Name: Stamcel-Based Engineered immuniteit tegen HIV infectie in het gehumaniseerde muismodel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Leer hoe je een gehumaniseerd BLT-muismodel bouwt met geïntegreerde immuniteit tegen HIV-infectie. Deze methode maakt preklinisch testen van stamceltherapieën mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen mevrouw Jessica Selander bedanken voor haar artistieke assistentie bij het maken van onze figuren. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de NIAID/NIH, subsidienummer RO1AI078806, het UCLA Center for AIDS Research (CFAR), subsidienummer P30AI28697, het California Institute for Regenerative Medicine, subsidienummer TR4-06845, de American Federation for AIDS Research (amfAR), subsidienummer #108929-54-RGRL, en het UC Multi-campus Research Program and Initiatives, California Center for Antiviral Drug discovery (CCADD)

<ol><li>Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLT+humanized+mice+as+a+small+animal+model+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+virology%22%5BJournal%5D)">BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection.</a> Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).</li>
<li>Zhen, A., Kitchen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-based+gene+therapy+for+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-based gene therapy for HIV infection.</a> Viruses. 6 (1), 1-12 (2014).</li>
<li>Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+and+SIV+CTL+escape%3A+implications+for+vaccine+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design.</a> Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).</li>
<li>Kitchen, S. G., Bennett, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Antigen-Specific+T+Cells+from+Genetically+Modified+Human+Hematopoietic+Stem+Cells+in+Immunodeficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Engineering Antigen-Specific T Cells from Genetically Modified Human Hematopoietic Stem Cells in Immunodeficient Mice.</a> PloS one. 4 (12), e8208(2009).</li>
<li>Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+and+SIV+CTL+escape%3A+implications+for+vaccine+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design.</a> Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).</li>
<li>Kitchen, S. G. S., Levin, B. R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+suppression+of+HIV+by+antigen+specific+T+cells+derived+from+engineered+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">In vivo suppression of HIV by antigen specific T cells derived from engineered hematopoietic stem cells.</a> PLoS Pathogens. 8 (4), e1002649(2012).</li>
<li>Yang, O. O., Tran, A. C., Kalams, S. A., Johnson, R. P., Roberts, M. R., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysis+of+HIV-1-infected+cells+and+inhibition+of+viral+replication+by+universal+receptor+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Lysis of HIV-1-infected cells and inhibition of viral replication by universal receptor T cells.</a> PNAS. 94 (21), 11478-11483 (1997).</li>
<li>Zhen, A., Kamata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-specific+Immunity+Derived+From+Chimeric+Antigen+Receptor-engineered+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">HIV-specific Immunity Derived From Chimeric Antigen Receptor-engineered Stem Cells.</a> Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).</li>
<li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+Antigen+Receptor+Therapy+for+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65 (1), 333-347 (2014).</li>
<li>Pejchal, R., Doores, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Potent+and+Broad+Neutralizing+Antibody+Recognizes+and+Penetrates+the+HIV+Glycan+Shield%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Potent and Broad Neutralizing Antibody Recognizes and Penetrates the HIV Glycan Shield.</a> Science. 334 (6059), 1097-1103 (2011).</li>
<li>Caskey, M., Klein, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viraemia+suppressed+in+HIV-1-infected+humans+by+broadly+neutralizing+antibody+3BNC117%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Viraemia suppressed in HIV-1-infected humans by broadly neutralizing antibody 3BNC117.</a> Nature. 522 (7557), 487-491 (2015).</li>
<li>West, A. P., Scharf, L., Scheid, J. F., Klein, F., Bjorkman, P. J., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+on+the+role+of+antibodies+in+HIV-1+vaccine+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural insights on the role of antibodies in HIV-1 vaccine and therapy.</a> Cell. 156 (4), 633-648 (2014).</li>
