Name: High Content Screening Analyse van de toxicologische effecten van schadelijke en potentieel schadelijke bestanddelen Evalueren (HPHC) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Leer hoe high-content screening en impedantieanalyse worden gebruikt om de toxiciteit van sigarettenrookbestanddelen te evalueren in humane bronchiale epitheelcellen. Deze methode biedt inzicht in effectieve doses en biologische effecten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag karsta Luettich en Grégory Vuillaume bedanken voor hun herziening van het manuscript.

<ol><li>Rodgman, A., Perfetti, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRodgman%2C+A+%22The+chemical+components+of+tobacco+and+tobacco+smoke%22">The chemical components of tobacco and tobacco smoke</a>. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2013).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+Principles+of+Humane+Experimental+Technique%22">The Principles of Humane Experimental Technique</a>. , Methuen, London. (1959).</li>
<li>Zock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+high+content+screening+in+life+science+research+combinatorial+chemistry+%26+high+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High.+Throughput.+Screen%22%5BJournal%5D)">Applications of high content screening in life science research combinatorial chemistry & high throughput screening.</a> Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 132 (9), 870-876 (2009).</li>
<li>US Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Harmful+and+potentially+harmful+constituents+in+tobacco+products+and+tobacco+smoke%3B+established+list%2C+federal+register%22">Harmful and potentially harmful constituents in tobacco products and tobacco smoke; established list, federal register</a>. , 20034-20037 (2012).</li>
<li>Gonzalez-Suarez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+Biology+Approach+for+Evaluating+the+Biological+Impact+of+Environmental+Toxicants+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Systems Biology Approach for Evaluating the Biological Impact of Environmental Toxicants in Vitro.</a> Chem. Res. Toxicol. 27 (3), 367-376 (2014).</li>
<li>Camilleri-Broet, S., Vanderwerff, H., Caldwell, E., Hockenbery, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+alterations+in+mitochondrial+mass+and+function+characterize+different+models+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct alterations in mitochondrial mass and function characterize different models of apoptosis.</a> Exp. Cell. Res. 239 (2), 277-292 (1998).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c+and+dATP-dependent+formation+of+Apaf-1%2Fcaspase-9+complex+initiates+and+apoptotic+protease+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates and apoptotic protease cascade.</a> Cell. 91 (4), 479-489 (1997).</li>
<li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+strand+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Double strand breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J. Biol. Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li>
<li>Westwick, J. K., Weitzel, C., Minden, A., Karin, M., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+%CE%B1+stimulates+AP-1+activity+through+prolonged+activation+of+the+c-jun+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor α stimulates AP-1 activity through prolonged activation of the c-jun kinase.</a> J. Biol. Chem. 269 (42), 26396-26401 (1994).</li>
<li>Bindokas, V. P., Jordán, J., Lee, C. C., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+production+in+rat+hippocampal+neurons%3A+selective+imaging+with+hydroethidine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Superoxide production in rat hippocampal neurons: selective imaging with hydroethidine.</a> J. Neurosci. 16 (4), 1324-1336 (1996).</li>
<li>Barhoumi, R., Bailey, R. H., Burghardt, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+glutathione+in+anchored+cells+with+monochlorobimane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of glutathione in anchored cells with monochlorobimane.</a> J. Cytometry. 19 (3), 226-234 (1994).</li>
<li>Huang, T. C., Lee, J. F., Chen, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pardaxin+an+antimicrobial+peptide%2C+triggers+caspase-dependent+and+ROS-mediated+apoptosis+in+HT-1080+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Drugs%22%5BJournal%5D)">Pardaxin an antimicrobial peptide, triggers caspase-dependent and ROS-mediated apoptosis in HT-1080 Cells.</a> Mar. Drugs. 9 (10), 1995-2009 (2011).</li>
<li>Bao, S., Knoell, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+modulates+cytokine-induced+lung+epithelial+cell+barrier+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Zinc modulates cytokine-induced lung epithelial cell barrier permeability.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291 (6), L1132-L1141 (2006).</li>
<li>Xia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compound+Cytotoxicity+Profiling+Using+Quantitative+High-Throughput+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Compound Cytotoxicity Profiling Using Quantitative High-Throughput Screening.</a> Environ Health Perspect. 116 (3), 284-291 (2008).</li>
</ol>

Alle auteurs zijn medewerkers van Philip Morris International. Philip Morris International is de enige bron van financiering en sponsor van dit project.

