Name: In Vivo Tracks Biosensor Non-apoptotische caspase activiteit in Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Leer de CaspaseTracker-biosensor gebruiken om niet-apoptotische caspase-activiteit in levende Drosophila te detecteren en te volgen. Deze methode onthult nieuwe rollen van caspases in gezonde cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Polan Santos en Darren Obbard voor Drosophila illustraties in Fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena voor het gebruik van de JHMRI insectary. Dit werk werd ondersteund door het Life Science Research Foundation fellowship (HLT), University Grants Committee van de Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF), en NIH subsidies NS096677, NS037402 en NS083373 (JMH). Ho Lam Tang is een Shurl en Kay Curci Foundation Fellow van de Life Sciences Research Foundation.

1. Bereiding van CaspaseTracker Flies <ol><li> Ter voorbereiding CaspaseTracker (DQVD) vliegt voor experimenten uit te voeren deze kruising: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP; Ubi&gt; Stoppen&gt; GFP-NLS), door de overdracht van 7-10 maagd vrouw (of man) vliegen die de caspase biosensor substraat mCD8-DIAP1 Gal4-gedreven door de ubiquitine-promoter 35 tezamen met eenzelfde aantal mannelijke (of vrouwelijke) G-TRACE vliegen, waarbij het tweede chromosoom Cyo balanceerinrichting moet letaliteit van de homozygote combinatie van G- voorkomen TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP, en Ubi&gt; Stoppen&gt; GFP-NLS) 34. Plaats vliegt in een vers voedsel flacon met verse gist plakken als eiwitbron. </li><li> Incubeer bestanden bij 18 ° C gedurende 5 tot 7 dagen (maximum 2 weken) en verwijder vervolgens de bovenliggende vliegt uit het flesje te vermijden overbezetting met nieuwe nageslacht, en het opzetten van nieuwe veredelingstechnieken flesjes. </li><li> Verder incubatie bij 18 ° C tot nageslacht vliegt Eclose. Selecteer de niet-Cyo [non-curly vleugel] nageslacht van de juiste genotype van CaspaseTracker, die transgeen voor CaspaseTracker en G-TRACE elementen 35 zijn. </li><li> Tegelijkertijd genereren controle ouderlijke niet-transgene w118 vliegen en caspase-ongevoelige (DQVA) vliegen parallel aan specifieke CaspaseTracker RFP en GFP-fluorescentie te controleren. </li><li> Voer PCR genotypering om bestanden met CaspaseTracker met behulp van de primers te bevestigen: 5&#39;-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3&#39;-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, het produceren van een 3897 bp product. Voor genotypering van de G-Trace loci, gebruik maken van de volgende primers voor GFP (474 ​​bp), 5&#39;-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G, 3&#39;-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; voor RFP (258 bp), 5&#39;-GGC TGC TTC ATC TAC AAG AAG GTG TTC ATC GG, 3&#39;-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; en voor Flpase (655 bp), 5&#39;CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3&#39;-GCC TAC TAA CGC TTG TTG TCT TCT CTG TCA C. Voor genotypering Gal4 in de pUWR vector (554 bp), 5&#39;-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT CAGTCA CGC, 3&#39;-TGG AAT TGG GGT ACG TCT AGA. </li></ol> 2. Tissue Voorbereiding, kleuring en Montage <ol><li> Voor fly dissecties, voorkomen ontleed weefsel van het vasthouden aan plastic pipet tips en centrifugebuizen, jas tips en buizen met 1% runderserumalbumine (BSA), opgelost in water. </li><li> Ontleden vliegt op een siliconen kussen behulp van een tang. <ol><li> Om beschadiging van de uiteinden van de forceps op een hard oppervlak bij het uitvoeren van het weefsel dissectie voorkomen, mag dissectie op een siliciumoppervlak. Voor het maken van siliconen dissectie platen, smelt het silicium in de commerciële kit volgens instructies van de fabrikant (Materials List). Na smelten van de siliconen, voeg 3-4 ml van een 60 mm weefselkweekplaat. Silicon gerechten kunnen worden hergebruikt. </li><li> Verdoven een vlieg met CO 2, en overgebracht naar een silicagel platen met 1 ml koude PBS. Introduceer de CO 2 om een flacon met het vliegen met behulp van een blaaspijp, en vervolgens over het verdoofd vlieg toa Pad dat een CO 2 aanbod heeft. </li><li> Gebruik een tang om de vlieg greep hoofd, en een tweede tang de thorax trekken in de tegenovergestelde richting van de vlieg kop los te koppelen van het lichaam die zonder de verbinding tussen de kop en voordarm. </li><li> Gebruik 2 paar tang om de vleugels en poten van de thorax te verwijderen. </li><li> Gebruik een tang om de thorax te houden en een tang om de buik te trekken om het opnieuw scheiden van de thorax zonder beschadiging van de verbinding tussen de voordarm en middendarm. </li><li> Ontleden inwendige organen, inclusief de hersenen, darmen, Malpighian buisjes en de eierstokken, zoals eerder aangetoond. 