Name: Cycloheximide Chase Analyse van de afbraak van eiwitten in Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Leer de cycloheximide chase methode voor eiwitafbraakanalyse in Saccharomyces cerevisiae met westerse blottechniek. Deze eenvoudige aanpak vervangt radioactieve isotopen en vereenvoudigt het bestuderen van eiwitstabiliteit in gist.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken de huidige en voormalige leden van het Rubenstein-lab voor het bieden van een ondersteunende en enthousiaste onderzoeksomgeving. De auteurs danken Mark Hochstrasser (Yale University) voor het delen van reagentia en expertise. E.M.R. bedankt Stefan Kreft (University of Konstanz) en Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) voor het delen van onschatbare expertise in kinetische analyse van eiwitten. Dit werk werd ondersteund door een National Institutes of Health-subsidie (R15 GM111713) aan E.M.R., een Ball State University ASPiRE-onderzoeksbeurs aan E.M.R, een onderzoeksbeurs van de Ball State University-afdeling van Sigma Xi aan S.M.E., en fondsen van het Ball State University Provost's Office en het Department of Biology.

1. Groei en Oogst van gistcellen <ol><li> Zoniet analyseren afbraakkinetiek van een endogeen gisteiwit, transformatie gewenste giststam (s) met een plasmide dat codeert voor het eiwit van belang. Betrouwbare werkwijzen voor transformatie van gist zijn hiervoor beschreven 37. </li><li> Inoculeer gist in 5 ml geschikt medium (bijvoorbeeld selectieve synthetische gedefinieerd (SD) medium voor plasmide handhaving van getransformeerde cellen of niet-selectieve gistextract-pepton-dextrose (YPD) medium voor niet- getransformeerde cellen). Incubeer overnacht bij 30 ° C, roteren. OPMERKING: 30 ° C is de optimale groeitemperatuur voor typische wildtype laboratorium giststammen 38. Omdat sommige mutante giststammen niet optimaal groeien bij 30 ° C en sommige eiwitten ondergaan temperatuurafhankelijke degradatie, het voor groei gebruikte gistcel en cycloheximide chase temperaturen worden empirisch bepaald 39. </li><li> meet the optische dichtheid bij 600 nm (OD 600) van elke overnacht kweek. OPMERKING: Cellen kunnen in logaritmische en stationaire groeifase maar moet minimaal bereikt een dichtheid verdunning zal een OD 600 = 0,2 in 15 ml vers medium. </li><li> Verdun de overnachtkweken een OD600 waarde van 0,2 in 15 ml vers medium. </li><li> Incubeer gist bij 30 ° C, schudden totdat de cellen te bereiken mid-logaritmische groeifase (dwz een OD 600 tussen 0,8 en 1,2). </li><li> Tijdens gistcel groei, de volgende in voorbereiding op de cycloheximide chase procedure: <ol><li> Stel een hitteblok die plaats 15 ml conische buizen tot 30 ° C voor incubatie van cellen in de aanwezigheid van cycloheximide. Voeg water toe aan de putjes van de warmte blok voor een efficiënte warmteverdeling culturen mogelijk te maken. Voeg water toe aan elk putje zodat een 15 ml conische buis zorgt ervoor dat het waterniveau stijgt, maar niet overstromen, de rand van de put. </li><li> Stel een tweede warmte-blok dat plaats biedt aan 1,5 ml microcentrifugebuizen tot 95 ° C voor eiwitdenaturatie na cellysis. </li><li> Voorverwarmen vers groeimedium (1,1 ml per tijdstip per cultuur te testen) tot 30 ° C. </li><li> Voeg 50 ul 20x Stop Mix voor een pre-gelabeld microcentrifugebuizen (één buis per tijdstip per cultuur te testen). Plaats de buizen op ijs. LET OP: Natriumazide, een ingrediënt in 20x Stop Mix, is giftig via orale inname of huidcontact. Volg de aanbevelingen van de fabrikant bij de voorbereiding, de opslag en het hanteren van natriumazide. In geval van accidentele blootstelling, raadpleeg veiligheidsinformatieblad verstrekt door de fabrikant. </li></ol></li><li> Wanneer cellen mid-logaritmische groei hebben bereikt, het verzamelen van 2,5 OD 600 eenheden van elke cultuur per tijdstip om te worden getest (bv 7,5 OD 600 eenheden eiwit overvloed op drie tijdstippen te analyseren). Centrifuge verzamelde cellen in 15 ml conische buisjes 3,000 xg bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. Opmerking: Een OD 600 eenheid is gelijk aan de hoeveelheid gist aanwezig in 1 ml kweek bij een