Extended Time-lapse intravitale Imaging van Real-time Meercellige Dynamiek in de tumor micro

Het algemene doel van deze procedure is om de dynamische gebeurtenissen binnen de tumormicro-omgeving te visualiseren via hoogresolutie, intravitale multifotonmicroscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de tumormicro-omgeving, zoals welke dynamische gebeurtenissen betrokken zijn bij vasculaire permeabiliteit en multicellulaire interacties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de kinetiek van de gebeurtenissen in de tumormicro-omgeving kan worden waargenomen en gemeten.

Schakel vóór aanvang van de procedure alle microscoop- en lasercomponenten in, inclusief de tweefotonlasers en de detectoren. Stel de verwarmingskast in op 30 °C om de objecttafel voor te verwarmen. Reinig de objecttafel van de microscoop en de houder van de objecttafel met 70% ethanol.

Wanneer de tafel droog is, breng een grote druppel water aan op het 25 x 1,05 NA microscoopobjectief om optisch contact met het dekglas te behouden en plaats een dekglas met een dikte van nummer 1,5 over de poort voor beeldvorming van de insert. Snijd vervolgens een stuk polyethyleenslang van 30 centimeter af. Plaats het rubberen kussen bovenop het dekglas.

Breek met een pincet een naald van 31 gauge af van de plastic houder en steek het stompe uiteinde van de naaldhouder in de slang. Steek een naald van 31 gauge in het andere uiteinde van de PE-slang en bevestig deze. Vul vervolgens een spuit van 1 cc met steriele PBS en bevestig de spuit aan de naald van 31 gauge.

Gebruik de PBS om alle lucht uit de slang en de naald te spoelen. Vul vervolgens één injectiespuit van 1 cc met 200 µL van het geschikte vasculaire label en een andere met het geschikte injecteerbare eiwit. Bevestig vóór aanvang van de operatie de juiste anesthesie door te controleren op het ontbreken van een reactie op een knijpreflex in de teen en breng oogzalven aan bij de geanestheseerde muis.

Plaats het dier vervolgens op een chirurgisch platform onder een warmtelamp om de circulatie in de staart te verhogen. Steriliseer na twee minuten de staart met 70% ethanol en voeg de punt van de 31 gauge katheter twee tot drie millimeter in de laterale staartader in. Breng vervolgens een stukje laboratoriumtape van één centimeter aan op de katheter om de naald parallel aan de ader langs de lengte van de staart te fixeren.

Zodra de katheter is gefixeerd, worden de ventrale zijde en de tumoroppervlakken afgeveegd met 70% ethanol. Til vervolgens de huid over het abdomen op en gebruik een steriele schaar om een subcutane incisie van ongeveer één centimeter te maken langs de ventrale middenlijn van het abdomen, waarbij nauwkeurig wordt vermeden om het peritoneum te doorboren. Snijd voorzichtig het bindweefsel door dat de melkklier en de tumor aan het peritoneum bevestigt om de tumor bloot te leggen.

Verwijder vervolgens met de schaar en de pincet voorzichtig het fascia en vet van het blootgestelde oppervlak van de tumor. Wanneer de tumor is vrijgelegd, wordt de muis overgebracht naar de voorverwarmde beeldvormingsplateau. Gebruik laboratoriumtape om het dekglas te bevestigen en plaats de tumor vervolgens in het gat van een rubberen matje dat het dekglas over het microscoopobjectief bedekt.

Wanneer het dier in positie is, vult u de kamer van het rubberen kussen met PBS om het weefsel gehydrateerd te houden en het optische contact met het dekglas te behouden. Plaats een pulse-oximetrie-sondecollarsensor rond de nek om de vitale functies van het dier te bewaken en plaats de verwarmingsdoos over het dier. Gebruik vervolgens de microscope IP's om scherp te stellen op de fluorescente tumorcellen op het oppervlak van de tumor en het gebied met stromende bloedvaten.

Zodra een regio van interesse is geselecteerd, schakelt u de microscoop over naar de multiphoton-beeldvormingsmodus en gebruikt u de focusregelaar om het objectief naar de gewenste startlocatie te bewegen. Klik vervolgens op de knop voor de bovenste Z-positie om de bovengrens van de z-serie in te stellen en visualiseer het collageenvezelnetwerk aan het oppervlak van de tumor in het kanaal voor tweede harmonische generatie. Beweeg vervolgens het objectief naar de gewenste beeldvormingsdiepte en klik op de knop voor de onderste z-positie om de ondergrens van de z-serie in te stellen.

Voer vervolgens de gewenste waarde in de velden voor de stapgrootte in. Schakel daarna over naar het Time Lapse-paneel en voer de juiste tijd tussen de opnames in. Zodra de beeldgevingsparameters waren bepaald, werd de spuit die aan de katheter was bevestigd vervangen door een spuit met vasculaire labelingskleurstof en werd langzaam maximaal 200 µL van de kleurstofoplossing toegediend, waarbij erop werd gelet dat de oplossing de ader binnendrong.

Plaats na de injectie de PBS-spuit terug in de katheter en start de z-stap time-lapse imaging. Wanneer alle beelden zijn verkregen, vervangt u de PBS-spuit door de spuit met het injecteerbare eiwit, waarbij u er nauwkeurig op let dat er geen luchtbellen in de lijn terechtkomen. Injecteer vervolgens langzaam de eiwitsuspensie in de muis en vervang de spuit door een spuit met PBS.

Macrofagen kunnen worden gevolgd met fluorescentielabelled 70 kilodalton dextran, dat zich ophoopt in de fagocytische macrofagen. Dubbele labeling van de tumorcellen en de macrofagen maakt het mogelijk om de directe interactie tussen deze twee celtypen in real-time te visualiseren. Om veranderingen in de vasculaire permeabiliteit van de tumor te visualiseren, kunnen quantum dots ook worden gebruikt om de vasculaire ruimte te labelen.

Aangezien ze groot genoeg zijn om niet gemakkelijk door de interarteriële ruimtes te diffunderen. Continue beelden met een hoge resolutie maken het mogelijk om vasculaire permeabiliteitsgebeurtenissen vast te leggen en de kinetiek van de dextraan-extravasatie en klaring te kwantificeren. In dit voorbeeld van het gezichtsveld wordt de piek van de vasculaire extravasatie waargenomen tussen 29 en 34 minuten, zoals blijkt uit het extravasculaire TMR-signaal.

Het injecteren van aanvullende vasculaire kleurstoffen of proteïnen om vasculaire permeabiliteit te induceren kan inzicht verschaffen in de signaleringsgebeurtenissen die de vasculaire permeabiliteit reguleren. Inderdaad kan binnen de eerste seconden na injectie worden waargenomen dat 10 kilodalton dextran FITC extravaseert vanuit de vaten, terwijl de 155 kilodalton dextran TMR beperkt blijft tot de vasculaire ruimte. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in één uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken het bindweefsel voorzichtig te verwijderen zonder het oppervlak van de tumor te beschadigen en om het tumoroppervlak gehydrateerd te houden. Na deze procedure van cellulaire dynamiek kan dergelijke tumormigratie worden gevisualiseerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de directionaliteit van tumormigratie en intravasatie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe dynamische cellulaire gebeurtenissen in een tumormicro-omgeving kunnen worden gevisualiseerd met intervitaal multifotonmicroscopie.