Name: Coculture Testen om te studeren macrofagen en microglia Stimulatie van glioblastoma Invasion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Leer cocultuurtesten om macrofaag- en microglia-stimulatie van glioblastoom-invasie te bestuderen. Deze methode helpt onderzoekers om interacties in de tumor-micro-omgeving te modelleren en potentiële behandelingen te identificeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Dr. Konstantin Dobrenis bedanken voor het verstrekken van muis microglia voor deze studies.

1. Fluorescerende Labeling van Cellen OPMERKING: Label glioblastoma cellijnen en microglia met fluorescerende kleurstoffen 9. Alternatief genereren cellijnen die constitutief fluorescerende eiwitten zoals GFP / RFP expressie zoals beschreven in 14. <ol><li> 80% confluent op dag van kleuring - plaat cellen op een 6 wells plaat zodanig dat ze 70 zijn. Voor de muizen glioblastoma cellijn GL261 en menselijke glioblastoma cellijn U87, plaat 1 x 10 6 en 1,5 x 10 6 cellen, respectievelijk op een 6 cm schaal 24 uur voor kleuring. </li><li> Bereid fluorescerende cel vlek kleurstof oplossing in DMSO en voeg 5 uM kleurstof media, ofwel Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) of macrofaag serumvrij medium (MSFM), vortex goed. </li><li> Incubeer cellen met kleurstof gedurende 30 minuten bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Verwijderen kleurstof bevattende media en voeg vers medium (RPMI of MSFM) aan de cellen. </li><li> Incubeer cellen gedurende 30 min. Opmerking: Cellen nugekleurd en klaar voor gebruik in experimenten. </li></ol> 2. Pre-coated Matrix Kamer Coculture Invasion Assay <ol><li> Differentiëren THP-1-cellen met behulp forbolmyristaatacetaat (PMA) 15. <ol><li> Plate 2-3 x 10 5 THP-1 cellen in 1,5 ml RPMI / 10% FBS in een 6 putjes plaat. Direct na plating toevoegen 100 nM PMA en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 48 uur. Opmerking: na 48 uur, THP-1-cellen die met succes hebben ondergaan differentiatie hechtende en verspreid naar de bodem van de put die op een ronde morfologie. </li><li> Verwijder PMA door eenmaal wassen met 1x PBS en te vervangen door vers RPMI / 10% FBS. Wacht nog 48 uur tot cellen zijn klaar voor gebruik in test. </li></ol></li><li> Evenwicht matrix voorbekleed kamers door ze in een putje met 500 pl medium alleen (zonder serum) en toevoegen van 500 pl medium alleen naar boven. Incubeer kamers voor 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2. <br/&gt; NB: Pre-coated kamers werden gekocht van de fabrikant; zie tabel of Materials / Equipment. </li><li> Om voorzichtig los cellen (fluorescent gelabeld glioblastoma cellijnen en de microglia / macrofagen), verwijder media uit cellen door aspiratie. Was de cellen op schotel met 2 mM EDTA / PBS. Voeg 500 ul van 2 mM EDTA / PBS en incubeer gedurende 5-10 minuten in een cel incubator bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Resuspendeer cellen in 5 ml medium bevattende 0,3% runderserumalbumine (BSA). </li><li> Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 120 x g. </li><li> Aspireren supernatant en resuspendeer pellet in MSFM / 0,3% BSA media (GL261 cellen en microglia) of RPMI / 0,3% BSA (voor U87 en THP-1 cellen) zodat de concentratie van cellen is gelijk aan 1 x 10 6 cellen / ml . Gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen. </li><li> Voeg 500 ul media / 0,3% BSA per putje van de plaat met 24 putjes. </li><li> Verwijder media uit kamers die zijn geëquilibreerd gedurende ten minste 2 uur (stap 2,2). plaats chambers in putje met 500 ul media /% BSA 0.3 (stap 2.7). </li><li> Als remmers worden gebruikt om hun effect op macrofagen bestuderen / microglia gestimuleerd glioom invasie, voeg de juiste concentratie zowel de onderste en bovenste gedeelten van de kamer. LET OP: De concentraties van CSF-1R remmer gebruikt om microglia volledig remmen gestimuleerd GL261 glioblastoma invasie kan worden gevonden in referentie 9. </li><li> Afhankelijk van de gebruikte cellijnen, cellen aan de bovenste kamer zoals beschreven in de volgende twee stappen: muis glioblastoom (2.10.1) en humaan glioblastoom (2.10.2). <ol><li> Mix 1,5 x 10 5 GL261 (glioblastoma) cellen (150 pi) en 5 x 10 4 muis microglia (50 pl) (zie stap 2.6 voor media-informatie). Breng het volume op 500 pl door toevoeging van 300 ul MSFM / 0,3% BSA. Voeg celmengsel aan de bovenste kamer en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 48 uur. LET