Name: Multicolor Fluorescentie detectie voor Droplet Microfluidics Met behulp van optische vezels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Leer een compacte methode voor multicolor fluorescentiedetectie in druppelmicrofluidica met behulp van optische vezels. Deze techniek vereenvoudigt biologische screening en ondersteunt hoogdoorvoeronderzoek naar zeldzame fenotypes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door DARPA-subsidienummer 84389.01.44908, een NSF CAREER-prijs (DBI-1253293), een NIH verkennend/ontwikkelingsonderzoekssubsidie (CA195709) en NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01), en een New Directions-subsidie van het UCSF-middelenallocatieprogramma.

1. SU8 Master Fabrication <ol><li> Ontwerp de microfluïdische structuren voor drie lagen fabricage met behulp van design software en hebben de ontwerpen gedrukt door een verkoper aan printplaat film met 10 micrometer resolutie. De details van apparaatontwerp worden gegeven in een aangrenzende referentie 6 en het kanaal geometrieën zijn weergegeven in figuur 1. De lagen moeten omvatten uitlijnmerktekens om legeren features uit elke fabricage laag 8. </li><li> Plaats een pre-gereinigde 3 inch diameter silicium wafer op een spin coater en zet de stofzuiger om het aan te brengen op de boorkop. Breng 1 ml SU8-3050 in het midden van de wafel en centrifugeren gedurende 20 sec bij 500 tpm, vervolgens 30 sec bij 1750 rpm, die een laagdikte van 80 pm. </li><li> Verwijder de wafer en bakken op 135 ° C verwarmingsplaat gedurende 30 min. Laat de wafer afkoelen tot kamertemperatuur alvorens naar de volgende stap. </li><li> Expose de gecoate wafer aan de 1 ste laag masker onder een gecollimeerde 190 mW, 365 nm LED voor 3 minuten. Na de belichting, plaatst u de wafer op een 135 ° C kookplaat gedurende 1 minuut, daarna afkoelen tot kamertemperatuur voordat u verder gaat met de volgende stap. </li><li> Plaats de wafer op de spin coater en zet de stofzuiger om het aan te brengen op de boorkop. Breng 1 ml SU8-3050 in het midden van de wafel en centrifugeren gedurende 20 sec bij 500 tpm, vervolgens 30 sec bij 5000 rpm, wat resulteert in een laag die een extra dikte van 40 urn verschaft. </li><li> Verwijder de wafer en bakken op een 135 ° C kookplaat gedurende 30 minuten, daarna afkoelen tot kamertemperatuur voordat u naar de volgende stap. </li><li> Lijn de 2 e laagmasker op de geometrie patroon in 1.3 en bloot de gecoate wafer aan een gecollimeerde 190 mW, 365 nm LED voor 3 min. Na blootstelling, te plaatsen op een 135 ° C kookplaat gedurende 4 min 30 sec, daarna afkoelen tot kamertemperatuur voordat u verder gaat met de volgende stap. </li><li> Plaats de wafer op de spin coater en zet de stofzuiger om het aan te brengen op de boorkop. Breng 1 ml SU8-3050 in het midden van de wafel en centrifugeren gedurende 20 sec bij 500 tpm, vervolgens 30sec bij 1000 rpm, wat resulteert in een laag die een extra dikte van 100 urn verschaft. </li><li> Verwijder de wafer en bakken op een 135 ° C kookplaat gedurende 30 minuten, daarna afkoelen tot kamertemperatuur voordat u naar de volgende stap. </li><li> Lijn de 3 e laagmasker op de geometrie patroon in 1.3 en bloot de gecoate wafer aan een gecollimeerde 190 mW, 365 nm LED voor 3 min. Na blootstelling, te plaatsen op een 135 ° C kookplaat 9 min, daarna afkoelen tot kamertemperatuur voordat u verder gaat met de volgende stap. </li><li> Ontwikkeling van de maskers door onderdompeling in een geroerd bad van propyleenglycolmonomethyletheracetaat gedurende 30 min. Was de wafer in isopropanol en bakken op 135 ° C gedurende 1 min kookplaat. Plaats de ontwikkelde meester in een 100 mm petrischaal voor polydimethylsiloxaan (PDMS) gieten. </li></ol> 2. PDMS Device Fabrication <ol><li> Bereid 10: 1 PDMS door het combineren van 50 g siliconen basis met 5 g hardingsmiddel in een plastic beker. De inhoud met een draaiend gereedschap uitgerust met een roerstokje. degterwijl het mengsel in een exsiccator gedurende 30 minuten of totdat alle luchtbellen worden verwijderd. </li><li> Giet de PDMS tot een dikte van 3 mm over de master te geven en plaats terug in de exsiccator voor verdere ontgassen. Zodra alle luchtbellen worden verwijderd bak de inrichting bij 80 ° C gedurende 80 min. </li><li> Snijd het apparaat uit de mal met behulp van een scalpel en leg ze op een schone ondergrond met de patroon naar boven en pons de vloeibare in- en uitlaten met een 0,75 mm biopsie punch. Het apparaat moet worden gesneden zodat de 120 urn en 220 urn lang geometrieën zijn vanaf de zijkant van het apparaat. </li><li> Plasma behandelen apparaat, met kenmerk naar boven, samen met een voorgereinigde 2 inch bij 3 inch glasplaatje bij 1 mbar O2 plasma gedurende 20 seconden in een 300 W plasma cleaner. Bond de PDMS inrichting door het plaatsen van het patroon van het PDMS apparaat op de met plasma behandelde zijde van het glaasje. Plaats het apparaat in een 80 ° C oven en bak de samengestelde inrichting voor 40 min. </li><li> Render de kanalenhydrofobe via een injectiespuit aan het apparaat met