OD 600 van 1,0. Het volume van cultuur (in ml) nodig om X OD 600 eenheden (V) oogsten kan worden bepaald met de volgende vergelijking: V = X OD 600 eenheden / OD 600 gemeten. Bijvoorbeeld, tot 7,5 OD 600 eenheden van gist celcultuur oogsten op een OD 600 van 1,0, het verzamelen van 7,5 OD 600 eenheden / 1,0 = 7,5 ml gistcultuur. </li><li> Resuspendeer elk celpellet in 1 ml van 30 ° C (voorverwarmd) vers groeimedium per 2,5 OD 600 eenheden van cellen (bijvoorbeeld 3 ml van 7,5 OD 600 eenheden). </li></ol> 2. Cycloheximide Chase <ol><li> Evenwicht gistcel schorsingen door incubatie gedurende 5 minuten in de 30 ° C verwarmen blok. </li><li> Bereid een timer te tellen van 0:00. </li><li> Om de cycloheximide chase, drukt u op &quot;Start&quot; op de timer te beginnen. Snel,maar goed, de volgende stappen: <ol><li> Cycloheximide aan een uiteindelijke concentratie van 250 ug / ml aan de eerste gistcel suspensie (bijvoorbeeld voeg 37,5 ul van 20 mg / ml cycloheximide voorraad tot 3 ml celsuspensie) en vortex kort mengen. LET OP: Cycloheximide is een irriterend voor de huid en is giftig via orale inname. Volg de aanbevelingen van de fabrikant bij de voorbereiding, de opslag en het hanteren van cycloheximide. In geval van accidentele blootstelling, raadpleeg veiligheidsinformatieblad verstrekt door de fabrikant. </li><li> Onmiddellijk na het toevoegen van cycloheximide en vortexen, overdracht 950 ui (2,4 OD 600 eenheden) van de gist celsuspensie met cycloheximide toegevoegd aan een pre-gemerkte microcentrifugebuis met 50 ul ijskoude 20x stop mix. Vortex de microcentrifugebuis, en leg ze op ijs tot alle monsters zijn verzameld. </li><li> Zet de gistcel suspensie tot 30 ° C. </li></ol></li><li> Herhaal de stappen 2.3.1 tot 2.30,3 voor elk van de overblijvende gist celsuspensies op regelmatige tijdstippen (bijvoorbeeld elke 30 seconden, zodat cycloheximide toegevoegd aan Sample # 1 op 0:00, Monster # 2 in 00:30, Monster # 3 op 1:00 , enz.). </li><li> Bij elke volgende tijdstip, draaikolk gistcel schorsingen en overdracht 950 ul aan gemerkt microcentrifugebuizen die 50 pi pre-gekoelde 20x Stop Mix. Vortex en plaats verzamelde cellen op ijs. Terug 15 ml conische buizen tot 30 ° C verwarmen blok. <ol><li> Bijvoorbeeld, voor verzameling cellen 30 minuten na toevoeging cycloheximide (uitgaande van 30-seconden intervallen tussen cycloheximide Naast gist celsuspensies aan het begin van het tijdsverloop), vortex en verwijder 950 pi celsuspensie van Voorbeeld # 1 in 30:00 . Herhaal voor monster # 2 op 30:30, enzovoort. LET OP: Om te voorkomen dat de afwikkeling van gist, vortex celsuspensies in 15 ml conische buizen ongeveer om de 5 min in de loop van de jacht. Als alternatief, gist celsuspensieB kan in een continu roeren waterbad gedurende de duur van de cycloheximide chase experiment gehandhaafd. </li></ol></li><li> Wanneer alle monsters zijn verzameld, pellet cellen verzameld door centrifugeren bij 6500 xg bij kamertemperatuur gedurende 30 sec. Verwijder de bovenstaande vloeistof door pipetteren of aspiratie. De cellen zijn nu klaar voor alkaline lysis. Alternatief snap-freeze gepelleteerde cellen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C. </li></ol> 3. Post-alkaline Protein Extraction (Gewijzigd van 16,40) <ol><li> Voeg 100 ul gedestilleerd water aan elk celpellet. Resuspendeer door en neer te pipetteren of vortexen. </li><li> Voeg 100 ul van 0,2 M NaOH aan elk monster. Meng door en neer te pipetteren of vortexen. </li><li> Incubeer gesuspendeerde cellen bij kamertemperatuur gedurende 5 min. In dit stadium hebben gistcellen niet zijn gelyseerd, en eiwitten zijn niet vrijgegeven 40. </li><li> Pellet cellen door centrifugeren bij 18.000 xg bij kamertemperatuur temperARD voor 30 sec. Verwijder supernatant door pipetteren of aspiratie. </li><li> Te lyseren, voeg 100 pl Laemmli monsterbuffer aan elke celpellet. Resuspendeer door en neer te pipetteren of vortexen. OPMERKING: Sequentiële incubatie van cellen met NaOH en Laemmli monsterbuffer releases eiwitten in een vorm geschikt voor natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) onder toepassing van een Tris-glycine-loopbuffer