De behoefte aan alternatieven voor dierproeven en voor nieuwe high throughput testen benaderingen zijn uitvoerig besproken in de afgelopen jaren. Dit heeft ertoe geleid dat wetenschappers en regelgevende instanties om alternatieve methoden voor standaard testen van de toxiciteit, met behulp van cellulaire assays die nauw nabootsen de fysiologie van doelweefsels te onderzoeken. In deze studie hebben we de toepassing van een combinatie van een real-time cell analyzer (RTCA) met een hoog gehalte screening (HCS) platform om de effecten van blootstelling aan één CS bestanddelen menselijke longepitheelcellen beoordelen aangetoond. Deze opstelling kan analoog worden toegepast op cytotoxiciteit geïnduceerd door diverse andere zwevende stoffen, zwevende deeltjes en nanodeeltjes evalueren. Bovendien kunnen de verkregen resultaten worden vergeleken met die van hele genoom transcriptomics en computationele werkwijzen op basis van causale biologische netwerken. Zoals eerder gemeld, deze aanpak konden we gegevens over de moleculaire route bevestigenverstoring bij CS blootstelling 5 met HCS eindpunten, het aanpakken van deze route verstoringen ook fenotype. Als een flowchart assay, real-time cel analyse geeft cel-levensvatbaarheid-gerelateerde informatie op een dosis- en tijdsafhankelijke resolutie, die een betere besluitvorming welke dosis en blootstelling tijdstip gunstig voor downstream-analyse 14 kan zijn toelaat. Het principe van de analyse is gebaseerd op veranderingen in elektrische impedantie die door de cellen als ze hechten en verspreid over een kweekputje oppervlak bedekt met een gouden micro-elektrode. De impedantie wordt omgezet in een dimensieloze parameter genaamd cel-index, die kan worden gebruikt om celadhesie te controleren, verspreiding, morfologie en uiteindelijk cellevensvatbaarheid. Hoewel deze techniek geen informatie over cytotoxische mechanismen, de gevoeligheid maakt detectie van morfologische cellulaire veranderingen, zelfs bij zeer lage doses waarbij de HCS niet informatief (gegevens niet getoond). Gebaseerd op Previlende experimenten, hebben we vastgesteld dat RTCA methode kan morfologische veranderingen bij lagere doses dan de HCS eindpunten detecteren. Na de eerste screening van de real-time cell analyzer, werd een HCS platform gebruikt om meer gedetailleerde informatie over de aard van cytotoxiciteit opgewekt door elke HPHC krijgen. De HCS assay panel mag HPHCs profileren ten opzichte van hun potentiële impact op cellulaire compartimenten / organellen, alsmede aan die welke genotoxiciteit of oxidatieve stress te identificeren. Hierbij bleek verschillende profielen waarbij de geselecteerde HPHCs induceren cytotoxiciteit NHBE cellen. In het algemeen zijn de verbindingen, behalve fenol, bleken necrose bij de hoogste geteste dosis. Consistent met een potentiële rol in tumorigenese 1-aminonaphtalene geïnduceerde fosforylering van H2AX als een marker voor genotoxiciteit, maar de HCS paneel ook onbedekt activiteit van dit HPHC in de mitochondriale toxiciteit uitlezing (massa toe en cytochroom C release) en oxidatieve stress (GSH uitputting). Evenzo, zoals hiervoor beschreven, fenol werd geïdentificeerd als mitochondriale disfunctie veroorzaken en leiden tot DNA-schade en GSH uitputting. Chroom (VI), één van de verbindingen ingedeeld in groep I carcinogenen en Crotonaldehyde werden geïdentificeerd als zowel genotoxisch, met name chroom (VI) ook geïnduceerde apoptose (caspase cascade activering) en Crotonaldehyde veroorzaakt verhoogde ROS generatie. Tenslotte Arseen (V), bleek fosforylering cJun dat een merker van stress kinase pathway activatie induceren. In deze studie hebben we gebruik gemaakt NHBE cellen als model voor long epitheelcellen in vitro. Met behulp van deze cellen in een HCS omgeving is ongekend en stelde het onderzoek van een breder scala van eindpunten, waaronder genotoxiciteit en oxidatieve stress markers. Zowel levende cellen en vaste cel kleuring methoden beschreven in onze protocollen demonstreren de flexibiliteit van de algehele techniek. in fact, kan precies dezelfde protocollen worden toegepast op een breder scala van doelstellingen die door het gebruik van een fluorescente kleurstof of antilichaam kan worden gericht. Voor het succesvol uitvoeren van de levende kleuringsprotocollen, is het belangrijk om de incubatietijd te respecteren, zoals sommige van de kleurstoffen hebben een beperkte halfwaardetijd en het fluorescentiesignaal afnemen vóór de beeldverwerving is voltooid. Het is ook belangrijk om te overwegen dat als een ander celtype wordt gebruikt, alle omstandigheden de kleuring opnieuw moet worden geëvalueerd, de optimale kleurstof concentratie en de incubatietijd kan verschillen. In de huidige papieren hebben we een scenario waarin slechts vijf verbindingen waarbij gescreend met de HCS methodologie beschreven. Gezien de hiervoor beschreven plaatindeling, werden ze gedoseerd via 2 verschillende sets plaat voor een totaal van 24 platen (6 assays en 2 tijdstippen) .Het aantal platen kan ook worden verhoogd, waardoor het gelijktijdig screenen van verbindingen of meer de invesderzoek van meer eindpunten. Alvorens dit te doen, echter, moet men rekening mee houden dat bepaalde eindpunten (GSH en ROS) vereisen onmiddellijke overname, en als gevolg daarvan, moet de dosering van de platen worden uitgevoerd in een gespreide manier aan de overname van de vorige plaat mogelijk te maken. Anderzijds, met een vaste cel kleuring protocol vormt een voordeel als de platen kunnen worden gestapeld, onderbreken protocol naar elke stap na de fixatie, voor de voltooiing van de kleuring procedure later. Deze aanpak, bijvoorbeeld, zou de operator te voorzien van de tijd om alle levende cel kleuring platen te voltooien, zonder afbreuk te doen aan de kwaliteit van de gegevens. De workflow verder te optimaliseren door het verminderen van het aantal platen, zou het ook mogelijk zijn om meer eindpunten samen multiplexen. Bijvoorbeeld in deze context DNA Schade en Stress Kinase samen konden worden onderzocht eenvoudig met behulp van twee secundaire antilichaam met fluorochromen emitterende in verschillende channels. Continue ontwikkeling van de HCS-platform, waaronder volledig geautomatiseerde cel enten verbinding verdunning dosering en kleuring, evenals de toevoeging van nieuwe eindpunten zullen het vermogen van de HCS platform verder uitbreiden als een krachtig profiling instrument HPHCs op epitheel- en andere celtypen .

