Name: Extended Time-lapse intravitale Imaging van Real-time Meercellige Dynamiek in de tumor micro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Leer intravitaal multiphotonmicroscopie voor het visualiseren van dynamische gebeurtenissen in de tumor-micro-omgeving met enkele-celresolutie. Deze methode maakt real-time metingen van vasculaire permeabiliteit en multicellulaire interacties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd gesteund door het Ministerie van Defensie Breast Cancer Research Program onder award nummer (ASH, W81XWH-13-1-0010), NIH CA100324, PPG CA100324, en de geïntegreerde Imaging Program.

Alle beschreven procedures moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften voor het gebruik van gewervelde dieren, met inbegrip van de voorafgaande goedkeuring van het Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care en gebruik Comite. 1. Productie fluorescent gelabelde tumoren en tumor-geassocieerde macrofagen <ol><li> Genereer fluorescent gelabelde tumorcellen door het oversteken van de spontane, autochtone, genetisch gemanipuleerde muizen borstkanker model waarbij de muis borsttumor virus lange terminale repeat drijft de polyoma midden T-antigeen (MMTV-PyMT) met transgene muizen met fluorescerende verslaggevers [ie, versterkt groen fluorescerend eiwit (EGFP), verbeterde cyaan fluorescerend eiwit (ECFP) of Dendra2] 8,9. </li><li> Fluorescent label macrofagen in PyMT dieren met een fluorescent gelabelde tumorcellen door het kruisen van genetisch gemanipuleerde muis modellen met myeloid- en macrophage- specifieke tl-reporters [ie, MacGrEen 15 of MacBlue muizen Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16]. </li><li> Alternatief genereren fluorescent gelabelde tumoren met orthotope transplantatie van fluorescent gelabelde PyMT tumorcellen (syngene), humane borstkanker cellijnen of primaire humane patiënt afgeleide tumors (xenotransplantaten) 11,17. <ol><li> Implant fluorescent gelabelde PyMT tumorcellen in syngene muizen met fluorescent-gelabelde eiwit myeloïde cellen aan dieren met fluorescent gelabelde tumorcellen en myeloïde cellen 13 gegenereerd. </li></ol></li><li> Injecteer 100 ui van 10 mg / kg TL 70 kDa dextran door ader intraveneuze (iv) staart in ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (SCID) muizen met xenograft tumoren van humane cellijnen of patiënt afgeleide primaire tumoren fluorescent label macrofagen 2 uur voor aanvang van intravitale beeldvorming. </li></ol> 2. Microscoop Setup en Imaging Voorbereiding Opmerking: Deze procedure beschrijft de set-upvoor intravitale beeldvorming op een multiphoton microscoop 8. <ol><li> Zet alle microscoop en laser componenten waaronder twee-foton lasers en detectoren. </li><li> Schakel de verwarmingskast op 30 ° C voorverwarmen het podium. Deze stap is essentieel voor het handhaven van de fysiologische temperatuur van het dier. </li><li> Voor gebruik op een omgekeerde microscoop plaats de op maat gemaakte stadium insert op de microscoop podium. Speciaal inzetstuk is een vel van 1/8 &quot;dik aluminium gefreesd om in de fase inbouwruimte en met een 1&quot; diameter doorgaand gat in het midden voor beeldvorming. <ol><li> Veeg de microscoop podium en het podium insert met 70% ethanol en aan de lucht drogen. </li><li> Zet een grote druppel water op de 20X, 1,05 NA microscoop doelstelling om optisch contact met het deksel glas te handhaven. </li><li> Plaats dekking van glas (# 1,5 dikte) over de imaging-poort op de microscoop podium insert. Vast te zetten met een lab tape. </li><li> Gebruik een perforator om een ​​gat van 2 cm x 2 cm punchin een flexibele rubberen pad en plaats de rubberen strip op de microscoop podium met het gat in het pad in lijn met het gat in de aangepaste stadium insert. </li></ol></li></ol> 3. Voorbereiding van Tail Vein Catheter en reagentia voor injectie tijdens Imaging <ol><li> Snijd een 30 cm lengte van polyetheen (PE) buizen. </li><li> Met behulp van een tang, verplaats de metalen naald van een 31 G naald heen en weer tot het breekt af van de kunststof fitting. </li><li> Met behulp van een tang, plaatst u de stompe einde van de vrijstaande naald in de PE-slang. </li><li> Plaats een 31 G naald in het