Name: Een Choroid Plexus Epitheliale-Cell gebaseerde model van het menselijk bloed-cerebrospinale vloeistof Barrier om bacteriële infectie studie uit het basolaterale Side (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Leer een choroid plexus epitheelcelmodel van de menselijke bloed-cerebrospinale vloeistofbarrière maken met HIBCPP-cellen. Deze methode stelt onderzoekers in staat om bacteriële infecties vanaf de basolaterale zijde te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Prof. Hartwig Wolburg bedanken voor het uitvoeren van de elektronenmicroscopie.

1. Bereid Cultuur van de Cel Filter Voegt Seeding HIBCPP Cellen in een omgekeerde Model System <ol><li> Voorverwarmen DMEM / F12 (Ham) gesupplementeerd met 5 ug / ml insuline, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 10% foetaal kalfsserum (FCS). </li><li> Gebruik een steriel pincet tot 0,33 cm² groeigebied celkweek filter inserts te plaatsen met een poriegrootte van 3 urn op zijn kop in een 12-well plaat (figuur 1E). </li><li> Vul medium in het onderste compartiment van de celkweek filterelement (ongeveer 3 ml) en 100 gl bovenop het filterelement. Overspoelen de plaat en het onderste compartiment medium. Zuig het medium buitensporige zodanig dat het onderste compartiment van het filterelement blijft gevuld (figuur 1E). Opmerking: Het wordt aanbevolen om een ​​serologische pipet te gebruiken voor deze stap. </li><li> Bedek 12-wells plaat met het deksel en breng de bereide celkweek filter inserts in de incubator, 37 ° C,5% CO 2 tot toevoeging van cellen. </li></ol> 2. Teelt en passage van HIBCPP Cells <ol><li> Bereid DMEM / F12 (Ham) gesupplementeerd met 5 ug / ml, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 10% FCS. </li><li> Pre-warm medium en PBS in een 37 ° C waterbad. Aspireren medium van de kolf. Voeg 10 ml PBS aan de kolf en krul. Herhaal deze stap een keer. </li><li> Voeg 3 ml 0,25% trypsine-EDTA aan de kolf en krul. Plaats in de incubator, 37 ° C, 5% CO2. </li><li> Na ongeveer 20 minuten verwijder de kolf uit de incubator. Zorgen dat de cellen losgemaakt van de bodem van de kolf en weer een ronde vorm wanneer onderzocht met de microscoop. Opmerking: De cellen niet volledig los van elkaar en worden vaak in agglomeraten. Het wordt aanbevolen om de cellen te gebruiken tot passage 38. </li><li> Om te stoppen met behandeling met trypsine toe 17 ml medium. Resuspendeer de cellen door en neer te pipetteren en breng de suspensiein een 50 ml buis. Centrifugeer bij 50 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer de cellen in een geschikt volume van medium en tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Opmerking: De concentratie van geresuspendeerde cellen HIBCPP moet 1 x 10 6 cellen / ml. Voor onderhoud HIBCPP cellen wordt voorgesteld om een hoeveelheid van 1-6 x 10 6 cellen overdragen 10 ml medium aan een T75-kolf. Veranderen medium elke tweede dag. </li></ol> 3. Seeding Omgekeerde Cell Culture Filter wisselplaten met HIBCPP Cells <ol><li> Op elkaar omgekeerd filterelement (de onderzijde van het filter) voeg 80 ul celsuspensie (bijv. 8 x 10 4 cellen) (figuur 1E). Opmerking: Zorg ervoor dat de cellen gelijkmatig in de suspensie worden verdeeld door het omkeren van de buis voor het zaaien. </li><li> Bedek de geënte-celkweek filterelementen met het deksel van de 12-well plaat en transfer naar de incubator, 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Op de eerste dag, vul 1 ml medium in de putjes van een 24-wells plaat. Til de celkweek filter inserts met behulp van een tang uit de 12-well plaat, gooi het medium binnen, draai het filter inserts en plaats ze in de standaard oriëntatie in de voorbereide 24-well plaat (figuur 1E). </li><li> Plaats de cellen in vers medium elke tweede dag. Bereid 24-wells met vers medium en de overdracht van de filter inserts aan. Vul wisselplaten met 0,5 ml vers medium. Controleer TEER elke