39-41 </li><li> Verwijder alle stukken van de cuticula en het vet lichamen met een tang als deze weefsels te produceren sterke autofluorescentie. Geduld en oefening moeten een compleet orgaansysteem bereiden zijn. </li></ol></li><li> Transfer ontleed weefsels tot 1,5 ml centrifuge buizen, en bevestig weefsels wiste 0,5 ml 4% paraformaldehyde in PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) bij kamertemperatuur gedurende 20 tot 30 min met rotatie in het donker bleken RFP en GFP in de weefsels voorkomen. Vermijd langdurige fixatie die volgende kleuring resultaten in gevaar kunnen brengen. </li><li> Verwijder de paraformaldehyde door voorzichtig pipetteren en was 3 maal met 0,5 ml PBST (PBS + 0,1% Triton X-100) bij kamertemperatuur. </li><li> Permeabilize de weefsels met 0,5 ml PBST bij 4 ° C geïncubeerd onder zacht schudden. Kortere incubaties kunnen onvolledig permeabilisatie en compromissen vlekken resultaten opleveren. <ol><li> Als het nodig is om achtergrondkleuring te verminderen, overwegen incuberen weefsels in 0,5 ml PBST met 1% BSA in plaats van PBS. </li></ol></li><li> Was de weefsels 3 maal met 0,5 ml PBST. </li><li> Kernen en filamenteus actine (F-actine) vlek toepassen 0,5 ml PBST met 10 ug / ml Hoechst 33342 kleurstof en blauw nucleaire 0,3 uM Alexa Fluor 633 Phalloidin F-actine kleurstof en incubeer gelijktijdig met weefsels gedurende 1 uur bij kamertemperatuur wie zachte rotatie in het donker. Vermijd langdurig kleuring omdat dit de achtergrond zal toenemen. <ol><li> Voor immunokleuring Incubeer gefixeerd en gepermeabiliseerd weefsels met 0,1% Triton X-100 in 0,5 ml PBS overnacht bij 4 ° C, vlek met 1: 100 verdunning van anti-Elav antilichaam of 1: 200 verdunning van anti-caspase-3 nacht bij 4 ° C (300 ui). Volg de overeenkomstige secundaire antilichaam verdund 1: 100 en incubeer gedurende 1 tot 3 uur bij kamertemperatuur. Zie Materialen List voor specifiek antilichaam informatie. </li></ol></li><li> Was de weefsels 3 maal, telkens 5 min in 0,5 ml PBST met zachte rotatie. </li><li> Met een pipet, verwijder alle PBST en voeg 200 ul anti-bleekmiddel montagemiddel (zie materialen) volledig te bedekken weefsels gedurende 1-3 uur bij kamertemperatuur of 4 ° C overnacht. Optimale weefsels die volledig zijn opgenomen het montagemiddel zal zinken naar de bodem van de buis. </li><li> Pre-Clean het glaasje met water of 70% ethanol en de overdracht van de weefsels met montage agent om het glass glijbaan. </li><li> Plaats een glazen afdekplaat slip over de weefsels voorzichtig. Solliciteer vaseline aan het glaasje en het deksel slip te voorkomen dat het vernietigen van het weefsel door overkompressie. Verwijder extra bevestiging agent met vloeipapier. </li><li> Dicht de dekglas door toepassing nagellak langs de randen van het dekglas om lekkage montage stoffen uit de weefsels voorkomen. </li></ol> 3. Confocale microscopie <ol><li> Gebruik een omgekeerde confocale epi-fluorescentie microscoop. Echter, rechtopstaande microscopen worden gebruikt. Om het gebruik van weefsels tiling handhaven stabiele kamertemperatuur drift van focus en verschuiving van xy vlak voorkomen door de thermische uitzetting en krimp van de componenten. Milieu-controle systemen en aandacht driftcompensatie systemen helpen om dit probleem te voorkomen als gevolg van het verlies van thermo-evenwicht van de microscoop systeem. </li><li> Plaats het preparaat op het podium van de microscoop. Neem een ​​paar testbeelden met behulp van lage resolutie (125 x 125 pixels), eend het juiste aantal tegels nodig bestrijken het gehele gebied van belang (ROI) te bepalen. </li><li> Stel de microscoop scansysteem om beelden met scanresolutie zoals 500 x 500 pixels vast te leggen. Selecteer het doel zoals een 20x NA 0,8 of een 63x NA 1,4 Plan-Apochromat doelstelling voor het analyseren van weefsel door glazen dekglaasjes, zodat elk van de afbeeldingen (tegels) overlapt 20% aan alle kanten. </li><li> Stel de afbeelding sequentie uit langste excitatiegolflengten kortste als de lange golflengte van licht veroorzaakt lagere foto-bleken. De sequentie van het langste tot excitatiegolflengte kortste is: (i) 633 nm voor Phalloidin F-actine en antilichaam tegen geactiveerde caspasen, (ii) 561 nm voor RFP, (iii) 488 nm voor GFP, en (iv) 405 nm voor Hoechst nucleaire vlek. </li><li> Tijdens de beeldvorming, minimaliseren de blootstelling van cellen aan fluorescente laser excitatie bij beeldvormend proces foto-bleken voorkomen doordat de laserintensiteit om beelden van hoge kwaliteit van weefsels te verkrijgen. </li><li> Nadat ikmages worden verzameld, het samenvoegen van de beelden met behulp van microscoop software. </li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier illustreren we de bouw en de innerlijke werking van CaspaseTracker dat de detectie van een brede basale caspase-activiteit in gezonde weefsels te vergemakkelijken. De kritische stappen voor het detecteren van niet-apoptotische caspase activiteit in vivo zijn: 1) het genereren van vliegen met de biosensor transgen 2) na caspase-reporter functie met geschikte controles, 3) de toepassing dissectie technieken om alle interne orgaansystemen van de volwassen Drosophila observeren, en 4) onderscheiden bi...

