High Content Screening Analyse van de toxicologische effecten van schadelijke en potentieel schadelijke bestanddelen Evalueren (HPHC)
10 mei 2016
Het doel van het onderzoek was om de biologische impact van 15 bestanddelen van sigarettenrook te beoordelen door middel van een combinatie van een impedantie-gebaseerde real-time celanalysator en een op hoogwaardige inhoud gebaseerde (HCS)-platform voor toxicologische beoordeling in vitro. Dit onderzoek biedt informatie over effectieve doseringen, toxiciteit en werkingsmechanismen van de geteste verbindingen.
Het algemene doel van deze aanpak, die een Impedantie-Gebaseerde Real Time Cel Analyzer combineert met een Hoog Inhoud Screening-Gebaseerde Platform, is om informatie te verstrekken over effectieve doses, toxiciteit en biologische effecten, om het Tox Profiel van de geteste verbindingen te verkrijgen. Deze aanpak kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van toxicologie. Met betrekking tot bijvoorbeeld cytotoxiciteit, genotoxiciteit en cellulaire stressreacties.
Bovendien levert het niet alleen informatie over meerdere biochemische en morfologische parameters tegelijk, het kan ook worden toegepast op een ander scala van celtypen en celcultuurmodellen. Vanwege jurisdictie en beperkingen, zal de volledige aanpak worden uitgevoerd terwijl alleen een klein stukje verbinding wordt beoordeeld. Om dezelfde reden, zal er slechts één protocol worden getoond voor het demonstreren van de Hoog Inhoud Screening Beoordeling.
De procedure zal worden gedemonstreerd door Stefano Acali en Alexander Laurent, technici uit mijn laboratorium. Om de normale humane bronchiale epitheelcellen, of NHBE-cellen, te zien, programmeert u het instrument om het aantal en de duur van de impedantiemetingen te definiëren. In deze studie worden gegevens elke 15 minuten gedurende 48 uur opgenomen.
Meet de achtergrond van de plaat door 50 microliter voorverwarmd medium in elke put van een 96-wels RTCA-plaat te pipetteren. Deze stap vertegenwoordigt een technische vereiste voor het instrument om de elektrische weerstand van het medium te berekenen om als referentiebasis te gebruiken voor celgebaseerde berekeningen. Voeg vervolgens 50 microliter celsuspensie met een concentratie van 144.000 cellen per milliliter toe aan het medium dat al in elke put van de RTCA-plaat staat.
Zodra de cel is verwarmd, is het erg belangrijk om de plaat 40 minuten op kamertemperatuur te laten staan om de cellen te laten hechten en een homogene celverdeling te verkrijgen. Incubeer de RTCA-platen in de wieg in de incubator en begin met het opnemen van gegevens voor de volgende 24, plus of min twee uur, vóór het doseren. Voor de positieve controle verdunt u de 10 millimolair staurosporine stamoplossing, één op tien, in DMSO.
Voeg vijf microliter van de verdunning toe aan 195 microliter medium om een 5x werkoplossing te verkrijgen. Voor de schadelijke en potentieel schadelijke bestanddelen, lost u elk van hen op in het voertuig om een eenmolaire stamoplossing te genereren. Verdun vervolgens elke testsubstantie stamoplossing, één op tien, in medium om een 100 millimolair oplossing te genereren.
Genereer de verbindingsmasterplaat door eerst medium plus 10% voertuig toe te voegen in putten van B tot F en de 100 millimolair oplossing in put A. Voer een vijf-staps, één op tien, seriële verdunning uit om de 5x werkoplossingen te verkrijgen. Voor het doseren, pauzeert u het RTCA-instrument, opent u de wieg om de blootstellingsplaat te verwijderen en plaatst u de plaat in het RTCA temperatuurgereedschap om afkoeling van de cellen te voorkomen, wat de impedantiemeting zou kunnen beïnvloeden. Voeg 25 microliter van de 5x oplossing van de Compound master plate toe aan de cellen in triplicaat, waarbij dezelfde doseervolgorde wordt gehandhaafd als in de Compound master plate.