een gefluoreerde oppervlakte behandelingsvloeistof spoelen. Onmiddellijk bak de inrichting bij 80 ° C gedurende 10 minuten om het oplosmiddel te verdampen. </li></ol> 3. Voorbereiding van optische componenten <ol><li> Bereid de laser excitatie vezel door het verwijderen van de isolatie van de laatste 5 mm van een 105 micrometer kern, 125 urn bekleding, NA = 0,22 optische vezel. </li><li> Bereid de 2 e kleuren laser excitatie vezel door het herhalen van 3.1 voor een 2e identieke vezels. </li><li> Bereid de vezel voor het verzamelen van de fluorescentie-signaal door het herhalen van 3.1 voor een 200 urn kern, 225 urn bekleding, NA = 0,39 optische vezel. </li><li> Inspecteer de uiteinden van de vezels - als de tips niet eindigen in een plat vlak, re-klieven de uiteinden met een vezel schrijver. </li><li> Bevestig een laser vezel koppelaar een 50 mW, 405 nm laser en bevestig één van de 105 urn kernvezels de laser. Richt de gestripte uiteinde op de sensor van het laservermogenmeter, en gebruik maken van de fijnafstelling van de laser koppeling naar het laservermogen te maximaliseren. </li><li> Herhaal 3,5 voor een 50 mW, 473 nm laser. </li><li> Monteer een 446/510/581/703 nm quad banddoorlaatfilters op de PMT gebruik lens buizen laserlicht te blokkeren en te verzenden uitgezonden fluorescentie. Bevestig fiber koppeling zodat het licht reist door de filters alvorens naar de PMT. </li><li> Bevestig de vezel van 3,3 tot het apparaat geassembleerd in 3.7. </li></ol> 4. Offline Mixed Emulsion Generation <ol><li> Het verkrijgen van een stroom aandacht microfluidics dropmaker apparaat met een 60 micrometer x 60 micrometer opening. </li><li> Vul een 1 ml spuit met HFE 7500 olie met 2% ionische fluorsurfactans 9. </li><li> Vul een reeks van 1 ml injectiespuiten met de volgende combinaties van fluoresceïne (FITC) en dextran-geconjugeerde blauwe kleurstoffen (CB) in PBS: 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nM CB en 10 nM FITC / 100 nM CB. </li><li> Monteer de dropmaker apparaat op het podium van een omgekeerde micro&#39;sgaan en de waterige en olie spuiten op spuitpompen. Stel de spuiten om de apparaten met PE-2 buizen. </li><li> Running spuitpompen 500 ul / uur voor de olie- en 250 ul / uur voor het waterige oplossingen, creëren een mengsel van 80 urn druppeltjes met de oplossingen van 4,3. Voor elk type waterige monster, gebruik dan een frisse dropmaker apparaat om kruisbesmetting te voorkomen. Verzamel ~ 200 ul emulsie van elke kleurstofcombinatie in een lege injectiespuit. </li><li> Na de 4 druppels types zijn verzameld in een enkele verzameling spuit, meng de emulsie door herhaaldelijk draaien van de spuit. </li><li> Herhaal stap 4,2-4,6 met waterige oplossingen die 0,1, 1, 10 en 100 nM FITC in PBS. </li></ol> 5. Optical Fiber Insertion <ol><li> Plaats de microfluïdische chip vervaardigd in stap 2 op het podium van een omgekeerde microscoop gekoppeld aan een digitale camera die in staat &lt;100 psec sluitersnelheden. </li><li> aandachtig werken vanaf de zijkant, insert de vezel gekoppeld aan de 473 nm laser in de verste stroomopwaartse 120 um kanaal, zorg niet om door te prikken aan de hoofdstroom kanaal. </li><li> Steek de vezel gekoppeld aan de 405 nm laser in de verste stroomafwaartse 120 micrometer hoog zijkanaal, waardoor vezels tussenruimte van 300 micrometer. </li><li> Plaats de PMT-gekoppelde vezel in de 220 urn lang kanaal loodrecht op de twee laser excitatie vezels. </li></ol> 6. Fluorescentie Detectie van Mixed emulsies <ol><li> Monteer een 5 ml injectiespuit gevuld met HFE 7500 met 2% ionische fluorsurfactant de afstandhouder olie inlaat van de detectie-inrichting met PE-2 buizen. </li><li> Monteer de spuit met de gemengde FITC / CB-emulsie op een verticaal georiënteerd spuit pomp en koppel om het apparaat druppel herinjectie inlaat met behulp van PE-2 buizen. Sluit een lengte van PE-2 buizen van de afrit apparaat naar een afvalcontainer. </li><li> Vul het apparaat door het uitvoeren van elk van de pompen bij 1000 ul / uur totdat beideolie druppeltjes worden gezien regelmatig worden gecombineerd in de inrichting en stroomt stroomafwaarts. </li><li> Regel het debiet zodanig dat de afstandhouder olie draait op 6000 pl / uur en de druppels bij 100 pl / uur, wat een aanzienlijke afstand tussen druppeltjes reizen door de detectie regio. </li><li> Zet de lasers, start het data-acquisitie programma, en pas de PMT winst voor signalen die meer dan 100x de basislijn lawaai verdieping zijn voorzien. Stel het laservermogen zodat alle doublet pieken zijn duidelijk zichtbaar op één lineair geschaald timetrace. </li><li> Verwerven van 60 sec van het PMT voltage timetrace op tenminste 20 kHz. Importeer de gegevens in de computer programma zoals Matlab en meet de hoogtes van de pieken van de opgenomen doubletten met behulp van het programma aangepast computergebruik script. LET OP: Deze wordt verstrekt als aanvullende informatie. </li><li> Herhaal stap 6,2-6,7 met behulp van de FITC-only gemengde emulsie gemaakt in 4.7, met de 405 nm laser uitgeschakeld. </li></ol>