dag zoals beschreven in hoofdstuk 4. </li><li> Wanneer TEER waarden van HIBCPP gezaaid-cellen op celkweek inserts hoger is dan 70 Ω x cm² (ongeveer 4 dagen na het zaaien), ga dan verder celkweek in medium dat 1% FCS en 5 ug / ml insuline. Bereid 24-well platen met 1 ml medium voor elk putje. Transfer filter inserts aan de voorbereide putten en uitwisseling medium in het bovenste compartiment. Opmerking: Dit serum herroeping na confluentie leidt tot de vorming vaneen hogere membraanpotentiaal. </li><li> Aspireren medium van filter compartiment, over te dragen aan het goed voorbereid en vul met 500 pl medium. Herhaal deze stap een keer. Zet de cellen een nacht in de incubator, 37 ° C, 5% CO2. </li></ol> 4. Meting van Transepitheliaal elektrische weerstand (TEER) <ol><li> Dompel de elektrode tips van epitheelweefsel voltohmmeter gedurende 15 minuten in 80% ethanol. Transfer voltohmmeter onder de motorkap en laat de elektrode drogen voor een moment. Plaats elektrode in respectievelijke kweekmedium voor de cellen gedurende nog 15 min equilibreren. </li><li> Metingen uitvoeren door het zo langere arm van de elektrode zodat het raakt de bodem van het onderste compartiment telkens plaats de kortere arm in het filter insteekopening. Opmerking: Weerstand waarden van celkweek filter inserts zonder cellen in medium moeten worden gebruikt als blanco-waarden ((gemeten waarde (Ω) - blanco waarde (Ω)) x filteroppervlak (dwz 0,33 cm²)). </li><li> Na meting Elektrode terug in 80% ethanol gedurende 15 minuten. Bewaren in een droge buis. </li></ol> 5. Vaststelling van Paracellulaire permeabiliteit <ol><li> Los 1 g FITC-inuline in 200 ml kweekmedium gesupplementeerd met 5 ug / ml insuline 1% FCS. Toepassen 50 ug / ml van de oplossing in het bovenste filtercompartiment voor infectie van de cellen. </li><li> Na infectie verzamelen mediummonsters van de onderste put te bepalen hoeveel Inuline overgedragen van het filtercompartiment door de cellaag. </li><li> Bereid een FITC-inuline standaardoplossing en uitvoeren 1: 2 verdunningen, 10 keer (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,2% en 0%) . Bepaal fluorescentie door meting van monsters microplate reader. </li></ol> 6. Voorbereiding van Bacteriën voor Infectie van HIBCPP Cellen op Cell Culture Filter Voegt <ol><li> Een dag voorafgaand aan het experiment, schrapen thij bevroren N. meningitidis stammen uit een glycerol-voorraad en streak op Chocolate Agar met Vitox. Grow &#39;s nachts in de incubator bij 37 ° C, met 5% CO 2. </li><li> Extract 20-30 kolonies van de overnachtkweek en over in een buis met 8 ml proteosepepton gesupplementeerd met 0,042% NaHCO3, 0,01 M MgCl2 en 1% Polyvitex. </li><li> Schud de bacteriën gedurende 1,25 uur bij 220 rpm, 37 ° C. Pellet de bacteriën door centrifugeren bij 2684 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de bacteriële pellet met 8 ml serumvrij medium. Vortex om een ​​gelijkmatige suspensie. </li><li> Om kweekdichtheid bepalen, meten een verdunning van 1:10 in een optische densiteit (OD) van 600 nm. Stel de bacteriële suspensie om een OD 600 van 0,1. Opmerking: Deze suspensie bevat ong. 1 x 10 8 CFU / ml. </li><li> De bacteriële celconcentratie bevestigen Verdun de suspensie stapsgewijs (1:10) tot eenverdunning van 10 -5 en plaat op Chocolate Agar platen. Opmerking: dezelfde seriële verdunningen moeten worden uitgevoerd om bacteriële groeicurven berekenen. </li></ol> 7. Infectie van HIBCPP Cells over Cell Culture Filter Inserts en Bepaling van bacteriële invasie van Double Immunofluorescentie <ol><li> Na aanhoudende celkweek in medium dat 1% FCS en 5 ug / ml insuline, het meten van de cellen elke dag met behulp van een epitheelweefsel voltohmmeter. Als cellen een TEER van ongeveer 500 Ω x cm² hebben bereikt, het uitvoeren van de infectie. </li><li> Infecteren de cellen met de bereide bacteriesuspensie bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 