systeem. </li><li> Incubeer bij 95 ° C gedurende 5 minuten om volledig eiwitten denatureren. OPMERKING: Incubatie bij 95 ° C niet geschikt voor de analyse van eiwitten die gevoelig zijn voor aggregatie (bijvoorbeeld, eiwitten met meerdere transmembraan segmenten). Deze eiwitten kunnen onoplosbare worden wanneer geïncubeerd bij 41 verhoogde temperaturen. Dus voor de analyse van dergelijke eiwitten, lysaten worden geïncubeerd bij lagere temperaturen (bijvoorbeeld 37 ° C - 70 ° C) gedurende 10 - 30 min, zoals empirisch. </li><li> Centrifuge lysaten bij 18.000 xg bij roOM gedurende 1 min om onoplosbaar materiaal te pelletiseren. Het supernatans (oplosbaar geëxtraheerd eiwit) is gereed voor scheiding door SDS-PAGE en daaropvolgende Western-blot analyse. Als alternatief, opslag lysaten bij -20 ° C. </li></ol> 4. Representatieve SDS-PAGE en Western Blotting Procedure (Aangepast van 16) <ol><li> Load eiwitstandaarden molecuulgewicht en empirisch bepaalde hoeveelheid lysaten op een SDS-PAGE gel. OPMERKING: Kies het percentage acrylamide en bis-acrylamide in de SDS-PAGE gel op basis van het molecuulgewicht van het beoogde eiwit. Doorgaans lagere percentage gels zijn beter geschikt voor het oplossen hogere hoogmoleculaire eiwitten. </li><li> Run gel bij 200 V totdat de kleurstof voorkant heeft de onderkant van de gel bereikte. </li><li> Transfer eiwitten uit de gel polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan door natte overdracht bij 20 V gedurende 60-90 min bij 4 ° C. </li><li> Blok membraan door incuberen in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 5% magere melk, schommelen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur of bij 4 ° C overnacht. OPMERKING: microbiële groei in de aanwezigheid van een membraan overnacht geïncubeerd voorkomen, wordt aanbevolen om natriumazide in de blokkerende oplossing omvat bij een uiteindelijke concentratie van 0,02%. </li><li> Incubeer het membraan met primaire antilichaam specifiek voor eiwit van interesse in TBS met 0,1% Tween-20 (TBS / T) en 1% magere melk, schommelen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Was membraan bij kamertemperatuur 3 x 5 min met TBS / T, schommelen. </li><li> Incubeer het membraan met geschikte fluorofoor-geconjugeerd secundair antilichaam in TBS / T met 1% magere melk bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, schommelen. LET OP: fluoroforen lichtgevoelig. Derhalve verdunningen van antilichamen geconjugeerd met fluoroforen worden bereid in het donker en incubatie van membranen bij aanwezigheid van antilichamen geconjugeerd met fluoroforen en daaropvolgende wasstappen optreedt in lichtdichte (bijvoorbeeld in folie verpakte) containers. </li><li> Was membraan bij kamertemperatuur 3 x 5 min met TBS / T, schommelen. </li><li> Afbeelding membraan met behulp van LI-COR Odyssey CLX en beeld Studio-software (of vergelijkbare imaging apparatuur en software), naar aanleiding van aanbevelingen van de fabrikant. </li><li> Nabeeld membraan verkrijgen Incubeer het membraan met een primair antilichaam specifiek voor een beladingscontrole eiwit in TBS / T met 1% magere melk bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, schommelen. </li><li> Was membraan bij kamertemperatuur 3 x 5 min met TBS / T, schommelen. </li><li> Incubeer het membraan met geschikte fluorofoor-geconjugeerd secundair antilichaam in TBS / T met 1% magere melk bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, schommelen. </li><li> Was membraan bij kamertemperatuur 3 x 5 min met TBS / T, schommelen. </li><li> Beeld Membraan voor stap 4,9. </li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit artikel wordt een methode voor het analyseren van eiwitafbraak kinetiek gepresenteerd. Deze techniek kan gemakkelijk worden toegepast op een reeks van proteïnen gedegradeerd door verschillende mechanismen. Het is belangrijk op te merken dat cycloheximide chase experimenten rapporteren afbraakkinetiek van de steady state pool van een bepaald eiwit. Andere technieken kunnen worden gebruikt om de afbraak kinetiek van specifieke populaties van eiwitten te analyseren. Zo kan bijvoorbeeld de afbrekende lot van ontluike...