Toxicologische risicobeoordeling is van oudsher vertrouwd op het gebruik van dierlijke modellen die, hoewel fundamenteel in de life sciences, zijn ook in verband met tekortkomingen, zoals inconsistent vertaalbaarheid voor de mens en de hoge kosten. Verder is er een toenemende poging om alternatieven voor dierproeven in de geest van &quot;The 3Rs&quot; 2 (vervanging, vermindering en verfijning) te vinden. Deze inspanningen werden versneld in de afgelopen jaren, niet alleen vanwege de recente ontwikkelingen zoals high-throughput technieken en systemen benaderingen, maar ook vanwege de wetgeving die het gebruik van dierproeven, vooral in de Europese Unie. De complexiteit van cellulaire signaleringsroutes reguleren van de reactie op toxische beledigingen maakt het duidelijk dat het gebruik van één toxicologische eindpunten niet voldoende om de toxicologische hand van bepaalde verbindingen geven is. Hiervoor de wisselwerking tussen honderden interactie proteins bijdragen aan een biologisch netwerk moet ook rekening worden gehouden. Om het effect van toxische stoffen op deze netwerken bestuderen een systeem toxicologische benadering in combinatie met fenotypische midden- en hoge doorvoer screening assays nuttig potenties afleiden en tegelijkertijd zorgen voor meer informatie over het werkingsmechanisme van individuele toxische stoffen. In deze studie hebben we gebruik HCS als krachtige screeningsmethode, dat bestaat uit een geautomatiseerde microscoop en een biologisch softwaretoepassing die kan verkrijgen, te verwerken en beeldgegevens afkomstig van specifieke fluorescentie gebaseerde cellulaire assays analyseren. Dit maakt visuele veranderingen binnen een cel te kwantificeren, op een enkele cel of subcellulair niveau, en vele parameters tegelijkertijd te analyseren. 3 werden bijvoorbeeld DNA double-strand breaks geëvalueerd onder toepassing van een antilichaam gebaseerde identificatie van histon H2AX fosforylatie en reactieve zuurstofspecies (ROS) werden gekwantificeerd onder toepassing van een cel-permduidelijker zichtbaar superoxide gevoelige kleurstof. Omdat long epitheelcellen de eerste biologische barrière vormen tegen ingeademd toxische stoffen, zoals sigarettenrook, we benut primaire bronchiale epitheelcellen als een in vitro model om het effect van HPHCs gepubliceerd door de Amerikaanse Food and Drug Administration te profileren. 4 Dit handschrift is een vervolg -up op een eerdere studie 5 waarin we de biologische gevolgen van een andere deelverzameling van HPHCs geëvalueerd. Als onderdeel van onze workflow te cytotoxiciteit in vitro te beoordelen, we in eerste instantie onderzocht de potenties van een selectie van 15 HPHC&#39;s, met behulp van een impedantie gebaseerde real-time mobiele analyse (RTCA) systeem dat liet ons toe om de dosis-bereik, geschikt voor de volgende HCS vast analyse (Figuur 1). Een HCS toxicologische evaluatie werd vervolgens uitgevoerd met behulp van negen meerdere parametrische eindpunten van cellulaire toxiciteit, elk is op twee tijdstippen (4 en 24 uur). De merkers die werden gebruikt waren indicatief voor mitochondriale toxiciteit, DNA schade, stress kinase, reactieve zuurstof species (ROS), glutathion (GSH) gehalte, caspase 3-7 activiteit, cytochroom C en afgifte celmembraan permeabiliteit, zoals beschreven in Tabel 1. Onze aanpak ingeschakeld identificatie en karakterisering van het effect van sigarettenrook bestanddelen door de dosis en tijdsafhankelijke sampling. Uiteindelijk leverde dat een in vitro toxicologisch profiel voor elke HPHC. Multi-omics benaderingen kunnen ook worden gebruikt om de HCS analyse verder aanvullen. Dit zou uiteindelijk ook een dieper inzicht in de effecten op de cell signaling en / of transcriptie niveau.

<table><tbody><tr><td>Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader</td><td>Thermo</td><td>N01-0002B</td><td></td></tr><tr><td>xCelligence RTCA MP</td><td>ACEA</td><td>05331625001</td><td></td></tr><tr><td>Screener (HCS)</td><td>Genedata</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CASY counter TTC</td><td>Roche</td><td>05 651 719 001</td><td></td></tr><tr><td>e-Plates VIEW 96</td><td>ACEA</td><td>06 472 451 001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Frame 96</td><td>ACEA</td><td>05232392001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Cardio Temperature Tool</td><td>ACEA</td><td>2801171</td><td></td></tr><tr><td>Plate sealer breathseal</td><td>Greiner bio-one</td><td>676051</td><td></td></tr><tr><td>Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-2540</td><td>non-smoking 60-year-old Caucasian male donor&nbsp;</td></tr><tr><td>BEGM BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>Warm at 37 &deg;C before use</td></tr><tr><td>ReagentPack Subculture Reagents kit</td><td>Lonza</td><td>CC-5034</td><td>Warm at 37 &deg;C before use</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (100x)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Easy Flask filter cap 75&nbsp;cm2</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-565-349</td><td></td></tr><tr><td>96 well assay plate&nbsp; black&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-62249</td><td></td></tr><tr><td>Draq5 (For Far Red Nuclear Staining)</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7513</td><td></td></tr><tr><td>ROS Dye: Dihydroethidium</td><td>Sigma</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>ROS Dye: CellROX</td><td>Life technologies</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>ROS Dye: MitoSOX</td><td>Life technologies</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>GSH Dye: Monochlorobimane</td><td>Sigma</td><td>69899</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>GSH Dye: Monobromobimane</td><td>Life technologies</td><td>M-1378</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Membrane permeability Dye: YO-PRO-1&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>Y3603</td><td>Irritating&nbsp;</td></tr><tr><td>Membrane permeability Dye: TO-PRO-1&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>T3602</td><td>Irritating&nbsp;</td></tr><tr><td>Membrane permeability Dye: TOTO-1&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>T3600</td><td>Irritating&nbsp;</td></tr><tr><td>Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green</td><td>Life technologies</td><td>C10423</td><td>Irritating&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Cytochrome C antibody (Mouse)</td><td>Thermo</td><td>MA5-11823</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse)</td><td>Thermo</td><td>MA5-15889</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse)</td><td>Thermo</td><td>MA1-2022</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG DyLight 650&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab96878</td><td></td></tr><tr><td>10x permeabilization buffer</td><td>Fisher</td><td>8408400</td><td></td></tr><tr><td>4% Formaldehyde solution</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>10x blocking buffer</td><td>Fisher</td><td>8408500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Phosphate Buffered Saline&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt solution</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Sigma</td><td>S4400</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Sigma</td><td>V0627</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Paraquat</td><td>Sigma</td><td>36541</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Anisomycin</td><td>Sigma</td><td>A9789</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Ethacrynic acid</td><td>Sigma</td><td>E4754</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>1-Aminonaphthalene</td><td>Sigma</td><td>34390</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>2-Nitropropane</td><td>Sigma</td><td>130265</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Acetamide</td><td>Sigma</td><td>695122</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma</td><td>A9099</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Arsenic (V)</td><td>Sigma</td><td>A6756</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Benzene</td><td>Sigma</td><td>12540</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Chromium (VI)</td><td>Sigma</td><td>216623</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Crotonaldehyde</td><td>Sigma</td><td>262668</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Methyl ethyl ketone</td><td>Sigma</td><td>34861</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Nickel&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>203866</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Nitrobenzene</td><td>Sigma</td><td>48547</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma</td><td>P5566</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Quinoline</td><td>Sigma</td><td>241571</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Sigma</td><td>34866</td><td>Toxic</td></tr></tbody></table>

