Name: Through the Looking Glass: Time-lapse microscopie en Longitudinal volgen van enkele cellen aan anti-kanker Therapeutics Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Leer tijdverloopmicroscopie voor het volgen van enkele cellen bij anti-kankertherapieën. Deze methode maakt real-time observatie van heterogene therapeutische respons en celgedrag mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Joshua Marcus voor technische ondersteuning en Jolien Tyler, Ph.D., directeur van de Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, voor technisch advies. Dit werk werd ondersteund door fondsen van de University of Colorado Boulder en de University of Colorado Boulder Graduate School aan J.D.O. R.T.B. wordt gedeeltelijk ondersteund door een pre-doctorale opleidingsbeurs van de NIH (T32 GM008759). We danken Karyopharm Therapeutics, Inc. voor selinexor en Merck Serono voor Kinesin-5-remmer. FUCCI-plasmiden zijn afkomstig van Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was afkomstig van Addgene. HeLa die H2b-mCherry en β-tubulin-EGFP tot expressie brengen, zijn afkomstig van Daniel Gerlich (IMBA, Oostenrijkse Academie van Wetenschappen, Oostenrijk).

Het volgende protocol gebruikt parameters bepaald door de experimenten in Figuren 4 en 6 betreffende verwerving instellingen en de testomstandigheden. Veel van deze parameters kunnen worden aangepast voor andere experimenten passen (bijv belichtingstijden, binning, fluorescerende kanalen, enz.). Alle procedures moeten voldoen aan institutionele richtlijnen en regelgeving en door de institutionele bioveiligheid commissie worden goedgekeurd. Microscope fabrikant websites bevatten uitstekende informatie voor live-cell imaging. 1. microscopen en Imaging Software <ol><li> Live cell imaging op een breed scala van omgekeerde microscopen. De meest voorkomende microscopen zijn groothoek epifluorescentie en spinning-disk confocale. Hier, maken gebruik van een geautomatiseerde en gemotoriseerd groothoek epifluorescentiemicroscoop met 200 watt HQI lichtbron. </li><li> Zorg voor een stage-top of microscoop klimaatkamer. Hier, gebruik dan een stage-top klimaatkamer. </li><li> Gebruik commerciële software aan microscopen werken met hulpprogramma&#39;s om time-lapse microscopie te voeren. </li><li> Gebruik in de handel verkrijgbare software of ImageJ voor beeldanalyse. Veel andere analyse-instrumenten zijn in de handel verkrijgbaar, en er zijn op maat gemaakte programma&#39;s waarvan vele zijn gepubliceerd 8,18. </li></ol> 2. Het visualiseren van cellulaire processen en fenotypische Responses <ol><li> Visualiseer cellen met helderveld microscopie. Differentiële interferentie contrast en fasecontrast alleen kan zeer informatief tussen reacties op antikankergeneesmiddel responsen bestuderen. Deze werkwijzen kunnen omvatten mitose, celmotiliteit en apoptose. </li><li> Visualiseren celstructuren, organellen en processen fluorescerende biosensoren. Fluorescerende probes zijn informatief bij het opsporen van specifieke subcellulaire processen. Deze kunnen onder meer dynamiek van microtubuli, mitochondriale en endoplasmatisch reticulum dynamiek, eiwit accumulatie en lokalisatie, enmoleculaire signalering (bijv., fosforylatie, calcium). </li></ol> 3. Voorbereiding van monsters <ol><li> Groeien cellen in celkweek gecertificeerd gerechten in een standaard celkweek bevochtigde incubator (bijvoorbeeld 37 ° C, 5% CO2, 80% relatieve vochtigheid). <ol><li> Groeien HT1080 cellen in MEM met EBSS. Aanvullen van het medium met 10% v / v FBS, 1% v / v Pen / Strep, 1% v / v natriumpyruvaat en 1% v / v niet-essentiële aminozuren. </li></ol></li><li> Twee dagen voor imaging, plaat 50.000 HT1080 Fucci cellen in 3 putjes van een 12-well # 1.5 glazen bodem schaal in een gecertificeerde steriele laminaire stroming kap. Pas het aantal cellen uitgeplaat bereiken ~ 60% confluentie voor de start van het experiment. Afhankelijk van de cellijn en de aard van het experiment celdichtheid kan minder zijn. Opmerking: Celdichtheid kunnen grote invloed hebben op de groei van de cellijn en de experimentele resultaten. Tellen cellen te minimaliseren experiment-to-experiment variability als gevolg van de dichtheid. <ol><li> Afhankelijk van de klimaatkamer en de noodzakelijke voorwaarden voor het experiment, plaat cellen in enkele putjes (typisch 35- of 60-mm), 4 en 35-mm gerechten, 6-, 12- of 24-well celkweek platen, of dekglaasje dia&#39;s in verschillende formaten. Gebruik glazen bodem platen met # 1,5 glas als de meeste objectieven zijn geoptimaliseerd voor deze dikte van het glas, en de beeldvorming door celcultuur plastic is zeer slecht. Opmerking: Sommige cellijnen niet groeien en te overleven op glas. In deze gevallen kan het glas worden bekleed om celhechting te verbeteren (bijv., Poly-lysine of collageen). Sommige bedrijven produceren optische celkweek kunststof bestaat, moet empirisch worden bepaald of dit een haalbare optie. </li></ol></li></ol> 4. Milieu Chamber Set-up <ol><li> Vóór iedere proefneming, opzet de klimaatkamer zodat het werkt op ~ 80% luchtvochtigheid en zo de temperatuur van het monster positie 37 o C. Meest gekweekte cellen groeien in 5% CO2 / luchtbalans sfeer door natriumbicarbonaat buffer in het medium. Afhankelijk van de set-up, ofwel zet de milieu-controller tot 5% CO 2 en het zal mixen 100% CO 2 met lucht, of gebruik maken van pre-mixed, gecertificeerde 5% CO 2 / balans lucht gas. Volg de aanwijzingen van de fabrikant voor de gasstroom-tarieven. Opmerking: Sommige cellijnen groeien in CO 