Een Choroid Plexus Epitheliale-Cell gebaseerde model van het menselijk bloed-cerebrospinale vloeistof Barrier om bacteriële infectie studie uit het basolaterale Side

Het algemene doel van deze methode is om een op choroïde plexus-epitheelcellen gebaseerd model van de menselijke bloed-hersenvochtbarrière te genereren. Dit maakt het mogelijk om bacteriële infecties vanaf de basaal-laterale kant te bestuderen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen over infectieziekten van het centrale zenuwstelsel te beantwoorden, zoals welke processen betrokken zijn bij bacteriële interacties met het choroïde plexus-epitheel.

Het grote voordeel van deze techniek is dat het de analyse van de interacties van pathogenen met de basale laterale zwarte kant van epitheelcellen mogelijk maakt. Deze methode kan ook worden toegepast op andere studies, zoals de onderzoek naar de transmigratie van immuuncellen en tumorcellen door het choroïde plexus-epitheel. Ik kreeg voor het eerst het idee om de humane choroïde plexus-papilloom, of HIBCCP-cellen te gebruiken voor deze methode toen ik het manuscript uit 2005 van Shibata et.al. las.

die de cellijn beschrijft. Begin met het gebruik van steriele pincetten om celkweekfilterinserts met een groeivorm van 0,33 vierkante centimeter, met poriën van drie micron groot, op de kop te plaatsen in afzonderlijke putjes van een twaalf-putjesplaat. Spuit vervolgens met een serologische pipettering ongeveer drie milliliter voorverwarmd medium in de putjes, en zuig eventuele overtollige oplossing weg totdat het onderste compartiment net gevuld is.

Voeg vervolgens 100 micrometer van 37 graden subculturemedium toe dat is aangevuld met tien procent FCS bovenop het filter. Bij het toevoegen van het medium is het erg belangrijk om de vorming van luchtbellen te voorkomen, omdat de belletjes voorkomen dat de cellen voldoende worden gevoed. Wanneer het medium aan alle inserts is toegevoegd, dek de plaat af en breng de inserts over naar een 37 graden Celsius vijf procent CO2-incubator.

Bevestig aan het einde van de incubatie dat de cellen zich hebben losgemaakt van de bodem van de flacon en een ronde vorm vertonen. De cellen losmaken zich niet volledig van elkaar en worden vaak in agglomeraten aangetroffen. Breng de kweek opnieuw in suspensie met 17 milliliter medium om de reactie te stoppen en breng de suspensie over in een 50 milliliter buis.

Centrifugeer vervolgens de cellen en breng het pellet opnieuw in suspensie in een geschikt volume medium voor het tellen. Verdun vervolgens de cellen tot een concentratie van één keer tien tot de zesde cellen per milliliter, en draai de buis om de cellen gelijkmatig te verdelen. Voeg vervolgens 80 microliter cellen toe aan de bovenkant van elk filterinsert.

Wanneer alle inserts zijn gezaaid, dek de plaat af en breng deze terug in de incubator voor een nachtelijke kweek. De volgende dag voegt u een milliliter medium toe aan elk putje van een 24-putjesplaat. Til vervolgens met behulp van pincetten elk insert op en gooi het medium erin weg en plaats de inserts met de rechterkant omhoog in afzonderlijke putjes van de 24-putjesplaat.

Wanneer de filterinserts van de 12-putjesplaat in de 24-putjesplaat worden omgedraaid, wees voorzichtig om het filtermembraan met de cellen die erop groeien niet aan te raken. Vul de inserts met 0,5 milliliter vers medium en breng de plaat terug in de incubator. Breng de inserts om de twee dagen over naar een nieuwe 24-putjesplaat met vers medium, waardoor het medium in het bovenste compartiment wordt vervangen.

Om de trans-epitheliale elektrische weerstand, of TEER van de cellen te meten, dompelt u eerst de elektrodenpunten van een epitheelweefsel volt-ohmmeter in 80 procent ethanol. Verwijder de elektrode na 15 minuten uit het ethanol om de elektrode te laten drogen. Plaats vervolgens de punten in een aliquot van het subculturemedium gedurende nog eens 15 minuten.

Wanneer de elektrode is geëquilibreerd, plaats de langere arm zodat deze de bodem van het onderste compartiment van een putje van de celkweekplaat raakt en de kortere arm zodat deze in het filterinsertcompartiment uitsteekt. Meet de weerstandswaarden van de celkweekfilterinserts in medium zonder cellen om de blanco waarden te verkrijgen. Meet vervolgens de TEER van elk van de gezaaide inserts.

Na het meten, plaats de elektrode weer in 80 procent ethanol gedurende 15 minuten, gevolgd door opslag in een droge buis. Wanneer de TEER-waarden van de HIBCCP-gezaaide inserts 70 ohm per vierkante centimeter overschrijden, vernieuwt u het medium met vers kweekmedium dat is aangevuld met vijf microgram per milliliter insuline en één procent FCS en brengt u de plaat terug in de cellen kweekincubator voor een nacht. Om de paracellulaire permeabiliteit van de insertculturen te bepalen, voegt u 50 microgram per milliliter vers bereid FITC-inulin toe in vers serumarm kweekmedium aan het bovenste filtercompartiment van elk insert en brengt u de cellen terug in de incubator.

Wanneer de culturen een TEER van ongeveer 500 ohm per vierkante centimeter hebben bereikt, infecteert u de cellen met een bacteriële suspensie van belang bij een multipliciteit van infectie van tien en brengt u de cellen terug in de incubator voor de juiste kweekperiode. Was vervolgens de cellen drie keer door het filter over te brengen naar een nieuw putje met een milliliter serumvrij medium. Plaats elk keer het medium in het filtercompartiment met 500 microliter van hetzelfde medium, en bepaal tenslotte de concentratie inuline die na de bacteriële infectie vanuit het filtercompartiment door de cellage is gegaan door mediummonsters te verzamelen uit het onderste putje van elk celkweekfilterinsert en alle monsters te meten in een microplaatlezer tegen tien een en twee FITC-inulin standaardverdunningen.

HIBCCP-cellen vertonen specifieke barrièrefuncties die hen in staat stellen om hun moleculaire uitwisseling tot een bescheiden mate te beperken. Immunofluorescence-analyses van het type-verbinding die geassocieerd is met het eiwit, ZO-1, Occludin en Claudin-1, onthullen een ononderbroken signaal op de plaatsen van cel-tot-cel-contact. Dit illustreert de onderlinge verbondenheid van de cellen door continue strengen van strakke verbindingen.

Wanneer gekweekt onder de juiste omstandigheden, vertonen HIBCPP-cellen een hoog membraanpotentiaal, die oploopt tot ongeveer 500 ohm