Through the Looking Glass: Time-lapse microscopie en Longitudinal volgen van enkele cellen aan anti-kanker Therapeutics Studie

Het algemene doel van deze procedure is het observeren van de therapeutische respons tegen kanker in individuele cellen in kweek. Deze methode kan belangrijke vragen binnen het kankeronderzoek beantwoorden, waaronder heterogene therapeutische respons en het lot van de cel. Begin met het voorbereiden van HT1080-cellen in voor kweek gecertificeerde schalen onder een gecertificeerde steriele laminaire flowkast volgens het tekstprotocol, en incubeer de cellen vervolgens in een bevochtigde celkweekincubator.

Planteer twee dagen voor de beeldvorming 50.000 HT1080 FuGENE-cellen per put in het gewenste aantal putten van een 12-wells glazen bodemschaal (no. 1.5). Pas het aantal geplanteerde cellen aan op basis van hun groeisnelheid en de gebruikte schaal om een confluentie van ongeveer 60% te bereiken bij de start van het experiment.

Stel de klimaatkamer in op ongeveer 80% luchtvochtigheid, waarbij de temperatuur op de positie van het monster wordt ingesteld op 37 graden Celsius. Zorg ervoor dat het waterreservoir is gevuld met steriel gedestilleerd water volgens de instructies van de fabrikant. Zet vervolgens de klimaatkamer aan op de gewenste temperatuurinstelling, plaats deze in de microscooptafel en stel deze in.

Als er vrije ruimte is tussen de bovenkamer van de tafel en de tafelinzet, leg dan stukjes paraffinefilm over de randen van de opening van de tafelinzet voordat u de kamer erin plaatst, om de kamer aan de tafel te koppelen. Zorg ervoor dat er geen verbindingen aan de kamer trekken, aangezien beide bewegingsartefacten kunnen introduceren. Plaats een dummy-schaal met water in de kamer en laat de kamer equilibreren naar 37 °C, waarna een stabiele temperatuur moet worden gehandhaafd.

Om de beeldvorming voor te bereiden, schakelt u de microscoop, de computer en alle benodigde randapparatuur in. Afhankelijk van de lichtbron wacht u met het inschakelen ervan tot dit nodig is. Selecteer de 20x objectief met een numerieke apertuur van 0,7 terwijl de objectiefrevolver in een lage positie staat.

Positioneer vervolgens het monster boven het objectief, wat het makkelijker maakt om de cellen te vinden zodra het monster zich in de kamer bevindt. Nadat de te beelden cellen volgens het tekstprotocol naar de omgevingskamer zijn overgebracht, wordt de kamer afgesloten om een stabiele omgeving te handhaven en wordt het atmosferische gas ingeschakeld. Selecteer vervolgens beeldcondities die fototoxiciteit voorkomen door de belichtingstijden te beperken en licht van een lagere intensiteit te gebruiken.

Om de X-, Y- en Z-vlakken en de gewenste golflengten voor elke te beelden positie te bepalen. Voor langdurige time-lapse van de meeste cellulaire processen wordt elke tien tot twintig minuten één beeld vastgelegd. Een hogere temporele resolutie levert meer datapunten en een robuustere celtracking op, maar resulteert in een hogere geïntegreerde lichtblootstelling en grotere datasets.

Aangezien HT1080 FuGENE dynamische groene en rode fluorescerende eiwitten bevatten, dienen de volgende belichtingstijden en een twee bij twee bin te worden gebruikt. Schakel onder de geavanceerde instellingen de softwaregestuurde autofocus in met de standaardinstellingen. Definieer een autofocusbereik van 10 micrometers met de aanbevolen stapgrootte.

Vervang in de experimentele schaal, om thermische drift te verminderen, de helft van het medium door medium dat is opgewarmd tot 37 °C en het gewenste geneesmiddel bevat. Start tot slot de time-lapse en leg beelden vast volgens het tekstprotocol. Deze films tonen voorbeelden van een paar gematchte MCF7-cellijnen afgeleid van borstkanker, die alleen verschillen in hun p53-status en werden behandeld met een antikankerdrug die kinesine-5 remt, wat resulteert in mitotische arrestatie.

Zoals in deze figuur te zien is, wanneer p53 wordt verwijderd door stabiele p53-knockdown, ondergaan de cellen herhaalde cycli waarin zij een tweede ronde van mitose ingaan in plaats van te arresteren nadat ze de mitose hebben verlaten, en verlaten ze de mitose zonder deling. Hier worden Hela-cellen getoond, afgeleid van een cervixcarcinoom, die stabiel het chromatine-marker Histone 2b gefuseerd met mCherry en beta-tubuline gefuseerd met EGFP tot expressie brengen. Wanneer ze worden behandeld met het microtubuli-stabiliserende middel paclitaxel, worden de chromosoomuitlijning en -segregatie tijdens de mitose verstoord, wat resulteert in de vorming van nucleaire uitstulpingen en micronuclei die gevoelig zijn voor DNA-schade.

Deze cellijn co-expressieert stabiel de twee fluorescerende ubiquitine-celcyclusindicatoren voor CDT1, in oranje, en geminine in groen, en doorloopt de celcyclus normaal. Wanneer dezelfde cellen worden behandeld met de CDK46-remmer, doorlopen de cellen de G2-fase en delen ze zich normaal, om vervolgens sterk te arresteren in de G1-fase, wat wijst op het potentieel voor effectieve cytostatische effecten in groeiende tumoren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat u de respons van een enkele cel direct in real-time over een periode van meerdere dagen kunt volgen, in plaats van deze responsen af te leiden.