high content screening analyse van de toxicologische effecten van schadelijke en potentieel schadelijke bestanddelen evalueren (hphc)

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

Sigarettenrook (CS) is een belangrijke risicofactor voor hart- en longziekten. Omdat CS is een complex aerosol met meer dan 7.000 chemicaliën 1 het een uitdaging om de bijdragen van de afzonderlijke bestanddelen zijn algemene toxiciteit te beoordelen. Toxicologische profielen van de afzonderlijke onderdelen, alsmede voor mengsels kunnen echter worden vastgesteld in vitro, door het toepassen van high-throughput screening instrumenten, die de profilering van schadelijke en potentieel schadelijke bestanddelen (HPHCs) van tabaksrook mogelijk te maken, zoals gedefinieerd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA). 2 Voor een eerste beoordeling, werd een impedantie gebaseerde instrument gebruikt voor een real-time, label-free beoordeling van de toxiciteit van de verbinding. Het instrument uitlezing is gebaseerd op celadhesie, leefbaarheid en morfologie dat allemaal bij elkaar geven een overzicht van de status cel. Een dimensieloze parameter genaamd cel index wordt gebruikt voor kwantificering. Een set van diflende kleuring protocollen ontwikkeld voor fluorescentie beeldvorming gebaseerd onderzoek en een HCS platform werd gebruikt om meer gedetailleerde informatie over de aard van cytotoxiciteit opgewekt door elke HPHC krijgen. Van de 15 geteste bestanddelen slechts vijf geselecteerd voor HCS-gebaseerde analyse en mocht berekenbare LD 50 (&lt;20 mM) geregistreerd. Deze omvatten 1-aminonaphtalene, arseen (V), chroom (VI), Crotonaldehyde en fenol. Op basis van hun werking in de HCS kan 1-aminonaphtalene en fenol worden geïdentificeerd mitochondriale dysfunctie induceren, en samen met chroom (VI) als genotoxisch gebaseerd op de verhoogde histon H2AX fosforylering. Crotonaldehyde werd geïdentificeerd als oxidatieve stress inductor en Arseen als stress-kinase pathway activator. Deze studie toont aan dat een combinatie van impedantie gebaseerde en HCS technologie verschaft een robuust hulpmiddel voor in vitro beoordeling van CS bestanddelen.