2-onafhankelijke medium in welk geval zij zonder CO 2 kan worden gehandhaafd. Speciaal beeldmedia is ook dat de toevoeging van autofluorescente verbindingen beperkt. De groei in scripties mediums voor het gewenste type cel moet empirisch vooraf worden bepaald. </li><li> Voorafgaand aan de beeldvorming, zorgen voor het waterreservoir gevuld is (na aanwijzingen van de fabrikant) met steriel gedestilleerd water. Schakel de klimaatkamer op de gewenste temperatuur en legt deze in de microscooptafel inzet. Om gas op te slaan, hoeft de stroom op dit moment niet starten. Opmerking: Als er een vrije ruimte tussen het podium-top kamer en het podium inzet en / of enige spanning op aansluitsnoeren naar de kamer kan bewegingsartefacten te introduceren in het experiment. <ol><li> Leg stukjes van paraffine film over de randen van het podium inzet opening voorafgaand aan het plaatsen van de kamer erin het koppelen van de kamer naar het podium, en zorg ervoor dat geen verbindingen te trekken op de kamer. </li></ol></li><li> Laat de kamer in evenwicht tot 37 o C. Zorg voor een stabiele temperatuur aan temperatuurschommelingen te voorkomen dat tijdens de beeldvorming welke cel fysiologie van invloed kan zijn en de invoering van drift. Temperatuurevenwicht bereiken vereist gewoonlijk 30 minuten tot 1 uur, afhankelijk van de omgeving. <ol><li> Plaats een &#39;dummy&#39; schotel met water in de putten in de kamer tijdens het opwarmen. Een imaging schotel gevuld met water bootst de steekproef, te helpen zorgen voor de kamer is voldoende opgewarmd en gestabiliseerd. Het vullen van de kamer met voorverwarmde steriel watervermindert de tijd die nodig temperatuurstabilisatie en minimaliseert de temperatuurdaling na toevoeging van het experimentele monster. </li></ol></li></ol> 5. Microscoop Set-up <ol><li> Schakel de microscoop, bijbehorende computer en alle benodigde randapparatuur. <ol><li> Afhankelijk van de lichtbron, wacht aan te zetten totdat het nodig is (bijv., LED). </li></ol></li><li> Met het doel torentje in een lage positie, selecteer de 20X 0,7 NA doel worden gebruikt. </li><li> Plaats het monster op het streven - dit maakt het makkelijker om de cellen te vinden wanneer het monster in de kamer. </li><li> imaging parameters op dit moment als deze bekend uit eerdere experimenten. </li></ol> 6. Het transport van cellen op een microscoop en in de Kamer <ol><li> Vervoer de cellen af ​​te beelden uit de incubator naar de klimaatkamer. Zorg ervoor dat deze snel wordt gedaan om de effecten van een relatief lage CO 2 beperken </sub&gt; sfeer en verlaagde temperatuur op de cellen. Volg alle institutionele bioveiligheid richtlijnen voor het monster transport en clean-up in geval van een lekkage. <ol><li> Plaats de cellen in een afgesloten container Styrofoam of geïsoleerde zak om grote veranderingen in het milieu te voorkomen. </li></ol></li><li> Plaats het monster beeldvorming schaal in de kamer volgende aanwijzingen van de fabrikant. </li><li> Nadat de cellen hebben in de klimaatkamer veiliggesteld, sluit de kamer naar een stabiele omgeving te onderhouden en meteen weer op de bron (nen) van de atmosferische gas. <ol><li> Aangezien sommige klimaatkamers geen strakke, gesloten deksel gebruiken, verdamping, laag steriele embryo gecertificeerde minerale olie vertragen bovenop het groeimedium. Wikkel gas-permeant paraffine film rond de omtrek-randen van de schaal voor monsters zorg dat u de glazen imaging gebied niet te hinderen. Gelokaliseerde bevochtiging secundaire werkwijzen kunnen worden toegepast. Condensatie op het deksel van de schaal voor monsters kan verminderen uitvoeMance van helderveld microscopie. </li></ol></li><li> Om de effecten van thermische drift vroeg tijdens het experiment te minimaliseren Wacht 30 minuten voordat de time-lapse. De benodigde tijd is afhankelijk van imaging gerecht en andere factoren. Bepaal empirisch. </li></ol> 7. Instellen van de Imaging <ol><li> Selecteer imaging voorwaarden die het beste de gegevens zal vertegenwoordigen. Neem voorzorgsmaatregelen om fototoxiciteit te voorkomen door het beperken van de blootstelling keer, met behulp van een lagere intensiteit van het licht en het selecteren van probes die zijn enthousiast over langere golflengten van het licht. </li><li> Definieer x, y en z-vlak en de gewenste golflengte (n) voor elke positie af te beelden. De tijdsresolutie wordt beperkt door het aantal posities en golflengten. Voor de lange termijn time-lapse van de meeste cellulaire processen, het verwerven van een afbeelding om de 10 - 20 min; hogere tijdsresolutie (met korte tussenpozen, bijv., 1 min) zorgt voor meer datapunten en daardoor robuuster cell tracking, maar ook resulteert in een meer geïntegreerdeblootstelling aan licht en grotere datasets. <ol><li> Zoals HT1080 Fucci hebben dynamisch groen en rood fluorescerende eiwitten (zie Representatieve resultaten), gebruikt u de volgende belichtingstijden: FITC / GFP - 50 msec, Texas Red / TRITC - 40 msec, Helderveld - 20 msec. Gebruik een 2 x 2 bin. </li></ol></li><li> Enable software gecontroleerde autofocus met behulp van de standaard parameters onder geavanceerde instellingen. Definieer een autofocus bereik van 10 urn met de aanbevolen stapgrootte. Zorg ervoor dat u dit te doen voordat het starten van de time-lapse. Autofocus met helderveld beelden en nooit met fluorescentie tot fototoxiciteit en fotobleken te verminderen. <ol><li> Gebruik software gecontroleerde autofocus systemen op een microscoop met een gemotoriseerde podium, en direct gericht op het