Multicolor Fluorescentie detectie voor Droplet Microfluidics Met behulp van optische vezels

Het algemene doel van deze procedure is om een eenvoudige toepassing van druppelmicrofluidische fluorescentiedetectie met behulp van optische vezels te demonstreren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in hoogdoorvoerig biologisch screening, zoals de identificatie van zeldzame fenotypes en de gerichte evolutie van enzymen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige en goedkope toepassing van fluorescentiedetectie in druppelmicrofluidica mogelijk maakt.

Om te beginnen, plaats een voorgereinigd siliciumwafer van drie inch diameter op de vacuümklem van een spincoater. Breng vervolgens één milliliter SU-8 3050 aan in het midden van de wafer en laat de wafer draaien om een laag fotoresist van 80 micrometer dik te verkrijgen. Verwijder de gecoate wafer uit de spincoater en plaats deze op een hotplate voorverwarmd tot 135 graden Celsius.

Na 30 minuten verwijdert u de wafer en laat deze afkoelen tot kamertemperatuur. Plaats vervolgens de wafer op een vlakke oppervlakte en lijn de eerste laagmasker op de wafer uit. Stel de wafer gedurende drie minuten bloot onder een gecollimeerde 190 milliwatt, 365 nanometer LED.

Na de belichting plaatst u de wafer gedurende één minuut op een hotplate van 135 graden Celsius en laat deze vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur. Zodra het afgekoeld is, plaatst u de wafer terug op de spincoater en bevestigt u deze aan de klemmen. Breng nog eens één milliliter SU-8 3050 aan in het midden van de wafer en laat het 20 seconden draaien bij 500 r.p.m.

gevolgd door 30 seconden bij 5.000 r.p.m. Bak vervolgens de wafer op een hotplate. Laat deze afkoelen tot kamertemperatuur en plaats hem vervolgens terug op het maskeruitlijningsoppervlak.

Gebruik de dissectiescoop om de tweede laagmasker handmatig uit te lijnen met de gepatterede uitlijningsmarkeringen op de wafer. Zodra goed uitgelijnd, stelt u de gecoate wafer gedurende 4-1/2 minuten bloot onder dezelfde omstandigheden als eerder. Na de belichting plaatst u de wafer gedurende één minuut op een hotplate van 135 graden Celsius, koelt u de wafer vervolgens af en bevestigt u deze weer op de spincoater.

Breng één milliliter SU-8 3050 voor de derde keer aan op de wafer en laat draaien om een extra 100 micrometer fotoresist toe te voegen. Verwijder de wafer en bak deze gedurende 30 minuten op een hotplate van 135 graden Celsius. Koel het vervolgens af tot kamertemperatuur en plaats het terug op het uitlijningsoppervlak.

Lijn de derde laagmasker uit met de vorige geometrie en stel de gecoate wafer gedurende negen minuten bloot onder dezelfde omstandigheden als eerder. Na de belichting plaatst u de wafer gedurende één minuut op een hotplate van 135 graden Celsius en koelt u deze vervolgens af tot kamertemperatuur. Zodra afgekoeld, ontwikkelt u de maskers door de wafer gedurende 30 minuten in een geroerd bad van ontwikkelaar te dompelen.

Was de wafer vervolgens in isopropanol en bak deze nog een laatste keer gedurende één minuut op een hotplate van 135 graden Celsius. Bewaar de ontwikkelde master in een 100 millimeter petrischaal tot het vormen. Bereid een 10:1 mengsel van PDMS voor door 50 gram siliciumbasis te combineren met vijf gram hardingsmiddel in een plastic kop.

Meng de inhoud met een rotatietool en ontgas vervolgens het mengsel gedurende 30 minuten in een exsiccator, of tot alle luchtbellen zijn verwijderd. Giet het ontgaste PDMS over de voorbereide master om een dikte van drie millimeter te verkrijgen. Plaats vervolgens de petrischaal terug in de exsiccator voor verdere ontgassing.

Zodra alle bubbels zijn verwijderd, bakt u het apparaat gedurende 80 minuten op 80 graden Celsius. Zodra afgekoeld, snijdt u het apparaat uit de mal met een scalpel zodat zowel de 120 micrometer als de 220 micrometer telegeometrieën toegankelijk zijn vanaf de zijkant van het apparaat. Prik vervolgens de vloeistoftoevoer en -uitlaat met een 0,75 mm biopsiepunch.

Behandel het apparaat met plasma met de functiezijde omhoog samen met een voorgereinigde glazen plaat en 1 millibar zuurstofplasma gedurende 20 seconden in een 300 watt plasmareiniger. Verbind het apparaat door de patroonzijde van het PDMS-apparaat stevig op de plasmabehandelde zijde van de glazen plaat te plaatsen. Plaats vervolgens het apparaat in een apparaatooven van 80 graden Celsius en bak het geassembleerde apparaat gedurende 40 minuten.

Na het bakken, gebruikt u een spuit om het apparaat te spoelen met een gefluorineerde oppervlaktebehandelingsvloeistof om de kanalen hydrofoob te maken. Bak vervolgens het apparaat onmiddellijk gedurende 10 minuten op 80 graden Celsius om het oplosmiddel te laten verdampen. Bereid twee laserexcitatievezels voor door de isolatie van de laatste vijf millimeter van de optische vezels te verwijderen.

Bereid ook de vezel voor op het verzamelen van het fluorescentiesignaal door de isolatie van de laatste vijf millimeter van een grotere optische vezel te verwijderen. Inspecteer de uiteinden van alle vezels onder een microscoop. Als de uiteinden niet eindigen op een vlak oppervlak, scherp de uiteinden opnieuw met een vezelschrijver.

Bevestig vervolgens een laservezelkoppeling aan een 50 milliwatt, 405 nanometer laser en bevestig een van de 105 micrometer kernvezels aan de laser. Richt het blootgestelde uiteinde van de sensor van een laservermogensmeter en gebruik de fijne aanpassingen van de laserkoppeling om het laservermogen te maximaliseren. Voer hetzelfde proces uit om de andere vezel af te stemmen met behulp van een 50 milliwatt, 473 nanometer laser.

Monteer vervolgens een quad bandpass filter op de fotovermenigvuldigerbuis met behulp van lensbuizen om het laserlicht te blokkeren en de uitgezonden fluorescentie door te laten. Bevestig een vezelkoppeling zodat het licht door de filters reist voordat het de fotovermenigvuldigerbuis