<ol><li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 198-220 (2008).</li>
<li>Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+and+sorting+using+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocol%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics.</a> Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).</li>
<li>Hindson, B. J., Ness, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).</li>
<li>Agresti, J. J., Antipov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-throughput+screening+in+drop-based+microfluidics+for+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (14), 4004(2010).</li>
<li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picoinjection+Enables+Digital+Detection+of+RNA+with+Droplet+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR.</a> PLOS ONE. 8 (4), (2013).</li>
<li>Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compact+and+modular+multicolour+fluorescence+detector+for+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics.</a> Lab Chip. 15 (13), 2754-2758 (2015).</li>
<li>Guo, F., Lapsley, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+droplet-based%2C+optofluidic+device+for+high-throughput%2C+quantitative+bioanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis.</a> Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).</li>
<li>Lithography. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html">https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html</a> (2015).</li>
<li>DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+Biocompatible+Oil-Water+Interfaces+without+Synthesis%3A+Direct+Interactions+between+Primary+Amines+and+Carboxylated+Perfluorocarbon+Surfactants%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants.</a> Anal Chem. 85 (21), (2013).</li>
<li>Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+completely+in+vitro+ultrahigh-throughput+droplet-based+microfluidic+screening+system+for+protein+engineering+and+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution.</a> Lab Chip. 12, 882(2012).</li>
<li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-Throughput+Mammalian+Single-Cell+Reverse-Transcriptase+Polymerase+Chain+Reaction+in+Microfluidic+Drops%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops.</a> Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).</li>
<li>Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+encoded+multicolor+fluorescence+detection+in+a+microfluidic+flow+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer.</a> Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).</li>
<li>Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+fabrication+of+a+microfluidic+device+with+integrated+optical+waveguides+for+DNA+fragment+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis.</a> Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).</li>
<li>Martinez Vazquez, R., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sensing+in+microfluidic+lab-on-a-chip+by+femtosecond-laser-written+waveguides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides.</a> Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).</li>
<li>Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+control+of+microchannels+fabricated+in+fused+silica+by+femtosecond+laser+irradiation+and+chemical+etching%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching.</a> Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Glasvezel detectie vereist de aanpassing van de optische vezels met betrekking tot vloeistof kanalen. Omdat onze apparaat maakt gebruik van gidskanalen gefabriceerd met multilayer fotolithografie, plaatsing van maskers met ten opzichte van elkaar is van groot belang. Indien de vezel geleidingskanalen te dicht bij het vloeistofkanaal, is er een risico van lekkage; als de gids kanalen bevinden zich te ver weg of niet goed uitgelijnd, kan de fluorescentie signaal verzameld door de detectie vezel aanzienlijk worden verminde...