10. Bewaar de geïnfecteerde cellen in de incubator bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende de aangegeven tijdsduur. Opmerking: De MOI kan worden berekend door rekening te houden met het aantal cellen per celkweek filterelement bij samenloop (1,21 x 10 6 cellen / cm2). </li><li> Stop de infection door driemaal wassen met 500 gl serumvrij medium (SFM) die 1% runderserumalbumine (BSA) aangebracht op het filtercompartiment, 1 ml tot het onderste compartiment. </li><li> Blok met 500 gl SFM bevattende 1% BSA buffer in het filtercompartiment en 1 ml in het onderste compartiment gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur om hechting van antilichamen tegen niet-specifieke bindingsplaatsen te voorkomen. </li><li> Incuberen met 100 gl primair antilichaam anti N. meningtidis α-OMP (1: 200) in het filtercompartiment en 500 ul in het onderste compartiment gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Opmerking: Indien nodig kan de antilichaamconcentratie moet worden getitreerd. </li><li> Was de cellen door het opzuigen van het medium uit het filtercompartiment, de overdracht van het filterelement naar een goed voorbereid met 1 ml SFM met 1% BSA en vul de geleegde filter compartiment met 500 ul SFM met 1% BSA. Herhaal deze stap twee keer. </li><li> Fix cellen met 500 pi 4% formaldehyde in het filter bedrijrtment, 1 ml in het onderste compartiment gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de cellen door het opzuigen van het medium uit het filtercompartiment, de overdracht van het filterelement naar een goed voorbereid met 1 ml PBS en vul de geleegde filter compartiment met 500 pi PBS. Herhaal deze stap een keer. Noot: Monsters kunnen overnacht worden opgeslagen in PBS bij 4 ° C. </li><li> Cut vaste celcultuur filtert uit de inserts en wassen met 250 ul PBS met 1% BSA. Incubeer cellen gedurende 15 min bij kamertemperatuur met 250 pl fluorescent gelabelde (excitatiegolflengte 594 nm) secundair antilichaam kip anti konijn (1: 500) om extracellulaire bacteriën kleuren. Opmerking: Indien nodig kan de antilichaamconcentratie moet worden getitreerd. </li><li> Doorlaatbaar cellen met 250 ul PBS met 1% BSA en 0,5% Triton X-100 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Was de cellen drie maal met 250 ul PBS met 1% BSA. </li><li> Incuberen met 250 ui primaire antilichaam anti N. meningitidis </em&gt; α-OMP (1: 200) gedurende 30 min tot extra- en intracellulaire bacteriën kleuren. Was de cellen drie maal met 250 ul PBS met 1% BSA. </li><li> Toepassen 250 pl fluorescent gelabelde (excitatiegolflengte 488 nm) secundair antilichaam (1: 500), fluorescent gemerkte (excitatiegolflengte 660 nm) Phalloidin (1: 250) en 4&#39;, 6-diamidino-2-fenylindool dihydrochloride (DAPI) ( 1: 50.000) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur extra- en intracellulaire bacteriën, actine cytoskelet en kernen vlek. Opmerking: Indien nodig kan de antilichaamconcentratie moet worden getitreerd. </li><li> Was de cellen drie maal met 250 ul PBS met 1% BSA. Insluiten cellen in fixeermiddel en bewaar bij 4 ° C totdat zij onderzocht via microscoop. </li><li> Bepaal aantal binnengedrongen bacteriën per vooraf gedefinieerde gebied. Doe dit door het tellen van 20 velden per filter membraan. Bereken het percentage van binnengedrongen bacteriën. Let op: Vermenigvuldig het gemiddelde aantal bacteriën in de 20 microscopische velden met een oppervlakte coefficseerde. Het resultaat drukt de totale hoeveelheid bacteriën in een 0,33 cm² celkweek filter insert. Verdeel deze waarde door de hoeveelheid bacteriën gekweekt in media tijdens de duur van de infectie. </li></ol>

<ol><li>Abott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiol Dis. 37, 13-25 (2009).</li>
<li>Wolburg, H., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 75-88 (2010).</li>