<li>Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+functional+human+immune+system+in+immunodeficient+mice+through+combined+human+fetal+thymus%2Fliver+and+CD34%2B+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation.</a> Blood. 108 (2), 487-492 (2006).</li>
<li>Melkus, M. W., Estes, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+mount+specific+adaptive+and+innate+immune+responses+to+EBV+and+TSST-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1.</a> Nature medicine. 12 (11), 1316-1322 (2006).</li>
<li>Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+for+immune+system+investigation%3A+progress%2C+promise+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges.</a> Nature Reviews: Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).</li>
<li>Vatakis, D. N., Bristol, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+BLT+humanized+mouse+as+a+stem+cell+based+gene+therapy+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using the BLT humanized mouse as a stem cell based gene therapy tumor model.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (70), e4181(2012).</li>
<li>De Rosa, S. C., Brenchley, J. M., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+six+colors%3A+a+new+era+in+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Beyond six colors: a new era in flow cytometry.</a> Nature medicine. 9 (1), 112-117 (2003).</li>
<li>Shimizu, S., Hong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+short+hairpin+RNA+potently+down-regulates+CCR5+expression+in+systemic+lymphoid+organs+in+the+hu-BLT+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model.</a> Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).</li>
<li>Denton, P. W., Olesen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+HIV+latency+in+humanized+BLT+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Generation of HIV latency in humanized BLT mice.</a> Journal of virology. 86 (1), 630-634 (2012).</li>
<li>Zhou, J., Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryoid+bodies+formation+and+differentiation+from+mouse+embryonic+stem+cells+in+collagen%2FMatrigel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Embryoid bodies formation and differentiation from mouse embryonic stem cells in collagen/Matrigel scaffolds.</a> Journal of Genetics and Genomics. 37 (7), 451-460 (2010).</li>
<li>Vatakis, D. N., Arumugam, B., Kim, S. G., Bristol, G., Yang, O., Zack, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+Exogenous+T-cell+Receptors+Into+Human+Hematopoietic+Progenitors+Results+in+Exclusion+of+Endogenous+T-cell+Receptor+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Introduction of Exogenous T-cell Receptors Into Human Hematopoietic Progenitors Results in Exclusion of Endogenous T-cell Receptor Expression.</a> Molecular Therapy. 21 (5), 1055-1063 (2013).</li>
<li>Ito, R., Takahashi, T., Katano, I., Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+humanized+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Current advances in humanized mouse models.</a> Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 208-214 (2012).</li>
<li>Martinez-Torres, F., Nochi, T., Wahl, A., Garcia, J. V., Denton, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypogammaglobulinemia+in+BLT+humanized+mice--an+animal+model+of+primary+antibody+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Hypogammaglobulinemia in BLT humanized mice--an animal model of primary antibody deficiency.</a> PloS one. 9 (10), e108663(2014).</li>
<li>McCune, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+the+SCID-hu+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development and applications of the SCID-hu mouse model.</a> Seminars in Immunology. 8 (4), 187-196 (1996).</li>
<li>Srivastava, S., Riddell, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+CAR-T+Cells%3A+Design+Concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Engineering CAR-T Cells: Design Concepts.</a> Trends in immunology. 36 (8), (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Met CAR en HSC-gebaseerde engineered immuniteit stroomversnelling naar klinische studies, is het belangrijk om een ​​goede diermodel zorgvuldig worden afgewogen differentiatie en functie van deze gemanipuleerde cellen. In dit protocol beschrijven we de methoden voor de bouw en het testen van vermenselijkte muizen met genetisch gemodificeerde stamcellen engineered tegen HIV. Het is belangrijk om efficiënte transductie van stamcellen voorafgaand aan transplantatie. Vanwege het vermogen van T-cellen te prolifereren bij her...

