Stamcel-Based Engineered immuniteit tegen HIV infectie in het gehumaniseerde muismodel

Het algemene doel van deze procedure is om een gehumaniseerde muis te creëren die is gemodificeerd met een chimere antigeenreceptor. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van HIV en immunologie met betrekking tot het testen van de werkzaamheid van op stamcellen gebaseerde geëngineerde immuniteit tegen HIV-infectie en andere chronische infecties en maligniteiten. Zoals een mechanisme van immuunfalen en manieren om het immuunsysteem te versterken en een therapie te ontwikkelen om een betere anti-virale of anti-tumor immuniteit te creëren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het in staat is tot een grote hoeveelheid experimentele manipulaties. Het gehumaniseerde BLT-muismodel bootst de menselijke immuniteit na en maakt in dit geval preklinische testen mogelijk voor celgebaseerde gentherapieën tegen HIV-infectie. Het demonstreren van de procedure zullen Valerie Rezek en Brianna Lam zijn, zij zijn technici van mijn laboratorium.

Begin met het gebruik van scalpels om de thymus in kleine stukjes van ongeveer één millimeter te snijden in een schaal met aangevuld RPMI-medium. Gebruik vervolgens gebogen stompe pincetten om elk afzonderlijk stukje thymus in een enkele put op een 96-welplate te plaatsen. Voeg 100-200 microliters medium toe aan alle putten zodat het weefsel niet uitdroogt.

Visualiseer het weefsel onder de microscoop om elk weefsel dat mogelijk geen thymus is of dat bindweefsel heeft dat eraan is bevestigd, te elimineren. Verwijder vervolgens de bevestigde stukken thymus, combineer ze in een T25 celkweekkolf. Voeg zeven milliliter antibioticum aangevuld RPMI-medium toe aan de kolf en schudden voorzichtig om te mengen.

Plaats vervolgens de kolf in de weefselkweekincubator. Deze stap voorkomt bacteriële besmetting van het weefsel. Begin de isolatie van CD34 positieve HSC's uit de foetale lever door twee scalpels te gebruiken om de lever in kleine stukjes van ongeveer drie millimeter in een schaal met IMDM te snijden.

Verwijder en gooi eventueel wit bindweefsel weg. Gebruik vervolgens een 10 milliliter spuit voorzien van een 16 gauge stompe naald om de lever stukken en medium te verwijderen en over te brengen naar een 50 milliliter conische buis. Neem voorzichtig vijf tot zeven keer op en werp uit om het weefsel volledig te homogeniseren.

Na het voorbereiden van 10 milliliter IMDM-medium, supplementeer het met collageenase, hyaluronidase, antibiotica, Dnase en anti-schimmel. Haal het medium door een 0,22 micron filter. Voeg vervolgens het gefilterde medium toe aan de lever suspensie.

Na het afdekken van de 50 milliliter conische buis met de lever suspensie, sluit deze goed af met zelfklevende folie zoals parafilm om lekken te voorkomen. Roteren in een buisrotator in de 37 graden celsius incubator gedurende 90 minuten. Na de incubatie, filter de gedigesteerde celsuspensie door een 100 micron celstrainer in een verse 50 milliliter buis.

Voeg PBS toe aan de suspensie om het totale volume op 50 milliliter te brengen. Verdeel dit in twee 50 milliliter buizen, elk bevattend 25 milliliter celsuspensie. Langzaam en voorzichtig onderlaag de cellen in elke buis met 10 milliliter van een dichtheidscentrifugatie medium, zoals Ficoll.

Slaan bij 1200 keer g gedurende 20 minuten zonder pauze. Na de centrifugatie, verwijder voorzichtig het interface van elke buis en breng het over in twee afzonderlijke 50 milliliter buizen. Breng het volume van elk buisje interface op 50 milliliter met PBS.

En centrifugeer vervolgens bij 300 keer g gedurende zeven tot 10 minuten. Combineer en was de cel pellets drie keer met 50 milliliter PBS bevattend twee procent FBS, draaiend bij 300 keer g gedurende zeven tot 10 minuten elke keer. Na de laatste draai, resuspendeer de pellet in 50 milliliter RPMI-medium plus 10 procent FBS.

Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Sorteer vervolgens CD34 positieve cellen onmiddellijk met behulp van een CD34 sorteerkit volgens het protocol van de fabrikant, en bewaar zowel de CD34 positieve als de CD34 negatieve fractie. Giet de stukken thymus en medium van de kolf in een 60 millimeter schaal.

Koel enkele positieve verplaatsing pipette tips door ze in open 1,5 milliliter steriele schroefdopbuizen op ijs te plaatsen. Plaats ook de cel pellets en een volume gelatineus eiwit mengsel zoals matrigel op ijs. Anesthetiseer de ontvangende muizen met een injecteerbaar anestheticum volgens een goedgekeurd dierprotocol.

Controleer het anesthesieniveau van de muis door een poot te knijpen. Het ontbreken van een reactie op de prik geeft een chirurgisch niveau van anesthesie aan. Scheer de linkerkant van elke muis van heup tot schouder tussen het midden van de rug en de buik.

Injecteer subcutaan zes milligram per kilogram verdund Carprofen in de schouder of inguinale driehoek van het dier. Spoel de canule van de trocar met PBS in een 60 millimeter schaal. Gebruik een paar stompe gebogen pincetten om een stukje thymus uit de 60 millimeter schaal net binnen de opening van de canule te plaatsen, trek vervolgens terug op de trocar om het weefsel in de canule te aspireren.

Gebruik vervolgens een positieve verplaatsing pipette en een gekoelde tip om vijf microliters koud gelatineus eiwit mengsel toe te voegen aan de buis met de cel pellet. En roer voorzichtig om de cel suspensie te genereren. Pipetteer de cel suspensie in de opening van de canule en trek langzaam terug op de trocar om de naald te laden.

Veeg het geschoren gebied van de muis af met povidonjodium gevolgd door isopropenyl drie keer. Bepaal de donkerste plek onder de huid die de locatie van de milt aangeeft. De nier bevindt zich ongeveer vijf millimeter dorsaal ten opzichte van de milt.

Na het verzekeren van een geschikt niveau van anesthesie door het ontbreken van een reactie van de pootprik, gebruik gebogen pincetten om de huid op te tillen en gebruik chirurgische scharen om een 15 millimeter insnijding in de huid te maken evenwijdig aan de milt. Maak vervolgens een soortgelijke snede in de buikv