Caspasen zijn cysteïne proteasen die apoptotische celdood bemiddelen door het splitsen van een groot aantal intracellulaire eiwitten na sleutel aspartaat residuen. Bijvoorbeeld, initiator caspases te activeren effector caspasen, derepresseren DNA nucleasen, splitsen cytoskelet componenten en de lipide samenstelling van celmembranen veranderen om snel te ontmantelen cellen en hun erkenning en engulfment stimuleren door naburige cellen die beschikken over de cel lijken. 1-4 Er wordt geschat dat miljarden cellen sterven per dag in het menselijk lichaam, en apoptose is een belangrijk mechanisme van door chemotherapie geïnduceerde tumorceldood. 5 een andere groep caspasen kan celdood dan veroorzaken bij verschillende niet-apoptotische processen aangeboren immuniteit stimuleren. 6, het meeste onderzoek op caspases is gericht op hun pro-dood functies. Interessant vroeg bewijs op het gebied bleek dat dezelfde caspasen verantwoordelijk voor het bevorderen celdood ook niet dood fzalven. Baanbrekende studies hebben aangetoond dat caspasen zijn betrokken bij diverse cellulaire functies in gezonde cellen, waaronder de regulering van celproliferatie en celmigratie tijdens embryogenese. 7-9 Caspasen zijn vereist voor spermatide individualisering in Drosophila 10,11, voor het blokkeren van een alternatieve necroptotic celdood in muizen 12,13, en microRNA verwerking in C. elegans. 14,15 In misschien de langste duur cellen, neuronen, caspasen en andere apoptotische mechanisme betrokken zijn bij de regulering van de neuronale activiteit van snoeien synaptische uiteinden, een proces vermoedelijk essentieel zijn andere synapsen voor leren en geheugen versterken. 16- 18 Het is mogelijk dat caspases pruning een soort mini-apoptose kleine neuronale uitsteeksels niet met hele celdood bevorderen. 19 echter caspasen kunnen alternatieve functies verbonden moeten apoptose-achtige verschijnselen. 20,21 dubbelrols in het leven en de dood zijn niet uniek voor caspases; BCL-2 familie eiwitten en cytochroom c zijn rol in cellulaire energetica in gezonde cellen, maar maken ook deel uit van de kern apoptotische route die geactiveerd wordt door veel celtypen stress. 22-25 Hoewel niet bewezen, lijkt het logisch dat de evolutie dag is gekoppeld -Jobs dood-banen binnen dezelfde moleculen om tijdig eliminatie van ongeschikte of ongewenste cellen te waarborgen. Op dit moment worden de moleculaire mechanismen van apoptotische caspase activiteit begrepen, en de mate van niet-apoptotische caspase activiteit tijdens embryonale ontwikkeling en in volwassen weefsels is ook niet bekend. Een belangrijke uitdaging is de moeilijkheid in het onderscheiden van dag-banen van de dood-banen van caspases. In tegenstelling tot apoptose en pyroptosis wanneer caspase-activiteit wordt versterkt door een proteolytische cascade worden de dag-banen van caspases verwacht bij veel lagere niveaus van enzymatische activiteit, vermoedelijk beneden detectie plaatsvinden door vele beschikbare technologies. Voor de hier gepresenteerde werk, anderen ontwikkeld diverse caspase biosensoren voor verschillende doeleinden. De SCAT biosensoren (bijv ECFP-DEVD-Venus) snel op te sporen real-time caspase-activiteit in gekweekte cellen en dierlijke weefsels met behulp van FRET. 26,27 Bij caspase decollete, de kern gerichte GFP deel van Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) ondergaat subcellulaire herlokalisatie binnen enkele minuten wanneer de plasmamembraan-tether wordt gesplitst door caspases. 28 Evenzo NES-DEVD-YFP-NLS ApoAlert-pCaspase3-Sensor () herlokaliseert van het cytoplasma naar de kern op caspase decollete. 29,30 Meer voor kort werd de chromofoor in iCasper slim ontworpen om fluoresceren wanneer gesplitst door caspases, waardoor de detectie van biosensor in real-time in neuronen van Drosophila embryo&#39;s, maar vooral in combinatie met een ontwikkelingsstoornis celdood. 31 caspase-afhankelijke dood van olfactorische neuronen tijdens veroudering was demonstbeoordeeld door immunodetectie van de caspase-gesplitste vorm van CPV biosensoren (bijvoorbeeld mCD8 PARP-Venus). 32,33 Belangrijk is dat de geactiveerde vorm van caspase-3 in afwezigheid van celdood gedetecteerd door gevoelige immunostain in stekels van gekweekte neuronen, en in het soma via caspase-afhankelijke fluorescentie van het nucleaire CellEvent reporterkleurstof, maar probleemgevallen door foto-toxiciteit, hoewel celdood werd uitgesteld tot na wervelkolom eliminatie. 19 Aldus nieuwe caspase biosensoren nodig detecteren en volgen basale cellen met caspase-activiteit in vivo. Om deze moeilijkheden te overwinnen, genereerden wij een nieuwe tweekleurige caspase biosensor, aangewezen CaspaseTracker. Deze strategie combineert een aangepaste versie van de Drosophila caspase-gevoelige Apoliner biosensor 28 met de Drosophila G-TRACE FRT recombinasesysteem 34 permanent labelen en volgen cellen in vivo. &lt;sup&gt; 35 Het Gal4-geactiveerde G-trace systeem maakt het mogelijk zeer lage niveaus van caspases tot CaspaseTracker activeren, wat resulteert in RFP expressie in het cytoplasma en permanente GFP expressie nucleair doelwit in een cel die ooit caspase activiteit heeft meegemaakt. 35 Dit systeem kan labelen cellen in leven in gehele dieren met behulp van Drosophila melanogaster, een soepel en veel gebruikt model voor de studie van caspases en celdood. 36-38