Ondanks het succes van gecombineerde anti-retrovirale therapie, HIV-infectie blijft een levenslange aandoening. De cellulaire immuunrespons tegen HIV speelt zeer belangrijke rol bij de controle van HIV-replicatie. Recente ontwikkelingen in stamcellen manipulatie toegestaan ​​voor de snelle ontwikkeling van gentherapie benaderingen voor behandeling van HIV 1-3. Dientengevolge is het belangrijk om een goede diermodel waarmee in vivo studie van de effectiviteit van celgebaseerde therapieën tegen HIV. Die met HIV in diermodellen is gecompliceerd door het feit dat het virus infecteert alleen menselijke cellen. Om deze beperking te omzeilen, hebben wetenschappers hun toevlucht tot het gebruik van de ziekte van modellen zoals de Simian Immunodeficiency Virus (SIV) bij Rhesus makaken 4,5. Helaas zijn er grote beperkingen in dit model te wijten aan de inherente verschillen tussen de soorten en de verschillen tussen SIV en HIV. Daarnaast zijn er slechts zeer gespecialiseerde faciliteiten capable ondersteuning van het werk met niet-menselijke primaten en elke makaak vergt een grote investering. Aldus, is er dringend behoefte aan een model dat het menselijke immuunsysteem, dat gevoelig is voor HIV-infectie / pathogenese gebruikt en minder financieel onbetaalbaar. De niet-obese diabetische (NOD) -severe gecombineerde immuundeficiënte (SCID) -gezamenlijke gammaketen knockout (c γ - / -) (of NSG) Blood / Liver / Thymus (BLT) gehumaniseerd muismodel steeds bewezen als een belangrijk instrument HIV-infectie te bestuderen. Door het implanteren van hematopoietische stamcellen (HSC) en foetale thymus, de muizen in staat zijn om te ontwikkelen en te herhalen een menselijk immuunsysteem 1-3. Een type stamcel gentherapie behelst &#39;ombuigen perifere T-cellen targeten HIV door herprogrammering hematopoëtische stamcellen (HSC) te differentiëren tot antigeen-specifieke T-cellen. We hebben eerder aangetoond dat techniek HSCs met een moleculair gekloneerde anti-HIV-specifieke T cel rereceptor (TCR) tegen SL9 epitoop (aminozuren 77-85, SLYNTVATL) van HIV-1 Gag kunnen stamcellen te sturen naar de vorming van rijpe T-cellen die HIV replicatie in de gehumaniseerde NSG-BLT muismodel 6 onderdrukken. Het nadeel van het gebruik van een moleculair gekloneerd TCR is dat het beperkt is tot een specifiek humaan leukocyt antigeen (HLA) subtype dat de toepassing van deze therapie wordt beperkt. Chimere antigeenreceptoren (CAR), anderzijds, kan universeel toegepast op alle HLA-subtypes. Initiële studies werden uitgevoerd onder toepassing van een CAR geconstrueerd met de extracellulaire en transmembrane domeinen van humaan CD4 gefuseerd aan het intracellulaire signalering ζ domein van CD3 (aangeduid als de CD4ζCAR). CD4ζCAR expressie op CD8 T-cellen kunnen herkennen HIV envelop en leiden tot een cytotoxische T-celreactie die vergelijkbaar is met die gemedieerd wordt door een T-celreceptor 7. We hebben onlangs aangetoond dat humane HSCs instelbaar onder CD4ζCAR, die vervolgens kunnen differentiëren in verschillende hematopoietische lineages, waaronder functionele T-cellen kunnen onderdrukken HIV replicatie in de gehumaniseerd muismodel 8. Met de snelle vooruitgang in chimeer antigen receptor therapieën voor kanker 9 en de verdere karakterisering van potente breed neutraliserende antilichamen tegen HIV 10-12 dat de constructie van enkelketenige antilichamen CARs mogelijk is waarneembaar dat vele nieuwe