OP: Muizen microglia zijn geïsoleerd van pasgeboren muizen, zoals beschreven in 1 6. </li></ol></li></ol> Mix 7,5 x 10 4 U87 (glioblastoma) cellen (75 ui) en 2,5 x 10 4 THP1 (macrofaag) cellen (25 pi). Breng volume 500 pl door toevoeging van 400 pl RPMI / 0,3% BSA. Voeg de cel mengsel aan de bovenste kamer. Incubeer cellen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 24 uur. <ol><li> Na incubatie verwijderen cellen uit de top van de kamer door behoedzame aspiratie en lossen door het plaatsen van camera&#39;s in 3,7% formaldehyde in PBS. Toestaan ​​kamers in fixeermiddel blijft gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (of overnacht bij 4 ° C). Verwijder fixatief door zachte aspiratie en te vervangen door 500 ul 1x PBS. Ga verder naar hoofdstuk 4 voor beeldanalyse. LET OP: Experiment kunnen worden gepauzeerd op dit moment en opgeslagen voor beeldvorming in 1x PBS. Fluorescerende kleurstof signalen kunnen worden gedetecteerd tot 2 weken na fixatie. </li></ol> 3. Invasion Assay &quot;3D&quot; -embedding glioom en macrofagen / microglia in Matrix <ol><li>Dooi matrix mix bij 4 ° C gedurende de nacht. Voer alle verdere manipulaties met behulp van matrix op het ijs in de kap. </li><li> Bereid 10 mg / ml concentratie van matrix media (MSFM of RPMI) met 0,3% BSA op ijs. Opmerking: De concentratie van matrix kenmerkend ongeveer 15 mg / ml. </li><li> Om cellen (gelabeld in stap 1) tot schorsing bereiden in matrix, verwijder media uit cellen door aspiratie. Was de cellen op schotel met 2 mM EDTA / PBS. Voeg 500 ul van 2 mM EDTA / PBS cellen en incubeer gedurende 5-10 minuten in de broedstoof bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Resuspendeer cellen in 5 ml medium bevattende 0,3% BSA. </li><li> Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 120 x g. </li><li> Aspireren supernatant van pellet. Resuspendeer pellet in media / 0,3% BSA zodat de concentratie van cellen is gelijk aan 1 x 10 6 cellen / ml. Gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen. </li><li> Voeg 1,5 x 10 5 GL261 cellen (in 150 pl) + 5 x 10 4 microglia cellen (in 50 ui) in een 1,5 ml microfugebuis.Voeg 2 x 10 5 GL261 cellen (200 ui) in een afzonderlijke 1,5 ml microfugebuis. OPMERKING: GL261 cellen alleen zonder microglia dient als controle. </li><li> Spin cellen in microfuge gedurende 5 minuten bij 120 x g. </li><li> Resuspendeer cellen in 200 ul koude matrix op ijs. </li><li> Plaat 50 ul (50.000 cellen) op het midden van het bovenste compartiment van 8 uM poriegrootte kamer insert. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min bij polymerisatie optreedt. </li><li> Voeg 200 ul serumvrij medium aan de bovenste kamer en 700 pl serum bevattend celkweekmedium de onderste put. </li><li> Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 48 uur. </li><li> Na incubatie verwijderen cellen uit de top van de kamer door behoedzame aspiratie en lossen door het plaatsen van camera&#39;s in 3,7% formaldehyde in PBS. Toestaan ​​kamers in fixeermiddel blijft gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (of overnacht bij 4 ° C). Verwijder fixatief door zachte aspiratie en te vervangen door 500 ul 1x PBS. Ga naar deel 4 foimage r analyse. </li></ol> 4. Imaging Testen <ol><li> Verwijder Chambers van 3,7% formaldehyde en was in goed met vers 500 ul 1x PBS. LET OP: Sta niet toe dat de kamers te drogen. </li><li> Met een wattenstaafje, reinig de niet-invasieve cellen uit het bovenste gedeelte van het filter (zijde naar de binnenzijde van de kamer) schrapen het filteroppervlak. Begin voorzichtig en geleidelijk te verhogen druk. Doe dit minstens 3 keer per kamer. </li><li> Plaats kamers in ofwel een glazen bodem schaal of laat het in een 24 wells plaat. </li><li> Plaats monster op het podium van een epifluorescerende of laser confocale fluorescentiemicroscoop uitgerust met camera en image capture software 9,10. </li><li> Haal een paar 10X of 20X beelden van representatieve velden. </li><li> Met een beeldanalyse software zoals ImageJ Tel het aantal glioblastoma cellen die het filter zijn overgestoken naar de onderzijde 9,10. </li><li> Wanneer beeldvorming van de &quot;3D. &quot;Invasie assay (beschreven in hoofdstuk 3), het genereren van een Z-stack-serie met behulp van een fluorescerende laser confocale microscoop 5-6 Om het beeld van de invasieve cel bevolking aan de onderkant van het filter, volg het protocol stappen 4,2-4,6 hierboven beschreven. </li></ol>