Verwijder het bestaande celkweekmedium niet. Voeg vervolgens 25 microliter van de 5x Positive control oplossing toe aan de cellen in de rechterhelft van de onderste rij, zonder het bestaande kweekmedium te verwijderen. Voeg op dezelfde manier 25 microliter medium toe aan de cellen in de linkerhelft van de onderste rij.
Na het afdichten van de plaat met de plaatverzegeling, plaatst u de plaat terug in de RTCA-wieg en vergrendelt u deze. Start de gegevensopname opnieuw voor de gewenste blootstellingstijd. Na het opnemen van gegevens, analyseert u de RTCA celviabiliteitsgegevens om te bepalen welke testsubstantie te gebruiken is in de HCS-analyse.
In dit experiment zijn 1-aminonaftaleen, Arseen, Chroom en Crotonaldehyde geselecteerd voor HCS-analyse. Om de NHBE-cellen te zien, voegt u 100 microliter van een celsuspensie toe met 120.000 cellen per milliliter aan elke put van een 96-wels zwarte plaat. Laat de HCS-plaat 30 minuten op kamertemperatuur staan om cellen te laten hechten aan de putten, en incubeer bij 37 graden Celsius en 5%CO2 gedurende 24, plus of min twee uur, vóór het doseren.
Voor de positieve controle, doseert u 40 microliter van de stamoplossing van elke positieve controle in kolom twee. Doseer vervolgens 20 microliter van het voertuig in kolommen drie en vijf. En 40 microliter van het voertuig in kolom vier.
Haal 12 microliter uit de putten in kolom twee, doseer het in de putten in kolom drie en meng. Ga door tot een laatste seriële verdunning met drie doses en voertuig voor elke positieve controleverbinding is verkregen. Om de positieve controlep plaat te genereren, bereidt u een verdunning van één op veertig in media van de drie doses en voertuig.
Om de verbindingsmasterplaat te maken, resuspendeert en verdunt u elke testsubstantie stamoplossing, één op tien in medium voor een concentratie van 100 millimolair. Voer verdunningen uit met medium met 10% voertuig om de geselecteerde 5x doses voor elke testsubstantie te verkrijgen. Zowel positieve controles als verbindingsplaat zijn nu klaar om over de blootstellingsplaat te worden gedoseerd.
Voeg vervolgens 25 microliter van de 5x oplossingen van de Compound master plate toe aan de cellen in triplicaat, waarbij dezelfde doseervolgorde wordt gehandhaafd als in de Compound master plate. Verwijder het bestaande celkweekmedium niet. Voeg vervolgens 25 microliter van de 5x oplossing van de Positive control plate toe aan de cellen in de onderste rij, waarbij dezelfde doseervolgorde wordt gehandhaafd als in de Positive control plate.
Bereid een voldoende volume van de levende-celkleuringsoplossing voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Verdun vervolgens zowel de mitochondriënkleurstof als de membraanpermeabilite
Overzicht
Deze studie onderzoekt de biologische effecten van 15 bestanddelen van sigarettenrook met behulp van een impedantie-gebaseerde real-time celanalysator en een hoogwaardig screeningsplatform. Het onderzoek heeft tot doel inzichten te verschaffen in effectieve doseringen, toxiciteit en werkingsmechanismen van deze verbindingen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Toxicologie
- Celbiologie
- Milieugezondheid
Achtergrond
- Sigarettenrook bevat talrijke schadelijke bestanddelen.
- Het begrijpen van de effecten van deze verbindingen is cruciaal voor de volksgezondheid.
- Impedantie-gebaseerde analyse maakt real-time monitoring van celreacties mogelijk.
- Hoogwaardig screening biedt gedetailleerde inzichten in cellulaire effecten.
Doel van het onderzoek
- Om de toxiciteit van sigarettenrookbestanddelen te beoordelen.