monster. Ze kunnen echter de meetsnelheid van het experiment beperken. Hardware gecontroleerde continue focus systemen werken goed voor time-lapse microscopie en het verbeteren van de snelheid, waardoor meer posities af te beelden of een hoger percentage van de overname. Echter, zijvertrouwen op detectie van lucht-glasgrensvlak en kunnen focus van het monster verliezen met variaties in glasdikte in de put. </li></ol></li><li> Vervang de helft van de media met media die de gewenste geneesmiddelconcentratie die is verwarmd tot 37 oC Gedeeltelijke vervanging media helpt om thermische drift te verminderen. De omstandigheden in dit experiment zijn Vehicle (DMSO), 1 uM selinexor en 10 uM PD0332991. Opmerking: Deze stap kan ook na het starten van de overname door onderbreken en opnieuw starten van de proef. Dit maakt lengterichting volgen van pre- en post-drug reacties van enkele cellen. Als geneesmiddel stabiliteit of metabolisme is een zorg, pauzeren en vervangen van de media kan met dezelfde methode. Om te testen voor drug afbraak of metabolisme, media van behandelde cellen kunnen zich ook bevindt op naïeve cellen geplaatst om drug actie te testen. </li><li> Start de time-lapse. </li><li> Als de time-lapse loopt, ervoor te zorgen dat de afgebeelde velden in focus en de chambe blijvenr handhaaft een vochtige 37 o C. <ol><li> Pas de scherpstelling zo nodig door het pauzeren van de overname gedurende de tijd tussen tijdstippen. </li></ol></li><li> Indien nodig, voeg water toe tot de kamer tijdens langere experimenten. Vermijd het koelen van de kamer door het toevoegen van voorverwarmde, steriel gedestilleerd water bij 37 o C. </li></ol> 8. Het beëindigen van de Time-lapse <ol><li> Wanneer het experiment is uitgevoerd voltooid, stoppen de overname als deze niet is ingesteld op automatisch stoppen. </li><li> Zorg ervoor dat de time-lapse de juiste manier is opgeslagen op de harde schijf, hoewel de meeste software pakketten automatisch op te slaan tijdens de overname zo niet klaar met de juiste gegevens verloren kunnen gaan. </li><li> Verwijder de kamer van de microscoop en gooi de cellen in biologisch gevaarlijk afval volgende goedgekeurde institutionele bioveiligheid procedures. </li></ol> 9. Longitudinal Tracking en analyse van Time-lapse gegevens <ol><li> Kies de methodologie voor de analyse die iseigenen voor de biologische processen van belang. Veel plugins voor ImageJ, programma&#39;s met behulp van Matlab, en aangepaste platforms zijn geproduceerd voor specifieke toepassingen. De volgende methode omvat het volgen van kernen en analyse van nucleaire fluorescente probes zoals aangetoond in figuren 4 en 5. </li><li> Open de .tif beeld stacks voor de gebruikte kanalen in ImageJ. Als alternatief geopend oorspronkelijke bestanden uit de overname programma rechtstreeks in ImageJ met de Bioformats plugin. </li><li> Teken een regio van belang (ROI) binnen de kern van een cel met behulp van beeld helderveld of de nucleaire label kanaal (indien gebruikt) en voeg deze toe aan de ROI manager. Opmerking: Als de afgebeelde cellen een nucleaire label (bijvoorbeeld histon H2B-EGFP.), Vervolgens automatisch cell tracking worden toegepast om gebieden van belang (ROI) die individuele kernen maken door de tijd. </li><li> Ga door naar de volgende keer punt en de positie van de ROI binnen dezelfde nucleus. Voeg de ROI van de ROI manager. </li><li> Deze volgen en te ROI voor de individuele cel totdat een cellulaire gebeurtenis (mitose, apoptose, enz.) Of de cel kan niet meer worden gevolgd (bijv., Beweegt van frame of het experiment is beëindigd). </li><li> Wanneer ROI vastgesteld voor cellen door de tijd dat ze in het veld, op elkaar leggen op de fluorescerende kanalen van belang. Meet de gemiddelde intensiteit van de fluorescentie in elk kanaal voor elk tijdstip. Sla de ROI lijst voor later gebruik. <ol><li> Verschillende metingen kunnen worden gedaan binnen de ROI voor toepassingen in verschillende experimenten. Klik Analyse → Set Metingen ... om een menu te brengen tot de analytische methode te kiezen (bijv., Gemiddelde intensiteit binnen de ROI, geïntegreerde intensiteit, enz.). </li></ol></li><li> Opmerking cel lot voor individuele cellen (bijv., Apoptose, afdeling, overleving), terwijl het bijhouden van. Dit maakt het mogelijk voor de oprichting van de overleving bochten en further populatie-analyse. </li><li> Met de gemiddelde intensiteit voor beide kanalen, maakt u een scatterplot te celcyclus dynamiek weer te geven in reactie op Therapeutics (Figuur 5B, C). Noot: Plots kan worden gemaakt voor individuele cellen in de tijd gemiddeld over een of populatie van cellen gevolgd. Kwantitatieve beeldvorming kan kritisch voor het vaststellen van complexe reacties en cel verhoudingen als reactie op kanker therapeutische middelen. Langdurig time-lapse microscopie longitudinale tracking en hierbij zijn een meerstaps proces met vele mogelijkheden voor het type microscopie en analyse, en volgt de hoofdlijnen gegeven in Figuur 1. </li></ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Voordelen van de Time-lapse Microscopie en Longitudinal Tracking De microscoop is een ideaal instrument voor longitudinale studies van geneesmiddelrespons omdat hiermee onderzoekers individuele cellen en hun lot en de gehele populatie te volgen. Variabiliteit in drug antwoord binnen een populatie van cellen is een groot probleem voor anti-kanker therapeutische design. Longitudinaal volgen van enkele cellen kunnen onderzoekers deze variabiliteit observeren en beginnen de onde...

