Through the Looking Glass: Time-lapse microscopie en Longitudinal volgen van enkele cellen aan anti-kanker Therapeutics Studie

Het algemene doel van deze procedure is om de anti-kankertherapeutische respons in enkele cellen in cultuur te observeren. Deze methode kan sleutelvragen in het kankeronderzoeksveld beantwoorden, inclusief heterogene therapeutische respons en celbestemming. Om te beginnen, bereidt u onder een gecertificeerde steriele laminaire stroomkap HT1080-cellen in gekeurde culturenschotels volgens het tekstprotocol voor en incubeert u de cellen in een bevochtigde celcultuur incubator.

Twee dagen voorafgaand aan de beeldvorming, zet 50.000 HT1080 FuGENE-cellen per put in de gewenste aantallen putten van een 12-wels, nr. 1.5 glazen bodem schotel. Pas het aantal geplaatste cellen aan, afhankelijk van hun groeisnelheid en de gebruikte schotel, om ongeveer 60% confluëntie te bereiken voor het begin van het experiment.

Stel de omgevingskamer in op ongeveer 80% luchtvochtigheid met de temperatuur op de monsterpositie ingesteld op 37 graden Celsius. Zorg ervoor dat het waterreservoir gevuld is met steriele gedistilleerd water volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Zet vervolgens de omgevingskamer aan op de gewenste temperatuurinstelling, en plaats deze in de microscoop standaard en stel deze in.

Als er vrije ruimte is tussen de bovenkant van de kamer en de inzet in de standaard, leg stukken paraffine film over de randen van de opening van de inzet in de standaard, voordat u de kamer erin inbrengt, om de kamer aan de standaard te koppelen. Zorg ervoor dat er geen verbindingen aan de kamer trekken, beide kunnen bewegingsartefacten introduceren. Plaats een dummy schotel met water in de kamer, en laat de kamer gelijkwaardig worden aan 37 graden Celsius en houd vervolgens een stabiele temperatuur vast.

Om in te stellen voor beeldvorming, zet de microscoop, de computer en eventuele vereiste randapparatuur aan. Afhankelijk van de lichtbron, wacht tot deze aangezet wordt wanneer het nodig is. Met de objectief toren in een lage positie, selecteer het 20x 0.7 numerieke apertuur objectief.

Plaats vervolgens de monster over het objectief, wat het gemakkelijker zal maken om de cellen te vinden wanneer het monster in de kamer is. Na het overbrengen van de cellen die afgebeeld moeten worden naar de omgevingskamer, volgens het tekstprotocol, verzegel de kamer om een stabiele omgeving te handhaven en zet het atmosferische gas aan. Selecteer vervolgens beeldvormingsomstandigheden die fototoxiciteit voorkomen door blootstellingstijden te beperken en licht van lagere intensiteit te gebruiken.

Om de X, Y, en Z vlakken en de gewenste golflengten voor elke positie die afgebeeld moet worden te vinden. Voor lange termijn tijdsverloop van de meeste cellulaire processen, verwerf één beeld elke tien tot twintig minuten. Grotere tijdresolutie biedt meer datapunten en robuustere celtracking maar resulteert in meer geïntegreerde lichtblootstelling en grotere datasets.

Aangezien HT1080 FuGENE dynamische groene en rode fluorescente eiwitten hebben, gebruik de volgende blootstellingstijden en gebruik een twee bij twee bin. Onder geavanceerde instellingen, schakel software-gestuurde automatische focussering in met de standaardinstellingen. Definieer een automatische focusbereik van 10 micrometer met de aanbevolen stapgrootte.

In de experimentele schotel, om thermische drift te verminderen, vervang de helft van het medium met medium dat het gewenste medicijn bevat dat is verwarmd tot 37 graden Celsius. Start ten slotte de tijdsverloop en verwerf beelden volgens het tekstprotocol. Deze films tonen voorbeelden van een paar overeenkomende borstkanker-afgeleide MCF7 cellijnen die alleen verschillen in hun p53-status die werden behandeld met een anti-kanker medicijn dat kinesin-5 remt, resulterend in mitotische arrestatie.

Zoals te zien is in deze figuur, wanneer p53 wordt verwijderd door stabiele p53 knockdown, gaan de cellen in plaats van te arresteren nadat ze de mitose verlaten hebben, door herhaalde cycli waarbij ze een tweede ronde van mitose binnengaan in plaats van te arresteren, en verlaten de mitose zonder deling. Hier getoond zijn cervixcarcinoom-afgeleide Hela-cellen die stabiel de chromatine marker Histon 2b gefuseerd met mCherry en bèta tubuline gefuseerd met EGFP tot expressie brengen. Wanneer behandeld met het microtubulusstabiliserende medicijn paclitaxel, wordt chromosoomuitlijning en segregatie verstoord tijdens mitose, resulterend in de vorming van nucleaire uitstulpingen en micronuclei die vatbaar zijn voor DNA-schade.

Deze cellijn co-expresseert stabiel de twee fluorescente ubiquitine celcyclusindicatoren voor CDT1, in oranje, en geminin in groen, en vordert normaal door de celcyclus. Wanneer dezelfde cellen worden behandeld met de CDK46-remmer, vorderen de cellen door de G2-fase en delen normaal en arresteren vervolgens sterk in de G1-fase, wat wijst op het potentieel voor effectieve cytostatische effecten in groeiende tumoren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat je een enkelcellig antwoord direct, in realtime, kan volgen over de loop van vele dagen in plaats van deze antwoorden te infereren.