kandidaat constructen naast CD4ζCAR , wordt gegenereerd en getest op stamcel gebaseerde gentherapie van HIV ziekten en andere ziekten. Daarnaast kan de gehumaniseerde NSG-BLT muismodel die deze antigeen-specifieke voertuigen ook een nuttig instrument een grondig onderzoek in de humane T cel responsen in vivo. Belangrijker ons protocol verschilt van eerdere werkwijzen beschreven voor de constructie van gehumaniseerde van BLT muizen 13-15, dat de HSCs in gelatineuze eiwitmengsel wordt gebruikt in plaats van foetale lever stammen 16. Dit protocol beschrijft: 1) de bouw van humanized BLT gemanipuleerde muizen met CD4ζCAR; en 2) karakterisering van de differentiatie van de genetisch gemodificeerde cellen; en 3) karakterisering van de functionaliteit van de genetisch gemodificeerde cellen.

```html
<table><tbody><tr><td>CD34 microbead kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-046-702</td><td>Voor het sorteren van humane CD34+ progenitorcellen</td></tr><tr><td>Bambanker</td><td>Wako</td><td>302-14681</td><td>Voor het invriezen van cellen</td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td>Voor het meten van virale belasting in het serum</td></tr><tr><td>MACSQuant Flow Cytometer</td><td>Miltenyi</td><td></td><td>Voor flowanalyse</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa&trade;</td><td>BD biosciences</td><td></td><td>Voor flowanalyse</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>H6254-500MG&nbsp;</td><td>Voor weefseldigeratie</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Worthington</td><td>LS002006&nbsp;</td><td>voor weefseldigeratie</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Life technology</td><td>17104-019&nbsp;</td><td>voor weefseldigeratie</td></tr><tr><td>CFX Real time PCR detectiesysteem</td><td>Biorad</td><td></td><td>Voor het meten van virale belasting en genexpressie</td></tr><tr><td>Muizen, stam NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td>Voor het construeren van de gehumaniseerde muizen</td></tr><tr><td>Penicilline Streptomycine (Pen Strep)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10378016</td><td>Voor het kweken van cellen</td></tr><tr><td>Piperacillin/tazobactam</td><td>Pfizer</td><td>Zosyn</td><td>Anti-fungaal</td></tr><tr><td>Amphotericin B (Fungizone antischimmelmiddel)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15290-018</td><td>Anti-fungaal</td></tr><tr><td>Autoclip Wondclips, 9 mm - 1.000 eenheden</td><td>Becton Dickinson</td><td>427631&nbsp;</td><td>Voor chirurgie</td></tr><tr><td>Steriele Poly-versterkte Aurora chirurgische jasjes, 30 per verpakking&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Medline</td><td>DYNJP2707&nbsp;</td><td>Voor chirurgie</td></tr><tr><td>Hechtdraad, 4-0, vicryl&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Owens and Minor</td><td>23000J304H&nbsp;&nbsp;</td><td>Voor chirurgie</td></tr><tr><td>Alcohol prep pads&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Owens and Minor</td><td>3583006818</td><td>Voor chirurgie</td></tr><tr><td>Chirurgische handschoenen, 6 1/2</td><td>Owens and Minor</td><td>4075711102</td><td>Voor chirurgie</td></tr><tr><td>Yssel&rsquo;s serumvrij T-cell medium</td><td>Gemini Bio-products</td><td>400-102</td><td>Voor CD34+ celtransductie</td></tr><tr><td>Humaan Serum Albumine&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9511</td><td>Voor CD34+ celtransductie</td></tr></tbody></table>
```