Levende cellen microscopie en longitudinale volgen van enkele cellen is geen nieuwe techniek. Van de vroegste microscopen, liefhebbers en wetenschappers hebben waargenomen en studeerde enkele cellen en organismen, hun gedrag en de ontwikkeling van 1-3. Een beroemd voorbeeld van de late David Rogers aan de Vanderbilt University in de jaren 1950 toont een menselijke neutrofielen in een bloed uitstrijkje achter een Staphylococcus aureus bacterie en uiteindelijk het proces van fagocytose 4. Deze levende cellen film is een uitstekend voorbeeld van hoe meerdere processen kunnen worden waargenomen en gecorreleerd in een enkel experiment: detectie van een chemische gradiënt, mechanica en snelheid van celmotiliteit, cel vormen dynamiek, hechting en fagocytose van een pathogeen. De komst van volledig geautomatiseerde microscopen en zeer gevoelige digitale camera&#39;s heeft geleid tot een toename van het aantal onderzoekers met behulp van microscopie op fundamentele vragen in de celbiologie, variërend f vragenrom hoe cellen verplaatsen 5,6 en verdeel 7,8 tot dynamiek en membraantransport 9-11 organel. Niet-fluorescerende, helderveld microscopie, met inbegrip van fase-contrast (PC), die de Nobelprijs voor Frits Zernike in 1953 oogstte, en differentieel interferentie contrast (DIC) zorgen voor de waarneming van cellen en kernen, maar ook sub-cellulaire structuren waaronder microtubule bundels , chromosomen, nucleoli, organel dynamiek, en dikke actine vezels 12. Genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten en de ontwikkeling van fluorescerende kleurstoffen tegen organellen dramatisch beïnvloed time-lapse microscopie 13-15. Hoewel niet de focus van dit artikel, beeldvorming in cel sferoïden en in situ (intravitale microscopie) met behulp van confocale microscopie en multi vormen een andere uitbreiding van de aanpak, en er zijn uitstekende artikelen die te gebruiken en te bespreken deze benaderingen 16-19. De reacties van cellen op anti-Cancer drugs of natuurlijke producten worden bepaald op de moleculaire en cellulaire schaal. Inzicht in cel reacties en lot na behandeling gaat vaak gepaard met de bevolking gemiddeld assays (bijv., Immunoblotting, geheel goed maatregelen), of vaste tijdstippen met immunofluorescentie detectie en flowcytometrie, die enkele cellen te meten. Heterogeniteit in één cel reacties op geneesmiddelen binnen een populatie, in het bijzonder bij tumoren, kan een deel van de variabiliteit verklaren respons gezien in cellijnen en tumoren die worden behandeld met hetzelfde geneesmiddel bij verzadiging. Langdurige longitudinale benaderingen van een bepaalde cel of een populatie van cellen te volgen is een minder voorkomende maar zeer krachtige benadering die het mogelijk maakt de directe studie van moleculaire respons pathways, verschillende fenotypen (bv., Celdood of celdeling), waarneming van cel-tot-cel variabiliteit binnen een populatie, en hoe deze factoren bijdragen aan populatie respons dynamiek 20-22. Optimistisch, in staatom te observeren en te kwantificeren eencellige antwoorden zullen helpen bij het verbeteren ons begrip van hoe geneesmiddelen werken, waarom ze soms niet, en hoe optimaal gebruik te maken hen. De techniek van lange-termijn time-lapse microscopie longitudinale volgen en analyseren geneesmiddel reacties beschikbaar voor vele onderzoekers en kan eenvoudig zijn met alleen uitgezonden licht fenotype reacties 20,21 observeren. De belangrijkste onderdelen van de aanpak zijn: geschikte voorbehandeling van de cellen van belang, een geautomatiseerde microscoop met omgevingskamer, een camera geïntegreerd met een computer te verwerven en opslaan van de beelden, en software om de time-lapse beoordelen meten en analyseren van de cellen en tl biosensoren. Wij bieden een gedetailleerd protocol met veel tips voor het uitvoeren van time-lapse microscopie van gekweekte cellen voor zo lang als enkele dagen met behulp van helderveld en / of groothoek epifluorescerende microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt voor elke cellijn kan worden gekweekt in kweekhun reacties op anti-kankertherapieën bestuderen. Wij bieden voorbeelden van data verkregen en geanalyseerd met behulp van meerdere verschillende genetisch gecodeerd fluorescerende biosensoren en een voorbeeld van fase-contrast microscopie, kort ingaan op de verschillende soorten probes, de voor- en nadelen van de lange-termijn time-lapse en longitudinale tracking, wat kan worden geleerd van deze aanpak is dat moeilijk te begrijpen van niet-directe aanpak, en een aantal variaties die we hopen van belang en waarde voor onervaren onderzoekers die niet hebben overwogen met behulp van de aanpak zal zijn, en ervaren onderzoekers.

