Correlatieve Licht en Electron Microscopy om te studeren Microgliale Interacties met β-amyloïde plaques
June 1st, 2016
Dit artikel beschrijft een protocol voor het visualiseren Ap amyloïde plaques in de ziekte van Alzheimer muismodellen behulp methoxy-X04, die de bloed-hersenbarrière doorkruist en selectief bindt aan P-geplooide platen in dichte kern Ap-plaques. Hiermee pre-screening van plaque bevattende weefselcoupes voorafgaand aan immunokleuring en verwerking voor elektronenmicroscopie.
Het algemene doel van deze procedure is om beta-amyloïde plaques in hersensecties van muizenmodellen met de ziekte van Alzheimer te identificeren vóór pre-inbeddingsimmunokleuring en weefselverwerking voor elektronenmicroscopie. Deze methode kan helpen om de belangrijkste vragen in het gebied van neuro-immunologie te beantwoorden, zoals de interactie van microgliale cellen met de synaps nabij amyloïde bèta-plots. Het grote voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om hersenweefsels met amyloïde bèta-plots in de regio's en lagen van belang vooraf te screenen.
Hoewel deze methode kan worden toegepast op de ziekte van Alzheimer, kan deze ook worden toegepast op andere ziekten of weefsels waar amyloise aanwezig is. Bereid eerst een oplossing van vijf milligram per milliliter van de methoxy X04-verbinding. Weeg vijf milligram van de methoxy X04 af met behulp van een microschaal.
Los onder een afzuigkap de methoxy X04 op in 100 microliter DMSO en roer tot een heldere, groenachtige oplossing wordt verkregen. Voeg opeenvolgend 450 microliter propyleenglycol en 450 microliter fosfaatgebufferde zoutoplossing toe terwijl u blijft roeren. Houd de oplossing gedurende één nacht mengend op vier graden Celsius.
De volgende dag zou een gelig-groene emulsie zichtbaar moeten zijn. Na injectie van methoxy X04, voeg een dosis toe van 10 milligram per kilogram lichaamsgewicht en offer het dier op het gewenste tijdstip volgens de goedgekeurde methoden aan. Was de para-ormaldehyde-gefixeerde hersenen drie keer met gekoelde PBS. Vervolgens, met behulp van een scherp scheermes, verwijder de reukbol en snijd de hersenen coronaal in twee tot drie stukken van ongeveer gelijke hoogte, die allemaal gelijktijdig kunnen worden gesneden om de procedure te versnellen.
Lijm de stukken hersenweefsel op de monsterplaat die in de lade is bevestigd. Zorg ervoor dat de gladde snijoppervlakte stevig op de monsterplaat blijft plakken. Voeg PBS-oplossing toe aan de lade tot het hele hersenoppervlak volledig ondergedompeld is.
Plaats de lade in de vibratome en pas de instellingen van de vibratome aan om secties van 50 micron dikte te verkrijgen. Begin met snijden en breng de secties onmiddellijk over in PBS met behulp van een fijn penseel. Alternatief kunnen secties in glazen flesjes met cryobeschermde oplossing worden geplaatst voor opslag bij 20 graden Celsius.
Met behulp van een stereotactische muizenhersenatlas, selecteert u hersensecties die het gebied van belang bevatten en plaats elke sectie in cryoprotectant in een putje van een 24-wells culture plate. Gebruik vervolgens een wegwerppipet om een druppel PBS op een microscoopglasplaatje te zetten en plaats de sectie op de druppel. Onderzoek de sectie onder een fluorescentiemicroscoop om regio's met met methoxy X04 gelabelde a-bèta plaques te identificeren.
Zonder de microscoopstand te verplaatsen, maakt u opnames van de belangrijke regio's in helder veld en in fluorescentiemodus. Elke opname moet dezelfde regio in beide velden tonen om de plaque te correleren met de structurele regio van de weefselsectie. Sla de genomen opnamen op en noem ze volgens het diernummer.