stamcel-based engineered immuniteit tegen hiv infectie in het gehumaniseerde muismodel

Stem-cell Based Engineered Immunity Against HIV Infection in the Humanized Mouse Model

Met de snelle ontwikkeling van stamcel-gebaseerde gentherapieën tegen HIV, er dringende taak een diermodel om de hematopoëtische differentiatie en het immuunsysteem van de genetisch gemodificeerde cellen te bestuderen. Het gehumaniseerde beenmerg / Liver / Thymus (BLT) muismodel maakt volledige reconstructie van een menselijk immuunsysteem in de omtrek, die T-cellen, B-cellen, NK-cellen en monocyten omvat. De menselijke thymus implantaat worden ook thymus selectie van T-cellen autologe thymusweefsel. Naast de studie van HIV-infectie, het model staat als een krachtig hulpmiddel om differentiatie, ontwikkeling en functionaliteit van cellen afkomstig van hematopoietische stamcellen (HSCs) te bestuderen. Hier beschrijven we de constructie van gehumaniseerde niet-obese diabetische (NOD) -severe gecombineerde immuundeficiënte (SCID) -gezamenlijke gammaketen knockout (c γ - / -) -Bone merg / Liver / Thymus (NSG-BLT) muizen met HSCs getransduceerd met CD4 chimere antigen receptor (CD4CAR)lentivirus vector. We laten zien dat de CD4CAR HSCs succes kunnen differentiëren in meerdere lijnen en anti-HIV-activiteit. Het doel van de studie is het gebruik van NSG-BLT muismodel als een in vivo model van technisch immuniteit tegen HIV te tonen. Het is vermeldenswaard dat, omdat lentivirus en menselijk weefsel wordt gebruikt, experimenten en operaties moeten worden uitgevoerd in een klasse II bioveiligheid kast in een Biosafety Level 2 (BSL2) met speciale voorzorgsmaatregelen (BSL2 +) faciliteit.