<table><tbody><tr><td>Taxol (paclitaxel)</td><td>Sigma</td><td>T7191</td><td>microtubule stabilisatiemiddel</td></tr><tr><td>Etoposide</td><td>Selleckchem</td><td>S1225</td><td>topoisomerase II-remmer</td></tr><tr><td>Selinexor</td><td>Karyopharm Therapeutics</td><td>na</td><td>XPO1/CRM1-remmer, geschenk</td></tr><tr><td>Kinesin-5-remmer</td><td>Merck Serono</td><td>na</td><td>geschenk, ook verkrijgbaar bij American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2</td></tr><tr><td>Celgroeimedium</td><td>HyClone (Fisher) of Mediatech</td><td></td><td>veel bedrijven beschikbaar</td></tr><tr><td>5% CO2/luchtbalans, gecertificeerd</td><td>Airgas</td><td>Z03NI7222004379</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Schaal, 20 mm glazen bodem</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>veel bedrijven beschikbaar</td></tr><tr><td>35 mm 4-welp Schaal, 20 mm glazen bodem</td><td>Cellvis</td><td>D35C4-20-1.5-N</td><td>veel bedrijven beschikbaar</td></tr><tr><td>35 mm Schaal, rasterglazen bodem</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-CGRD</td><td>veel bedrijven beschikbaar</td></tr><tr><td>Multi-well, glazen bodem</td><td>Cellvis</td><td>P12-1.5H-N</td><td>veel bedrijven beschikbaar</td></tr><tr><td>Olympus IX81 omgekeerde epifluorescentiemicroscoop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX2-UCB controller</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRIOR LumenPro200</td><td>Prior Scientific</td><td>Lumen200PRO</td><td></td></tr><tr><td>PRIOR Proscan III gemotoriseerde standaard</td><td>Prio Scientific</td><td>H117</td><td></td></tr><tr><td>STEV-kamer</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV.ECU.HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>Omgevingsregeleenheid</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV.ECU.HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA R2 CCD met controller</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon laserlancering</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOLA lichtmotor</td><td>lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra 897 EM-CCD</td><td>ANDOR&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TOKAI HIT incubatiekamer</td><td>TOKAI HIT</td><td>TIZSH</td><td></td></tr></tbody></table>