andere uiteinde van de PE buis. </li><li> Vul een 1 cc injectiespuit met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en steek deze in de 31 G-naald en spoel alle lucht uit de slang en naald met PBS. PBS wordt gebruikt voor het handhaven van hydratatie en bloed osmolariteit 9,18 kunnen echter isotone zoutoplossing worden gebruikt. </li><li> Vul een 1 cc spuit met 200 ul van 3 mg / kg 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine (TMR) Of quantum dots voor vasculaire labeling. </li><li> Stelt andere injecteerbare eiwitten zoals een 165 aminozuren isoform van vasculaire endotheliale groeifactor A (VEGFA 165) in een 1 cc spuit en plaats op ijs. Injecteer 0,2 mg / kg VEGFA 165 19 in een concentratie van 0,05 mg / ml. </li></ol> 4. Het inbrengen van de inwonende Tail Vein Catheter <ol><li> Plaats het dier onder narcose met een inductie kamer met 5% isofluraan met O2 als draaggas. </li><li> Breng de muis om de chirurgische platform zodra het volledig is verdoofd en reageert niet op een teen knijpen. </li><li> Open isofluraananesthesie lijn naar de chirurgische platform, sluit de narcose lijn naar de inductie kamer en plaats de neuskegel op snuit van het dier. Verminder de isofluraan van 5% tot 2,5%. </li><li> Toepassing oogzalf om de ogen van de muis tot droog te voorkomen tijdens de anesthesie. </li><li> Verwarm het dier onder de warmtelampgedurende nog 2 minuten de circulatie in de staart toenemen circulatie vertraagt ​​met diepe anesthesie. </li><li> Steriliseren ader van de muis staart met 70% ethanol. </li><li> Steek de punt van de 31 G naald uit de katheter geconstrueerd in hoofdstuk 3 in de laterale staart van het dier en duw de naald in 2-3 mm. </li><li> Trek op de spuit om bloed te zien, het waarborgen van de katheter wordt geplaatst in de staartader. </li><li> Gebruik een 1 cm lengte van lab tape geplaatst over de naald om de naald op zijn plaats houden parallel aan de ader langs de lengte van de staart. </li></ol> 5. Skin Flap chirurgische ingreep om de borsttumor Expose <ol><li> Met het dier op het platform chirurgische zwabberen de tumor en het ventrale oppervlak met 70% ethanol. Opmerking: Zoals beschreven, is deze procedure niet volledig aseptisch uitgevoerd. Voor lange beeldvorming sessies waarin infectie een verstorende factor kan worden, is het raadzaam om een ​​goede aseptische techniek te gebruiken. </li><li> Met behulp van Sterile tang, til de ventrale huid met een steriele schaar maken een subcutane incisie langs de ventrale middellijn van ongeveer 1 cm. Vermijd het aanprikken van het buikvlies tijdens de incisie. </li><li> Voorzichtig stuurde de bindweefsel vastmaken van de melkklier en tumor van het buikvlies tot de borsttumor bloot. </li><li> Met een schaar en forceps verwijder voorzichtig weggesneden en de fascia en vet van het blootgestelde oppervlak van de tumor met behoud van de integriteit van de tumorvasculatuur en het minimaliseren bloeden. Deze stap is essentieel voor het behoud van de tumor vasculatuur architectuur en levering van de tumor. </li></ol> 6. Animal Voorbereiding voor Microscopie <ol><li> Breng het dier naar een voorverwarmde afbeeldeenheid de blootgestelde tumor geplaatst op het dekglaasje op het podium inzetstuk via microscoopobjectief voor beeldvorming. Zorg ervoor dat de staartader katheter zacht overdracht met het dier om te voorkomen dat de naald los. </li><li> plaats the anesthesie neuskegel op snuit van het dier om anesthesie set tot 3% isofluraan te handhaven. </li><li> Plaats het dier zodat de tumor ligt in het gat van de rubber pad en maakt contact met de glazen dekglaasje. </li><li> Gebruik twee rubberen pads om voorzichtig te houden van de tumor op zijn plaats en zet ze vast aan de microscoop podium met lab tape om beweging te verminderen tijdens beeldacquisitie. </li><li> Vul de kamer van het rubber pad met PBS om het weefsel gehydrateerd en optische contact met de dekglaasje te houden. </li><li> Beginnen met de monitoring vitale functies van het dier met een puls oximeter sonde. Bevestig een clip sensor op de dij van het dier. Alternatief een kraag die is ingericht om rond de hals past kan worden gebruikt. </li><li> Plaats de verwarmingskast op het dier te handhaven 