de cellen de mid-logaritmische groeifase hebben bereikt. Terwijl de gistcellen groeien, bereidt u de cycloheximide chase-procedure voor. Stel een warmteblok dat geschikt is voor 15 ml conische buizen in op 30 °C voor de incubatie van cellen in aanwezigheid van cycloheximide.

Voeg water toe aan elke houder van het warmteblok om een efficiënte warmteverdeling naar de culturen te waarborgen, zodanig dat een conische buis van 15 milliliter het waterniveau laat stijgen tot aan, maar niet over, de rand van de houder. Stel een tweede warmteblok in dat geschikt is voor microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter op 95 degrees Celsius voor proteïnedenaturatie na cellysis. Warm vers groeimedium voor tot 30 degrees Celsius.

Per tijdstip per te analyseren cultuur is 1,1 milliliter medium nodig. Voeg 50 microliter van 20x Stop Mix toe aan vooraf gelabelde microcentrifugebuisjes. Bereid één buisje voor per tijdstip per te analyseren cultuur.

Plaats de buisjes op ijs. Wanneer de gistcellen de mid-logaritmische groeifase hebben bereikt, verzamel dan 2,5 OD600-eenheden van elke cultuur per tijdstip dat geanalyseerd moet worden. Eén OD600-eenheid is gelijk aan de hoeveelheid gist aanwezig in één milliliter cultuur bij een OD600 van 1,0.

Centrifugeer de geoogste cellen in 15 milliliter conische buizen bij 3.000 ×g op kamertemperatuur gedurende twee minuten. Verwijder het supernatant. Resuspendeer elke celpellet in één milliliter vers groeimedium van 30 °C per 2,5 OD600 eenheden cellen.

Equilibreer de gistcel-suspensies door ze vijf minuten te incuberen in het warmteblok van 30 graden Celsius voordat u start met de cycloheximide-chase. Het meest uitdagende aspect van deze procedure is de timing van de toevoeging van cycloheximide en het verzamelen van cellen voor elk monster. Wij garanderen succes door het opstellen van en het strikt naleven van een tijdsschema voor de toevoeging van cycloheximide en het verzamelen van de cellen.

Om de cycloheximide-chase te starten, drukt u op "Start" op de timer. Voeg snel maar zorgvuldig cycloheximide toe aan de eerste gistcel-suspensie tot een eindconcentratie van 250 µg/mL en vortex kort om te mengen. Draag onmiddellijk 950 µL, of ongeveer 2,4 OD600-eenheden, van de gistcel-suspensie met toegevoegd cycloheximide over naar een vooraf gelabelde microcentrifugeebuis die 50 µL ijskoude 20x Stop Mix bevat.

Vortex de microcentrifugebuis en plaats deze op ijs tot alle monsters zijn verzameld. Begin de cycloheximide chase zoals gedemonstreerd voor elk van de overige gistcel-suspensies met regelmatige tijdsintervallen. Vortex bij elk opeenvolgend tijdstip de gistcel-suspensies en breng 950 microliters over naar gelabelde microcentrifugebuizen die 50 microliters voorkoelde 20x Stop Mix bevatten.

Vortex en plaats de verzamelde cellen op ijs. Om bezinking van de gistcellen te voorkomen, worden de celsuspensies in de 15 milliliter conische buizen gedurende de chase ongeveer elke vijf minuten gevortexd. Wanneer alle monsters zijn verzameld, worden de verzamelde cellen gepellet door centrifugatie bij 6.500 ×g en kamertemperatuur gedurende 30 seconden.

Verwijder het supernatant door middel van pipetteren of aspiratie. De cellen zijn nu klaar voor alkalische lysis. Bereid de cellen voor op alkalische lysis door 100 µL gedestilleerd water aan elk celpellet toe te voegen en resuspendeer door herhaaldelijk te pipetteren.

Voeg 100 µL 0,2 M natriumhydroxide toe aan elk monster. Meng door te vortexen. Incubeer de cellen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

In dit stadium zijn de gistcellen nog niet gelyseerd en zijn de eiwitten nog niet vrijgekomen. Pelleteer vervolgens de cellen door centrifugatie bij 18, 000 ×g bij kamertemperatuur gedurende 30 seconden. Verwijder het supernatant door middel van pipetteren of aspiratie.

Voeg 100 µL Laemmli Sample Buffer toe aan elk cellpellet om de cellen te lyseren. Resuspendeer door herhaaldelijk met de pipet op en neer te zuigen. Incubeer vijf minuten bij 95 °C om de eiwitten volledig te denatureren.

Centrifugeer de lysaten bij 18, 000 ×g en kamertemperatuur gedurende één minuut om onoplosbaar materiaal te pelletteren. Het supernatant, dat bestaat uit gesolubiliseerd geëxtraheerd eiwit, is klaar voor scheiding via SDS PAGE en daaropvolgende Western blot-analyse. Alternatief kunnen de lysaten worden bewaard bij -20 °C.

De stabiliteit van Deg1-Sec62, een model-substraat voor gist-endoplasmatisch reticulum-geassocieerde degradatie, werd geanalyseerd met behulp van de cycloheximide-chase-methode. Het Deg1-Sec62-eiwit migreert op SDS-PAGE als meerdere soorten en wordt snel afgebroken in wild-type cellen. Pgk1 dient als laadcontrole waarvan de abundantie niet varieert onder de geteste condities.

Verlies van zowel de ER-residente ubiquitine-ligase hrd1 als het ubiquitine-conjugerende enzym ubc7 stabiliseerde het Deg1-Sec62-eiwit aanzienlijk, wat de eerder waargenomen rol van deze eiwitten bij de degradatie van Deg1-Sec62 bevestigt. Cue1 is een transmembraaneiwit dat ubc7 aan het ER-membraan verankert en het enzym activeert, maar de noodzaak van cue1 bij de degradatie van Deg1-Sec62 is nog niet direct onderzocht. De observatie uit deze studie dat Deg1-Sec62 werd gestabiliseerd bij afwezigheid van cue1, bevestigde een rol voor cue1 bij de ER-geassocieerde degradatie van Deg1-Sec62.

Het resultaat van de Western blot werd gekwantificeerd met behulp van imaging-software. Om de abundantie van het Deg1-Sec62-eiwit tussen de monsters te vergelijken, werd voor elk monster de ratio bepaald van de gecorrigeerde signaalintensiteiten van Deg1-Sec62 ten opzichte van Pgk1. Het is belangrijk om te onthouden dat deze procedure het meest direct rapporteert over de degradatiekinetiek van een populatie in steady state van een eiwit van belang.

Om de degradatie van de pas gesynthetiseerde populatie van een eiwit van belang te visualiseren, kunnen andere technieken, zoals pulse-chase experimenten, worden gebruikt. Houd er rekening mee dat cycloheximide en natriumazide extreem toxisch zijn en er voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om direct contact met deze chemicaliën tijdens het uitvoeren van deze procedure te vermijden.