Eiwitten uit te voeren cruciale functies in vrijwel elke cellulaire proces. Vele fysiologische processen vereisen de aanwezigheid van een specifiek eiwit (of eiwitten) voor een bepaalde periode of onder bepaalde omstandigheden. Organismen daarom controleren en reguleren eiwit overvloed aan mobiele behoeften 1 te voldoen. Bijvoorbeeld, cyclinen (eiwitten die celdeling) aanwezig op specifieke fasen van de celcyclus en het verlies van cycline gereguleerde niveau is geassocieerd met kwaadaardige tumorvorming 2. Naast het reguleren van eiwit niveaus om cellulaire behoeften te voldoen, cellen in dienst afbrekende kwaliteitscontrole mechanismen om verkeerd gevouwen, niet gemonteerd of anderszins afwijkende eiwitmoleculen 3 te elimineren. Controle van eiwit overvloed impliceert regulering van beide macromoleculaire synthese (transcriptie en vertaling) en afbraak (RNA verval en proteolyse). Gestoorde of overmatige afbraak van eiwitten bijdraagt ​​aan meerdere pathologieën, Waaronder kanker, cystische fibrose, neurodegeneratieve aandoeningen en cardiovasculaire aandoeningen 4-8. Proteolytische mechanismen vertegenwoordigen daarom veelbelovende therapeutische doelwitten voor een reeks van ziekten 9-12. Analyse van eiwitten op een enkel tijdstip (bijvoorbeeld door western blot 13, 14 flowcytometrie of fluorescentiemicroscopie 15) geeft een overzicht van de steady-state-eiwit overvloed zonder het openbaren van de relatieve bijdrage van de synthese of degradatie. Evenzo groei gebaseerde reporter assays tijdens steady state eiwitniveaus over een langere tijdsperiode zonder onderscheid tussen de invloeden van de synthese en degradatie 15-20. Het is mogelijk de bijdrage van afbrekende processen steady state eiwitniveaus afgeleid door vergelijking overvloed voor en na remming van specifieke onderdelen van de afbrekende mechanisme (bijvoorbeeld door het inactiveren farmacologisch proteasome 21 of het uitspelen van een gen dat de hypothese vereist zijn voor de afbraak 13). Een verandering in de steady state eiwitniveaus na remmen afbraakroutes sterk bewijs voor de bijdrage van proteolyse de controle eiwitgehalte 13. Echter, een dergelijke analyse nog steeds geen informatie verstrekken over de kinetiek van de omzet eiwit. Cycloheximide chase gevolgd door western blotting overwint deze tekortkomingen doordat onderzoekers om eiwitafbraak te visualiseren in de tijd 22-24. Omdat verder eiwitdetectie volgende cycloheximide chase typisch uitgevoerd door middel van Western blotting, radioactieve isotopen en langdurige immunoprecipitatie stappen niet vereist voor cycloheximide chase, in tegenstelling tot veel gangbare pulse chase technieken, die eveneens uitgevoerd om eiwitafbraak 25 te visualiseren. Cycloheximide werd eerst geïdentificeerd als een verbinding met anti-schimmel juistebanden geproduceerd door de gram-positieve bacterie Streptomyces griseus 26,27. Het is een cel-permeabel molecuul dat specifiek eukaryote cytosolische (maar niet organellen) vertaling remt door afbreuk ribosomale translocatie 28-31. In een cycloheximide chase experiment wordt cycloheximide toegevoegd aan cellen en monsters van cellen onmiddellijk op specifieke tijdstippen na toevoeging van de verbinding 22 verzameld. Cellen worden gelyseerd en eiwitgehalte op elk tijdstip geanalyseerd, typisch door western blot. Afneemt eiwitgehalte na toevoeging van cycloheximide veilig kan worden toegeschreven aan eiwitafbraak. Een instabiele eiwit zal afnemen in overvloed in de tijd, terwijl een relatief stabiele eiwit weinig verandering in overvloed zal vertonen. Mechanismen van selectieve afbraak van eiwitten zijn sterk geconserveerd in heel Eukarya. Veel van wat bekend is over eiwitafbraak werd voor het eerst geleerd inhet model eencellige eukaryoot, Saccharomyces cerevisiae (gist) 25,32-36. Studies met gist zijn waarschijnlijk blijven leveren nieuwe en belangrijke inzichten in eiwitafbraak. Werkwijze voor cycloheximide chase in gistcellen gevolgd door Western blot analyse van eiwitten overvloed wordt hier gepresenteerd.