Figuur 1 toont een overzicht van het construeren humanized BLT muizen met gemodificeerde stamcellen. 10 weken na de implantatie werden de muizen gedood om de differentiatie en ontwikkeling van genetisch gemanipuleerde cellen te evalueren. Zoals getoond in figuur 2, zijn meerdere lymfoïde weefsel (bloed, milt, thymus en beenmerg) geoogst uit een muis die was gemodificeerd met CD4ζCAR. De CD4ζCAR gebruikt in dit protocol bevat CD4 chimere antigen receptor ...

Dit protocol beschrijft de methoden voor het construeren van een gehumaniseerd muismodel voor beenmerg/lever/thymus met stamcelgebaseerde geëngineerde immuniteit tegen HIV-infectie.

Stamcel-Based Engineered immuniteit tegen HIV infectie in het gehumaniseerde muismodel

With the rapid development of stem cell-based gene therapies against HIV, there is pressing requirement for an animal model to study the hematopoietic ...

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van gehumaniseerde muizen die zijn gemodificeerd met een chimeer antigeenreceptor. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de velden van HIV en immunologie met betrekking tot het testen van de effectiviteit van stamcelgebaseerde engineered immuniteit tegen HIV-infectie en andere chronische infecties en maligniteiten. Denk hierbij aan het mechanisme van immuunfalen en manieren om het immuunsysteem te versterken en een therapie te ontwikkelen om een betere antivirale of antitumorale immuniteit te creëren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze een grote hoeveelheid experimentele manipulaties mogelijk maakt. Het gehumaniseerde BLT-muismodel imiteert de menselijke immuniteit en maakt in dit geval preklinische testen mogelijk voor celgebaseerde gentherapieën tegen HIV-infectie. De procedure zal worden gedemonstreerd door Valerie Rezek en Brianna Lam, technici uit mijn laboratorium.Begin met het snijden van de thymus in kleine stukjes van ongeveer één millimeter kubiek met scalpels in een schaal met aangevuld RPMI-medium. Gebruik vervolgens gebogen stompe pincetten om elk afzonderlijk stukje thymus in een enkele put van een 96-wellplaat te plaatsen. Voeg 100-200 µL medium toe aan alle putjes om te voorkomen dat het weefsel uitdroogt.Visualiseer het weefsel onder de microscoop om weefsel te verwijderen dat geen thymus is of waaraan bindweefsel vastzit. Verwijder vervolgens de bevestigde stukjes thymus en voeg deze samen in een T25-celkweekfles. Voeg zeven milliliters antibioticum-gesupplementeerd RPMI-medium toe aan de fles en schud voorzichtig om te mengen.Plaats de fles vervolgens in de weefselkweekincubator. Deze stap voorkomt bacteriële contaminatie van het weefsel. Begin de isolatie van CD34-positieve HSC's uit foetale lever door de lever met twee scalpels in kleine stukjes van ongeveer drie millimeter kubus te snijden in een schaal met IMDM.Verwijder en gooi al het witte bindweefsel weg. Gebruik vervolgens een spuit van 10 milliliter voorzien van een stompe naald van 16 gauge om de leverstukjes en het medium op te nemen en over te brengen naar een conische buis van 50 milliliter. Trek de vloeistof voorzichtig vijf tot zeven keer op en spuit deze weer uit om het weefsel volledig te homogeniseren.Nadat 10 milliliter IMDM-medium is bereid, wordt dit aangevuld met collagenase, hyaluronidase, antibiotica, Dnase en antimycotica. Filtreer het medium door een 0,22 micron filter. Voeg vervolgens het gefilterde medium toe aan de leversuspensie.Nadat de 50 milliliter conische buis met de leversuspensie is afgesloten, dient deze stevig te worden verzegeld met zelfafdichtende folie, zoals parafilm, om lekken te voorkomen. Roteer de buis gedurende 90 minuten in een buisrotator in de incubator bij 37 degrees celsius. Filter na de incubatie de gedigereerde celsuspensie door een 100 micron celzeef in een nieuwe 50 milliliter buis.Voeg PBS toe aan de suspensie om het totale volume aan te vullen tot 50 milliliters. Verdeel dit over twee 50 milliliter buizen, elk met 25 milliliters cel-suspensie. Leg de cellen in elke buis langzaam en voorzichtig onder met 10 milliliters van een medium voor dichtheidscentrifugatie, zoals Ficoll.Centrifuge 20 minuten bij 1200 ×g zonder pauze. Verwijder na de centrifugatie voorzichtig de interface uit elke buis en breng deze over in twee aparte buizen van 50 milliliter. Vul het volume van elke buis met interface aan tot 50 milliliter met PBS.Centrifuge vervolgens bij 300 ×g gedurende zeven tot 10 minuten. Combineer de celpellets en was deze drie keer met 50 milliliters PBS met twee procent FBS, waarbij elke keer gecentrifugeerd wordt bij 300 ×g gedurende zeven tot 10 minuten. Resuspendeer de pellet na de laatste centrifugeerstap in 50 milliliters RPMI-medium met 10 procent FBS.Tel de cellen met een hemocytometer. Sorteer vervolgens onmiddellijk de CD34-positieve cellen met een CD34-sorteerkit volgens het protocol van de fabrikant, en bewaar zowel de CD34-positieve als de CD34-negatieve fractie. Giet de thymusstukjes en het medium vanuit de kolf in een schaal van 60 millimeter.Koel enkele positive displacement pipetpunten af door ze in open steriele