Droplet microfluidics een platform voor high throughput biologie door compartimentering van experimenten in een groot aantal van de waterige druppeltjes gesuspendeerd in een drager olie 1. Druppeltjes zijn gebruikt voor toepassingen die variëren van eencellige analyse 2, digitale polymerasekettingreactie (PCR) 3, en enzym evolutie 4. Fluorescerende assays zijn de standaard manier van detectie voor druppel microfluidics, als hun heldere signalen en een snelle time respons verenigbaar is met het opsporen van sub-nanoliter druppel volumes bij kilohertz tarieven zijn. Veel toepassingen vereisen fluorescentiedetectie ten minste twee kleuren simultaan. Zo ons lab voert gewoonlijk PCR-geactiveerde sortering druppel experimenten die detectiekanaal gebruiken voor het resultaat van een test, en gebruikt een secundaire achtergrond kleurstof assay-negatieve druppeltje telbare 5 maken. Typische detectie stations voor druppel microfluidics zijn based op epifluorescentie microscopen, en vereisen ingewikkelde licht manipulaties&#39;s om excitatielicht introduceren van vrije ruimte lasers in microscoop te worden gericht op het monster. Nadat fluorescentie wordt uitgezonden van een druppel, wordt het uitgezonden fluoresceerden licht gefilterd zodat elk detectie-kanaal maakt gebruik van een fotomultiplicatorbuis (PMT) gecentreerd op een golflengte band. Epifluorescentie-microscoop gebaseerde optische detectie systemen een toetredingsdrempel als gevolg van hun kosten, complexiteit en benodigde onderhoud. Optische vezels zorgen voor de middelen om een ​​vereenvoudigde en robuuste detectie systeem te bouwen, omdat vezels handmatig in microfluïdische apparaten kunnen worden geplaatst, waardoor de noodzaak voor-spiegel op basis van licht routing, en waardoor het licht paden te worden gekoppeld met behulp van optische vezel connectoren. In dit artikel beschrijven we de assemblage en validatie van een compact en modulair systeem ter multicolor fluorescentiedetectie te voeren door gebruik te maken van een reeks van optische vezels eenda enkele fotodetector 6. Optische vezels zijn gekoppeld met individuele lasers en worden normaal opgenomen om een ​​L vormig stroomkanaal regelmatige ruimtelijke offsets. Een fluorescentie verzameling vezel wordt evenwijdig aan de excitatie regio en is verbonden met een PMT. Omdat een druppel passeert de laserstralen op verschillende tijdstippen, gegevens die door de PMT toont een tijdelijke offset waarmee de gebruiker onderscheid te maken tussen de uitgezonden nadat de druppel wordt opgewekt door elke afzonderlijke laserbundel fluorescentie. Deze tijdelijke verschuiving elimineert de noodzaak om uitgezonden licht te scheiden om afzonderlijke PMT&#39;s met behulp van een reeks dichroïsche spiegels en banddoorlaatfilters. Om de effectiviteit van de detector te valideren, kwantificeren we fluorescentie druppeltjes populaties inkapselen van kleurstoffen van verschillende kleuren en concentratie. De gevoeligheid van het systeem werd onderzocht voor een kleur fluoresceïne detectie en geeft de mogelijkheid tot druppeltjes met concentraties beneden detecteren 0,1 nM, een 200x gevoeligheid vertovement vergeleken met recente vezel gebaseerde benaderingen in de literatuur 7.

<table><tbody><tr><td>Photomasks</td><td>CadArt Servcies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3" silicon wafers, P type, virgin test grade</td><td>University Wafers</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3035</td><td>Microchem</td><td>Y311074</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>Microchem</td><td>Y111072</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td><td>Krayden</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringes</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>10 ml syringes</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>27 gaugue needles</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>PE 2 polyethylene tubing</td><td>Scientific Commodities, Inc.</td><td>B31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>Novec 7500</td><td>Fisher Scientific</td><td>98-0212-2928-5</td><td>Commonly knowns as HFE 7500</td></tr><tr><td>Ionic Krytox Surfactant</td><td></td><td></td><td>Synthesis instructions in ref #10</td></tr><tr><td>Dextran-conjugated cascade blue dye</td><td>Life Technologies</td><td>D-1976</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein sodium salt</td><td>Sigma</td><td>28803</td><td></td></tr><tr><td>Quad bandpass filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-446/510/581/703-25</td><td></td></tr><tr><td>PMT</td><td>Thorlabs</td><td>PMM02</td><td></td></tr><tr><td>Fiber port</td><td>Thorlabs</td><td>PAFA-X-4-A</td><td></td></tr><tr><td>lens tube</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td><td></td></tr><tr><td>Patch cable with 200 &#956;m core / 225 &#956;m cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector</td><td>Thorlabs</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Patch cable with 105 &#956;m core / 125 &#956;m cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector</td><td>Thorlabs</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>125 &#956;m fiber stripping tool</td><td>Thorlabs</td><td>T08S13</td><td></td></tr><tr><td>225 &#956;m fiber stripping tool</td><td>Thorlabs</td><td>T10S13</td><td></td></tr><tr><td>laser fiber adapter</td><td>OptoEngine</td><td>FC/PC Adapter</td><td></td></tr><tr><td>405 nm CW laser at 50&nbsp;mW</td><td>OptoEngine</td><td>MDL-III-405</td><td>Distributor for CNI lasers</td></tr><tr><td>473 nm CW laser at 50&nbsp;mW</td><td>OptoEngine</td><td>MLL-FN-473-50</td><td></td></tr></tbody></table>