through the looking glass: time-lapse microscopie en longitudinal volgen van enkele cellen aan anti-kanker therapeutics studie

Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

De respons van de individuele cellen op anti-kankergeneesmiddelen belangrijke stap in het bepalen van de populatie respons, en daarom is een belangrijke factor in het algemene resultaat. Immunoblotting, stroomcytometrie en vaste celexperimenten worden vaak gebruikt om te bestuderen hoe cellen reageren op anti-kanker drugs. Deze werkwijzen zijn belangrijk, maar ze hebben een aantal tekortkomingen. Variabiliteit in drug reacties tussen kanker en normale cellen, en tussen cellen van verschillende oorsprong van kanker, en van voorbijgaande aard en zeldzame reacties zijn moeilijk te begrijpen met behulp van de bevolking gemiddelde assays en zonder de mogelijkheid om rechtstreeks te volgen en in lengterichting te analyseren. De microscoop is bijzonder goed geschikt voor het levende cellen. De vooruitgang in de technologie stelt ons in staat om routinematig afbeelding cellen op een resolutie die niet alleen cell tracking, maar ook de waarneming van een verscheidenheid van cellulaire reacties mogelijk maakt. We beschrijven een aanpak in detail die het mogelijk maakt voor de continue time-lapse beeldvorming vancellen tijdens de respons op geneesmiddelen voor wezen zo lang als gewenst, gewoonlijk tot 96 uur. Varianten van de benadering kunnen cellen worden gecontroleerd weken. Met de inzet van genetisch gecodeerd fluorescerende biosensoren talrijke processen, paden en reacties kunnen worden gevolgd. We tonen voorbeelden die volgen en kwantificeren van celgroei en voortgang van de celcyclus, chromosoom dynamiek, DNA schade en celdood omvatten. We bespreken ook variaties van de techniek en de flexibiliteit, en markeer een aantal gemeenschappelijke valkuilen.

Lange-termijn time-lapse microscopie en directe longitudinale tracking kan voor de studie van veel anti-kanker effecten tijdens drug reactie. Volgens de algemene schets in figuur 1, worden meerdere voorbeelden van cellen weergegeven expressie gevalideerd fluorescente reporters die behandeld met anti-kankergeneesmiddelen, gevolgd en geanalyseerd met behulp van verschillende methoden. Fasecontrastmicroscopie all...

Hier beschrijven we een methode van lange-termijn tijds-lapse microscopie om individuele cellen longitudinaal te volgen in reactie op anti-kanker therapieën.

Through the Looking Glass: Time-lapse microscopie en Longitudinal volgen van enkele cellen aan anti-kanker Therapeutics Studie

The response of single cells to anti-cancer drugs contributes significantly in determining the population response, and therefore is a major contributing ...