<ol><li>Buckner, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clin+Proc%22%5BJournal%5D)">Central nervous system tumors.</a> Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).</li>
<li>Furnari, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+astrocytic+glioma%3A+genetics%2C+biology%2C+and+paths+to+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment.</a> Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).</li>
<li>Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The brain tumor microenvironment.</a> Glia. 60 (3), 502-514 (2012).</li>
<li>Li, W., Graeber, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+profile+of+microglia+under+the+influence+of+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro.+Oncol%22%5BJournal%5D)">The molecular profile of microglia under the influence of glioma.</a> Neuro. Oncol. 14 (8), 958-978 (2012).</li>
<li>Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+function+in+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglia function in brain tumors.</a> J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).</li>
<li>Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2Fmacrophages+promote+glioma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia/macrophages promote glioma progression.</a> Glia. 59 (3), 472-485 (2011).</li>
<li>Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+glioma+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Microglia promote glioma migration.</a> Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).</li>
<li>Wesolowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia-derived+TGF-beta+as+an+important+regulator+of+glioblastoma+invasion%3A+an+inhibition+of+TGF-beta-dependent+effects+by+shRNA+against+human+TGF-beta+type+II+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion: an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against human TGF-beta type II receptor.</a> Oncogene. 27 (7), 918-930 (2008).</li>
<li>Coniglio, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+stimulation+of+glioblastoma+invasion+involves+epidermal+growth+factor+receptor+%28EGFR%29+and+colony+stimulating+factor+1+receptor+%28CSF-1R%29+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling.</a> Mol Med. 18, 519-527 (2012).</li>
<li>Miller, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semapimod+sensitizes+glioblastoma+tumors+to+ionizing+radiation+by+targeting+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Semapimod sensitizes glioblastoma tumors to ionizing radiation by targeting microglia.</a> PLoS One. 9 (5), (2014).</li>
<li>Goswami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+promote+the+invasion+of+breast+carcinoma+cells+via+a+colony-stimulating+factor-1%2Fepidermal+growth+factor+paracrine+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop.</a> Cancer Res. 65 (12), 5278-5283 (2005).</li>
<li>House, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+functional+S100A4+monomers+are+necessary+for+regulating+nonmuscle+myosin-IIA+and+HCT116+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Two functional S100A4 monomers are necessary for regulating nonmuscle myosin-IIA and HCT116 cell invasion.</a> Biochemistry. 50 (32), 6920-6932 (2011).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activity+status+of+cofilin+is+directly+related+to+invasion%2C+intravasation%2C+and+metastasis+of+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The activity status of cofilin is directly related to invasion, intravasation, and metastasis of mammary tumors.</a> J Cell Biol. 173 (3), 395-404 (2006).</li>
<li>Zagzag, D. 1, Miller, D. C., Chiriboga, L., Yee, H., Newcomb, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+immunohistochemistry+as+a+novel+experimental+tool+for+the+detection+of+glioma+cell+invasion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo.</a> Brain Pathol. 13 (1), 34-37 (2003).</li>
<li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int. J. Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
<li>Dobrenis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+cell+culture+and+in+transplantation+therapy+for+central+nervous+system+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease.</a> Methods. 16 (3), 320-344 (1998).</li>
<li>Coniglio, S. J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+microglia+stimulated+glioblastoma+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion.</a> Matrix Biol. 32 (7-8), 372-380 (2013).</li>
<li>See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+regulatory+T+cells+and+microglia+in+glioblastoma-associated+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression.</a> J Neurooncol. 123 (3), 405-412 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De zeer invasieve aard van hoogwaardige astrocytomen en glioblastoma maken deze hersentumoren zeer dodelijk. Het is daarom van het grootste belang voor de moleculaire en cellulaire mechanismen van glioblastoma invasie begrijpen. Er is al veel geleerd over het proces van glioblastoma invasie al 17. Met behulp van de test formaten beschreven in dit document, heeft ons laboratorium aangetoond in zowel muis en mens modellen die tumor-geassocieerde macrofagen glioma cel invasie kan stimuleren door 5-10 voudig. Dez...