<table><tbody><tr><td>Gewensen giststammen, plasmiden, standaardmedium en buffercomponenten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weggeef borosilicaat glasbuizen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>Beschikbaar bij verschillende fabrikanten</td></tr><tr><td>Temperatuurgeregelde incubator (bv Heratherm Incubator Model IMH180)</td><td>Dot Scientific</td><td>51028068</td><td>Beschikbaar bij verschillende fabrikanten</td></tr><tr><td>New Brunswick verwisselbare trommel voor 18 mm buizen (buisrol)</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-0450</td><td>Een buisrol wordt aanbevolen om overnacht starters van gistcellen in suspensie te houden. Als een buisrol niet beschikbaar is, kan een platform shaker in een temperatuurgestuurde incubator worden gebruikt voor overnacht starters. Een platform shaker of buisrol kan worden gebruikt om grotere culturen in suspensie te houden.</td></tr><tr><td>New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 H</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-4004</td><td>Voor gebruik met buisrol</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spectrofotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>Beschikbaar bij verschillende fabrikanten</td></tr><tr><td>Centrifuge 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216&nbsp;</td><td>Rotor die met het apparaat wordt verkocht, past 1,5 en 2,0 ml microcentrifugebuizen. Rotor kan worden vervangen door een die 15 en 50 ml kegelbuizen bevat</td></tr><tr><td>Vaste hoekrotor F-35-6-30 met deksel en adapters voor centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml kegelbuizen, 6-plaats</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>15-ml schermdruk schroefdopbuis 17 x 20 mm kegelvormig, polypropyleen</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>Beschikbaar bij verschillende fabrikanten</td></tr><tr><td>1,5-ml flex-buis, PCR-schoon, natuurlijke microcentrifugebuizen</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>Beschikbaar bij verschillende fabrikanten</td></tr><tr><td>Analoge Dri-Bath Verwarmers</td><td>Fisher Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>Het wordt aanbevolen dat twee verwarmers beschikbaar zijn (een voor het incuberen van cellen tijdens cycloheximidebehandeling en een voor het koken van lysaten om eiwitten te denatureren). Als alternatief kan een waterbad van 30 &deg;C worden gebruikt voor het incuberen van cellen in aanwezigheid van cycloheximide. Een kokend waterbad met hot plate kan als alternatief worden gebruikt om eiwitten te denatureren.</td></tr><tr><td>Verwarmingsblok voor 12 x 15 ml kegelbuizen</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-473-70</td><td>Voor gebruik met Dri-Bath Heater tijdens het incuberen van cellen in aanwezigheid van cycloheximide.</td></tr><tr><td>Verwarmingsblok voor 20 x 1,5 ml kegelbuizen</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-9Q</td><td>Voor gebruik met Dri-Bath Heater om lysaten te koken voor eiwitdenaturatie.</td></tr><tr><td>SDS-PAGE-apparaten voor draaien en overbrengen, voedingen en beeldvormingsapparatuur of donkere kamers voor SDS-PAGE en overbrengen naar membraan</td><td></td><td></td><td>Wisselt per lab en toepassing</td></tr><tr><td>Western blot beeldvormingssysteem (bv Li-Cor Odyssey CLx scanner en Image Studio Software)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>Wisselt per lab en toepassing</td></tr><tr><td>EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranen</td><td>Fisher Scientific</td><td>IPFL00010</td><td>Wisselt per lab en toepassing</td></tr><tr><td>Primaire antilichamen (bv Fosfoglyceraat Kinase (Pgk1) Monoklonaal antilichaam, muis (klon 22C5D8))</td><td>Life Technologies</td><td>459250</td><td>Wisselt per lab en toepassing</td></tr><tr><td>Secundaire antilichamen (bv Alexa-Fluor 680 Konijn Anti-Muis IgG (H + L))</td><td>Life Technologies</td><td>A-21065</td><td>Wisselt per lab en toepassing</td></tr></tbody></table>