<table><tbody><tr><td colspan="4">Verbruiksartikelen en reagentia</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Products</td><td>H-1000</td><td>Montagemedium</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Ted Pella</td><td>#505 (110mm, #5)</td><td>Dumont pincet biologiekwaliteit, roestvrij staal</td></tr><tr><td>Hanging Drop Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td>Glazen platen</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Molecular Probes</td><td>H1399</td><td>DNA-kleuring</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 Phalloidin</td><td>Molecular Probes</td><td>A22284</td><td>Actine-kleuring</td></tr><tr><td>Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antilichaam</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>Antibody Registry ID:&nbsp; AB_528218&nbsp;</td><td>Kleuring voor Drosophla pan-neuronale ELAV</td></tr><tr><td>Cleaved caspase-3 (Asp175) antilichaam</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#9661</td><td>Kleuring voor actief fragment van caspase-3</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade reagens</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td>voor het behoud van fluoroforen&nbsp;</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36961</td><td>voor het behoud van fluoroforen&nbsp;</td></tr><tr><td>SylGard 182 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning&nbsp;</td><td>Productcode: 0001023934</td><td>voor dissectieplaten</td></tr><tr><td colspan="4">Apparatuur</td></tr><tr><td>LSM780 confocale microscoop</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Beeldvorming</td></tr><tr><td>Carl Zeiss Stereomicroscoop Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Drosophila dissectie</td></tr><tr><td>AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscoop Illuminator, 150&nbsp;W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316</td><td>Lichtbron</td></tr></tbody></table>