30 ° C 20. </li><li> Langzaam verlagen van het niveau van isofluraan 0,5-1% anesthesie te handhaven en bloedtoevoer verstrekken. </li></ol> 7. Image Acquisition en Injectie van tlent Kleurstoffen en injecteerbare Eiwitten <ol><li> Met het oculair focus op de fluorescerende tumorcellen op het oppervlak van de tumor. </li><li> Selecteer een gebied van belang door het vinden van gebieden met stromend bloedvaten. De selectie van een gebied van belang met vloeiende bloedvaten is essentieel voor de beoordeling van tumorvasculatuur. </li><li> Zodra een regio van belang is geselecteerd schakelt de microscoop in multiphoton imaging-modus. </li><li> Stel de boven- en ondergrens van een z-serie. Stel de bovengrens van de Z-serie met behulp van de focus insteller aan de doelstelling om de gewenste startlocatie te bewegen en te klikken op de Z-positie knop &quot;Top&quot;. Bepaal de bovengrens van de z-serie van het visualiseren collageenvezelnetwerk aan het oppervlak van de tumor in de tweede harmonische generatie (SHG) kanaal en het waarnemen wanneer geen cellen maar collageenvezels zijn zichtbaar. <ol><li> Stel de ondergrens van de z-serie van het doel naar het gewenste beeldvormende diepte (typically 50-150 pm) en op de Z-positie &quot;Bottom&quot; knop. </li><li> Stel de stapgrootte door het intikken van de gewenste waarde in het veld stap grootte. Bepaal stap grootte op basis van overwegingen voor de resolutie en de overname tijd (normaal 2 micrometer wordt gebruikt voor hoge-resolutie 3D-reconstructie en 5 micrometer anderszins). </li></ol></li><li> Stel de time-lapse interval door over te schakelen naar de Time-Lapse paneel en het invoeren van de gewenste verloop tijd in het veld Time-Lapse. Voor een optimale temporele resolutie stelt u de tijd interval op 0 sec voor continue beeldvorming. Opmerking: Voor lange time-lapse imaging is het raadzaam om de tijd interval ingesteld op 10 sec tussen overnames om de doelstelling onderdompeling vloeistof te vullen. </li><li> Zodra de parameters voor de beeldvorming zijn bepaald, injecteer langzaam 155 kDa dextran-TMR. <ol><li> Verwijder de spuit met PBS in de staartader katheter en te vervangen door de spuit met 155 kDa dextran-TMR verzorgen eventuele luchtbellen te introduceren in de line. </li><li> Injecteer langzaam 155 kDa dextran-TMR in de muis, met een maximaal volume van 200 pl, en vervang de spuit met spuit met PBS. Kritische stap: Voer de injectie langzaam en voorzorgsmaatregelen nemen om te voorkomen dat oplossing buiten de ader. </li></ol></li><li> Start de overname van de Z-stack time-lapse imaging door te klikken op de Z-Stack en Time-Lapse knoppen om ze te drukken en vervolgens te klikken op de opnameknop. </li><li> Als er andere fluorescerende dextranen, dat wil zeggen, 10 kDa dextran-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC), of eiwitten, dat wil zeggen, VEGFA 165, zijn van tevoren voorbereid, injecteren ze na de start van het beeld acquisitie voor op = 0 min start. <ol><li> Verwijder de spuit met PBS in de staart ader katheter en te vervangen door de spuit met 10 kDa dextran-FITC of VEGFA 165 verzorgen eventuele luchtbellen te introduceren in de lijn. </li><li> injecteren langzaam injectables in de muis door middel van de staartader katheteren vervang de spuit met een spuit met PBS. </li></ol></li><li> Elke 30-45 min, injecteer langzaam 50 pl PBS of zoutoplossing hydratatie van het dier te handhaven. </li></ol> 8. Euthanasie <ol><li> Bij de beëindiging van het beeld overname, euthanaseren van de dieren. <ol><li> Verhoog de isofluraan tot 5%. </li><li> Houd het dier onder de 5% isofluraan tot 30 seconden nadat het ophoudt te ademen en verwijder het dier van het podium. </li><li> Voeren cervicale dislocatie volledige euthanasie waarborgen. </li></ol></li></ol> 9. Beeldverwerking <ol><li> Acquire beelden bij 16-bit TIFF-bestanden voor elk individueel kanaal op elk tijdstip en op te slaan elkaar. </li><li> Voer scheiding van spectrale overlap (dat wil zeggen, GFP en GVB), eliminatie van xy drift en het genereren van films van time-lapse sequenties met behulp van gevestigde methoden in ImageJ 9. Voer 3D-oppervlak reconstructies van beelden met hoge resolutie 13. </li></ol>