RTCA Omdat de HCS eindpunten niet informatief is wanneer er geen toxisch effect waargenomen, die verbindingen niet weergegeven cellevensvatbaarheid tot de hoogste concentratie in het RCTA niet door HCS (Figuur 3b, c, d, g, k, l, m getest , p). Verbindingen showing cellevensvatbaarheid op slechts de hoogste concentratie (Figuur 3e, o) ook gedeselecteerd voor HCS. Tenslotte alleen de bestanddelen met een berekenbare LD 50 (&lt;20 mM) worden geselecteerd voor verdere analyse HCS (figuur 3a, f, h, j, n). HPHCs aan bovenstaande criteria zijn: 1-aminonaphtalene, arseen (V), chroom (VI), Crotonaldehyde en fenol. HCS Als Quality Check (QC), positieve controles zijn fieerst geanalyseerd dat kleuring procedure correct uitgevoerd verzekeren. Representatieve Foto positieve controle behandelde cellen worden getoond in Figuur 6. Gegeven waarden zijn genormaliseerd voertuig zoals eerder beschreven. Geen dosis-respons curves zijn uitgezet als slechts drie doses worden getest en niet alle drie doses worden overwogen bij elke keer dat-point. Positieve controle doses worden geselecteerd (gebaseerd op eerdere experimenten, gegevens niet getoond) zodat geschikte reacties zijn waargenomen voor elk eindpunt aan zowel 4 uur en 24 uur. Met name doses 1 en 2 worden gebruikt om het effect te evalueren 4 uur terwijl doses 2 en 3 worden gebruikt om het effect van 24 uur geëvalueerd. Platen worden weggegooid als er geen antwoord wordt waargenomen voor de positieve controle doses. Merk op dat voor alle eindpunten, behalve mitochondriale membraanpotentiaal en GSH, toegenomen intensiteit van het signaal verwacht wordt. Alle verbindingen behalve fenol, induceerde een necrotische fenotype<html> type gebaseerd op verhoogde celmembraan permeabiliteit (Figuur 7a, f, h, l). 1-aminonaphtalene, chroom (VI), Crotonaldehyde en fenol werden geïdentificeerd als genotoxisch gebaseerd op verhoogde fosforylering van histon H2AX (figuur 7e, j, n, p). Fenol en 1-aminonaphtalene bleken ernstige mitochondriale dysfunctie (figuur 7b, o) die met 1-aminonaphtalene, leidde tot een verhoogde afgifte cytochroom C (Figuur 7c) induceren. Detectie van verhoogde caspase 3/7 activiteit bewijs geleverd van apoptotische evenement bij blootstelling chroom. Oxidatieve stress inductie (ROS of GSH) werd ook gedetecteerd bij behandeling met 1-aminonaphtalene, Crotonaldehyde en fenol (figuur 7d, m, q). Tenslotte Arseen induceert celstress zoals blijkt uit de toegenomen fosforylering van de transcriptiefactor cJun (figuur 7g). load / 53987 / 53987fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1. Verbinding Tox-Profiler workflow. A) Schema van de workflow ook in dit onderzoek. Eerst werd een dosis-range vinden met behulp van de RTCA platform om de juiste doses te selecteren voor de volgende HCS om de verbinding-specifieke toxiciteit profielen. B) experimentele opzet van de studie te karakteriseren. 24 uur na het zaaien, werden de cellen gedoseerd en impedantiewaarden continu bewaakt over de volgende 24 uur, terwijl de HCS-eindpunten werden onderzocht 4 en 24 uur na toediening. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig2.jpg" /> Figuur 2. RTCA Exposure Plate. Compound meester plaat wordt eerst gegenereerd door het uitvoeren van een vijf stappen 01:10 seriële verdunning. Elke verbinding,waaronder de mediumcontrole (dosis 0) toegevoegd in drievoud aan de plaatbelichter met medium en Staurosporine als controles. Merk op dat de doses volgorde wordt gehandhaafd bij de overdracht, de hoogste doses zijn in rij nummer 1 terwijl de bedieningsorganen van het voertuig zijn in rij nummer 7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig3.jpg" /> Figuur 3. Representatieve resultaten RTCA levensvatbaarheid van de cellen. A) 1-aminonaphtalene, b) 2-nitropropaan, c) aceetamide, d) Aceton, e) acrylamide, f) Arseen (V), g) benzeen, h) Chroom (VI) , j) Crotonaldehyde, k) methylethylketon, l) Nickel (II), m) nitrobenzeen, n) fenol, o) chinoline p) Tolueen. Op 24 uur na dosering, oppervlak onder de curve (AUC) werd berekend voor elke dosis (inclusief positieve en medium) en genormaliseerd in een traject van 0 tot -100% activiteit (y-as), waarbij 0 weerspiegelt de activiteit van het voertuig en -100 van de positieve controle. Waarden werden vervolgens uitgezet en voorzien met een vier parameter Hill-vergelijking en, indien mogelijk, LD50 werd berekend. Concentraties worden uitgedrukt op een logaritmische schaal (x-as). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig4.jpg" /> Figuur 4. Verwatering Regeling voor Positive Control verbindingen voor HCS Testen. A) Toevoeging van de positieve controles en vechine naar de seriële verdunning plaat. b) Seriële verdunning van de positieve controles. c) 200X positieve controles doses. de) verdunning van de 200x positieve controles doses in medium (01:40) naar de positieve controle plaat met de 5x doses te genereren. Merk op dat elke dosis wordt verdund in drievoud aan de uiteindelijke lay-out in de belichting plaat weer te geven). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig5.jpg" /> Figuur 5. HCS Exposure Plate. Compound meester plaat wordt eerst gegenereerd door het uitvoeren van een vijf stappen verdunning. Elke verbinding, omvattende het toezicht voertuig (dosis 0) toegevoegd in drievoud aan de plaatbelichter met de positieve controles. Merk op dat de doses orde wordt gehandhaafd bij de overdracht,hoogste doses zijn in rij nummer 1 terwijl de bedieningsorganen van het voertuig zijn in rij nummer 7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 6" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig6.jpg" /> Figuur 6. Vertegenwoordiger Fluorescent Foto&#39;s van antilichaam of Dye-gekleurde cellen a) Nuclear parameters - Nucleaire kleurstof. Een permeabel kleurstof die bindt aan DNA in levende of gefixeerde cellen. Deze kleurstof wordt gebruikt om individuele cellen te labelen nucleair gebied identificeren b) Necrose - celmembraan permeabiliteit kleurstof. Dye-gebaseerde detectie van celmembraanintegriteit. Reagens intrinsiek ondoorlaatbaar celmembraan. Tijdens necrose, het membraan permeabel en de kleurstof gaat de cel en bindt aan DNA produceert sterke fluorescente s. ignal c) Apoptosis - Cytochroom C: Antilichaam-gebaseerde detectie van cytochroom C release, een bekend kenmerk van vroege apoptose. Bij inductie van apoptose wordt cytochroom c vrijgelaten uit de mitochondriën en diffundeert naar de kern d) DNA Damage - pH2AX:.. Antilichaam-gebaseerde detectie van fosforylatie van histon H2AX, een bekend kenmerk van dubbelstrengige DNA breuken e) Stress