multicolor fluorescentie detectie voor droplet microfluidics met behulp van optische vezels

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescentiemetingen zijn de meest gebruikte meetmethoden in druppelmicrofluidica vanwege hun heldere signalen en snelle tijdsrespons. Toepassingen zoals multiplex-metingen, enzym-evolutie en moleculair biologische celsortering vereisen de detectie van twee of meer kleuren fluorescentie. Standaard meerkleurdetectiesystemen die vrije ruimtelasers koppelen aan epifluorescentiemicroscopen zijn omvangrijk, duur en moeilijk te onderhouden. In dit artikel beschrijven we een schema om meerkleurdetectie uit te voeren door discrete gebieden van een microfluïdische kanaal te exciteren met lasers gekoppeld aan optische vezels. Uitgezonden licht wordt verzameld door een optische vezel gekoppeld aan een enkele fotodetector. Omdat de excitatie op verschillende ruimtelijke locaties plaatsvindt, kan de identiteit van het uitgezonden licht worden gecodeerd als een temporele verschuiving, waardoor de noodzaak voor meer gecompliceerde lichtfilteringsschema's wordt geëlimineerd. Het systeem is gebruikt om druppelpopulaties met vier unieke combinaties van kleurstoffen te detecteren en om sub-nanomolare concentraties van fluoresceïne te detecteren.

Vervaardiging van een PDMS apparaat waarmee het inbrengen van optische vezels vereist een meerstaps fotolithografie procedure kanalen van variërende lengte (figuur 1) te maken. Eerst wordt een 80 urn groot laag van SU-8 gesponnen op een siliciumwafel gevormd en met behulp van een masker om de fluïdumverwerking geometrie. Vervolgens wordt een additionele 40 um laag van SU-8 gesponnen op de wafel en gevormd met behulp van een tweede masker om functies 120 urn lang laserfib...

Meerkleurige fluorescentiedetectie in druppelmicrofluidica omvat doorgaans omvangrijke en complexe detectiesystemen op basis van epifluorescentiemicroscopen. Hier beschrijven we een compact en modulair meerkleurig detectieschema dat gebruikmaakt van een reeks optische vezels om meerkleurige gegevens die door een enkele fotodetector worden verzameld, tijdelijk te coderen.

Multicolor Fluorescentie detectie voor Droplet Microfluidics Met behulp van optische vezels