- Om effectieve doseringen en werkingsmechanismen te bepalen.
- Om een uitgebreid toxicologisch profiel van de verbindingen te ontwikkelen.
Gebruikte methoden
- Impedantie-gebaseerde real-time celanalyse voor cytotoxiciteitsbeoordeling.
- Hoogwaardig screening voor evaluatie van cellulaire reacties.
- Gebruik van normale menselijke bronchiale epitheelcellen voor testen.
- Gegevensopname elke 15 minuten gedurende 48 uur.
Belangrijkste resultaten
- Effectieve doseringen voor verschillende schadelijke bestanddelen geïdentificeerd.
- Cytotoxiciteit en cellulaire stressreacties waargenomen.
- Geselecteerde verbindingen voor verdere hoogwaardige screeningsanalyse.
- Een raamwerk voor het beoordelen van meerdere biochemische parameters geboden.
Conclusies
- De gecombineerde aanpak evalueert effectief de toxiciteit van sigarettenrookbestanddelen.
- De resultaten dragen bij aan het begrijpen van de biologische impact van deze verbindingen.
- De bevindingen kunnen leiden tot regelgevende beslissingen en volksgezondheidsbeleid.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Assessing the toxicological profiles of individual cigarette smoke constituents enables mechanistic de-risking in early discovery by clarifying pathway-specific effects. This approach supports predictive confidence in target validation by linking compound exposure to defined cellular outcomes such as mitochondrial dysfunction, genotoxicity, oxidative stress, and kinase activation. The integration of impedance-based and high-content screening provides a scalable, reproducible workflow for prioritizing harmful constituents in tobacco product evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking constituent exposure to specific mechanisms like mitochondrial damage and histone H2AX phosphorylation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative LD50 determination and real-time viability tracking.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying constituents with computable toxicity profiles for further mechanistic study.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, multiparametric readouts including cell index, mitochondrial mass, cytochrome C release, and membrane permeability.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility via standardized staining protocols and automated imaging on HCS platforms.
- Scalability: Enables parallel processing of multiple plates, supporting medium-throughput screening of toxicant libraries.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Uses disease-relevant normal human bronchial epithelial cells to model respiratory toxicity.
- Mechanistic Continuity: Links early cytotoxicity signals to downstream genotoxic and stress pathway activations for risk-adjusted decision-making.
- Predictive De-risking: Identifies constituent-specific biomarkers such as phosphorylated H2AX and cytochrome C translocation for mechanistic profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The method bridges discovery biology and lead identification by providing quantitative toxicity data and mechanistic insights that inform compound selection and optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via real-time impedance measurements and endpoint-specific HCS readouts to clarify mechanisms of action.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized protocols with quantitative outputs for compound comparison and hit confirmation.
- Analytics: Provides LD50 calculation, dose-response curves, and multiparametric imaging data to enable cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects in vitro findings to respiratory disease models through use of NHBE cells and pathway-specific biomarker detection.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable toxicology profiling platform applicable to diverse compound libraries beyond tobacco constituents.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through multiparametric toxicity profiling.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via defined staining, fixation, and imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering early, mechanism-based toxicity data to reduce late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on validated toxicological mechanisms and effective doses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, impedance-based analysis, and high-content screening instrumentation.
- Dependent on access to RTCA and HCS platforms, live-cell dyes, fixation reagents, and automated washers.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols, dosing procedures, and image analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations when extending to other cell types or complex mixtures beyond single HPHCs.
- Limited by the need for compound solubility in vehicle and cytotoxicity thresholds that permit LD50 computation (<20 mM).
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:03
Real Time Cell Analyzer (RTCA)-based Dose Range Finding (DRF)
4:26
Preparation for Measuring Toxicological Effects by High-content Screening (HCS)
6:27
Cytotoxicity Assay
9:19
Results: Representative Results for 1-Aminonaphtalene
10:26
Conclusion