Het algemene doel van deze procedure is het observeren van de therapeutische respons tegen kanker in individuele cellen in kweek. Deze methode kan belangrijke vragen binnen het kankeronderzoek beantwoorden, waaronder heterogene therapeutische respons en het lot van de cel. Begin met het voorbereiden van HT1080-cellen in voor kweek gecertificeerde schalen onder een gecertificeerde steriele laminaire flowkast volgens het tekstprotocol, en incubeer de cellen vervolgens in een bevochtigde celkweekincubator.Planteer twee dagen voor de beeldvorming 50.000 HT1080 FuGENE-cellen per put in het gewenste aantal putten van een 12-wells glazen bodemschaal (no. 1.5). Pas het aantal geplanteerde cellen aan op basis van hun groeisnelheid en de gebruikte schaal om een confluentie van ongeveer 60% te bereiken bij de start van het experiment.Stel de klimaatkamer in op ongeveer 80% luchtvochtigheid, waarbij de temperatuur op de positie van het monster wordt ingesteld op 37 graden Celsius. Zorg ervoor dat het waterreservoir is gevuld met steriel gedestilleerd water volgens de instructies van de fabrikant. Zet vervolgens de klimaatkamer aan op de gewenste temperatuurinstelling, plaats deze in de microscooptafel en stel deze in.Als er vrije ruimte is tussen de bovenkamer van de tafel en de tafelinzet, leg dan stukjes paraffinefilm over de randen van de opening van de tafelinzet voordat u de kamer erin plaatst, om de kamer aan de tafel te koppelen. Zorg ervoor dat er geen verbindingen aan de kamer trekken, aangezien beide bewegingsartefacten kunnen introduceren. Plaats een dummy-schaal met water in de kamer en laat de kamer equilibreren naar 37 °C, waarna een stabiele temperatuur moet worden gehandhaafd.Om de beeldvorming voor te bereiden, schakelt u de microscoop, de computer en alle benodigde randapparatuur in. Afhankelijk van de lichtbron wacht u met het inschakelen ervan tot dit nodig is. Selecteer de 20x objectief met een numerieke apertuur van 0,7 terwijl de objectiefrevolver in een lage positie staat.Positioneer vervolgens het monster boven het objectief, wat het makkelijker maakt om de cellen te vinden zodra het monster zich in de kamer bevindt. Nadat de te beelden cellen volgens het tekstprotocol naar de omgevingskamer zijn overgebracht, wordt de kamer afgesloten om een stabiele omgeving te handhaven en wordt het atmosferische gas ingeschakeld. Selecteer vervolgens beeldcondities die fototoxiciteit voorkomen door de belichtingstijden te beperken en licht van een lagere intensiteit te gebruiken.Om de X-, Y- en Z-vlakken en de gewenste golflengten voor elke te beelden positie te bepalen. Voor langdurige time-lapse van de meeste cellulaire processen wordt elke tien tot twintig minuten één beeld vastgelegd. Een hogere temporele resolutie levert meer datapunten en een robuustere celtracking op, maar resulteert in een hogere geïntegreerde lichtblootstelling en grotere datasets.Aangezien HT1080 FuGENE dynamische groene en rode fluorescerende eiwitten bevatten, dienen de volgende belichtingstijden en een twee bij twee bin te worden gebruikt. Schakel onder de geavanceerde instellingen de softwaregestuurde autofocus in met de standaardinstellingen. Definieer een autofocusbereik van 10 micrometers met de aanbevolen stapgrootte.Vervang in de experimentele schaal, om thermische drift te verminderen, de helft van het medium door medium dat is opgewarmd tot 37 °C en het gewenste geneesmiddel bevat. Start tot slot de time-lapse en leg beelden vast volgens het tekstprotocol. Deze films tonen voorbeelden van een paar gematchte MCF7-cellijnen afgeleid van borstkanker, die alleen verschillen in hun p53-status en werden behandeld met een antikankerdrug die kinesine-5 remt, wat resulteert in mitotische arrestatie.Zoals in deze figuur te zien is, wanneer p53 wordt verwijderd door stabiele p53-knockdown, ondergaan de cellen herhaalde cycli waarin zij een tweede ronde van mitose ingaan in plaats van te arresteren nadat ze de mitose hebben verlaten, en verlaten ze de mitose zonder deling. Hier worden Hela-cellen getoond, afgeleid van een cervixcarcinoom, die stabiel het chromatine-marker Histone 2b gefuseerd met mCherry en beta-tubuline gefuseerd met EGFP tot expressie brengen. Wanneer ze worden behandeld met het microtubuli-stabiliserende middel paclitaxel, worden de chromosoomuitlijning en -segregatie tijdens de mitose verstoord, wat resulteert in de vorming van nucleaire uitstulpingen en micronuclei die gevoelig zijn voor DNA-schade.Deze cellijn co-expressieert stabiel de twee fluorescerende ubiquitine-celcyclusindicatoren voor CDT1, in oranje, en geminine in groen, en doorloopt de celcyclus normaal. Wanneer dezelfde cellen worden behandeld met de CDK46-remmer, doorlopen de cellen de G2-fase en delen ze zich normaal, om vervolgens sterk te arresteren in de G1-fase, wat wijst op het potentieel voor effectieve cytostatische effecten in groeiende tumoren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat u de respons van een enkele cel direct in real-time over een periode van meerdere dagen kunt volgen, in plaats van deze responsen af te leiden.

through-looking-glass-time-lapse-microscopy-longitudinal-tracking

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video demonstrates a method for tracking bispecific antibody-induced T cell trafficking to tumors in a mouse model. Luciferase-transduced effector T cells are injected into a mouse with a subcutaneous tumor cell xenograft. Bispecific antibodies are then introduced, binding to T cells and the tumor cells. The localization of the T cells is tracked using bioluminescent imaging, with the magnitude of the signal indicating the extent of T cell infiltration into the tumor.