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Het algemene doel van deze procedure is om een eenvoudige toepassing van fluorescentiedetectie in druppelmicrofluidica aan te tonen met behulp van optische vezels. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in biologische high-throughput screening, zoals de identificatie van zeldzame fenotypen en de gerichte evolutie van enzymen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige en goedkope toepassing van fluorescentiedetectie in druppelmicrofluidica mogelijk maakt.Begin met het plaatsen van een vooraf gereinigde siliciumwafer met een diameter van drie inch op de vacuümtafel van een spincoater. Breng vervolgens één milliliter SU-8 3050 aan in het centrum van de wafer en spin de wafer om een fotolithografische laag van 80 µm dikte aan te brengen. Verwijder de gecoate wafer uit de spincoater en plaats deze op een warmteplaat die is voorverwarmd tot 135 °C.Verwijder de wafer na 30 minuten en laat deze afkoelen tot kamertemperatuur. Plaats de wafer vervolgens op een vlak oppervlak en richt het masker van de eerste laag uit op de wafer. Belicht de wafer gedurende drie minuten onder een gecollimeerde 190 milliwatt, 365 nanometer LED.Plaats de wafer na blootstelling gedurende één minuut op een hotplate van 135 °C en laat deze vervolgens weer afkoelen tot kamertemperatuur. Zodra de wafer is afgekoeld, plaatst u deze terug op de spincoater en bevestigt u deze aan de chuck. Breng een extra milliliter SU-8 3050 aan in het centrum van de wafer en spin deze 20 seconden bij 500 r.p.m.gevolgd door 30 seconden bij 5.000 r.p.m. Bak de wafer vervolgens op een warmteplaat. Laat de wafer weer afkoelen tot kamertemperatuur en plaats deze daarna terug op het maskeruitlijnoppervlak.Gebruik de dissectiescoop om het masker van de tweede laag handmatig uit te lijnen met de gestructureerde uitlijningsmarkeringen op de wafer. Zodra deze correct zijn uitgelijnd, wordt de gecoate wafer gedurende 4-1/2 minuten belicht onder dezelfde omstandigheden als voorheen. Plaats de wafer na belichting gedurende één minuut op een hotplate bij 135 °C, koel de wafer vervolgens af en bevestig deze opnieuw op de spin coater.Breng voor een derde maal één milliliter SU-8 3050 aan op de wafer en spin deze om een extra 100 micrometers fotoresist toe te voegen. Verwijder de wafer en bak deze 30 minuten op een hotplate van 135 °C. Laat de wafer vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur en plaats deze op het uitlijnervlak.Lijn het masker van de derde laag uit met de vorige geometrie en belicht de gecoate wafer gedurende negen minuten volgens de eerder gebruikte condities. Plaats de wafer na belichting gedurende één minuut op een hotplate van 135 °C en laat deze vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur. Ontwikkel de maskers zodra de wafer is afgekoeld door deze 30 minuten onder te dompelen in een geroerd bad met ontwikkelaar.Was ten slotte de wafer in isopropanol en bak deze daarna voor een laatste maal gedurende één minuut op een warmteplaat bij 135 graden Celsius. Bewaar de ontwikkelde master in een Petri-schaal van 100 millimeter tot aan het gieten. Bereid een 10:1 mengsel van PDMS voor door 50 gram siliconenbase te combineren met vijf gram uithardingsmiddel in een plastic beker.Meng de inhoud met een rotatiemengapparaat en ontgas het mengsel vervolgens 30 minuten lang in een exsiccator, of totdat alle luchtbellen zijn verwijderd. Giet de ontgaste PDMS over de voorbereide master om een dikte van drie millimeter te verkrijgen. Plaats de petrischaal daarna terug in de exsiccator voor verdere ontgassing.Zodra alle luchtbellen zijn verwijderd, wordt het apparaat 80 minuten gebakken bij 80 °C. Snijd het apparaat na afkoeling met een scalpel uit de mal, zodat zowel de telegeometrieën van 120 µm als 220 µm vanaf de zijkant van het apparaat toegankelijk zijn. Pons vervolgens de fluïdische in- en uitlaten uit met een biopsietpons van 0,75 mm.Behandel het device met de functionele zijde naar boven, samen met een vooraf gereinigde glasplaat, met 1 millibar zuurstofplasma gedurende 20 seconden in een plasmareiniger van 300 watt. Bond het device door de gestructureerde zijde van het PDMS-device stevig op de plasmabehandelde zijde van de glasplaat te plaatsen. Plaats het device vervolgens in een device-oven van 80 graden Celsius en bak het geassembleerde device gedurende 40 minuten.Nadat het apparaat is gebakken, wordt een spuit gebruikt om het apparaat te spoelen met een gefluoreerd oppervlaktebehandelingsvloeistof om de kanalen hydrofoob