<ol><li>Gerlowski, L. E., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+permeability+of+normal+and+neoplastic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular permeability of normal and neoplastic tissues.</a> Microvasc Res. 31 (3), 288-305 (1986).</li>
<li>Wang, H. -L., Lai, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Evans+blue+quantitation+in+limited+rat+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples.</a> Sci Rep. 4, (2014).</li>
<li>Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rous-Whipple+Award+Lecture.+How+tumors+make+bad+blood+vessels+and+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Rous-Whipple Award Lecture. How tumors make bad blood vessels and stroma.</a> Am J Pathol. 162 (6), 1747-1757 (2003).</li>
<li>Nagy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+properties+of+tumor+surrogate+blood+vessels+induced+by+VEGF-A%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Permeability properties of tumor surrogate blood vessels induced by VEGF-A.</a> Lab Invest. 86 (8), 767-780 (2006).</li>
<li>Egawa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+analysis+of+vascular+permeability+in+mice+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 3, (2013).</li>
<li>Yuan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability+in+a+human+tumor+xenograft%3A+molecular+size+dependence+and+cutoff+size%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and cutoff size.</a> Cancer Res. 55 (17), 3752-3756 (1995).</li>
<li>Dellian, M., Yuan, F., Trubetskoy, V. S., Torchilin, V. P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability+in+a+human+tumour+xenograft%3A+molecular+charge+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability in a human tumour xenograft: molecular charge dependence.</a> Br J Cancer. 82 (9), 1513-1518 (2000).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setup+and+use+of+a+two-laser+multiphoton+microscope+for+multichannel+intravital+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging.</a> Nat Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tumor+cell+movement+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Imaging tumor cell movement in vivo.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter. 19, (2013).</li>
<li>Patsialou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+reveals+multicellular+streaming+as+a+crucial+component+of+in+vivo.+cell+migration+in+human+breast+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo. cell migration in human breast tumors.</a> Intravital. 2 (2), e25294(2013).</li>
<li>Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+classification+links+tumor+microenvironments+with+tumor+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype.</a> PLoS Biol. 12 (11), e1001995(2014).</li>
<li>Roussos, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mena+invasive+%28MenaINV%29+promotes+multicellular+streaming+motility+and+transendothelial+migration+in+a+mouse+model+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer.</a> J Cell Sci. 13, 2120-2131 (2011).</li>
<li>Harney, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Imaging+Reveals+Local%2C+Transient+Vascular+Permeability%2C+and+Tumor+Cell+Intravasation+Stimulated+by+TIE2hi+Macrophage-Derived+VEGFA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA).</a> Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).</li>
<li>Robinson, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+of+metastasis+in+human+breast+carcinoma%3A+a+potential+prognostic+marker+linked+to+hematogenous+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination.</a> Clin Cancer Res. 15, 2433-2441 (2009).</li>
<li>Sasmono, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+macrophage+colony-stimulating+factor+receptor-green+fluorescent+protein+transgene+is+expressed+throughout+the+mononuclear+phagocyte+system+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse.</a> Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).</li>
<li>Ovchinnikov, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Gal4-dependent+transgenes+in+cells+of+the+mononuclear+phagocyte+system+labeled+with+enhanced+cyan+fluorescent+protein+using+Csf1r-Gal4VP16%2FUAS-ECFP+double-transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukcocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice.</a> J Leukcocyte Biol. 83 (2), 430-433 (2008).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+from+human+breast+tumors+are+involved+in+spontaneous+metastases+in+orthotopic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).</li>
<li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> J Vis Exp. (73), (2013).</li>
<li>Weis, S., Cui, J., Barnes, L., Cheresh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+barrier+disruption+by+VEGF-mediated+Src+activity+potentiates+tumor+cell+extravasation+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial barrier disruption by VEGF-mediated Src activity potentiates tumor cell extravasation and metastasis.</a> J Cell Biol. 167 (2), 223-229 (2004).</li>
<li>Wyckoff, J., Gligorijevic, B., Entenberg, D., Segall, J., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Multiphoton+Imaging+of+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo.+Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Multiphoton Imaging of Tumors.</a> In Vivo. Cold Spring Harb Protoc. (10), (2011).</li>
<li>Lathia, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+in+vivo.+evidence+for+tumor+propagation+by+glioblastoma+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Direct in vivo. evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells.</a> PLoS One. 6 (9), e24807(2011).</li>
<li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li>
<li>Dreher, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+vascular+permeability%2C+accumulation%2C+and+penetration+of+macromolecular+drug+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers.</a> J Natl Cancer Inst. 98 (5), 335-344 (2006).</li>
<li>Wyckoff, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+macrophage-assisted+tumor+cell+intravasation+in+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors.</a> Cancer Res. 67 (6), 2649-2656 (2007).</li>
<li>Chittajallu, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo.+cell-cycle+profiling+in+xenograft+tumors+by+quantitative+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo. cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy.</a> Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).</li>
<li>Kedrin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nat Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).</li>
<li>Yano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial-temporal+FUCCI+imaging+of+each+cell+in+a+tumor+demonstrates+locational+dependence+of+cell+cycle+dynamics+and+chemoresponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Spatial-temporal FUCCI imaging of each cell in a tumor demonstrates locational dependence of cell cycle dynamics and chemoresponsiveness.</a> Cell Cycle. 13 (13), 2110-2119 (2014).</li>
<li>Yang, M., Jiang, P., Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+subcellular+multicolor+imaging+of+tumor-host+interaction+and+drug+response+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Whole-body subcellular multicolor imaging of tumor-host interaction and drug response in real time.</a> Cancer Res. 67 (11), 5195-5200 (2007).</li>
<li>Manning, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+reveals+conversion+between+distinct+tumor+vascular+morphologies+and+localized+vascular+response+to+Sunitinib%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging reveals conversion between distinct tumor vascular morphologies and localized vascular response to Sunitinib.</a> Intravital. 2 (1), 24790(2013).</li>
<li>Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+cancer+growth+and+invasion%3A+a+modified+skin-fold+chamber+model%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model.</a> Histochem Cell Biol. 130 (6), 1147-1154 (2008).</li>
<li>Brown, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo.+measurement+of+gene+expression%2C+angiogenesis+and+physiological+function+in+tumors+using+multiphoton+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo. measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy.</a> Nat Med. 7 (7), 864-868 (2001).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Cellulaire interacties die spontaan in de tumor micro-omgeving kan leiden tot veranderingen in motiliteit en tumorcel intravasation. Hoge-resolutie intravitale beeldvorming van levend tumorweefsel maakt de visualisatie van meercellige dynamiek die zeer voorbijgaand 10,13,24 zijn. Eindpunt in vivo testen of time-lapse beelden die met discrete tijdstippen kan essentiële informatie verschaffen over de moleculaire mechanismen van processen in de tumor micro. Intravitale imaging studies zijn gebruikt om p...