Glioblastoma multiforme is een agressieve menselijke hersenen kanker met een mediane overleving van ongeveer 12 maanden na de diagnose 1,2. Glioblastoma is een van de meest dodelijke soorten kanker en klinisch uitdagend omdat het ongevoelig is voor standaard chemotherapie en chirurgische resectie. De diffuse aard van glioblastoma stelt tumorcellen verspreid over de normale hersenen die de geavanceerde tumor praktisch onmogelijk operatief resectie volledig. Deze zeer invasieve aspect is een kenmerk kenmerk van glioblastoma en andere geavanceerde astrocytomen. Daarom is de focus van veel onderzoek gedaan naar de moleculaire mechanisme van glioblastoma celinvasie. De glioblastoma tumor micro-omgeving speelt een belangrijke rol bij vaststelling van maligniteit 3-6. Tumor-geassocieerde macrofagen / microglia werden voor de bevordering van glioblastoma invasie 7,8 te zijn. De meeste van deze studies het effect van macrofagen / microglia echter gemeten middelstesten die ze van de glioblastoma cellen fysisch scheiden. Ons laboratorium heeft tot betere analyses die ons in staat om te bestuderen hoe glioblastoma invasie is afhankelijk van macrofagen / microglia in coculturen en stellen ons in staat om het beeld van de fysieke interactie tussen hen tijdens de invasie te genereren uiteengezet. Classic assays voor het meten van cel invasie onder de &quot;standaard&quot; Boyden kamer chemotaxis en chemoinvasion formaten. Hier de cellen te bestuderen uitgeplaat in een plastic kamer die een polycarbonaat filter aan de achterkant die poriën van een bepaalde grootte (gewoonlijk tussen 0,4 en 8 uM in diameter) heeft bevat. Het proces van invasie omvat een fysieke barrière, gewoonlijk uit extracellulaire matrix eiwitten. In de chemoinvasion assay de voorkeur gebruikte matrix Matrigel (hierna &quot;matrix&quot;), een extracellulaire matrix eiwit mengsel afgescheiden door Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muizen sarcoma-cellen en bestaat grotendeels uit collagen type IV en laminine. De kamers worden dan geplaatst in een weefselkweek die goed celkweekmedia bevat met of zonder groeifactoren waarvan wordt vermoed dat invasie stimuleren. Cellen die een hogere invasiecapaciteit binnenvallen door de extracellulaire matrix bekleed filter met een hogere frequentie en zich aan de onderzijde van het filter hebben. We hebben deze assay gewijzigd om de rol van microglia en macrofagen op tumor geassocieerde glioblastoma celinvasie beoordelen. 10 voudige 9,10 - Wij hebben kunnen vaststellen middels co-cultuur assays beschreven in dit document dat microglia de invasie van twee glioblastoma cellijnen kunnen stimuleren door 5 geweest. Dit weerspiegelt wat wordt waargenomen in diermodellen van glioblastoma. Verder hebben we een driedimensionaal invasie assay waarbij de wisselwerking tussen glioblastoma cellen en macrofagen / microglia zijn directer onderzocht. De mate van glioblastoma celinvasie gestimuleerd door macrophages / microglia in het 3D assay is vergelijkbaar met wat gezien wordt met de bedekte matrix kamer benadering. Soortgelijke proeven werden eerder ontwikkeld om mammacarcinoom interacties met macrofagen tijdens invasie 11-13. Zowel in dit document beschreven werkwijzen moet de steun in het vermogen om het moleculaire mechanisme (s) van macrofagen / microglia-gestimuleerde invasie van glioblastoma cellen ontleden.