te maken. Bak het apparaat vervolgens onmiddellijk 10 minuten bij 80 °C om het oplosmiddel te laten verdampen. Bereid twee laser-excitatiefibers voor door de isolatie van de laatste vijf millimeter van de optische vezels te verwijderen.Bereid daarnaast de vezel voor het opvangen van het fluorescentiesignaal voor door de isolatie van de laatste vijf millimeter van een grotere optische vezel te verwijderen. Inspecteer de uiteinden van alle vezels onder een microscoop. Als de uiteinden niet vlak zijn, dienen ze opnieuw te worden gesneden met een vezelsnijder.Bevestig vervolgens een laservezelkoppelaar aan een laser van 50 milliwatt en 405 nanometer en sluit een van de vezels met een kern van 105 micrometer aan op de laser. Richt het gestripte uiteinde van de sensor van een laservermogensmeter erop en gebruik de fijne afstellingen van de laserkoppelaar om het laservermogen te maximaliseren. Voer hetzelfde proces uit om de andere vezel af te stemmen met behulp van een laser van 50 milliwatt en 473 nanometer.Monteer vervolgens een quad bandpass-filter op de fotovermenigvulper met behulp van lenstubes om het laserlicht te blokkeren en de geëmitteerde fluorescentie door te laten. Bevestig een vezelkoppelaar zodat het licht door de filters gaat voordat het de fotovermenigvulpker bereikt. Bevestig daarna de opvangvezel aan de vezelkoppelaar.Plaats de vervaardigde microfluidische chip op de tafel van een omgekeerde microscoop die gekoppeld is aan een digitale camera met een sluitertijd van ten minste 100 microseconden. Voer, terwijl u voorzichtig vanuit de zijkanten werkt, de vezel die gekoppeld is aan de 473 nanometer laser in het meest stroomopwaarts gelegen 120 micrometer kanaal in. Let erop dat u niet doorstoot naar het hoofdstroomkanaal.Voer vervolgens de vezel die gekoppeld is aan de 405 nanometer laser in het verste stroomafwaartse zijkanal van 120 micrometer hoog in, met een vezelafstand van 300 micrometer. Voer tot slot de grotere vezel die gekoppeld is aan de fotomultiplicatorbuis in het kanaal van 220 micrometer hoog, loodrecht op de twee laser-excitatievezels. Vul een spuit van vijf milliliter met HFE 7500 die 2% ionische fluoro-surfactant bevat en monteer deze aan de spacer-olie-inlaat van het detectieapparaat met behulp van PE2-slangen.Vul vervolgens een spuit met een mengsel van een FITC- en blauwe kleuremulsie en bevestig deze op een verticaal georiënteerde spuitenpomp die via PE2-slangen als druppelreinjectie-inlaat aan het apparaat is gekoppeld. Verbind een stuk PE-slang van de uitgang van het apparaat met een afvalbak. Prime dan het apparaat door elke pomp op 1.000 microliters per uur te laten lopen, totdat zowel de olie als de druppels regelmatig in het apparaat combineren en stroomafwaarts vloeien.Stel de stroomsnelheden zo in dat de spacerolie stroomt met 6.000 µL per uur en de druppels met 100 µL per uur, om een aanzienlijke tussenruimte te creëren tussen de druppels die door het detectiegebied bewegen. Zet vervolgens de lasers aan en start het programma voor gegevensverwerving. Stel daarna de gain van de fotomultiplicatorbuis zo in dat de signalen meer dan 100 keer hoger zijn dan de basislijnruis.Pas tot slot het laservermogen aan zodat alle dubbeltoppen duidelijk zichtbaar zijn op één lineair geschaalde tijdtrace. Een druppel die door het detectiekanaal stroomt, komt discrete excitatieregio's tegen voor elk van de lasergekoppelde optische vezels. De detectievezel registreert de uitgezonden fluorescentie met een temporele verschuiving, waarbij de piekseparatie correleert met de tijd die een druppel nodig heeft om van de ene excitatieregio naar de volgende te bewegen.Dit maakt verdere lichtfiltering en aparte fotomultiplicatorbuizen overbodig. De effectiviteit van het detectieschema werd getest door een gemengde emulsie van druppels te detecteren die kleurstoffen bevatten die exciteren bij 405 nanometer en bij 473 nanometer. Deze grafiek laat een duidelijke scheiding zien tussen de vier opnieuw geïnjecteerde druppeltypen wanneer deze met een snelheid van ongeveer 50 hertz stromen.Het dynamische bereik en de absolute gevoeligheid van de detector werden onderzocht door druppels met enkel fluoresceïne te meten. De gegevens tonen het vermogen van het systeem aan om kleurstofconcentraties te detecteren die variëren van 0,1 tot 100 nanomolar. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een eenvoudig en compact fluorescentiedetectiesysteem kunt implementeren door gebruik te maken van een array van ingevoegde optische vezels en een enkele fotodetector.