<li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers%3A+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Imunopathol%22%5BJournal%5D)">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Semin Imunopathol. 31, 497-511 (2009).</li>
<li>Ishiwata, I., Ishiwata, C., Ishiwata, E., Sato, Y., Kiguchi, K., Tachibana, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+malignant+choroid+plexus+papilloma+cell+line+%28HIBCPP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human malignant choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP).</a> Hum Cell. 18, 67-72 (2005).</li>
<li>Schwerk, C., Papandreou, T., Schuhmann, D., Nickol, L., Borkowski, J., Steinmann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+invasion+and+translocation+of+Neisseria+meningitidis+and+Streptococcus+suis+in+anovel+human+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in anovel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> PloS One. 7, e30069(2012).</li>
<li>Bernd, A., Ott, M., Ishikawa, H., Schroten, H., Schwerk, C., Fricker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+efflux+transport+proteins+of+the+human+choroid+plecus+papilloma+cell+line+HIBCPP%2C+a+functional+in+vitro+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plecus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> Pharm Res. , (2014).</li>
<li>Gründler, T., Quednau, N., Stump, C., Orian-Rousseau, V., Ishikawa, H., Wolburg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surface+proteins+InlA+and+InlB+are+interdependently+required+for+polar+basolateral+invasion+by+Listeria+monocytogenes+in+a+human+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).</li>
<li>Schwerk, C., Tenenbaum, T., Kwang, S. K., Schroten, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+plexus+-+a+multi-role+player+during+infectious+diseases+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The choroid plexus - a multi-role player during infectious diseases of the CNS.</a> Front Cell Neurosci. 9, 80(2015).</li>
<li>Pron, B., Taha, M. K., Rambaud, C., Fournet, J. C., Pattey, N., Monnet, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Neisseria+meningtidis+with+the+components+of+the+blood-brain+barrier+correlates+with+increased+expression+of+PilC%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Interaction of Neisseria meningtidis with the components of the blood-brain barrier correlates with increased expression of PilC.</a> J Infect Dis. 176, 1285-1292 (1997).</li>
<li>Guarner, J., Greer, P. W., Whitney, A., Shieh, W. J., Fischer, M., White, E. H., Carlone, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+and+diagnosis+of+human+meningococcal+disease+using+immunohistochemical+and+PCR+assays+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays assays.</a> Am J Clin Pathol. 122, 754-764 (2004).</li>
<li>Pizarro-Cerda, J., Kuhbacher, A., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+Listeria+monocytogenes+in+mammalian+epithelial+cells%3A+an+updated+view%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (2012).</li>
<li>Beutler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbe+sensing%2C+positive+feedback+loops+and+the+pathogenesis+of+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbe sensing, positive feedback loops and the pathogenesis of inflammatory diseases.</a> Immunol. Rev. 227, 248-263 (2009).</li>
<li>Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+immune+cells+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Trafficking of immune cells in the central nervous system.</a> J Clin Invest. 120, 1368-1379 (2010).</li>
<li>Meeker, R. B., Williams, K., Killebrew, D. A., Hudson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+trafficking+through+the+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">Cell trafficking through the choroid plexus.</a> Cell Adh Migr. 6, 390-396 (2012).</li>