<table><tbody><tr><td>Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix</td><td>Corning/Fisher Scientific</td><td>Cat: 354481</td><td></td></tr><tr><td>Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml)</td><td>Life Technologies</td><td>12065-074</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Red CMTPX Dye</td><td>Life Technologies/Molecular Probes</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Life Technologies/Molecular Probes</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>GL261 cell line</td><td>National Cancer Institute (NCI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U87 cell line</td><td>American Tissue Type Culture Collection</td><td>HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 cell line</td><td>American Tissue Type Culture Collection</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (500 ml)</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 &micro;M pore) 48 per pack.</td><td>Corning</td><td>CLS3422</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear</td><td>Trevigen</td><td>3445-005-01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>Cat: 10500064</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated</td><td>Fisherscientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8139-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

coculture testen om te studeren macrofagen en microglia stimulatie van glioblastoma invasion

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (graad IV glioom) is een zeer agressieve kanker bij de mens, met een mediane overleving van 1 jaar na de diagnose. Ondanks de toegenomen kennis van de moleculaire gebeurtenissen die leiden tot glioblastoma ontstaat, kanker nog steeds zeer ongevoelig voor conventionele behandeling. Chirurgische resectie van hooggradige hersentumoren is zelden volledig te wijten aan de sterk infiltrative aard van glioblastoma cellen. Therapeutische benaderingen die glioblastoma cel invasie afzwakken is daarom een ​​aantrekkelijke optie. Ons laboratorium en anderen hebben aangetoond dat de tumor-geassocieerde macrofagen en microglia (resident hersenen macrofagen) sterk stimuleren glioblastoma invasie. De in dit document beschreven protocol wordt gebruikt om te modelleren glioblastoma-macrofagen / microglia interactie met behulp van in vitro cultuur assays. Deze benadering kan de ontwikkeling en / of de ontdekking van geneesmiddelen die de communicatie met de macrofagen verstoren dat deze kwaadaardige Behav maakt veel gemakkelijkerIOR. 10-voudig - We hebben twee robuuste co-cultuur invasie assays, waar microglia / macrofagen stimuleren glioom cel invasie van 5 vastgesteld. Glioblastoma cellen gemerkt met een fluorescente merker of constitutief een fluorescerend eiwit tot expressie brengen worden uitgeplaat en zonder macrofagen / microglia on-bedekte matrix polycarbonaat kamer inzetstukken of ingebed in een driedimensionale matrix. Celinvasie wordt bepaald door fluorescentie microscopie aan te tellen alleen invasieve cellen aan de onderkant van het filter. Met behulp van deze assays, meerdere farmacologische remmers (JNJ-28312141, PLX3397, Gefitinib en Semapimod), geïdentificeerd die macrofagen blokkeren / microglia gestimuleerd glioblastoma invasie.

Met de hier beschreven werkwijzen, hebben we aangetoond dat microglia en macrofagen aanzienlijk kunnen stimuleren glioblastoom celinvasie. Twee verschillende invasie assays worden toegepast en worden weergegeven in figuur 1. In figuur 2, werden GL261 cellen die constitutief het fluorescerende eiwit tot expressie mCherry uitgeplaat op vooraf beklede kamers met en zonder microglia voor 48 uur. GL261 cellen werden minimaal invasieve op zichzelf echter indie...