Noteer ook het putjenummer in de plaat en het veld van de genomen foto's. Plaats de sectie terug in het aangewezen putje zodra de beeldvorming is voltooid. Onderzoek de volgende sectie in de reeks met dezelfde procedure om uitdroging van de secties te voorkomen.
Om de beelden uit te lijnen, opent u de helder veld- en UV-veldbeelden voor dezelfde ROI in ImageJ. Gebruik vervolgens de MosaicJ-plugin om de randen van de twee beelden uit te lijnen. Sla het uitgelijnde en gecombineerde beeld op volgens het putjenummer in een map met het nummer van het specifieke dier.
Combineer de beelden van verschillende secties van hetzelfde dier om de plaques in het gebied van belang te identificeren en lokaliseren. Nadat het screeningproces is voltooid, bewaart u de onderzochte secties bij 20 graden Celsius in een 24-wells culture plate met cryoprotectant totdat immunokleuring of verdere verwerking wordt uitgevoerd. Bereid eerst een 1% osmiumtetraoxide-oplossing in fosfaatbuffer in een glazen flesje voor.
Omdat osmiumtetraoxide lichtgevoelig is, bedekt u het glazen flesje met aluminiumfolie om de oplossing te beschermen tegen licht. Na het wassen in fosfaatbuffer, verwijdert u de buffer van de secties en spreidt u ze plat uit met behulp van een fijn penseel. Zorg ervoor dat u de secties onmiddellijk platlegt voordat u osmiumtetraoxide toevoegt, omdat alle plooien in de secties permanent zullen worden en het proberen om weefsel na osmiumfixatie te platleggen, alleen de secties zal breken.
Gebruik een overdrachtspijp om osmiumtetraoxide toe te voegen aan de secties, een druppel per keer, totdat de sectie is ondergedompeld. Bedek het putje met aluminiumfolie om de secties te beschermen tegen licht en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Tijdens deze incubatie bereidt u kunststofhars in een wegwerpbekker voor.
Combineer de componenten in volgorde en meng goed met behulp van een serologische pipet van 10 milliliter tot een uniforme kleur is verkregen. Breng het bereide mengsel over naar aluminium weegschalen. Deze zullen de weefselsecties ontvangen zodra ze zijn gedehydrateerd.
Zodra de incubatietijd is verstreken, dehydrateert u de secties gedurende twee minuten in toenemende concentraties ethanol. Breng de gedehydrateerde secties over van de 24-wells culture plate naar 20-milliliter glazen flesjes. Dompel de secties vervolgens drie keer gedurende twee minuten in propyleenoxide om resterend ethanol te verwijderen.
Gebruik vervolgens een gebogen glazen pipettentip of een fijn penseel om de secties van propyleenoxide-oplossing over te brengen naar de kunststofhars en laat ze een nacht infiltreren bij kamertemperatuur. Na infiltratie, plaats de aluminium weegschalen met de monsters in een oven van 50 tot 60 graden Celsius gedurende 10 tot 15 minuten. Om secties in polychloortrifluorethyleen filmbladen in te bedden, schildert u
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor het visualiseren van amyloïde Aβ-plaques in muismodellen van de ziekte van Alzheimer met behulp van methoxy-X04. Deze methode maakt het mogelijk om plaque-bevattende weefselsecties vooraf te screenen voorafgaand aan immunokleuring en verwerking voor elektronenmicroscopie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Neuro-immunologie
- Onderzoek naar de ziekte van Alzheimer
Achtergrond
- Aβ-plaques zijn geassocieerd met de ziekte van Alzheimer.
- Begrip van microgliale interacties met synapsen is cruciaal.
- Methoxy-X04 bindt selectief aan β-gevouwen vellen in Aβ-plaques.
- Deze techniek kan worden toegepast op andere aandoeningen met amyloïdose.
Doel van de studie
- Om beta-amyloïde plaques in hersensecties te identificeren.
- Om voorafgaande immunokleuring te vergemakkelijken.