Verspreiding van tumorcellen van primaire borsttumor is aangetoond dat niet alleen tumorcellen stromale cellen zoals macrofagen en endotheliale cellen omvatten, maar gastheer. Bovendien tumorvasculatuur met abnormaal verhoogde permeabiliteit 1. Aldus bepalen hoe tumorcellen, macrofagen en endotheelcellen interageren vasculaire permeabiliteit en tumorcel intravasation in de primaire tumor micro mediëren van belang voor het begrip metastase. Inzicht in de kinetiek van vasculaire permeabiliteit, tumorcel intravasation en de onderliggende signaleringsmechanisme van meercellige interacties in de tumor micro kan cruciale informatie bij het ontwikkelen en toediening van anti-kankertherapieën. Het belangrijkste middel van het bestuderen tumor vasculaire permeabiliteit in vivo meten van de extravasculaire kleurstoffen zijn zoals Evans blue 2, hoogmoleculaire dextranen molecuulgewicht (155 kDa)3 en ​​fluorofoor of tracer-geconjugeerde eiwitten (zoals albumine) 4 op vaste tijdstippen na injectie van de kleurstof. De vooruitgang in microscopie, hebben diermodellen en fluorescerende kleurstoffen de visualisatie van cellulaire processen en vasculaire permeabiliteit in levende dieren aanzetten met intravitale microscopie 5. Levende dieren beeldvorming met de overname van statische afbeeldingen of korte time-lapse sequenties over verschillende tijdstippen niet mogelijk is voor het volledig begrip van dynamische gebeurtenissen in de tumor micro 6,7. Inderdaad, statische beeldacquisitie de loop van 24 uur toonde dat de tumorvasculatuur lekt, maar de dynamiek van vasculaire permeabiliteit werd niet waargenomen 6. Aldus langere continue tijd-lapse imaging tot 12 uur vangt de kinetiek van dynamische gebeurtenissen in de tumor micro-omgeving. Dit protocol beschrijft het gebruik van verlengde time-lapse multiphotop intravitale microscopie dynamische meercellige gebeurtenissen in de tumor micro bestuderen. Meerdere celtypes in de tumor micro gelabeld met injecteerbare kleurstoffen of in transgene dieren tot expressie fluorescerende eiwitten. Via een staartader katheter vasculaire kleurstoffen of eiwitten kunnen worden geïnjecteerd na het begin van de beeldvorming kinetische gegevens van meercellige gebeurtenissen in de tumor micro verwerven. Voor live cell imaging de borsttumor wordt belicht door de chirurgische voorbereiding van een huid flap. Beelden werden tot 12 uur met een multifoton microscoop uitgerust met meerdere fotomultiplicatorbuizen (PMT) detectors 8. Door gebruikmaking van geschikte filters, een aftrekking algoritme stelt 4 PMT detectors 5 fluorescentiesignalen in de tumor micro gelijktijdig 9 verwerven. Hoge-resolutie multifoton intravitale microscopie vangt enkele cel resolutie afbeelding van tumor-stroma interacties in de tumor micro-omgeving, wat leidt tot een betere understanding van vasculaire permeabiliteit en tumorcel intravasation 10-13. Specifiek uitgebreid intravitale beeldvorming onthulde sterk gelokaliseerde, voorbijgaande vasculaire permeabiliteit gebeurtenissen die selectief plaatsvinden op plaatsen van interactie tussen een tumorcel, een macrofaag en een endotheelcel (gedefinieerd als de tumor micro van metastase, TMEM 14) 13. Bovendien tumorcel intravasation alleen optreedt bij TMEM en ruimtelijk en temporeel gecorreleerd met vasculaire permeabiliteit 13. Enkele cel resolutie van de dynamiek van deze gebeurtenissen is mogelijk gemaakt door het gebruik van verlengde time-lapse multifoton microscopie van fluorescent gelabelde cellen in de tumor micro-omgeving.