Het begrijpen van het kwaadaardige gedrag van kanker vereist het creëren van nauwkeurige modellen van hoe tumorcellen interageren met componenten van de tumormicro-omgeving, zoals macrofagen. Hier beschrijven we twee methoden om de interactie van glioblastoomcellen met tumorgeassocieerde macrofagen en microglia te bestuderen, waarbij het effect op glioblastoominvasie wordt beoordeeld.

Coculture Testen om te studeren macrofagen en microglia Stimulatie van glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Het algemene doel van dit experiment is om de interactie van glioblastoomcellen met microglia en macrofagen tijdens invasie in een in vitro assay te modelleren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de tumormicro-omgeving, zoals welke verbindingen of behandelingen de interactie van kanker met macrofagen kunnen verstoren, een celtype van de micro-omgeving tijdens de progressie naar maligniteit. Een van de belangrijkste voordelen van deze techniek is dat deze relatief eenvoudig uit te voeren is, binnen een redelijke tijd kan worden voltooid en accuraat de glioblastoominvasie in vivo lijkt te modelleren.Begin met het differentiëren van de betreffende cellijn met phorbolmyristaatacetaat, als volgt. Zaai eerst twee tot drie keer 10⁵ THP-1 cellen uit in 1,5 milliliters medium in een zeswells kweekplaat. Voeg direct na het uitzaaien 100 nanomolar PMA toe en incubeer gedurende 48 uur bij 37 °C en 5% CO2.Verwijder na 48 uur de PMA door het medium af te zuigen, was één keer met one-X PBS en voeg vers medium toe. Incubeer nogmaals 48 uur totdat de cellen klaar zijn voor gebruik in de assay. Equilibreer vervolgens de voorkoat met matrix bewerkte kamers door deze in een well met 500 microliters serumvrij medium te plaatsen en vervolgens 500 microliters serumvrij medium aan de bovenzijde toe te voegen.Incubeer de kamers gedurende twee uur bij 37 °C en 5% CO2. Aspireer vervolgens voorzichtig het medium uit de kweekvaten die de fluorescentie-gelabelde glioblastoomcellijnen en de microglia en macrofagen bevatten. Voeg daarna 500 µL van 2 mM EDTA en PBS toe en incubeer gedurende vijf tot 10 minuten in de weefselkweekincubator.Verzamel de cellen in vijf milliliter medium dat 0,3% runder serumalbumine bevat en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 120 ×g. Aspireer na de centrifugatie het supernatant en resuspendeer de celpellet in geschikt medium tot een concentratie van 1 × 10⁶ cellen per milliliter. Gebruik de hemocytometer om de cellen te tellen. Voeg vervolgens 500 µL van het geschikte medium dat 0,3% BSA bevat toe aan de wells van een 24-wells plaat.Verwijder vervolgens het medium uit de geëquilibreerde kamers en plaats de kamers in de wells van de 24-wells plaat. Indien remmers worden gebruikt om hun effect op door macrofagen of microglia gestimuleerde glioma-invasie te bestuderen, voeg dan de juiste concentratie toe aan zowel het onderste als het bovenste gedeelte van de kamer. Meng, afhankelijk van de gebruikte cellijn, glioblastoomcellen met muismicroglia of gliomacellen met macrofaagcellen volgens de details in het schriftelijke gedeelte van het protocol.Voeg het celmengsel toe aan de bovenste kamer en incubeer dit gedurende 24 tot 48 uur, afhankelijk van het celtype. Verwijder na de incubatie de cellen uit de bovenkant van de kamer door middel van voorzichtig aspireren. Plaats de kamers vervolgens in 3,7% formaldehyde in PBS om ze te fixeren.Laat de kamers 15 minuten bij kamertemperatuur in het fixeer middel staan. Verwijder vervolgens het fixeer middel door middel van voorzichtig aspireren en vervang dit door 500 µL 1X PBS. Ontdooi eerst de matrixmix gedurende één nacht bij 4 °C.Bereid vervolgens een matrixconcentratie van 10 mg/mL voor in het geschikte medium op ijs. Oogst daarna de gelabelde cellen voor suspensie in de matrix zoals eerder beschreven. Pipetteer vervolgens 1,5 × 10⁵ GL261-cellen in een volume van 150 µL, samen met 5 × 10⁴ microglia-cellen in 50 µL, in een microcentrifugebuis van 1,5 mL.Voeg 2 × 10⁵ GL261-cellen in een volume van 200 µL toe aan een aparte microcentrifugebuis van 1,5 mL. Centrifugeer de cellen vijf minuten lang bij 120 ×g. Resuspendeer de cellen vervolgens in 200 µL koude matrix op ijs. Voor deze stap is het cruciaal dat het ijsbakje in de zuurkast klaarstaat, de buisjes op ijs worden bewaard en de tips in de koelkast staan; zorg dat alles gekoeld is om voortijdige polymerisatie van de volgroeide gel te voorkomen.Plat na resuspensie 50.000 cellen in een volume van 50 µL uit op het midden van het bovenste compartiment van een chamber insert met een poriegrootte van 8 µm. Incubeer dit vervolgens 30 minuten bij 37 °C om polymerisatie mogelijk te maken. Voeg na 30 minuten 200 µL serumvrij medium toe aan de bovenkamer en 700 µL celgroeimedium met serum aan de onderste put.Na 48 uur incubatie worden de cellen uit het bovenste gedeelte van de kamer voorzichtig door aspiratie verwijderd. Fixeer de kamers zoals voorheen en vervang het fixeermiddel door 500 microliters one-X PBS voordat de cellen worden afgebeeld. Deze representatieve afbeelding toont invaderende mCherry-expresserende GL261-cellen in afwezigheid van microglia.De cellen werden uitgeplaat op met matrix gecoate kamers en gedurende 48 uur geïncubeerd. De beelden zijn vastgelegd met een 10X objectief en de schaalbalk staat voor 400 microns. Hier zijn de GL261-cellen gecombineerd met microglia.Het aantal invasieve GL261-cellen dat door het filter migreerde, werd gekwantificeerd. Zoals hier te zien is, versterkt co-cultivatie van de muis-glioblastoomcellijn GL261 met microglia de invasie met maximaal 10 keer in de 2D-assay. Deze afbeelding toont het effect van farmacologische remmers op de door microglia gestimuleerde invasie van GL261 in vergelijking met de DMSO-controle.De getoonde gegevens zijn afkomstig van zes onafhankelijke experimenten. Deze assay is ook succesvol toegepast met behulp van humane cellijnen. U87-cellen, geplaatst in met matrix gecoate kamers en gekleurd met CMFDA-groen, worden getoond na een incubatie van 24 uur.Hier werden de U87-cellen uitgeplaat met gedifferentieerde THP1-macrofagen. Deze afbeelding toont de kwantificering van de assay waarbij alleen invasieve U87-cellen zijn geteld. De menselijke macrofaagcellijn THP1 stimuleerde de invasie van U87-glioblastoomcellen.De getoonde gegevens zijn de gemiddelde waarden van 10 onafhankelijke experimenten. Deze afbeelding van een 3D-invasie-assay van een cocultuur van GL261 en microglia is een compositie van een Z-serie beelden en toont GL261-cellen, gekleurd met CMFDA groen, ingebed in matrix alleen. Hier werden de GL261-cellen gecultuurd samen met murine microglia, gelabeld met CMPTX rood.Hier worden GL261-cellen aan de onderzijde van het filter getoond, die als invasief zijn bepaald. Het totale aantal invaderende GL261-cellen werd bepaald en genormaliseerd ten opzichte van het aantal GL261-cellen in monocultuur. De getoonde gegevens representeren het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten die in dubbeltoestanden zijn uitgevoerd.Zodra deze techniek beheerst is, kan deze van begin tot eind in ongeveer twee uur worden voltooid. De uiteindelijke resultaten van het experiment kunnen na 48 uur worden verkregen. Bij het uitvoeren van deze techniek is het daarom zeer belangrijk dat alles gekoeld is en op vier graden wordt gehouden, inclusief de buisjes en de pipetten.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u glioblastoom kunt vestigen in invasie-assays met coculturen van macrofagen en microglia.

coculture-assays-to-study-macrophage-microglia-stimulation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

In this video, we perform the microglial phagocytosis assay for neuroblastoma using induced pluripotent stem cells. The assay helps assess the impairment of microglial function in neurodegenerative diseases.