multicolor-fluorescence-detection-for-droplet-microfluidics-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In dit artikel beschrijven we hoe we krijgen FRET sporen van individuele DNA-moleculen geïmmobiliseerd op een oppervlak met behulp van een geautomatiseerde scanning confocale microscoop.

Geautomatiseerd systeem voor Single Molecule Fluorescentie metingen van Surface-geïmmobiliseerde biomoleculen

Een lensless on-chip fluorescentie microscopie platform is aangetoond dat kan afbeelding fluorescerende voorwerpen over een ultra-breed-of-view van bijvoorbeeld,&gt; 0,6-8 cm2 met &lt;4μm resolutie met behulp van een steekproef op basis van compressie-algoritme decodering. Zo'n compacte en wide-field fluorescerende on-chip beeldvormende modaliteit kan waardevol zijn voor high-throughput cytometrie, zeldzame-cel onderzoek en microarray-analyse.

Lensless fluorescentie microscopie op een chip

Druppel op basis van microfluïdische platforms zijn veelbelovende kandidaten voor high throughput experimenten, omdat zij in staat zijn om goedkoop te genereren picoliter, self-gecompartimenteerde schepen op kHz tarieven. Door integratie met snelle, gevoelige en een hoge resolutie fluorescentie spectroscopische methoden, kunnen de grote hoeveelheden informatie uit die in deze systemen efficiënt kunnen worden geëxtraheerd, aangewend en gebruikt.

Fluorescentie detectiemethoden voor microfluïdische druppel platforms

This video demonstrates the use of fluorescence fluctuation spectroscopy to detect the interaction among cell surface proteins at cell-cell contacts. By expressing the transmembrane adhesion receptor of interest labeled with a fluorescent protein and mixing two different cell populations harboring two spectrally separated fluorescent labels, the trans-interaction between the receptors of two neighboring cells with different-colored fluorescence is assessed via cross-correlation in the...

Fluorescence Fluctuation Spectroscopy to Study Protein Interaction at Cell Contacts

Fluorescent-core microcavity sensoren gebruiken een hoge-index quantum dot-coating in het kanaal van silica microcapillaries. Veranderingen in de brekingsindex van vloeistoffen gepompt capillaire kanalen leiden tot verschuivingen in de microcavity fluorescentie spectrum die kunnen worden gebruikt om het kanaal medium analyseren.

Synthese en Werking van TL-core microcavities voor Refractometermethode Sensing

We demonstreren het gebruik van fluorescentie foto activerings lokalisatie microscopie (FPALM) om gelijktijdig meerdere soorten fluorescerend gelabelde moleculen binnen cellen af te beelden. De beschreven technieken leveren de lokalisatie op van duizenden tot honderdduizenden individueel fluorescent gelabelde eiwitten, met een precisie van tientallen nanometer binnen enkele cellen.

Gelijktijdige Multicolor beeldvorming van biologische structuren met fluorescentie Fotoactivatie Lokalisatie Microscopie

Dit werk geeft een eenvoudige en visuele methode om multi-nucleotide polymorfismen detecteren op een pneumatische druppel manipulatie platform. Met de voorgestelde werkwijze, het gehele experiment, met inbegrip druppeltje manipulatie en detectie van multi-nucleotide polymorfismen dergelijke kunnen bij 23 ° C zonder behulp van geavanceerde instrumenten.

De Visual Colorimetrische Detectie van Multi-nucleotide polymorphisms op een pneumatische Droplet Manipulation Platform

Hier presenteren we een protocol voor Multi-Color lokalisatie van één membraaneiwitten in organellen van levende cellen. Als u wilt koppelen fluorophores, worden zelf labeling eiwitten gebruikt. Eiwitten, gelegen in verschillende membranen compartimenten van de dezelfde organel, kunnen worden gelokaliseerd met een nauwkeurigheid van ~ 18 nm.

Multi-Color lokalisatie microscopie van één membraaneiwitten in organellen van de cellen van levende zoogdieren

Hier presenteren we een praktische gids voor het bouwen van een geïntegreerde microscopie-systeem, dat wordt samengevoegd conventionele epi-belichting fluorescerende imaging, single-molecuul detectie gebaseerde Super resolutie beeldvorming en Multi-Color single-molecuul detectie, met inbegrip van single-molecuul fluorescentie resonantie energieoverdracht imaging, in één set-up op een kostenefficiënte manier.

Uitvoeren van meerdere Imaging modi met één fluorescentie Microscoop

Visuele, single-molecule biochemie bestudeerd door microfluïdische kamers wordt aanzienlijk vergemakkelijkt met behulp van glazen vaten, gasdichte spuiten, stabiele verbindingen van slangen met stroomcellen en eliminatie van bellen door schakelkleppen tussen de spuiten en slangen te plaatsen. Het protocol beschrijft dubbele optische vallen die visualisatie van DNA-transacties en intermoleculaire interacties mogelijk maken.

Gebruik van dual optische pincet en microfluïdica voor single-molecule studies

Het protocol beschrijft een geavanceerd microfluïdisch platform om de cytokinesecretiedynamiek van individuele menselijke perifere mononucleaire bloedcellen kwantitatief te meten. Het platform meet tot drie cytokines parallel (IL-6, TNFα en IL-1β) voor elke individuele cel die wordt gestimuleerd met lipopolysaccharide als voorbeeld.

Microfluïdische benadering om gelijktijdige en sequentiële cytokinesecretie van individuele polyfunctionele cellen op te lossen 

Leer een compacte methode voor multicolor fluorescentiedetectie in druppelmicrofluidica met behulp van optische vezels. Deze techniek vereenvoudigt biologische screening en ondersteunt hoogdoorvoeronderzoek naar zeldzame fenotypes.

Multicolor Fluorescentie detectie voor Droplet Microfluidics Met behulp van optische vezels

Meer video's verkennen