<table><tbody><tr><td>155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1287</td><td>reconstitueer bij 20 mg/ml in 1x PBS</td></tr><tr><td>70 kDa dextran-Texas Red</td><td>Life Technologies</td><td>D-1830</td><td>reconstitueer bij 10 mg/ml in 1x PBS</td></tr><tr><td>10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD10S</td><td>reconstitueer bij 20 mg/ml in 1x PBS</td></tr><tr><td>Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots</td><td>Life Technologies</td><td>Q21561MP</td><td>Verdun 25 µl in 175 µl van 1x PBS voor injectie</td></tr><tr><td>MMTV-PyMT muizen</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2374</td><td></td></tr><tr><td>Csf1r-ECFP muizen (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>26051</td><td></td></tr><tr><td>Csf1r-EGFP muizen</td><td>Jackson Laboratory</td><td>18549</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoethesia (isofluraan)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>50033</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>Zuurstof</td><td>AirTech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml spuit, tuberculine gladde tip</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>30 G x 1 (0.3 mm x 25&nbsp;mm) naald</td><td>BD</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleen micro medisch buisje&nbsp;</td><td>Scientific Commodities Inc</td><td>BB31695-PE/1</td><td>0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D.</td></tr><tr><td>Microscoop dekglas</td><td>Corning</td><td>2980-225</td><td>dikte 1.5, 22 x 50&nbsp;mm</td></tr><tr><td>PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter, software en sensoren</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratoriumtape</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>zachte rubberen pad</td><td>McMaster-Carr</td><td>8514K62</td><td>Ultra-zachte polyurethaan film, 3/16” dik, 12" x 12", 40 Oo durometer, vlakke achterkant</td></tr><tr><td>harde rubberen pad</td><td>McMaster-Carr</td><td>8568K615</td><td>Hoogsterkte neopreen rubber blad 1/4" dik, 12" x 12", 50&nbsp;A durometer</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Olympus</td><td></td><td>De microscoop is een op maat gebouwde twee-laser multifoton microscoop gebaseerd op een Olympus IX-71 standaard met gebruik van een 20X 1.05NA objectieflens.</td></tr><tr><td>7-Punch set</td><td>McMaster-Carr</td><td>3429A12</td><td>1/4" tot 1" Gatdiameter, voor hamergestuurde gat pons</td></tr></tbody></table>