cycloheximide chase analyse van de afbraak van eiwitten in<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulering van eiwit overvloed is cruciaal voor vrijwel elke cellulaire proces. Eiwitgehalte weerspiegelt de integratie van de snelheden van eiwitsynthese en eiwitafbraak. Veel assays rapportage over eiwit overvloed (bijvoorbeeld één tijdstip western blotting, flowcytometrie, fluorescentie microscopie, of-groei op basis reporter assays) geen discriminatie van de relatieve effecten van de vertaling en proteolyse op eiwitgehalten niet toestaan. Dit artikel beschrijft het gebruik van cycloheximide chase gevolgd door Western blotting om specifiek wat eiwitafbraak in het model eencellige eukaryoot, Saccharomyces cerevisiae (gist). In deze procedure worden gistcellen geïncubeerd in aanwezigheid van de translationele remmer cycloheximide. Hoeveelheden van cellen onmiddellijk verzameld na en op specifieke tijdstippen na toevoeging van cycloheximide. Cellen worden gelyseerd en de lysaten worden gescheiden door polyacrylamidegelelektroforese for western blot analyse van eiwitten overvloed op elk tijdstip. De cycloheximide chase werkwijze maakt visualisatie van de afbraakkinetiek van de steady state populatie van verschillende cellulaire eiwitten. De procedure kan worden gebruikt om de genetische behoefte en omgevingsinvloeden op eiwitafbraak onderzoeken.

