Sequentiële Toepassing van dekglaasjes naar de Samenpersende stijfheid van de Muis Lens Assess: Strain en Morfometrische Analyses
3 mei 2016
Leeftijdsgerelateerde toenames in de stijfheid van het ooglens zijn gekoppeld aan presbyopie. Dit protocol beschrijft een eenvoudige, kosteneffectieve methode voor het meten van de stijfheid van muizenlenzen. Muizenlenzen worden, net als menselijke lenzen, stijver met de leeftijd. Deze methode is nauwkeurig en kan worden aangepast voor lenzen van grotere dieren.
Het algemene doel van deze procedure is om de compressieve stijfheid en geometrie van muizenlenzen te evalueren met behulp van een eenvoudige en goedkope aanpak. Deze methode kan belangrijke vragen in het lensgebied beantwoorden. Zoals hoe verschillende genetische en experimentele verstoringen de biomechanische eigenschappen van lenzen beïnvloeden.
De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het precies, reproduceerbaar is en geen dure of gespecialiseerde apparatuur vereist. Deze methode biedt inzicht in de eigenschappen van muizenlenzen, met mogelijke toepassing op grotere modelorganismen zoals ratten en konijnen. Visualisatie van de methode is cruciaal omdat stappen zoals lensdissectie en het aanbrengen van een dekglas moeilijk te leren zijn zonder demonstratie.
De procedure wordt gedemonstreerd door Catherine Cheng, een postdoc uit mijn laboratorium. Begin de dissectie met behulp van gekromde pincetten om het weefsel rond het oog van een geëuthaniseerde muis te deprimeren en het oog uit de oogkas te brengen. Verwijder vervolgens het oog en plaats het in een dissectiebakje met vers PBS onder een dissectiemicroscoop.
Snijd de oogzenuw zo dicht mogelijk bij het oogbol af. En steek voorzichtig en zorgvuldig fijne, rechte pincetten door het oogbol door het gat waar de oogzenuw het achterste deel van het orgaan verlaat. Maak voorzichtig een incisie met een schaar van het achterdeel naar de rand van het hoornvlies, zorg ervoor dat u het lens niet beschadigt.
Vervolg de incisie langs de verbinding tussen het hoornvlies en het sclera, minimaal de helft rond het oogbol. En druk voorzichtig op het hoornvlies om het lens uit het oog door de opening te verwijderen. Gebruik vervolgens fijne, rechte pincetten om voorzichtig eventueel groot puin dat nog aan het lens vastzit te verwijderen.
En controleer visueel of het lens geen schade heeft. Gebruik ten minste twee uur voor het begin van de stijfheidsmetingen een analytische weegschaal om ten minste 10 dekglazen uit dezelfde doos te wegen. Bepaal het gemiddelde gewicht van de dekglazen.
Bevochtig vervolgens de dekglazen en een rechthoekige spiegel in PBS op kamertemperatuur. Terwijl de materialen worden gehydrateerd, vul de meetkamer met 65 tot 75 milliliter PBS. Plaats de kamer vervolgens onder een dissectiemicroscoop ingesteld op 30 x vergroting, met verlichting vanaf de bodem en een glasvezellichtbron aan de linker- en rechterkant.
Wanneer de dekglazen klaar zijn, plaats de rechthoekige spiegel in de kamer op een constante afstand van de uitsparing die zal worden gebruikt om het lens vast te houden. Gebruik vervolgens gekromde pincetten om de gedissekteerde lenzen voorzichtig naar de meetkamer over te brengen. Stel de voeding van de krachtoptica in op 80% van de maximale lichtopbrengst en pas de uitgang van de voeding aan op basis van de omgevingsverlichting, gebruikersvoorkeur en beeldkwaliteit indien nodig.
Verkrijg bovenopnamebeelden van de onbelaste lenzen van direct boven de kamer. Neem vervolgens een foto van de rand van de spiegel in focus, gevolgd door een zijopname van het onbelaste lens door de spiegel buiten de uitsparing. Plaats vervolgens een lens in de uitsparing en controleer of de lens veilig en recht binnen de uitsparing op de anterieure of posterieure pool zit.
Maak een foto van het lens in de spiegel. Plaats vervolgens voorzichtig een dekglas op het lens. Neem na twee minuten nog een zijopname van de geladen lens.
Ga door met het toevoegen van dekglazen en neem twee minuten na het toevoegen van elk dekglas zijopnamefoto's, totdat het totaal van 10 dekglazen is toegepast. Verwijder vervolgens alle dekglazen, wacht nog eens twee minuten en verkrijg zijopnamefoto's van de lens binnen en buiten de uitsparing. En een bovenopname van de lens buiten de uitsparing.
Om de lensnucleusgrootte te bepalen, plaats een lens in een schone petrischaal gevuld met PBS en gebruik fijne, rechte pincetten om het lens voorzichtig te ontkapselen. Om de corticale vezelcellen uit te schakelen, rolt u het lens tussen behandschoende vingers. Spoel vervolgens voorzichtig de lensnucleus in de PBS en plaats de nucleus terug in de meetkamer.
Verkrijg een afbeelding van de lensnucleus via de rechthoekige spiegel. Gebruik ten slotte de juiste beeldanalysesoftware om de equatoriale en axiale diameters van de lenzen voor en na elke laadfase te meten. Meet ook de diameter van elke lensnucleus.