extended time-lapse intravitale imaging van real-time meercellige dynamiek in de tumor micro

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In de tumormicro-omgeving interageren gastheer-stromacellen met tumorcellen om tumorprogressie, angiogenese, tumorceldisseminatie en metastase te bevorderen. Multicellulaire interacties in de tumormicro-omgeving kunnen leiden tot tijdelijke gebeurtenissen, waaronder directionele tumorcelmobiliteit en vasculaire permeabiliteit. Kwantificering van vasculaire permeabiliteit van tumoren heeft vaak eindexperimenten gebruikt om de extravasatie van vasculaire kleurstoffen te meten. Echter, vanwege de tijdelijke aard van multicellulaire interacties en vasculaire permeabiliteit, kunnen de kinetiek van deze dynamische gebeurtenissen niet worden onderscheiden. Door cellen en vaatwerk te labelen met injecteerbare kleurstoffen of fluorescerende eiwitten, heeft intravitale microscopie met hoge resolutie en time-lapse de directe, real-time visualisatie van tijdelijke gebeurtenissen in de tumormicro-omgeving mogelijk gemaakt. Hier beschrijven we een methode voor het gebruik van multifotonmicroscopie om uitgebreide intravitale beeldvorming bij levende muizen uit te voeren om multicellulaire dynamica in de tumormicro-omgeving direct te visualiseren. Deze methode beschrijft cellulaire labelstrategieën, de chirurgische voorbereiding van een mammaire huidflap, de toediening van injecteerbare kleurstoffen of eiwitten door katheterisatie van de staartader en de acquisitie van time-lapse beelden. De time-lapsesequenties die met deze methode worden verkregen, vergemakkelijken de visualisatie en kwantificering van de kinetiek van cellulaire gebeurtenissen van mobiliteit en vasculaire permeabiliteit in de tumormicro-omgeving.

Uitgebreide time-lapse intravitale microscopie maakt enkele cel resolutie beeldvorming van meercellige processen in de tumor micro. Door fluorescent labeling tumorcellen, macrofagen, het vaatsysteem, en visualiseren van de collageenvezelnetwerk met de frequentieverdubbeling signaal worden meerdere compartimenten in de tumor micro gelijktijdig gevolgd tijdens de beeldvorming. Tumorcellen gelabeld met fluorescente proteïnen kunnen worden geproduceerd in transgene muizen zoals in MMTV-PyMT-...

Dit protocol beschrijft het gebruik van multiphoton microscopie tot uitgebreide time-lapse beeldvorming van meercellige interacties uit te voeren in real time, in vivo bij enkele resolutie cel.

Extended Time-lapse intravitale Imaging van Real-time Meercellige Dynamiek in de tumor micro

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Het algemene doel van deze procedure is om de dynamische gebeurtenissen binnen de tumormicro-omgeving te visualiseren via hoogresolutie, intravitale multifotonmicroscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de tumormicro-omgeving, zoals welke dynamische gebeurtenissen betrokken zijn bij vasculaire permeabiliteit en multicellulaire interacties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de kinetiek van de gebeurtenissen in de tumormicro-omgeving kan worden waargenomen en gemeten.Schakel vóór aanvang van de procedure alle microscoop- en lasercomponenten in, inclusief de tweefotonlasers en de detectoren. Stel de verwarmingskast in op 30 °C om de objecttafel voor te verwarmen. Reinig de objecttafel van de microscoop en de houder van de objecttafel met 70% ethanol.Wanneer de tafel droog is, breng een grote druppel water aan op het 25 x 1,05 NA microscoopobjectief om optisch contact met het dekglas te behouden en plaats een dekglas met een dikte van nummer 1,5 over de poort voor beeldvorming van de insert. Snijd vervolgens een stuk polyethyleenslang van 30 centimeter af. Plaats het rubberen kussen bovenop het dekglas.Breek met een pincet een naald v

extended-time-lapse-intravital-imaging-real-time-multicellular

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Wij presenteren een nieuwe benadering voor nanodeeltjes lokalisatie kwantificeren in het vaatstelsel van de menselijke xenografted tumoren met behulp van dynamische, real-time intravitale beeldvorming in een aviaire embryo model.

Evaluatie van de Nanodeeltje Opname in Tumoren in real time via intravitale Imaging

We beschrijven een werkwijze voor beeldvorming respons op...

Leef Imaging van de Drug antwoorden in de tumor micro-omgeving in muismodellen van Kanker van de Borst

De extracellulaire matrix ondergaat ingrijpende verbouwing tijdens de wondgenezing, ontsteking en het ontstaan ​​van tumoren. Wij presenteren een nieuwe intravitale immunofluorescentie microscopie benadering van de dynamiek van fibrillaire en mesh-achtige matrix componenten met hoge ruimtelijke en temporele resolutie met behulp van epifluorescentie of twee-foton microscopie visualiseren.