- Om weefselverwerking voor elektronenmicroscopie te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van een methoxy-X04-oplossing (5 mg/mL).
- Wegen van methoxy-X04 met een microbalans.
- Toepassing van de oplossing op hersenweefselsecties.
- Visualisatie van amyloïde plaques vóór verdere verwerking.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van Aβ-plaques in muismodellen.
- Identificatie van interessegebieden voor verder onderzoek.
- Vermakking van immunokleuring en elektronenmicroscopie.
- Mogelijke toepassing op andere amylodoïdose-gerelateerde aandoeningen.
Conclusies
- De methoxy-X04-methode is effectief voor het vooraf screenen van plaques.
- Deze techniek helpt bij het begrijpen van neuro-immunologische interacties.
- Het heeft bredere toepassingen buiten de ziekte van Alzheimer.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables early identification of amyloid plaques in brain tissue, supporting target validation in neurodegenerative disease models. By pre-screening for plaque-containing sections, it reduces wasted effort in downstream immunostaining and ultrastructural analysis. The method enhances predictive confidence in microglial–plaque interaction studies, informing go/no-go decisions in Alzheimer’s disease target de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microglial localization relative to amyloid plaques to test neuroinflammatory hypotheses.
- Operational Value: Prescreens tissue sections to focus resources on regions with detectable plaques, improving efficiency in target validation workflows.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by confirming plaque presence before investing in time-intensive EM and immunostaining procedures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Uses methoxy-X04 fluorescence to generate quantitative plaque localization data compatible with correlative imaging.
- Operational Value: Produces standardized, reproducible section selection criteria for downstream EM preparation.
- Assay Readiness: Generates archived, cryoprotected sections suitable for batch processing in immunostaining and resin embedding pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains plaque visibility through EM processing, enabling ultrastructural correlation with fluorescently labeled microglia.
- Disease Model Fidelity: Applicable to amyloidopathy models beyond Alzheimer’s, supporting broad target validation in protein misfolding diseases.
- <Risk-Adjusted Advancement: Facilitates go/no-go decisions based on plaque burden and regional distribution before committing to therapeutic intervention studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, specifically enabling efficient progression from plaque detection to microglial interaction analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microglial–amyloid plaque spatial relationships in defined brain regions.
- Screening: Enables reproducible selection of plaque-positive sections, reducing variability in immunostaining and EM sample preparation.
- Analytics: Generates correlated brightfield and fluorescence image datasets for quantitative plaque burden and co-localization analysis.
- Translational Research: Preserves plaque integrity through EM processing, allowing structural validation of fluorescently identified targets.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable pre-screening platform for amyloid detection across multiple disease models and target programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by confirming amyloid presence prior to mechanistic studies.
- Operational Value: Reduces reagent and instrument workload by excluding plaque-negative sections from downstream processing.
- Strategic Value: Improves capital efficiency in neurodegenerative target programs by minimizing failed experiments due to low plaque yield.
- Portfolio Impact: Enables risk-stratified target prioritization based on plaque burden and regional specificity in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescent microscopy, vibratome sectioning, and EM sample preparation.
- Dependent on access to methoxy-X04, DMSO, propylene glycol, and osmium tetroxide with appropriate safety controls.
- Necessitates standardized sectioning and staining protocols to ensure plaque detection consistency across operators and sites.
- Adaptation to non-murine models may require optimization of dosing, perfusion, and section thickness.
- Plaque detection sensitivity is limited by methoxy-X04 binding affinity and tissue autofluorescence in certain brain regions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Methoxy-X04 Solution Preparation and Injection
1:52
Brain Sectioning Using a Vibratome
3:21
Screening for the Presence of Methoxy-X04-stained Plaques
5:40
Tissue Processing for Electron Microscopy
9:01
Results: Visualization of Aβ Plaques in 21-month-old APP-PS1 Mice Using Light Microscopy Following Systemic Injection of the Fluorescent Dye Methoxy-X04
10:01
Conclusion