<li>Borkowski, J., Li, L., Steinmann, U., Quednau, N., Stump-Guthier, C., Weiss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+meningitidis+elicits+a+pro-inflammatory+response+involving+I+kappa+B+zeta+in+a+human+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving I kappa B zeta in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model.</a> J Neuroinflammation. 11, 163(2014).</li>
<li>Steinmann, U., Borkowski, J., Wolburg, H., Schroppel, B., Findeisen, P., Weiss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmigration+of+polymorphnuclear+neutrophils+and+monocytes+through+the+human+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+after+bacterial+infection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Transmigration of polymorphnuclear neutrophils and monocytes through the human blood-cerebrospinal fluid barrier after bacterial infection in vitro.</a> J Neuroinflammation. 10, 30(2013).</li>
<li>McGuiness, B. T., Clarke, I. N., Lambden, P. R., Barlow, A. K., Poolman, J. T., Heckels, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point+mutation+in+meningococcal+por+A+gene+associated+with+increased+endemic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Point mutation in meningococcal por A gene associated with increased endemic disease.</a> Lancet. 337, 514-517 (1991).</li>
<li>Ram, S., Cox, A. D., Wright, J. C., Vogel, U., Getzlaff, S., Boden, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisserial+lipopolysaccharide+is+a+target+for+complement+component+C4b.+inner+core+phosphoethanolamine+residues+define+C4b+linkage+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Neisserial lipopolysaccharide is a target for complement component C4b. inner core phosphoethanolamine residues define C4b linkage specificity.</a> J Biol Chem. 278, 50853-50862 (2003).</li>
<li>Claus, H., Maiden, M. C., Maag, R., Frosch, M., Vogel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+carried+meningococci+lack+the+genes+required+for+capsule+synthesis+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Many carried meningococci lack the genes required for capsule synthesis and transport.</a> Microbiology. 148, 1813-1819 (2002).</li>
<li>Claus, H., Maiden, M. C., Wilson, D. J., Mccarthy, N. D., Jolley, K. A., Urwin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+meningococci+carried+by+children+and+young+adults%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of meningococci carried by children and young adults.</a> J Infect Dis. 191, 1263-1271 (2005).</li>
<li>Tenenbaum, T., Papandreou, T., Gellrich, D., Friedrichs, U., Seibt, A., Adam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+bacterial+invasion+and+translocation+of+Streptococcus+suis+across+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro.</a> Cell Microbiol. 11, 323-336 (2009).</li>
<li>Laflamme, N., Echchannaoui, H., Landmann, R., Rivest, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+between+toll-like+receptor+2+and+4+in+the+brain+of+mice+challenged+with+cell+wall+components+derived+from+gram-negative+and+gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cooperation between toll-like receptor 2 and 4 in the brain of mice challenged with cell wall components derived from gram-negative and gram-positive bacteria.</a> Eur J Immunol. 33, 1127-1138 (2003).</li>
<li>Laflamme, S., Rivest, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4%3A+the+missing+link+of+the+cerebral+innate+immune+response+triggered+by+circulating+gram-negative+bacterial+cell+wall+components%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4: the missing link of the cerebral innate immune response triggered by circulating gram-negative bacterial cell wall components.</a> FASEB J. 15, 155-163 (2001).</li>
<li>Zughaier, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+meningitidis+capsular+polysaccharides+indice+inflammatory+responses+via+TLR2+and+TLR4-MD-2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Neisseria meningitidis capsular polysaccharides indice inflammatory responses via TLR2 and TLR4-MD-2.</a> J Leukoc Biol. 89, 469-480 (2011).</li>
