Correlatieve Licht en Electron Microscopy om te studeren Microgliale Interacties met β-amyloïde plaques
1 juni 2016
Dit artikel beschrijft een protocol voor het visualiseren Ap amyloïde plaques in de ziekte van Alzheimer muismodellen behulp methoxy-X04, die de bloed-hersenbarrière doorkruist en selectief bindt aan P-geplooide platen in dichte kern Ap-plaques. Hiermee pre-screening van plaque bevattende weefselcoupes voorafgaand aan immunokleuring en verwerking voor elektronenmicroscopie.
Het algemene doel van deze procedure is om beta-amyloïde plaques in hersensecties van muizenmodellen met de ziekte van Alzheimer te identificeren vóór pre-inbeddingsimmunokleuring en weefselverwerking voor elektronenmicroscopie. Deze methode kan helpen om de belangrijkste vragen in het gebied van neuro-immunologie te beantwoorden, zoals de interactie van microgliale cellen met de synaps nabij amyloïde bèta-plots. Het grote voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om hersenweefsels met amyloïde bèta-plots in de regio's en lagen van belang vooraf te screenen.
Hoewel deze methode kan worden toegepast op de ziekte van Alzheimer, kan deze ook worden toegepast op andere ziekten of weefsels waar amyloise aanwezig is. Bereid eerst een oplossing van vijf milligram per milliliter van de methoxy X04-verbinding. Weeg vijf milligram van de methoxy X04 af met behulp van een microschaal.
Los onder een afzuigkap de methoxy X04 op in 100 microliter DMSO en roer tot een heldere, groenachtige oplossing wordt verkregen. Voeg opeenvolgend 450 microliter propyleenglycol en 450 microliter fosfaatgebufferde zoutoplossing toe terwijl u blijft roeren. Houd de oplossing gedurende één nacht mengend op vier graden Celsius.
De volgende dag zou een gelig-groene emulsie zichtbaar moeten zijn. Na injectie van methoxy X04, voeg een dosis toe van 10 milligram per kilogram lichaamsgewicht en offer het dier op het gewenste tijdstip volgens de goedgekeurde methoden aan. Was de para-ormaldehyde-gefixeerde hersenen drie keer met gekoelde PBS. Vervolgens, met behulp van een scherp scheermes, verwijder de reukbol en snijd de hersenen coronaal in twee tot drie stukken van ongeveer gelijke hoogte, die allemaal gelijktijdig kunnen worden gesneden om de procedure te versnellen.
Lijm de stukken hersenweefsel op de monsterplaat die in de lade is bevestigd. Zorg ervoor dat de gladde snijoppervlakte stevig op de monsterplaat blijft plakken. Voeg PBS-oplossing toe aan de lade tot het hele hersenoppervlak volledig ondergedompeld is.
Plaats de lade in de vibratome en pas de instellingen van de vibratome aan om secties van 50 micron dikte te verkrijgen. Begin met snijden en breng de secties onmiddellijk over in PBS met behulp van een fijn penseel. Alternatief kunnen secties in glazen flesjes met cryobeschermde oplossing worden geplaatst voor opslag bij 20 graden Celsius.
Met behulp van een stereotactische muizenhersenatlas, selecteert u hersensecties die het gebied van belang bevatten en plaats elke sectie in cryoprotectant in een putje van een 24-wells culture plate. Gebruik vervolgens een wegwerppipet om een druppel PBS op een microscoopglasplaatje te zetten en plaats de sectie op de druppel. Onderzoek de sectie onder een fluorescentiemicroscoop om regio's met met methoxy X04 gelabelde a-bèta plaques te identificeren.
Zonder de microscoopstand te verplaatsen, maakt u opnames van de belangrijke regio's in helder veld en in fluorescentiemodus. Elke opname moet dezelfde regio in beide velden tonen om de plaque te correleren met de structurele regio van de weefselsectie. Sla de genomen opnamen op en noem ze volgens het diernummer.
Noteer ook het putjenummer in de plaat en het veld van de genomen foto's. Plaats de sectie terug in het aangewezen putje zodra de beeldvorming is voltooid. Onderzoek de volgende sectie in de reeks met dezelfde procedure om uitdroging van de secties te voorkomen.
Om de beelden uit te lijnen, opent u de helder veld- en UV-veldbeelden voor dezelfde ROI in ImageJ. Gebruik vervolgens de MosaicJ-plugin om de randen van de twee beelden uit te lijnen. Sla het uitgelijnde en gecombineerde beeld op volgens het putjenummer in een map met het nummer van het specifieke dier.