Om cycloheximide chase methoden illustreren de stabiliteit van -Sec62 ° 1 (figuur 1), een model gist endoplasmatisch reticulum (ER) geassocieerde afbraak (ERAD) substraat werd geanalyseerd 42-44. In ERAD, kwaliteitscontrole ubiquitine ligase enzymen covalent hechten ketens van het klein eiwit ubiquitine tot afwijkende eiwitten gelokaliseerd in het ER membraan. Dergelijke polyubiquitylated eiwitten worden vervolgens verwijderd uit het ER en afgebroken ...

Het aanbod van eiwitten weerspiegelt de snelheden van zowel eiwitsynthese als eiwitafbraak. Dit artikel beschrijft het gebruik van cycloheximide-chase gevolgd door western blotting om eiwitafbraak te analyseren in het model eencellige eukaryoot, Saccharomyces cerevisiae (knopgist).

Cycloheximide Chase Analyse van de afbraak van eiwitten in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

Het algemene doel van deze procedure is om de degradatie van de populatie in steady state van een specifiek eiwit in Saccharomyces cerevisiae te visualiseren. Deze methode kan worden gebruikt om de genetische vereisten voor, en milieueffecten op, de degradatie van een eiwit van belang te bepalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat radioactieve isotopen en langdurige immunoprecipitatiestappen niet nodig zijn, in tegenstelling tot pulse-chase technieken, die ook worden gebruikt om eiwitdegradatie te visualiseren.Deze procedure kan worden gebruikt om zowel een endogeen gisteiwit als een eiwit dat vanuit een plasmide wordt tot expressie gebracht, te analyseren. Voor dat laatste wordt de giststam getransformeerd met een plasmide dat het eiwit van belang codeert, volgens een standaardprotocol voor gisttransformatie. Inoculeer de gist in vijf milliliter van het geschikte medium.Incubeer overnacht bij 30 graden Celsius onder rotatie. Meet de volgende ochtend de optische dichtheid bij 600 nanometer, of OD600, van elke overnachtcultuur. Verdun de culturen tot een OD600 van 0,2 in 15 milliliter vers medium.Incubeer bij 30 °C onder schudding tot de cellen de mid-logaritmische groeifase hebben bereikt. Terwijl de gistcellen groeien, bereidt u de cycloheximide chase-procedure voor. Stel een warmteblok dat geschikt is voor 15 ml conische buizen in op 30 °C voor de incubatie van cellen in aanwezigheid van cycloheximide.Voeg water toe aan elke houder van het warmteblok om een efficiënte warmteverdeling naar de culturen te waarborgen, zodanig dat een conische buis van 15 milliliter het waterniveau laat stijgen tot aan, maar niet over, de rand van de houder. Stel een tweede warmteblok in dat geschikt is voor microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter op 95 degrees Celsius voor proteïnedenaturatie na cellysis. Warm vers groeimedium voor tot 30 degrees Celsius.Per tijdstip per te analyseren cultuur is 1,1 milliliter medium nodig. Voeg 50 microliter van 20x Stop Mix toe aan vooraf gelabelde microcentrifugebuisjes. Bereid één buisje voor per tijdstip per te analyseren cultuur.Plaats de buisjes op ijs. Wanneer de gistcellen de mid-logaritmische groeifase hebben bereikt, verzamel dan 2,5 OD600-eenheden van elke cultuur per tijdstip dat geanalyseerd moet worden. Eén OD600-eenheid is gelijk aan de hoeveelheid gist aanwezig in één milliliter cultuur bij een OD600 van 1,0.Centrifugeer de geoogste cellen in 15 milliliter conische buizen bij 3.000 ×g op kamertemperatuur gedurende twee minuten. Verwijder het supernatant. Resuspendeer elke celpellet in één milliliter vers groeimedium van 30 °C per 2,5 OD600 eenheden cellen.Equilibreer de gistcel-suspensies door ze vijf minuten te incuberen in het warmteblok van 30 graden Celsius voordat u start met de cycloheximide-chase. Het meest uitdagende aspect van deze procedure is de timing van de toevoeging van cycloheximide en het verzamelen van cellen voor elk monster. Wij garanderen succes door het opstellen van en het strikt naleven van een tijdsschema voor de toevoeging van cycloheximide en het verzamelen van de cellen.Om de cycloheximide-chase te starten, drukt u op "Start" op de timer. Voeg snel maar zorgvuldig cycloheximide toe aan de eerste gistcel-suspensie tot een eindconcentratie van 250 µg/mL en vortex kort om te mengen. Draag onmiddellijk 950 µL, of ongeveer 2,4 OD600-eenheden, van de gistcel-suspensie met toegevoegd cycloheximide over naar een vooraf gelabelde microcentrifugeebuis die 50 µL ijskoude 20x Stop Mix bevat.Vortex de microcentrifugebuis en plaats deze op ijs tot alle monsters zijn verzameld. Begin de cycloheximide chase zoals gedemonstreerd voor elk van de overige gistcel-suspensies met regelmatige tijdsintervallen. Vortex bij elk opeenvolgend tijdstip de gistcel-suspensies en breng 950 microliters over naar gelabelde microcentrifugebuizen die 50 microliters voorkoelde 20x Stop Mix bevatten.Vortex en plaats de verzamelde cellen op ijs. Om bezinking van de gistcellen te voorkomen, worden de celsuspensies in de 15 milliliter conische buizen gedurende de chase ongeveer elke vijf minuten gevortexd. Wanneer alle monsters zijn verzameld, worden de verzamelde cellen gepellet door centrifugatie bij 6.500 ×g en kamertemperatuur gedurende 30 seconden.Verwijder het supernatant door middel van pipetteren of aspiratie. De cellen zijn nu klaar voor alkalische lysis. Bereid de cellen voor op alkalische lysis door 100 µL gedestilleerd water aan elk celpellet toe te voegen en resuspendeer door herhaaldelijk te pipetteren.Voeg 100 µL 0,2 M natriumhydroxide toe aan elk monster. Meng door te vortexen. Incubeer de cellen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.In dit stadium zijn de gistcellen nog niet gelyseerd en zijn de eiwitten nog niet vrijgekomen. Pelleteer vervolgens de cellen door centrifugatie bij 18, 000 ×g bij kamertemperatuur gedurende 30 seconden. Verwijder het supernatant door middel van pipetteren of aspiratie.Voeg 100 µL Laemmli Sample Buffer toe aan elk cellpellet om de cellen te lyseren. Resuspendeer door herhaaldelijk met de pipet op en neer te zuigen. Incubeer vijf minuten bij 95 °C om de eiwitten volledig te denatureren.Centrifugeer de lysaten bij 18, 000 ×g en kamertemperatuur gedurende één minuut om onoplosbaar materiaal te pelletteren. Het supernatant, dat bestaat uit gesolubiliseerd geëxtraheerd eiwit, is klaar voor scheiding via SDS PAGE en daaropvolgende Western blot-analyse. Alternatief kunnen de lysaten worden bewaard bij -20 °C.De stabiliteit van Deg1-Sec62, een model-substraat voor gist-endoplasmatisch reticulum-geassocieerde degradatie, werd geanalyseerd met behulp van de cycloheximide-chase-methode. Het Deg1-Sec62-eiwit migreert op SDS-PAGE als meerdere soorten en wordt snel afgebroken in wild-type cellen. Pgk1 dient als laadcontrole waarvan de abundantie niet varieert onder de geteste condities.Verlies van zowel de ER-residente ubiquitine-ligase hrd1 als het ubiquitine-conjugerende enzym ubc7 stabiliseerde het Deg1-Sec62-eiwit aanzienlijk, wat de eerder waargenomen rol van deze eiwitten bij de degradatie van Deg1-Sec62 bevestigt. Cue1 is een transmembraaneiwit dat ubc7 aan het ER-membraan verankert en het enzym activeert, maar de noodzaak van cue1 bij de degradatie van Deg1-Sec62 is nog niet direct onderzocht. De observatie uit deze studie dat Deg1-Sec62 werd gestabiliseerd bij afwezigheid van cue1, bevestigde een rol voor cue1 bij de ER-geassocieerde degradatie van Deg1-Sec62.Het resultaat van de Western blot werd gekwantificeerd met behulp van imaging-software. Om de abundantie van het Deg1-Sec62-eiwit tussen de monsters te vergelijken, werd voor elk monster de ratio bepaald van de gecorrigeerde signaalintensiteiten van Deg1-Sec62 ten opzichte van Pgk1. Het is belangrijk om te onthouden dat deze procedure het meest direct rapporteert over de degradatiekinetiek van een populatie in steady state van een eiwit van belang.Om de degradatie van de pas gesynthetiseerde populatie van een eiwit van belang te visualiseren, kunnen andere technieken, zoals pulse-chase experimenten, worden gebruikt. Houd er rekening mee dat cycloheximide en natriumazide extreem toxisch zijn en er voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om direct contact met deze chemicaliën tijdens het uitvoeren van deze procedure te vermijden.

cycloheximide-chase-analysis-protein-degradation-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video describes a degradation assay for misfolded proteins using cycloheximide treatment along with detergent fractionation. This method aids in studying the dynamics of misfolded proteins and uncovering the in-depth mechanisms of protein turnover.