<li>Yamamoto, M., Yamazaki, S., Uematsu, S., Sato, S., Hemmi, M., Hoshino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Toll%2FIL-1-receptor+-mediated+gene+expression+by+the+inducible+nuclear+protein+IkappaBzeta%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of Toll/IL-1-receptor -mediated gene expression by the inducible nuclear protein IkappaBzeta.</a> Nature. 430, 218-222 (2004).</li>
<li>Lorenz, J., Zahlten, J., Pollok, I., Lippmann, J., Scharf, S., N'Guessan, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella+pheumophila-induced+IkappaBzeta-dependent+expression+of+interleukin-6+in+lung+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Legionella pheumophila-induced IkappaBzeta-dependent expression of interleukin-6 in lung epithelium.</a> Eur Respir J. 37, 648-657 (2011).</li>
<li>Jaerve, A., Muller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+CNS+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Chemokines in CNS injury and repair.</a> Cell Tissue Res. 349, 229-248 (2012).</li>
<li>Schneider, H., Weber, C. E., Schoeller, J., Steinmann, U., Borkowski, J., Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+of+T-cells+after+infection+of+human+choroid+plexus+papilloma+cells+with+Echovirus+30+in+an+in+vitro+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis of T-cells after infection of human choroid plexus papilloma cells with Echovirus 30 in an in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> Virus Res. 170, 66-74 (2012).</li>
<li>Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus%3A+Target+for+polypeptides+and+site+of+their+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus: Target for polypeptides and site of their synthesis.</a> Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).</li>
<li>Dickson, P. W., Schreiber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+messenger+RNA+for+transthyretin+%28prealbumin%29+in+human+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">High levels of messenger RNA for transthyretin (prealbumin) in human choroid plexus.</a> Neurosci. Lett. 66, 311-315 (1986).</li>
<li>Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+insulin-like+growth+factor+II+gene+in+the+choroid+plexus+and+the+leptomeninges+of+the+adult+rat+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 85, 141-145 (1988).</li>
<li>Lim, L., Zhou, H., Costa, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+winged+helix+transcription+factor+HFH-4+is+expressed+during+choroid+plexus+epithelial+development+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The winged helix transcription factor HFH-4 is expressed during choroid plexus epithelial development in the mouse embryo.</a> Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94, 3094-3099 (1997).</li>
<li>Vandenhaute, E., Stump-Guthier, C., Lasierra Losada, M., Tenenbaum, T., Rudolph, H., Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+plexus+may+be+an+underestimated+site+of+tumor+invasion+to+the+brain%3A+an+in+vitro+study+using+neuroblastoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">The choroid plexus may be an underestimated site of tumor invasion to the brain: an in vitro study using neuroblastoma cell lines.</a> Cancer Cell Int. , 15-102 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De epitheelcellen van de CP vormen de BCSFB dat de CSF uit het bloed 2,3 scheidt. We hebben onlangs vestigde de HIBCPP cellijn als een functioneel humaan model van de BCSFB. De cellen vertonen belangrijke barrièrefunctie van de BCSFB in vitro, waaronder de ontwikkeling van een hoge membraanpotentiaal, een lage permeabiliteit voor macromoleculen, alsmede de aanwezigheid van continue strengen TJs 5. TJ eiwitten dragen bij aan een apicale / basolaterale polariteit van de cellen. De polariteit...