An In Vivo Technique to Track Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking to Tumors

We beschrijven een single-cell high-throughput assay voor cytotoxiciteit van T-cellen te meten wanneer geïncubeerd met tumor doelcellen. Deze werkwijze gebruikt een dichte, elastomeer reeks sub-nanoliter wells (~ 100.000 putjes / array) ruimtelijk beperken de T-cellen en doelcellen met gedefinieerde verhoudingen en is gekoppeld met fluorescentie microscopie effector-target conjugatie en daaropvolgende apoptose controleren.

Quantitative High-throughput Eencellige cytotoxiciteit T cellen

Dit protocol beschrijft het gebruik van multiphoton microscopie tot uitgebreide time-lapse beeldvorming van meercellige interacties uit te voeren in real time, in vivo bij enkele resolutie cel.

Extended Time-lapse intravitale Imaging van Real-time Meercellige Dynamiek in de tumor micro

Dit protocol beschrijft een methode om te afbeelding resident tumor-infiltreren CD8 T cellen aangeduid met fluorescently gekoppelde antilichamen binnen de menselijke longen tumor segmenten. Deze techniek staat real-time analyses van CD8 T-cel migratie met behulp van de confocal microscopie.

Ex Vivo Beeldvorming van Resident CD8 T lymfocyten in menselijke longen Tumor plakjes met behulp van confocale microscopie

De in vivo immunofluorescentie lokalisatie (IVIL)-methode kan worden gebruikt om in vivo biodistributie van antilichamen en antilichaam conjugaten voor oncologische doeleinden in levende organismen te onderzoeken met behulp van een combinatie van in vivo tumor targeting en ex vivo-immunokleuring Methoden.

In vivo immunofluorescentie lokalisatie voor de beoordeling van therapeutische en diagnostische antilichamen Biodistribution in kankeronderzoek

Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe rooster Light-Sheet Microscopie te gebruiken om vierdimensionaal visualiseren oppervlakte receptor dynamiek in levende cellen. Hier worden T-celreceptoren op CD4+ primaire T-cellen weergegeven.

Visualiseren van Surface T-Cell Receptor Dynamics vierdimensionaal met behulp van Rooster Light-Sheet Microscopie

Macrofaag fagocytische activiteit tegen kankercellen, in het bijzonder 4T1 muis borstklier carcinoom cellen, werd afgebeeld in deze studie. Het cocultuurmodel van de levende cellen werd vastgesteld en waargenomen met behulp van een combinatie van fluorescerende en differentiële interferentie contrast microscopie. Deze beoordeling is gemaakt met behulp van imaging software om multipoint time-lapse-video te ontwikkelen.

Time-lapse 2D-beeldvorming van fagocytische activiteit in M1 macrophage-4T1 muis borstkanker cellen in co-culturen

Hier presenteren we een protocol om de in vivo lokalisatie van antilichamen in muizen tumor xenograft modellen te bestuderen.

Analyse van tumor- en weefselverdeling van doelantigeen-specifiek therapeutisch antilichaam

Deze studie presenteert een protocol van live-3D-cel immunocytochemie toegepast op een pediatrische diffuse midline glioom cellijnlijn, nuttig om in real-time de expressie van eiwitten op het plasmamembraan te bestuderen tijdens dynamische processen zoals 3D-celinvasie en migratie.

Live-3D-cel immunocytochemie Assays van pediatrische diffuse middellijn glioom

Hier beschrijven we een methode voor het transduceren van menselijke T-cellen met luciferase om in vivo tracking van bispecifieke antilichaam-geïnduceerde T-celhandel naar tumoren in studies te vergemakkelijken om de anti-tumor werkzaamheid en het mechanisme van T-cel-engaging bispecifieke antilichamen te evalueren.

Het volgen van bispecifieke antilichaam-geïnduceerde T-celhandel met behulp van luciferase-getransduceerde menselijke T-cellen

Dit protocol beschrijft single-antibody labeling (SAL) om de nanoschaal ruimtelijke organisatie van plasmamembraaneiwitten op te lossen. Door cumulatieve antilichaam-epitoopinteracties op het niveau van één molecuul te benutten, brengt membraan SAL (mSAL) lokale epitoopverdelingen in kaart terwijl het tegelijkertijd het bindingsgedrag van antilichamen in de natuurlijke cellulaire omgeving vastlegt.

Single-molecule localisatiemicroscopie van membraaneiwitten met single-antibody labeling

Leer tijdverloopmicroscopie voor het volgen van enkele cellen bij anti-kankertherapieën. Deze methode maakt real-time observatie van heterogene therapeutische respons en celgedrag mogelijk.

Through the Looking Glass: Time-lapse microscopie en Longitudinal volgen van enkele cellen aan anti-kanker Therapeutics Studie

Meer video's verkennen