in vivo tracks biosensor non-apoptotische caspase activiteit in drosophila

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Caspases zijn de belangrijkste bemiddelaars van apoptotische celdood via hun proteolytische activiteit. Wanneer caspasen in cellen worden geactiveerd tot niveaus die detecteerbaar zijn met beschikbare technologieën, wordt over het algemeen aangenomen dat apoptose kort daarna zal plaatsvinden. Caspases kunnen veel functionele en structurele componenten splitsen om snelle en volledige celvernietiging binnen enkele minuten te veroorzaken. Echter, toenemend bewijs geeft aan dat in normale gezonde cellen dezelfde caspasen andere functies hebben, vermoedelijk op lagere enzymatische niveaus. Studies naar niet-apoptotische caspase-activiteit zijn gehinderd door moeilijkheden met het detecteren van lage niveaus van caspase-activiteit en met het volgen van het uiteindelijke cellot in vivo. Hier illustreren we het gebruik van een ultragevoelige caspase-reporter, CaspaseTracker, die cellen permanent labelt die caspase-activiteit hebben ervaren in hele dieren. Deze in vivo dual-color CaspaseTracker biosensor voor Drosophila melanogaster drukt tijdelijk rood fluorescerend proteïne (RFP) uit om recente of lopende caspase-activiteit aan te geven, en permanent groen fluorescerend proteïne (GFP) in cellen die op enig moment in het verleden caspase-activiteit hebben ervaren, maar niet zijn gestorven. Belangrijk is dat deze caspase-afhankelijke in vivo biosensor gemakkelijk de aanwezigheid van niet-apoptotische caspase-activiteit in de weefsels van orgaansystemen in de hele volwassen vlieg onthult. Dit wordt aangetoond met behulp van gehele montages van individuele vliegen om biosensor-activiteit in gezonde cellen door het hele brein, darm, malpighische buisjes, cardia, eileiders en andere weefsels te detecteren. CaspaseTracker detecteert niet-apoptotische caspase-activiteit in langlevende cellen, aangezien biosensor-activiteit wordt gedetecteerd in volwassen neuronen en in andere weefsels ten minste 10 dagen na caspase-activering. Deze biosensor dient als een belangrijk hulpmiddel om de rollen en moleculaire mechanismen van niet-apoptotische caspase-activiteit in levende dieren te onthullen.

Er zijn twee belangrijke componenten waarmee CaspaseTracker om caspase-activiteit te detecteren in de normale gezonde cellen (figuur 1a). De eerste is een 146 aminozuur caspase afsplitsbare polypeptide gemodelleerd naar de caspase biosensor Apoliner (figuur 1b). 28 Deze polypeptide is afgeleid van DIAP1 (Drosophila remmer van apoptose) met een natuurlijk voorkomend caspase plaats die wordt gesplitst tijdens apoptose typisch door caspa...

Gezonde cellen in gehele dieren die lage niveaus van caspase activiteit bevatten detecteren, de aangewezen CaspaseTracker gevoelige biosensor werd gegenereerd voor Drosophila. Caspase-afhankelijke biosensor activiteit gedetecteerd in langlevende gezonde cellen in de inwendige organen van volwassen dieren onder geoptimaliseerde omstandigheden gekweekt bij afwezigheid van dood stimuli.

In Vivo Tracks Biosensor Non-apoptotische caspase activiteit in Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