Combineer de beelden van verschillende secties van hetzelfde dier om de plaques in het gebied van belang te identificeren en lokaliseren. Nadat het screeningproces is voltooid, bewaart u de onderzochte secties bij 20 graden Celsius in een 24-wells culture plate met cryoprotectant totdat immunokleuring of verdere verwerking wordt uitgevoerd. Bereid eerst een 1% osmiumtetraoxide-oplossing in fosfaatbuffer in een glazen flesje voor.
Omdat osmiumtetraoxide lichtgevoelig is, bedekt u het glazen flesje met aluminiumfolie om de oplossing te beschermen tegen licht. Na het wassen in fosfaatbuffer, verwijdert u de buffer van de secties en spreidt u ze plat uit met behulp van een fijn penseel. Zorg ervoor dat u de secties onmiddellijk platlegt voordat u osmiumtetraoxide toevoegt, omdat alle plooien in de secties permanent zullen worden en het proberen om weefsel na osmiumfixatie te platleggen, alleen de secties zal breken.
Gebruik een overdrachtspijp om osmiumtetraoxide toe te voegen aan de secties, een druppel per keer, totdat de sectie is ondergedompeld. Bedek het putje met aluminiumfolie om de secties te beschermen tegen licht en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Tijdens deze incubatie bereidt u kunststofhars in een wegwerpbekker voor.
Combineer de componenten in volgorde en meng goed met behulp van een serologische pipet van 10 milliliter tot een uniforme kleur is verkregen. Breng het bereide mengsel over naar aluminium weegschalen. Deze zullen de weefselsecties ontvangen zodra ze zijn gedehydrateerd.
Zodra de incubatietijd is verstreken, dehydrateert u de secties gedurende twee minuten in toenemende concentraties ethanol. Breng de gedehydrateerde secties over van de 24-wells culture plate naar 20-milliliter glazen flesjes. Dompel de secties vervolgens drie keer gedurende twee minuten in propyleenoxide om resterend ethanol te verwijderen.
Gebruik vervolgens een gebogen glazen pipettentip of een fijn penseel om de secties van propyleenoxide-oplossing over te brengen naar de kunststofhars en laat ze een nacht infiltreren bij kamertemperatuur. Na infiltratie, plaats de aluminium weegschalen met de monsters in een oven van 50 tot 60 graden Celsius gedurende 10 tot 15 minuten. Om secties in polychloortrifluorethyleen filmbladen in te bedden, schildert u
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor het visualiseren van amyloïde Aβ-plaques in muismodellen voor de ziekte van Alzheimer met behulp van methoxy-X04. Deze methode maakt het mogelijk om plaque-bevattende weefselcoupes voor te screenen voorafgaand aan immunokleuring en verwerking voor elektronenmicroscopie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Neuro-immunologie
- Onderzoek naar de ziekte van Alzheimer
Achtergrond
- Aβ-plaques zijn geassocieerd met de ziekte van Alzheimer.
- Het begrijpen van microgliale interacties met synapsen is cruciaal.
- Methoxy-X04 bindt selectief aan β-geplooide vellen in Aβ-plaques.
- Deze techniek kan worden toegepast op andere ziekten met amyloïdose.
Doel van de studie
- Om bèta-amyloïde plaques in hersendoorsneden te identificeren.
- Om pre-embedding immunostaining te faciliteren.
- Om de weefselverwerking voor elektronenmicroscopie te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van een methoxy-X04-oplossing (5 mg/mL).
- Wegen van methoxy-X04 met een microbalans.
- Applicatie van de oplossing op coupes van hersenweefsel.
- Visualisatie van amyloïde plaques voorafgaand aan verdere verwerking.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van Aβ-plaques in muismodellen.
- Identificatie van regio's van belang voor verder onderzoek.
- Facilitering van immunokleuring en elektronenmicroscopie.
- Potentiële toepassing op andere aandoeningen gerelateerd aan amyloïdose.
Conclusies
- De methoxy-X04-methode is effectief voor het vooraf screenen van plaques.
- Deze techniek helpt bij het begrijpen van neuro-immunologische interacties.