schroefdopbuisjes van 1,5 milliliter op ijs te plaatsen. Plaats daarnaast de celpellets en een volume van een gelatinair eiwitmengsel, zoals matrigel, op ijs. Anestheseer de ontvangende muizen met een injecteerbaar anestheticum volgens een goedgekeurd dierprotocol.Controleer het anesthesieniveau van de muis door in een pootje te knijpen. De afwezigheid van een reactie op de knijpbeurt duidt op een chirurgisch vlak van anesthesie. Scheer de linkerkant van elke muis van de heup tot de schouder, tussen het midden van de rug en de buik.Injecteer subcutaan zes milligram per kilogram verdund Carprofen in de schouder of de inguinale driehoek van het dier. Spoel de canule van de trocar door met PBS in een schaal van 60 millimeter. Plaats met een stompe gebogen pincet een stukje thymus uit de schaal van 60 millimeter net binnen de opening van de canule en trek vervolgens de trocar terug om het weefsel in de canule te aspireren.Gebruik vervolgens een positive-displacement pipet en een gekoelde tip om vijf µL van het koude gelatineuze eiwitmengsel in de buis met het celpellet toe te voegen. Roer voorzichtig om de celsuspensie te vormen. Pipetteer de celsuspensie in de opening van de canule en trek langzaam aan de trocart om de naald te vullen.Veeg het geschoren gebied van de muis drie keer af met povidonjodium gevolgd door isopropenyl. Bepaal het donkerste punt onder de huid, wat de locatie van de milt aangeeft. De nier bevindt zich ongeveer vijf millimeter dorsaal ten opzichte van de milt.Nadat een geschikt anesthesieniveau is bevestigd door de afwezigheid van een reactie op een knijpreflex van de poot, worden gebogen pincetten gebruikt om de huid op te tillen en een chirurgische schaar om een incisie van 15 millimeter in de huid te maken, parallel aan de milt. Maak vervolgens een soortgelijke snede in de onderliggende peritoneumlaag. Bij mannetjes is de nier gemakkelijk zichtbaar en kan deze simpelweg worden geëxtrudeerd door op de buik te drukken.Steun de nier met een hemostat of een paar gebogen stompe pincetten. Bij vrouwtjes blokkeren de eierstokken vaak de eenvoudige extractie van de nier. Pak de eierstok op met een hemostat en leg de nier voorzichtig bloot.Gebruik pincetten met naaldpunt om een klein gaatje in het posterieure uiteinde van het nierkapsel te maken. Schuif de trocart in dit gaatje en langs de nier tot de opening van de canule volledig door het nierkapsel wordt bedekt. Pers het weefsel onder het nierkapsel voorzichtig naar buiten en trek de trocart vervolgens weer terug.Gebruik de gebogen pincet om ervoor te zorgen dat het stukje thymus niet samen met de naald weer naar buiten komt. Til vervolgens het peritoneum op met de pincet en gebruik de hemostaat voorzichtig om de nier terug op zijn plaats te duwen. Zet één dubbele knoopsteek met chirurgisch hechtmateriaal in het peritoneum.Plaats daarnaast twee Autoclips wondklemmen om de huid te sluiten. Meng nu de getransduceerde CD34-positieve cellen en aspireer 0,5 × 10⁶ cellen in een volume van 100 µL in een insulinespuit. Injecteer deze cellen in de muis via een retro-orbitale vene-injectie.Breng na de injectie met een wattenstaafje een kleine druppel oogsmeermiddel aan in elk oog en leg de muis op zijn zij terug in een kooi. Bevestig na het implanteren van alle muizen dat de dieren weer bij bewustzijn zijn en kunnen lopen voordat ze terugkeren naar de verblijfruimte. De muizen werden 10 weken na de operatie geofferd, waarna bloed, milt, thymus en beenmerg werden geoogst.De resulterende cellen werden gekleurd met anti-humane CD45- en anti-humane CD4-antilichamen en geanalyseerd via flowcytometrie. Zoals hier te zien is, kunnen cellen die zijn gemodificeerd met een CD4-chimere antigeenreceptor in meerderelymfatische weefsels worden gedetecteerd via flowcytometrie. De cellen die zijn gemodificeerd met de CD4-chimere antigeenreceptor kunnen differentiëren in meerdere lineages.Hier zijn splenocyten van CD4 chimere antigeenreceptor-gemodificeerde muizen geoogst en gekleurd voor markers van T- en B-cellen. Cellen die negatief waren voor T- en B-celmarkers waren positief voor markers van monocyten en macrofagen en voor natural killer-cellen. Splenocyten van HIV-geïnfecteerde CD4 chimere antigeenreceptor-muizen werden gestimuleerd met ofwel HIV-geïnfecteerde of niet-geïnfecteerde T-cellen, en hun intracellulaire productie van cytokinen wordt getoond.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u gehumaniseerde BLT-muizen construeert die zijn gemodificeerd met chimere antigeenreceptoren. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in 48 uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om in een gestaag tempo te werken en nauwgezet aandacht te besteden aan de toestand van de muis waarop wordt geopereerd.Voor beginners is het belangrijk om chirurgie en ooginjecties te oefenen voordat er wordt gewerkt met weefsels en stamcellen die kostbaarder zijn. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van hiv en andere infectieziekten om de pathogenese van ziekten en immuungebaseerde therapieën in het gehumaniseerde muismodel te onderzoeken.