Kinase - cJun. antilichaam-gebaseerde detectie van fosforylatie van Ser-73 van cJun, een bekend kenmerk van cellulaire stress f) Oxidatieve stress - DHE: Dye gebaseerde detectie van superoxide radicalen. Dihydroethidium zelf fluoresceert blauw in het cytoplasma, terwijl de geoxideerde vorm ethidium fluoresceert rood op DNA intercalatie g) GSH - mBcl:. Dye-gebaseerde detectie van vrij GSH moleculen. mBcl reageert met GSH tegenereren van een sterk fluorescerend product h) Apoptosis - caspase 3/7 activering:. Dye-gebaseerde detectie van caspase 3/7 activiteit. Reagens niet fluorescerende met een vier aminozuur peptide dat remt DNA-binding. Bij caspase-3/7 activering wordt het peptide gesplitst waardoor de kleurstof aan DNA te binden en produceren een heldere, fluorogene reactie. Panels BH tonen positieve controle behandelde cellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 7" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig7.jpg" /> Figuur 7. Representatieve resultaten HCS. 1-aminonaphtalene (ae), arseen (V) (f en g), chroom (VI) (HK), Crotonaldehyde (ln) en fenol (OQ). 4 uur (blauwe lijn) en24 uur (oranje lijn) signalen werden berekend voor elke dosis en genormaliseerd tot het voertuig activiteit (0%). Waarden die niet zijn opgenomen in de curve-fitting berekeningen worden grijs weergegeven. Concentraties worden uitgedrukt op een logaritmische schaal (x-as). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> analyse </td><td> Endpoint # </td><td> biologische eindpunt </td><td> cellulair compartiment </td><td> Output feature </td></tr><tr><td rowspan="4"> cytotoxiciteit </td><td> 1 </td><td> Mitochondriale massa 6 </td><td> Cytoplasma </td><td> Spot gemiddelde oppervlakte </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Mitochondriale membraanpotentiaal 6 </td><td> Cytoplasma </td><td> Spot gemiddelde intensiteit </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Cytochroom C vrijlating <sup&gt; 7 </td><td> Kern </td><td> gemiddeld intensiteit </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Celmembraan permeabiliteit 8 </td><td> Kern </td><td> gemiddeld intensiteit </td></tr><tr><td> DNA-schade </td><td> 5 </td><td> fosfo-H2AX 9 </td><td> Kern </td><td> gemiddeld intensiteit </td></tr><tr><td> Stress Kinase </td><td> 6 </td><td> fosfo-cJun 10 </td><td> Kern </td><td> gemiddeld intensiteit </td></tr><tr><td> ROS </td><td> 7 </td><td> ROS 11 </td><td> Kern </td><td> gemiddeld intensiteit </td></tr><tr><td> GSH inhoud </td><td> 8 </td><td> GSH 12 </td><td> Cytoplasma </td><td> Spot gemiddelde intensiteit </td></tr><tr><td> apoptose </td><td> 9 </td><td> Caspase 3 13 </td><td> Cytoplasma </td><td> Spot gemiddelde intensiteit </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Lijst van HCS eenssays en eindpunten. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"></td><td rowspan="2"> Voertuig </td><td colspan="6" rowspan="2"> RTCA doses (uM) </td><td rowspan="2"> LD 50 </td><td colspan="5"> HCS doses </td></tr><tr><td colspan="2"></td><td colspan="4"> Cellevensvatbaarheid geselecteerd (uM) </td><td> 3R4F (nM) </td></tr><tr><td colspan="2"> 1-Aminonaphtalene </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> 280 uM </td><td> 2000 </td><td> 500 </td><td> 200 </td><td> 150 </td><td> 0.27 </td></tr><tr><td colspan="2"> 2-nitropropaan </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> aceetamide </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Aceton </td><td> Water </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> acrylamide </td><td> Water </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Arseen (V) </td><td> Water </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> 160 uM </td><td> 200 </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 25 </td> &lt;td&gt; 0,17 </td></tr><tr><td colspan="2"> benzine </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Chroom (VI) </td><td> Water </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> 20 uM </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 20 </td><td> 10 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td colspan="2"> crotonaldehyde </td><td> Water </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> 200 uM </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2000 </td></tr><tr><td colspan="2"> Methylethylketon </td><td> Water </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt;20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Nikkel </td><td> Water </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> nitrobenzeen </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Fenol </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> 2300 uM </td><td> 5000 </td><td> 2000 </td><td> 1000 </td><td> 500 </td><td> 240 </td></tr><tr><td colspan="2"> chinoline </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td&gt; <td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Tolueen </td><td> Water </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 2. Lijst van Getest HPHC Verbindingen met een relatieve LD 50 bij 24 uur van de behandeling. Verbindingen geselecteerd voor HCS analyse worden gemarkeerd in oranje en geteste doseringen worden ook gegeven. De dosis 3R4F komt overeen met de hoeveelheid van deze aanwezig is in de rook van een stok van de referentie sigaret 3R4F. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> analyse </td><td> samenstelling </td><td> voorraadoplossing </td><td> solvent </td&gt; <td colspan="3"> Dosis (s) (uM) </td></tr><tr><td> cellevensvatbaarheid </td><td> staurosporine </td><td> 10 mM </td><td> DMSO </td><td colspan="3"> 50 </td></tr><tr><td> cytotoxiciteit </td><td> Valinomycin </td><td> 10 mM </td><td> DMSO </td><td> 50 </td><td> 20 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> DNA-schade </td><td> paraquat </td><td> 100 mM </td><td> DMSO </td><td> 500 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Stress Kinase </td><td> anisomycin </td><td> 2 mM </td><td> DMSO </td><td> 10 </td><td> 4 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ROS </td><td> rotenon </td><td> 200 mM </td><td> DMSO </td><td> 1000 </td><td> 400 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> GSH inhoud </td><td> etacrynezuur </td><td> 200 mM </td><td> DMSO </td><td> 1000 </td><td> 400 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> apoptose </td><td> staurosporine </td><td> 40 mM </td><td> DMSO </td><td> 200 &lt;/ Td&gt; <td> 50 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table> Tabel 3. Lijst van positieve controles en gebruikte concentraties voor elke test.