Het algemene doel van dit experiment is om niet-apoptotische caspase-activiteit in levende dieren te detecteren en te volgen, met Drosophila Melanogaster als model. Caspases zijn proteasen die vele cellulaire componenten splitsen om apoptotische celdood te veroorzaken. Daarom wordt vaak aangenomen dat de aanwezigheid van actieve caspases in cellen wijst op aanstaande celdood.Er is echter steeds meer bewijs dat dezelfde caspasen die celdood veroorzaken, ook normale functies hebben in gezonde cellen. Deze reguliere taken van caspasen omvatten de regulatie van neuronale activiteit, mitochondriale functies en zelfs de onderdrukking van alternatieve pathways voor celdood. Er zijn twee belangrijke moeilijkheden bij het bestuderen van deze reguliere taken van caspasen.Ten eerste liggen normale basale niveaus van caspase-activiteit doorgaans onder de detectielimieten van de beschikbare technologieën. Ten tweede is het, zelfs wanneer basale caspase-activiteit detecteerbaar is, moeilijk om deze te onderscheiden van de caspase-activiteit die op korte termijn tot celdood zal leiden. Om dit probleem op te lossen, hebben we een caspase tracker ontwikkeld: een gevoeligere caspase-biosensor die cellen die caspase-activering hebben overleefd permanent kan labelen.Deze biosensor stelt ons in staat om cellen met niet-apoptotische caspase-activiteiten te detecteren en te volgen, en om de functies hiervan in levende dieren te bestuderen. Het in vivo caspase-tracker biosensorsysteem voor drosophila bestaat uit twee componenten: de caspase-activeerbare gist-transcriptor Gal4 en de Gal4-geactiveerde fluorescente reporter die bekend staat als G-Trace.Caspase-biosensorvliegen worden gekruist met G-Trace-vliegen om CaspaseTracker-vliegen te genereren die caspase-activiteit rapporteren als rode en groene fluorescentie. Caspase-activiteit wordt in de nakomelingen gedetecteerd wanneer de biosensor door actieve caspases wordt gesplitst bij de sequentie DQVD, waarbij Gal4 vanuit het plasmamembraan wordt vrijgegeven. Vrijgegeven Gal4 transloceert naar de nucleus en induceert de expressie van het rode fluorescerende eiwit, RFP, totdat caspases inactief worden.Echter induceert Gal4 ook de expressie van FLP-recombinase, wat leidt tot een continue expressie van kern-gericht GFP gedurende de levensduur van de cel. Een controle-biosensor heeft een mutatie, DQVA, in de caspase-splitsingsplaats. Begin met het kruisen van transgene vliegen die de caspase-gevoelige Gal4-biosensor dragen met vliegen die de G-Trace fluorescentiereporter dragen.Koppel zeven tot 10 maagdelijke biosensor-vrouwtjes met zeven tot 10 pas uitgekomen mannelijke G-Trace vliegen in een vers voedselbuisje. Een belangrijke negatieve controle is de caspase-ongevoelige versie van deze biosensor, die een enkele puntmutatie heeft in het aspartaatresidu dat nodig is voor caspase-splitsing. Gebruik voor deze controlevliegen dezelfde paringsprocedure.Houd de vials na het opzetten van de kruisingen op 18 graden Celsius. Wanneer de larven zich ontwikkelen en voordat de nieuwe nakomelingen uitkomen, moeten de ouderlijke vliegen naar nieuwe vials worden overgebracht om de productie van nieuwe nakomelingen voort te zetten. Verzamel de nakomelingen met rechte, niet-gekrulde vleugels zodra zij uitkomen.Dit fenotype geeft aan dat deze vliegen transgenen dragen voor zowel de caspase-biosensor als de fluorescente G-Trace-reporter. Dissekeer vervolgens, volgens gevestigde protocollen, de vliegen om intacte interne weke weefsels te isoleren van zowel de caspase-tracker-vliegen als de controlevliegen. Bereid ter start pipetpunten en centrifugebuizen voor waaraan de gedissekeerde weefsels niet zullen kleven.Om dit te doen, coatet u de tips en buisjes met één procent runderserumalbumine opgelost in water. Om de gedissekeerde weefsels te fixeren, vult u de gecoate transparante buisjes met 0,5 milliliter verse vier procent paraformaldehyde in PBS en brengt u de vers gedissekeerde weefsels over in deze buisjes. Plaats de weefsels vervolgens bij kamertemperatuur in het donker om fotobleken te voorkomen en incubeer ze gedurende 20 tot 30 minuten onder zachte rotatie, zodat de weefsels volledig door het fixatief worden omspoeld zonder dat ze beschadigen.Langere fixatie kan leiden tot suboptimale kleuring van weefsels. Om paraformaldehyde te verwijderen en de membraanpermeabilisatie van de gefixeerde weefsels te initiëren, verwijdert u voorzichtig de paraformaldehydeloplossing met een gecoate pipetpunt en wast u de weefsels drie keer met 0,5 mL PBST. Om de weefselpermeabilisatie te voltooien en aspecifieke binding in daaropvolgende kleuringsprocedures te blokkeren, incubeert u de weefsels gedurende één nacht in het donker bij 4 °C met een zachte rotatie in 0,5 mL PBST die 1% BSA bevat.Verwijder de volgende dag de PBST BSA-oplossing door de permeabiliseerde weefsels drie keer te wassen met 0,5 ml PBST. Om verschillende weefselstructuren te helpen visualiseren, worden het nucleaire DNA en het cytoplasmatische F-actine samen gekleurd door de geprepareerde weefsels gedurende één uur bij kamertemperatuur onder