Misfolding-Prone Protein Degradation Assay: A Technique to Monitor Misfolded Protein Degradation Using Cycloheximide Treatment and Detergent Fractionation

This video describes an in vitro fluorescence-based microplate assay to study the degradation kinetics of a fluorescently-labeled misfolded luciferase mutant protein expressed in the nuclei of transfected mammalian cells. The assay involves the treatment of cells expressing the fluorescent mutant protein with a translation inhibitor and a proteasome inhibitor to assess the proteasome-mediated degradation of the misfolded protein.

Fluorescence Microplate-Based Cycloheximide Chase Assay: A Technique to Monitor the Degradation Kinetics of Fluorescent Nuclear Misfolded Proteins

Hier beschrijven we een robuuste biologische test voor het kwantificeren van de relatieve snelheid van proteolyse door het ubiquitine-proteasoomsysteem. De uitlezing van de test is de groeisnelheid van gist in vloeibare cultuur, die afhankelijk is van de cellulaire niveaus van een reportereiwit dat een afbraaksignaal bevat dat is gefuseerd met een essentiële metabole marker.

-Reporter gebaseerd Growth Assay voor systematische analyse van eiwitafbraak

Dit artikel beschrijft een op groei gebaseerde gisttest voor de bepaling van genetische vereisten voor eiwitafbraak. Het demonstreert ook een methode voor snelle extractie van gisteiwitten, geschikt voor western blotting om biochemisch de afbraakvereisten te bevestigen. Deze technieken kunnen worden aangepast om de afbraak van een verscheidenheid aan eiwitten te monitoren.

-Groei op basis Vaststelling en Biochemische Bevestiging van Genetische Eisen voor de afbraak van eiwitten in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Dit rapport beschrijft protocollen voor het meten van degradatiesnelheden van verkeerd gevouwen eiwitten door middel van western blot of fluorescentie-gebaseerde assays. De methoden kunnen worden toegepast op de analyse van andere verkeerd gevouwen eiwitten en voor high-throughput screening.

Assays voor de afbraak van Misfolded Eiwitten in Cellen

We beschrijven chromatin endogene splitsing gekoppeld aan high-throughput sequencing (ChEC-seq), een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) -orthogonale methode voor het mappen van eiwitbindingsplaatsen genoom-wijd met micrococculaire nuclease (MNase) fusie-eiwitten.

Genoom-wide mapping van eiwit-DNA-interacties met ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Hier presenteren we een protocol voor het effectief en specifiek afbreken van een eiwit van belangstelling voor de gist Saccharomyces cerevisiae met behulp van het β-est hulpsysteem.

Afstemmings degradatie om een specifieke en efficiënte eiwit depletie te bereiken

Dit artikel presenteert een kleinschalig plasmamembraanisolatieprotocol voor de karakterisering van Candida albicans ABC (ATP-binding cassette) eiwit Cdr1, overexpressie in Saccharomyces cerevisiae. Een protease-breekbare C-terminal mGFPHis dubbele tag met een 16-residu linker tussen Cdr1 en de tag is ontworpen om de zuivering en detergent-screening van Cdr1 te vergemakkelijken.

Kleinschalige plasmamembraanvoorbereiding voor de analyse van Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Ondanks recente vooruitgang blijven veel mitochondriale gisteiwitten nog steeds met hun functies volledig onbekend. Dit protocol biedt een eenvoudige en betrouwbare methode om de submitchondriale lokalisatie van eiwitten te bepalen, wat fundamenteel is geweest voor de opheldering van hun moleculaire functies.

Beoordeling van submitchondrial protein localization in ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae

Dit protocol beschrijft twee methoden voor het stoppen van de gistcelcyclus en optionele afgifte, en gaat dieper in op het gebruik van fluorescentiemicroscopie om celcyclusafhankelijke processen in S. cerevisiae te bestuderen.

Manipulatie en analyse van celcyclusafhankelijke processen in ontluikende gist

Leer de cycloheximide chase methode voor eiwitafbraakanalyse in Saccharomyces cerevisiae met westerse blottechniek. Deze eenvoudige aanpak vervangt radioactieve isotopen en vereenvoudigt het bestuderen van eiwitstabiliteit in gist.

Cycloheximide Chase Analyse van de afbraak van eiwitten in

Meer video's verkennen