In dit representatieve experiment werden de stijfheid en afmetingen van twee, vier en acht maanden oude muizenlenzen gemeten en de axiale en equatoriale spanningen werden berekend. De axiale spanning is een logaritmische functie van de toegepaste belasting met een statistisch significante, leeftijdsafhankelijke afname van de axiale en equatoriale spanningen onder de maximale toegepaste belasting, wat aangeeft dat de muizenlens met de leeftijd stijf wordt. De beeldgegevens die tijdens dit experiment zijn verzameld, werden ook gebruikt om verschillende andere morfologische kenmerken van de lens te bepalen.
Zoals verwacht, namen de axiale en equatoriale diameters en het lensvolume met de leeftijd toe. De verhouding geeft aan dat het lens een iets grotere equatoriale diameter heeft dan de axiale diameter. En deze parameter veranderde niet met de leeftijd.
De diameter, het volume en het aandeel van de lensnucleus nemen toe met de leeftijd, wat suggereert dat de lensnucleus zich hermodelleert om in relatieve grootte toe te nemen naarmate het lens ouder wordt. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden voltooid in 30 tot 45 minuten per lens, indien correct uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het lens gelijkmatig in de uitsparing te plaatsen en het lens twee minuten tussen elke extra dekglas te laten ontspannen.
Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de compressieve stijfheid en morfometrie van muizenlenzen kunt beoordelen met behulp van de sequentiële toepassing van dekglazen. Deze precieze, eenvoudige en goedkope techniek baant de weg voor lensonderzoekers om de biomechanische effecten van genmutaties bij muizen te onderzoeken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een eenvoudige en kosteneffectieve methode voor het meten van de stijfheid van muizenlenzen, die, net als menselijke lenzen, stijver worden met de leeftijd. De techniek is nauwkeurig en kan worden aangepast voor gebruik met lenzen van grotere dieren.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Biomechaniek
Achtergrond
- Leeftijdgerelateerde toename van lensstijfheid is geassocieerd met presbyopie.
- Begrip van de biomechanische eigenschappen van lenzen is cruciaal voor het aanpakken van visueel-gerelateerde problemen.
- Muizenlenzen dienen als model voor het bestuderen van lensstijfheid en de implicaties daarvan.
- De methode kan worden toegepast op grotere modelorganismen, waardoor de relevantie wordt vergroot.
Doel van het onderzoek
- Om de compressieve stijfheid en geometrie van muizenlenzen te evalueren.
- Om te onderzoeken hoe genetische en experimentele factoren de lenseigenschappen beïnvloeden.
- Om een reproduceerbare methode te bieden die geen dure apparatuur vereist.
Gebruikte methoden
- Meting van de compressieve stijfheid van muizenlenzen.
- Evaluatie van lensgeometrie.
- Toepassing van een eenvoudige en goedkope benadering.
- Visualisatie van lensdissectie en de toepassing van de dekglastechniek.
Belangrijkste resultaten
- De methode toont precisie en reproduceerbaarheid bij het meten van lensstijfheid.
- De verkregen inzichten kunnen studies over lenseigenschappen bij verschillende soorten informeren.
- Visualisatie helpt bij het begrijpen van complexe dissectietechnieken.
- Potentiële toepassingen strekken zich uit tot grotere diermodellen.
Conclusies
- Deze methode biedt waardevolle inzichten in lensbiomechanica.
- Het is een kosteneffectieve tool voor onderzoekers in het veld.
- Verdere studies kunnen deze benadering gebruiken om genetische en experimentele effecten op lenseigenschappen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of lens compressive stiffness using sequential glass coverslips enables precise biomechanical characterization in genetically engineered mouse models. This reproducible, scalable method supports early-stage target validation and mechanistic de-risking for ocular disease research. Its cost-effectiveness and adaptability position it as a reusable capability for preclinical R&D pipelines focused on lens pathologies and age-related biomechanical changes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of genetic and experimental perturbations on lens biomechanics.
- Supports functional target validation by quantifying age- and mutation-dependent changes in lens stiffness.
- Facilitates mechanistic de-risking for ocular disease models by providing direct biomechanical readouts.
Screening & Assay Development
- Prepares validated ex vivo lens systems for downstream compound or genetic screening.
- Delivers standardized, quantitative strain and morphometric outputs for assay reproducibility.
- Supports scalability and platform reuse across different animal models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker development by modeling age-related biomechanical changes relevant to human lens pathologies.
- Enables continuity from genetic discovery to preclinical validation in lens research.
- Provides predictive confidence for advancing lens-targeted interventions.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for ocular research, supporting hypothesis testing, target validation, and translational modeling.
- Discovery Biology: Quantifies biomechanical effects of genetic or experimental manipulations in mouse lenses.
- Screening: Offers reproducible, quantitative strain and morphometric measurements for assay development.
- Analytics: Provides statistical outputs for comparing age groups, genotypes, or interventions.
- Translational Research: Models age-related lens stiffening, informing biomarker alignment for human disease.
- Enterprise Reuse: Adaptable for larger animal models, supporting cross-program standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in lens biomechanics.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable biomechanical assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in ocular portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic targets and interventions for lens pathologies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lens dissection and precise application of compressive loads.
- Needs basic imaging and analytical infrastructure for morphometric analysis.
- Demands cross-team standardization for reproducibility across studies and models.
- Adaptable to larger animal models with protocol adjustments.
- Dependent on careful handling to avoid lens damage and ensure data quality.