zachte rotatie te incuberen in 0,5 ml PBST met Hoechst 33342 blauwe kernkleurstof en Alexa Fluor 633 phalloïdine F-actinekleurstof. Verwijder overtollige kleurstof door de weefsels drie keer te wassen met 0,3 ml PBST.Incubeer elke wasstap vijf minuten bij kamertemperatuur met zachte rotatie. Verwijder voorzichtig alle oplossing uit de weefsels in de buis met een fijne pipetpunt. Om het fluorescentiesignaal tijdens de beeldvorming te behouden, voegt u 200 microliters anti-fade montagevloeistof toe zodat de weefsels volledig bedekt zijn.Incubeer de weefsels één tot drie uur bij kamertemperatuur, of gedurende de nacht bij vier graden celsius. Idealiter zullen weefsels die het montagemiddel volledig hebben geabsorbeerd, naar de bodem van de buis zinken. Reinig de glazen objectglas met water of 70%ethanol voordat u de weefsels monteert.Breng vaseline aan op het objectglas en op het dekglas om te voorkomen dat de weefsels door overmatige compressie worden beschadigd. Breng vervolgens de weefsels met het montagemedium over naar het objectglas. Verwijder overtollig montagemedium met absorberend papier.Sluit tot slot het dekglas af door nagellak langs alle randen aan te brengen. Plaats vervolgens het preparaat op de tafel van een omgekeerde microscoop. Leg beelden van de cellen vast met een 20x Plan-Apochromat objectief met een apertuur van 0,8.Maak enkele testafbeeldingen op lage resolutie om een plan voor het tegelen van afbeeldingen te verifiëren dat het interessegebied beslaat, wat in dit geval het volledige interne orgaansysteem van de vlieg is. Stel de beeldsequentie zo in dat deze begint met de langste excitatiegolflengte en eindigt met de kortste excitatiegolflengte. Dit zal fotobleking minimaliseren, welke toeneemt bij kortere golflengten.Maak vervolgens afbeeldingen met een geschikt hoge resolutie. Elke afbeelding moet een overlap van 10% met de volgende hebben voor een succesvolle tiling. Verzamel twee tot acht scans per tegel om de achtergrondruis te verminderen.Om de schaduw tussen beeldtegels van het differentieel interferentiecontrast, DIC, te elimineren, wordt een referentie-DIC-beeld van het lege gebied gemaakt. Voer vervolgens schaduwcorrectie uit op het tegelbeeld met behulp van het referentie-DIC-beeld. Dit is een gedissekeerde, pas uitgekomen caspase-tracker-vlieg met monddelen, voor-darm, krop, middendarm, achterdarm, anus, eileider en eierstokken.Via confocale microscopie wordt caspase-activiteit gevisualiseerd als RFP-fluorescentie, wat duidt op recente caspase-activiteit, en als GFP-fluorescentie, wat duidt op caspase-activiteit in het verleden. Vergrootte afbeeldingen tonen RFP- en GFP-biosensoractiviteit in de optische lob, het hart, de middendarm, de achterdarm en de eileider. Specifieke cellen langs de Malpighische buisjes vertonen prominent zowel RFP als GFP, wat wijst op aanhoudende caspase-activiteit.In tegenstelling hiermee werd geen RFP- of GFP-biosensoractiviteit aangetoond in eikamers, hoewel de biosensor wel tot expressie kwam in spiercellen tussen de eikamers, gebaseerd op co-kleuring met F-actine-kleuring. De cellen van eikamers zijn echter in staat om caspasen te activeren wanneer vliegen worden blootgesteld aan een stimulus voor celdood, zoals uithongering of een koudeshock, wat leidt tot kerndestructie en massale caspase-activatie op basis van immunokleuring. De caspase-tracker verschijnt waarschijnlijk vroegtijdig en wordt vervolgens afgebroken tijdens de celdood.In de optische lobus van het gezonde caspase-tracker-vliegenbrein wordt biosensoractiviteit gedetecteerd in gezonde cellen die neuronen lijken te zijn, op basis van co-kleuring met een pan-neuronaal marker anti-ELAVI-antilichaam. Dit suggereert een rol voor niet-apoptotische caspase-activiteit in neuronen. Andere strategieën kunnen worden gebruikt om de overleving op lange termijn van cellen met caspase-activiteit aan te tonen, zoals het uitschakelen van de biosensor-expressie met behulp van genetische instrumenten.Bijvoorbeeld GalADTS dat Gal4 remt. De caspase-tracker rapporteert specifiek caspase-activiteit; als controle wordt de niet-splitbare biosensor, DQVA, niet geactiveerd. Het enige signaal bij de controles is te wijten aan autofluorescentie van de resterende cuticula op de monddelen en de anus, en geconsumeerde voeding, gist, in de krops en het hart.Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u de caspase-tracker biosensor kunt gebruiken om niet-apoptotische caspase-activiteit in fruitvliegen te volgen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om negatieve controles op te nemen om caspase-biosensorsignalen te onderscheiden van autofluorescentie. Zo vertonen bijvoorbeeld het exoskelet en de vetlichamen sterke autofluorescentie bij vliegen met of zonder de biosensor.De huidige versie van de caspase-tracker biosensor is ontworpen om het actieve caspase DRICE te detecteren. Andere toepassingen kunnen biosensoren omvatten die specifiek zijn voor verschillende caspases, door de door DRICE herkende splitsingsplaats te vervangen door de splitsingsplaats die door andere caspases wordt herkend.