stem-cell-based-engineered-immunity-against-hiv-infection-humanized

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Het genereren en karakteriseren van tumorspecifieke T-cellen met gehumaniseerde muizen wordt hier beschreven. Human thymusweefsel en genetisch gemodificeerde humane hematopoietische stamcellen worden getransplanteerd in immunodeficiënte muizen. Dit resulteert in de bereiding van een op menselijke immuunsysteem waardoor in vivo onderzoek van anti-tumor immuunrespons.

Met behulp van de BLT Gehumaniseerd Muis als een Stem Cell gebaseerde Gene Therapy tumormodel

This video demonstrates a technique for generating human immune system (HIS) mice. CD34+ hematopoietic stem cells (HSCs) are isolated from human cord blood buffy coat cells using antibody-coated magnetic beads. The CD34+ HSCs are expanded in a growth medium enriched with cytokines and cryopreserved. Finally, the thawed HSCs are injected into an immunodeficient mouse pup to establish the HIS mouse model.

Isolating Cord Blood Hematopoietic Stem Cells to Generate Human Immune System Mice

This video demonstrates a method for generating a dual humanized mouse model with a human immune system and liver cells. It involves transplanting human liver cells and hematopoietic stem and progenitor cells into a transgenic immunodeficient mouse via intrasplenic injection, leading to engraftment of liver cells and development of human immune cells.

Developing a Humanized Mouse Model with Human Liver Cells and Immune Cells

The video demonstrates a technique to generate a humanized mouse model with stem-cell-based engineered immunity against the human immunodeficiency virus (HIV). Human fetal thymus tissue and engineered hematopoietic stem cells (HSCs) are implanted into the kidney capsule of a severely immunocompromised mouse. The HSCs, which express chimeric antigen receptors (CARs) against HIV, are mixed in a gelatinous protein mixture that promotes their co-localization with thymus tissue. Post-procedure, the...

Constructing a Humanized Mouse Model with Engineered Immunity against HIV

Dit protocol biedt een methode om vast te stellen gehumaniseerd muizen (hu-NSG) via Intrahepatische injectie van menselijke hematopoietische stamcellen in straling-geconditioneerd neonatale NSG muizen. De hu-NSG muis is gevoelig voor HIV-infectie en combinatorische antiretrovirale therapie (cART) en dient als een geschikt pathofysiologisch model voor HIV-replicatie en latentie onderzoeken.

Gehumaniseerd knik/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) muis Model voor HIV-replicatie en Latency Studies

Dit protocol biedt een betrouwbare methode om gehumaniseerde muizen te vestigen met zowel menselijk immuunsysteem als levercellen. Dubbele gereconstitueerde immunodeficiënte muizen bereikt via intrasplenische injectie van humane hepatocyten en CD34+ hematopoietische stamcellen zijn vatbaar voor humaan immunodeficiëntie virus-1 infectie en even leverschade zoals waargenomen in HIV-geïnfecteerde patiënten.

Oprichting van de dubbele gehumaniseerde TK-nog muis model voor HIV-geassocieerde lever pathogenese

Hier beschreven zijn drie experimentele benaderingen voor het bestuderen van de dynamiek van HIV-infectie in gehumaniseerde muizen. De eerste maakt de studie van chronische infectie gebeurtenissen, terwijl de twee laatsten voor de studie van acute gebeurtenissen na primaire infectie of virale reactivatie.

Chronische, acute en Gereactiveerde HIV-infectie in gehumaniseerde Immunodeficiënte Muismodellen

We hebben een protocol ontwikkeld voor de generatie en evaluatie van een gehumaniseerd en menselijk immunodeficiëntievirus besmet NOG muismodel op basis van stamceltransplantatie, intravaginale blootstelling aan het menselijke immunodeficiëntievirus en druppeldigitale PCR RNA Kwantificering.

Gehumaniseerde NOG Muizen voor intravaginale HIV Blootstelling en behandeling van HIV-infectie

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode om orale gecombineerde antiretrovirale geneesmiddelen te leveren die met succes hiv-1-RNA-replicatie bij gehumaniseerde muizen onderdrukken.

Orale gecombineerde antiretrovirale behandeling bij hiv-1 geïnfecteerde gehumaniseerde muizen

Dit protocol schetst de generatie van muizen van het menselijk immuunsysteem (HIS) voor immuno-oncologische studies. Instructies en overwegingen bij het gebruik van dit model voor het testen van menselijke immunotherapeutica op menselijke tumoren die in dit model zijn geïmplanteerd, worden gepresenteerd met de nadruk op het karakteriseren van de reactie van het menselijk immuunsysteem op de tumor.

Testen van kankerimmunotherapeutica in een gehumaniseerd muismodel met menselijke tumoren

Leer hoe je een gehumaniseerd BLT-muismodel bouwt met geïntegreerde immuniteit tegen HIV-infectie. Deze methode maakt preklinisch testen van stamceltherapieën mogelijk.

Stamcel-Based Engineered immuniteit tegen HIV infectie in het gehumaniseerde muismodel

Meer video's verkennen