Langdurige Intravitale Immuunfluorescentie beeldvorming van Tissue Matrix Bestanddelen met Epifluorescentie en twee-foton microscopie

Beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige werkwijze voor ex vivo beeldvorming van levende het tumorcel-stroma interacties binnen longmetastasen, gebruik fluorescente reporters in muizen. Gebruik draaiende schijf confocale microscopie Deze techniek maakt visualisatie van levende cellen gedurende ten minste 4 uur en kan worden aangepast om andere inflammatoire longaandoeningen bestuderen.

Ex vivo Live-Imaging van Lung metastase en hun Microenvironment

Dit protocol beschrijft het gebruik van multifotonmicroscopie om longtermijn, hoog-resolutie, enkelcellimago van de intacte long in real time uit te voeren met behulp van een vacuüm gestabiliseerd beeldvormingsvenster.

Langdurig High-Resolution intravitale microscopie in de long met een vacuüm gestabiliseerd Imaging Window

Dit protocol beschrijft de intravital beeldvorming van transgene muizen uiting van cel-specifieke fluorescente markeringen. Intravital imaging biedt een niet-invasieve methode voor hoge resolutie waarnemingen in levende dieren met behulp van implanteerbare windows waardoor de microscopische visualisatie van de processen mogelijk is. Deze methode is vooral handig om longitudinale processen te bestuderen.

Intravital microscopie van Tumor-geassocieerde therapieën met behulp van geavanceerde dorsale huidplooien venster Chambers op transgene fluorescerende muizen

Hier beschrijven we een methode voor High-Resolution time-lapse multiphoton Imaging van hersentumor cellen voor en na invasieve chirurgische ingrepen (bijv. biopsie) binnen hetzelfde levende dier. Deze methode maakt het bestuderen van de impact van deze invasieve chirurgische ingrepen op tumorcellen ' migratie, invasief, en proliferatief gedrag op een enkel celniveau.

Longitudinale Intravital beeldvorming van hersen tumor Celgedrag in reactie op een invasieve chirurgische biopsie

We beschrijven twee methoden voor het beoordelen van voorbijgaande vasculaire permeabiliteit geassocieerd met tumor micro omgeving van metastasen (tmem) deuropening functie en kankercel intravasatie met behulp van intraveneuze injectie van hoog-moleculair gewicht (155 kDa) dextran bij muizen. De methoden omvatten intravital beeldvorming in levende dieren en vaste weefsel analyse met behulp van immunofluorescentie.

Beoordeling van tumor Microenvironment van metastasen doorway-gemedieerde vasculaire permeabiliteit geassocieerd met kanker cel verspreiding met behulp van Intravital beeldvorming en vaste weefsel analyse

We beschrijven een methode om GFP-gelabeld γδ IELs met behulp van intravital Imaging van muizen dunne darm te visualiseren door omgekeerde spinnen schijf confocale microscopie. Deze techniek maakt het bijhouden van levende cellen in het slijmvlies voor maximaal 4 uur en kan worden gebruikt om een verscheidenheid van intestinale immuun-epitheel interacties te onderzoeken.

Intravital beeldvorming van epitheliale lymfocyten in muizen dunne darm

De rekrutering van leukocyten en bloedplaatjes vormt een essentieel onderdeel dat nodig is voor de effectieve groei van collaterale slagaders tijdens arteriogenese. Multifotonenmicroscopie is een efficiënt hulpmiddel voor het volgen van celdynamica met een hoge spatio-temporele resolutie in vivo en minder fototoxiciteit om leukocytenrekrutering en extravasatie tijdens arteriogenese te bestuderen.

Multifoton intravitale beeldvorming voor het monitoren van leukocytenrekrutering tijdens arteriogenese in een Murine Hindlimb-model

De hier beschreven intravitale beeldvormingsmethode maakt gebruik van collageen tweede harmonische generatie en endogene fluorescentie van de metabole co-factor NAD (P) H om een niet-invasieve tumormicro-omgeving te segmenteren in tumor-, stromale en vasculaire compartimenten voor diepgaande analyse van 4D intravitale beelden.

Een labelvrije segmentatiebenadering voor intravitale beeldvorming van de micro-omgeving van borsttumoren

Leer intravitaal multiphotonmicroscopie voor het visualiseren van dynamische gebeurtenissen in de tumor-micro-omgeving met enkele-celresolutie. Deze methode maakt real-time metingen van vasculaire permeabiliteit en multicellulaire interacties mogelijk.

Extended Time-lapse intravitale Imaging van Real-time Meercellige Dynamiek in de tumor micro

Meer video's verkennen