Het doel van het onderzoek was om de biologische impact van 15 bestanddelen van sigarettenrook te beoordelen door middel van een combinatie van een impedantie-gebaseerde real-time celanalysator en een op hoogwaardige inhoud gebaseerde (HCS)-platform voor toxicologische beoordeling in vitro. Dit onderzoek biedt informatie over effectieve doseringen, toxiciteit en werkingsmechanismen van de geteste verbindingen.

High Content Screening Analyse van de toxicologische effecten van schadelijke en potentieel schadelijke bestanddelen Evalueren (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...

Het algemene doel van deze aanpak, die een Impedantie-Gebaseerde Real Time Cel Analyzer combineert met een Hoog Inhoud Screening-Gebaseerde Platform, is om informatie te verstrekken over effectieve doses, toxiciteit en biologische effecten, om het Tox Profiel van de geteste verbindingen te verkrijgen. Deze aanpak kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van toxicologie. Met betrekking tot bijvoorbeeld cytotoxiciteit, genotoxiciteit en cellulaire stressreacties.Bovendien levert het niet alleen informatie over meerdere biochemische en morfologische parameters tegelijk, het kan ook worden toegepast op een ander scala van celtypen en celcultuurmodellen. Vanwege jurisdictie en beperkingen, zal de volledige aanpak worden uitgevoerd terwijl alleen een klein stukje verbinding wordt beoordeeld. Om dezelfde reden, zal er slechts één protocol worden getoond voor het demonstreren van de Hoog Inhoud Screening Beoordeling.De procedure zal worden gedemonstreerd door Stefano Acali en Alexander Laurent, technici uit mijn laboratorium. Om de normale humane bronchiale epitheelcellen, of NHBE-cellen, te zien, programmeert u het instrument om het aantal en de duur van de impedantiemetingen te definiëren. In deze studie worden gegevens elke 15 minuten gedurende 48 uur opgenomen.Meet de achtergrond van de plaat door 50 microliter voorverwarmd medium in elke put van een 96-wels RTCA-plaat te pipetteren. Deze stap vertegenwoordigt een technische vereiste voor het instrument om de elektrische weerstand van het medium te berekenen om als referentiebasis te gebruiken voor celgebaseerde berekeningen. Voeg vervolgens 50 microliter celsuspensie met een concentratie van 144.000 cellen per milliliter toe aan het medium dat al in elke put van de RTCA-plaat staat.Zodra de cel is verwarmd, is het erg belangrijk om de plaat 40 minuten op kamertemperatuur te laten staan om de cellen te laten hechten en een homogene celverdeling te verkrijgen. Incubeer de RTCA-platen in de wieg in de incubator en begin met het opnemen van gegevens voor de volgende 24, plus of min twee uur, vóór het doseren. Voor de positieve controle verdunt u de 10 millimolair staurosporine stamoplossing, één op tien, in DMSO.Voeg vijf microliter van de verdunning toe aan 195 microliter medium om een 5x werkoplossing te verkrijgen. Voor de schadelijke en potentieel schadelijke bestanddelen, lost u elk van hen op in het voertuig om een eenmolaire stamoplossing te genereren. Verdun vervolgens elke testsubstantie stamoplossing, één op tien, in medium om een 100 millimolair oplossing te genereren.Genereer de verbindingsmasterplaat door eerst medium plus 10% voertuig toe te voegen in putten van B tot F en de 100 millimolair oplossing in put A. Voer een vijf-staps, één op tien, seriële verdunning uit om de 5x werkoplossingen te verkrijgen. Voor het doseren, pauzeert u het RTCA-instrument, opent u de wieg om de blootstellingsplaat te verwijderen en plaatst u de plaat in het RTCA temperatuurgereedschap om afkoeling van de cellen te voorkomen, wat de impedantiemeting zou kunnen beïnvloeden. Voeg 25 microliter van de 5x oplossing van de Compound master plate toe aan de cellen in triplicaat, waarbij dezelfde doseervolgorde wordt gehandhaafd als in de Compound master plate.Verwijder het bestaande celkweekmedium niet. Voeg vervolgens 25 microliter van de 5x Positive control oplossing toe aan de cellen in de rechterhelft van de onderste rij, zonder het bestaande kweekmedium te verwijderen. Voeg op dezelfde manier 25 microliter medium toe aan de cellen in de linkerhelft van de onderste rij.Na het afdichten van de plaat met de plaatverzegeling, plaatst u de plaat terug in de RTCA-wieg en vergrendelt u deze. Start de gegevensopname opnieuw voor de gewenste blootstellingstijd. Na het opnemen van gegevens, analyseert u de RTCA celviabiliteitsgegevens om te bepalen welke testsubstantie te gebruiken is in de HCS-analyse.In dit experiment zijn 1-aminonaftaleen, Arseen, Chroom en Crotonaldehyde geselecteerd voor HCS-analyse. Om de NHBE-cellen te zien, voegt u 100 microliter van een celsuspensie toe met 120.000 cellen per milliliter aan elke put van een 96-wels zwarte plaat. Laat de HCS-plaat 30 minuten op kamertemperatuur staan om cellen te laten hechten aan de putten, en incubeer bij 37 graden Celsius en 5%CO2 gedurende 24, plus of min twee uur, vóór het doseren.Voor de positieve controle, doseert u 40 microliter van de stamoplossing van elke positieve controle in kolom twee. Doseer vervolgens 20 microliter van het voertuig in kolommen drie en vijf. En 40 microliter van het voertuig in kolom vier.Haal 12 microliter uit de putten in kolom twee, doseer het in de putten in kolom drie en meng. Ga door tot een laatste seriële verdunning met drie doses en voertuig voor elke positieve controleverbinding is verkregen. Om de positieve controlep plaat te genereren, bereidt u een verdunning van één op veertig in media van de drie doses en voertuig.Om de verbindingsmasterplaat te maken, resuspendeert en verdunt u elke testsubstantie stamoplossing, één op tien in medium voor een concentratie van 100 millimolair. Voer verdunningen uit met medium met 10% voertuig om de geselecteerde 5x doses voor elke testsubstantie te verkrijgen. Zowel positieve controles als verbindingsplaat zijn nu klaar om over de blootstellingsplaat te worden gedoseerd.Voeg vervolgens 25 microliter van de 5x oplossingen van de Compound master plate toe aan de cellen in triplicaat, waarbij dezelfde doseervolgorde wordt gehandhaafd als in de Compound master plate. Verwijder het bestaande celkweekmedium niet. Voeg vervolgens 25 microliter van de 5x oplossing van de Positive control plate toe aan de cellen in de onderste rij, waarbij dezelfde doseervolgorde wordt gehandhaafd als in de Positive control plate.Bereid een voldoende volume van de levende-celkleuringsoplossing voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Verdun vervolgens zowel de mitochondriënkleurstof als de membraanpermeabilite