in-vivo-biosensor-tracks-non-apoptotic-caspase-activity-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een effectieve methode voor het bestuderen dynamica van apoptotische cel...

Wonen Imaging van apoptotische cel Clearance tijdens<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

De embryonale epidermis zeer laat stadium Drosophila embryo's verschaft een in vivo systeem voor snelle steekwond respons-analyse en kunnen worden gecombineerd met genetische manipulatie of chemische behandelingen microinjectie studies gaan in wondgenezing voor de vertaling in zoogdierlijke modellen.

Micro-injectie wondproef en<em&gt; In vivo</em&gt; Lokalisatie van epidermale Wound Response Verslaggevers in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s.

Bepaalde genetische verstoringen of blootstelling aan toxines kunnen normale ontwikkelingsprocessen verstoren, wat leidt tot de dood van specifieke celtypen. De analyse van geactiveerde Caspase 3 door middel van immunofluorescence in zijn geheel in zebrafish embryo's onthult een stadium- en weefselspecifieke lokalisatie van cellen die specifiek apoptose ondergaan.

Analyse van Apoptose in Zebravis Embryo's door middel van Whole-mount Immunofluorescentie om Geactiveerd Caspase 3 te Detecteren

Het begrip anastasis verwijst naar het fenomeen waarbij stervende cellen in een laat stadium een celdoodproces omkeren, zichzelf repareren en uiteindelijk overleven. Hier demonstreren we protocollen voor het detecteren en volgen van cellen die anastasis ondergaan.

Strategieën voor Tracking Anastasis, A Cell Survival verschijnsel dat apoptose Keert

Anastasis is technisch uitdagende te detecteren in vivo omdat de cellen die de cel dood proces hebben omgekeerd morfologisch niet te onderscheiden van normale gezonde cellen kunnen. Hier beschrijven we protocollen voor het opsporen en volgen van cellen die anastasis in levende dieren ondergaan met behulp van ons nieuw ontwikkelde in vivo CaspaseTracker biosensor systeem.

Opsporen van Anastasis In Vivo door CaspaseTracker Biosensor

Hierin beschrijven we een fagocytose assay met behulp van de gedispergeerde embryonale cellen van Drosophila . Het stelt ons in staat om in vivo fagocytose niveaus eenvoudig en nauwkeurig te kwantificeren en nieuwe moleculen te identificeren die nodig zijn voor de fagocytose van apoptotische cellen.

Fagocytose Assay voor Apoptotische Cellen in Drosophila Embryo's

Hier we illustreren hoe enkel molecuul foto-geactiveerde lokalisatie microscopie kan worden uitgevoerd op de motorische zenuw-terminal van een levende Drosophila melanogaster derde instar larve.

In Vivo Single-molecuul volgen bij de Terminal van de presynaptische motorische zenuw Drosophila

Dit protocol beschrijft caspase Bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC); een door de imaging gebaseerde methode die kan worden gebruikt voor het visualiseren van geïnduceerde nabijheid van initiatiefnemer caspases, die is de eerste stap in hun activering.

Verlichting van de trajecten voor Caspase activeren met behulp van fluorescentie Bimolecular complementatie

Hier presenteren we een protocol voor live-imaging wond reparatie en de geassocieerde inflammatoire respons bij hoge spatio-temporele resolutie in vivo. Deze methode maakt gebruik van de popstadium van Drosophila ontwikkeling om op lange termijn beeldvormings- en na verloop van tijd het volgen van specifieke cel populaties en is compatibel met efficiënte RNAi-gemedieerde gene inactivatie.

Op lange termijn In Vivo Tracking van inflammatoire cel dynamiek binnen Drosophila poppen

Hier presenteren we een protocol om recombinant Drosophila caspases Dronc en Drice uit te drukken en te zuiveren, en hun gebruik in in vitro splitsingstests.

In vitro Splitsingstests met gezuiverde recombinante Drosophila Caspases voor substraatscreening

Leer de CaspaseTracker-biosensor gebruiken om niet-apoptotische caspase-activiteit in levende Drosophila te detecteren en te volgen. Deze methode onthult nieuwe rollen van caspases in gezonde cellen.

In Vivo Tracks Biosensor Non-apoptotische caspase activiteit in Drosophila

Meer video's verkennen