Microglial Phagocytosis Assay: An In Vitro Assay to Establish Microglial Phagocytosis Model for Neuroblastoma Cells Using iPSC Macrophages

This video describes a co-culture assay of glioblastoma cells on micropatterned neurons, which mimic the myelinated neuronal tracts invasion by the glioblastoma stem-like cells as they migrate on neurons in the peritumoral spaces. This assay can help analyze the effects of pharmacological drugs that inhibit glioblastoma cells' migration on neurons in a glioma.

Co-Culturing Glioblastoma Cells on Patterned Neurons: A Technique to Monitor the Migration of Glioblastoma Cells on Rat Hippocampal Neurons In Vitro

This video demonstrates an in vitro assay utilizing β-glucans to activate microglial cells for the production of superoxide radicals, a reactive oxygen species. In brain cancer cells, the generated reactive oxidants actively suppress tumor cell proliferation and induce cell death.

An Assay for Analyzing Test &beta;-Glucan as an Immunotherapy Strategy against Brain Cancer Cells

This video demonstrates the assessment of neuronal electrical activity in a co-culture of hiPSC-derived cortical glutamatergic neurons and glioma cells using a microfluidic device with multielectrode arrays.

Assessing Glutamatergic Neurons and Glioma Cells Interactions in a Co-Culture

In this video, glioblastoma and microglia cells are mixed with a polymer matrix solution and transferred to a porous chamber insert where a gel forms, embedding the cells. Microglia stimulate the migration of glioblastoma cells through the porous insert, mimicking tumor cell invasion into surrounding tissue, Cells are then fixed and prepared for further analysis.

Matrix-Based Tumor Invasion Model Using Microglia Glioblastoma Co-Culture

Het organotypische co-kweek met hersenplakjes carcinoomcellen kunnen visualiseren morfologische veranderingen van fluorescentie en helderveld (video) microscopie gedurende het proces van cel carcinoom invasie van hersenweefsel. Dit model systeem maakt het ook mogelijk voor mobiele uitwisseling en replenishment benaderingen en biedt een breed scala van manipulaties en analyses.

Coculture systeem met een Organotypische Brain Slice en 3D Sferoïde van carcinomacellen

Dit artikel is een nuttige in vitro assay om het vermogen van geconditioneerd medium van tumorcellen te evalueren om macrofagen aan te trekken.

In vitro assay om tumor-macrofaag interactie te bestuderen

Hier presenteren we een methode met behulp van permeabele membraan ondersteuningen om de studie van contactloze paracrine signalering die door tumorcellen wordt gebruikt om de immuunrespons te onderdrukken te vergemakkelijken. Het systeem is vatbaar voor het bestuderen van de rol van tumor-uitgescheiden factoren bij het demping van macrofaag activering.

Het bestuderen van de effecten van door tumor uitgescheiden Paracrine liganden op macrofaag activering met behulp van co-cultuur met permeabel membraan ondersteunt

Hier presenteren we een eenvoudig te gebruiken co-cultuurtest om glioblastoom (GBM) migratie op neuronen met patronen te analyseren. We ontwikkelden een macro in FiJi-software voor eenvoudige kwantificering van GBM-celmigratie op neuronen en merkten op dat neuronen GBM-celinvasieve capaciteit wijzigen.

Co-cultuur van Glioblastoom Stam-achtige cellen op patroonneuronen om migratie en cellulaire interacties te bestuderen

Hier presenteren we een protocol om de interactie van primaire humane monocyt-afgeleide macrofagen met een tumorsferoïde in een driedimensionale (3D) collageen I-matrix te onderzoeken, met de mogelijkheid om de impact van oplosbare en fysische eigenschappen van de micro-omgeving op celinvasie te vergelijken.

Een macrofaag-tumor sferoïde co-invasietest

Leer cocultuurtesten om macrofaag- en microglia-stimulatie van glioblastoom-invasie te bestuderen. Deze methode helpt onderzoekers om interacties in de tumor-micro-omgeving te modelleren en potentiële behandelingen te identificeren.

Coculture Testen om te studeren macrofagen en microglia Stimulatie van glioblastoma Invasion

Meer video's verkennen