- Het heeft bredere toepassingen buiten de ziekte van Alzheimer.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Dit protocol maakt vroege identificatie van amyloïde plaques in hersenweefsel mogelijk, wat bijdraagt aan targetvalidatie in modellen voor neurodegeneratieve ziekten. Door vooraf te screenen op coupes die plaques bevatten, wordt verspilling van inspanningen bij daaropvolgende immunokleuringen en ultrastructurele analyses beperkt. De methode vergroot het voorspellende vertrouwen in studies naar de interactie tussen microglia en plaques, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen bij het verminderen van risico's rondom targets voor de ziekte van Alzheimer.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar de lokalisatie van microglia ten opzichte van amyloïde plaques mogelijk om neuro-inflammatoire hypothesen te testen.
- Operationele waarde: Maakt het mogelijk om weefselcoupes vooraf te screenen om middelen te concentreren op regio's met detecteerbare plaques, wat de efficiëntie in workflows voor targetvalidatie verhoogt.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door de aanwezigheid van plaques te bevestigen voordat er wordt geïnvesteerd in tijdrovende EM- en immunokleuringprocedures.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Maakt gebruik van methoxy-X04 fluorescentie om kwantitatieve gegevens over plaque-lokalisatie te genereren die compatibel zijn met correlatieve beeldvorming.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare criteria voor sectieselectie voor daaropvolgende EM-preparatie.
- Assay-gereedheid: Genereert gearchiveerde, cryoprotectieve secties die geschikt zijn voor batchverwerking in immunokleuring- en harsinbeddingspijplijnen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Behoudt de zichtbaarheid van plaques tijdens EM-verwerking, waardoor ultrastructurele correlatie met fluorescentieel gelabelde microglia mogelijk wordt.
- Getrouwheid van het ziektemodel: Toepasbaar op amyloidopathie-modellen buiten Alzheimer, ter ondersteuning van brede target-validatie bij proteïnevouwingsziekten.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Faciliteert go/no-go-beslissingen op basis van de plaquebelasting en regionale distributie voordat men overgaat tot therapeutische interventiestudies.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van doelhypotheses tot preklinische validatie, en maakt specifiek een efficiënte overgang mogelijk van plaque-detectie naar de analyse van microgliële interacties.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothese-testen over de ruimtelijke relaties tussen microglia en amyloïde plaques in gedefinieerde hersenregio's.
- Screening: Maakt reproduceerbare selectie van plaque-positieve coupes mogelijk, waardoor variabiliteit in immunostaining en EM-monsterpreparatie wordt verminderd.
- Analyses: Genereert gecorreleerde brightfield- en fluorescentiebeeldsets voor kwantitatieve analyse van de plaquebelasting en co-lokalisatie.
- Translationeel Onderzoek: Bewaart de integriteit van plaques tijdens de EM-verwerking, wat structurele validatie van fluorescentieel geïdentificeerde targets mogelijk maakt.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar pre-screeningplatform voor amyloïde-detectie in meerdere ziektemodellen en targetprogramma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van het target door de aanwezigheid van amyloïd te bevestigen voorafgaand aan mechanistische studies.
- Operationele waarde: Vermindert de belasting van reagentia en instrumenten door plaque-negatieve coupes uit te sluiten van verdere verwerking.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie in programma's voor neurodegeneratieve targets door het aantal mislukte experimenten als gevolg van een lage plaque-opbrengst te minimaliseren.
- Impact op de portfolio: Maakt risigegestratificeerde prioritering van targets mogelijk op basis van de plaquebelasting en regionale specificiteit in preklinische modellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in fluorescentiemicroscopie, vibratoom-snijden en EM-monstervoorbereiding.
- Afhankelijk van toegang tot methoxy-X04, DMSO, propyleenglycol en osmiumtetroxide met de juiste veiligheidsmaatregelen.
- Vereist gestandaardiseerde snij- en kleuringsprotocollen om de consistentie van plaque-detectie tussen verschillende gebruikers en locaties te waarborgen.
- Aanpassing aan niet-murine modellen kan optimalisatie van dosering, perfusie en sectiedikte vereisen.
- De gevoeligheid van plaque-detectie wordt beperkt door de bindingsaffiniteit van methoxy-X04 en weefselautofluorescentie in bepaalde hersengebieden.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Methoxy-X04 Solution Preparation and Injection
1:52
Brain Sectioning Using a Vibratome
3:21
Screening for the Presence of Methoxy-X04-stained Plaques
5:40
Tissue Processing for Electron Microscopy
9:01
Results: Visualization of Aβ Plaques in 21-month-old APP-PS1 Mice Using Light Microscopy Following Systemic Injection of the Fluorescent Dye Methoxy-X04
10:01
Conclusion