high-content-screening-analysis-to-evaluate-toxicological-effects

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft een nieuw protocol en reagensset ontworpen voor de gevoelige meting van de neurotoxische effecten van verbindingen en behandelingen op co-culturen van neuronen en astrocyten met behulp van hoge inhoudsanalyse. Resultaten tonen aan dat de hoge inhoudelijke analyse een spannende nieuwe technologie voor neurotoxiciteit assessment vertegenwoordigt.

Een Neuronale en astrocyte co-cultuur assay voor High Content Analysis van neurotoxiciteit

We beschrijven een methodiek combineert geautomatiseerde cel kweken met een hoog-content imaging te visualiseren en te kwantificeren meerdere cellulaire processen en structuren, in een high-throughput manier. Dergelijke methoden kunnen helpen bij de verdere functionele annotatie van genomen en te identificeren ziektegen netwerken en potentiële drug targets.

Hoog gehalte Screening bij neurodegeneratieve ziekten

De protocollen beschrijven twee in vitro ontwikkelingstoxiciteit testsystemen (UKK en UKN1) op basis van menselijke embryonale stamcellen en transcriptoom studies. De testsystemen voorspellen mens ontwikkelingsstoornissen giftigheidsgevaar, en kunnen bijdragen aan dierproeven, de kosten en de tijd die nodig is voor de chemische veiligheid testen te verminderen.

Pluripotente menselijke stamcellen Gebaseerd Ontwikkelingstoxiciteit Testen voor Chemical Safety Screening and Systems Biology gegevens Generation

Met het oog op het 3V-principe, respiratoire modellen als alternatieven voor dierproeven evolueren. Met name voor risico-evaluatie van respiratoire stoffen is er een gebrek aan adequate tests. Hier beschrijven we het gebruik van menselijke precisie-cut Long segmenten voor de beoordeling van airborne stoffen.

Beoordeling van de cytotoxische en immunomodulerende effecten van stoffen in menselijke precisie-cut Lung plakjes

Hoge-doorvoer kleine remmende RNA screening is een belangrijk instrument die helpen kan sneller het ophelderen van de moleculaire mechanismen van chemische hoornvlies epitheliale letsel. Hierin presenteren wij de ontwikkeling en validatie van blootstelling modellen en methoden mbt de hoge doorvoer screening van waterstoffluoride en chloorpikrine-geïnduceerde hoornvlies epitheliale letsel.

High Throughput SiRNA Screening voor chloorpikrine en waterstoffluoride-geïnduceerde hoornvlies epitheliale cel letsel

Een kwantitatieve methode is ontwikkeld om te identificeren en te voorspellen van de acute toxiciteit van chemische stoffen door het automatisch analyseren de fenotypische profilering van Caenorhabditis elegans. Dit protocol wordt beschreven hoe behandelen van wormen met chemicaliën in een 384-well-plate, vastleggen van video's en kwantificeren van toxicologische verwante fenotypen.

Een High-throughput Assay voor de voorspelling van de chemische toxiciteit door geautomatiseerde fenotypische profilering van Caenorhabditis elegans

Dit protocol presenteert een geautomatiseerde, op afbeeldingen gebaseerde high-throughput-techniek om verbindingen te identificeren die natural killer cel-gemedieerde borstkankerceldoding moduleren in de aanwezigheid van een therapeutisch anti-HER-2-antilichaam.

High-Content screening assay voor de identificatie van antilichaam-afhankelijke cellulaire cytotoxiciteit modificerende verbindingen

Demonstratie van kwantificering van dsDNA met behulp van Molecular Probes PicoGreen kleurstof en Hitachi F-7000 fluorescentie Spectrofotometer uitgerust met een microplaat reader accessoire.

Kwantificering van dsDNA het gebruik van de Hitachi F-7000 fluorescentie Spectrophotometer en PicoGreen Dye

Een high-content screening methode voor de identificatie van nieuwe signalering bevoegde transmembraanreceptoren beschreven. Deze methode is ontvankelijk voor grote schaal automatisering en maakt...

Een High-inhoud Imaging Workflow om Grb2 signaalcomplexen Studie door Expression Klonen

Een protocol wordt ontwikkeld om de effecten van een epigenetisch medicijn DZNep op de ontwikkeling, vruchtbaarheid en overlevingskansen van muggen te onderzoeken. Hier beschrijven we procedures voor de aqueuze blootstelling van DZNep aan onvolwassen muggen en een op bloed gebaseerde blootstelling van DZNep aan volwassen muggen, naast het meten van SAH hydrolase remming.

Toxicologische Testen voor Testing Effecten van een epigenetische Drug ontwikkelingssamenwerking, Vruchtbaarheid en Survivorship van malariamuggen

Leer hoe high-content screening en impedantieanalyse worden gebruikt om de toxiciteit van sigarettenrookbestanddelen te evalueren in humane bronchiale epitheelcellen. Deze methode biedt inzicht in effectieve doses en biologische effecten.

High Content Screening Analyse van de toxicologische effecten van schadelijke en potentieel schadelijke bestanddelen Evalueren (HPHC) (Video) | JoVE Journal

High Content Screening Analyse van de toxicologische effecten van schadelijke en potentieel schadelijke bestanddelen Evalueren (HPHC)

Meer video's verkennen