De bloed-cerebrospinale vloeistofbarrière (BCSFB) is een van de drie plaatsen barrière tussen bloed en hersenen 1. De morfologische correlaat zijn de epitheelcellen van de choroid plexus (CP) 2,3, een endotheel-epitheliale convoluut, die sterk gevasculariseerd en in de ventrikels. De CP dient om de cerebrospinale vloeistof (CSF) te produceren en om deze uit het bloed te scheiden. Om de barrière functie te bereiken, de CP epitheliale cellen vertonen een lage pinocytotic activiteit uitdrukken specifieke transporters, en worden dicht verbonden door een continu netwerk van krappe kruispunten (TJs) 2,3. Menselijke choroid plexus papilloma (HIBCPP) cellen, afgeleid van een kwaadaardige choroid plexus papilloom van een Japanse vrouw 4, werden gebruikt om een functionele in vitro model van de BCSFB construeren. HIBCPP cellen een aantal karakteristieken van een functionele BCSFB de vorming van TJstrengen, de ontwikkeling van een hoge transepitheliale membraanpotentiaal welke bepaald als transepitheliale elektrische weerstand (TEER) en geringe permeabiliteit voor macromoleculen. Bovendien HIBCPP cellen brengen karakteristieke transporters, die kunnen dienen tot de ionische micro-omgeving te reguleren, en tonen apicale / basolaterale polariteit 5,6,7. De BCSFB is aangetoond gefunctioneerd als ingangsplaats voor ziekteverwekkers (bacteriën, virussen en schimmels) in het centrale zenuwstelsel (CNS) 8. De invasie van ziekteverwekkers, waaronder Neisseria meningitidis (N. meningitidis), een Gram-negatieve bacterie kan ernstige ziekten zoals meningitis veroorzaken. Bewijs dat het overwint de beschermende epitheliale barrière van de CP wordt ondersteund door histopathologische observaties bij patiënten met meningokokken ziekte vertonen verhoogde hoeveelheden van meningokokken in de vaten en CP epitheelcellen 9,10. Om binnenkomst in gastheercellen ba te krijgencteria kapen vaak endocytotische mechanismen, die worden gemedieerd of veroorzaakt door specifieke oppervlakte receptoren op de gastheercellen. Aangezien interacties van pathogenen met deze receptoren kunnen soortspecifiek 11, diermodellen kunnen alleen worden geraadpleegd beperkte mate. De HIBCPP cellijn biedt de mogelijkheid om de invasie proces en de onderliggende moleculaire mechanismen in een humaan model te bestuderen. Gebruikmakend van celkweek inserts stelt ons in staat om interacties van pathogenen analyseren gastheercellen uit twee verschillende cel kanten. Veel bacteriën, inclusief N. meningitidis, sterk de invloed van de zwaartekracht tijdens infectie tests onderworpen. Optimale interactie van pathogenen met HIBCPP cellen tijdens de testen worden de bacteriën eerst toegevoegd aan het bovenste compartiment van de celkweek filterinzetstuk systeem. Om infectie inschakelen van het apicale of basolaterale celkant respectievelijk twee varianten van het in vitro systeem zijn established: In het standaardsysteem HIBCPP cellen worden gezaaid in het bovenste compartiment van het filterelement, het nabootsen van de situatie wanneer micro-organismen op het CB-kant en in contact met de apicale zijde van de cellen (Figuur 1 A, C). In tegenstelling tot het gebruik van de HIBCPP cellen in een omgekeerde celcultuur filter insert systeem weerspiegelt de voorwaarden wanneer bacteriën de bloedbaan hebt ingevoerd. Micro-organismen verspreiden in het bloed en ontmoeting CP epitheelcellen van de basolaterale zijde (Figuur 1B, D). Opmerkelijk in dit modelsysteem is aangetoond dat bacteriën tasten HIBCPP cellen in een polair wijze bepaald uit de basolaterale zijde cel 5,7. Vervolgens infectie van de CP, kan de invasie ziekteverwekkers worden herkend door het aangeboren immuunsysteem door middel van ligatie aan receptoren patroonherkenning (PRRS). Goed beschreven leden van het PRRS behoren tot de Toll-achtige receptor (TLR) familie. kan TLRs bind karakteristieke structuren van besmettelijke micro-organismen, die genoemd pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) zijn. Ligatie van de receptoren leidt tot activatie gastheercel signaaltransductiecascades dat expressie van cytokines en chemokines 12, die op zijn beurt stimuleert transmigratie van immuuncellen in de BCSFB 13,14 activeren. Het is aangetoond dat HIBCPP cellen brengen verschillende TLRs op mRNA-niveau en dat infectie met N. meningitidis resulteert in afscheiding van verschillende cytokinen en chemokinen, waaronder CXCL1-3, IL6, IL8 en TNFa 15,16. We beschrijven kweek en infectie van de humane cellijn HIBCPP in omgekeerde celkweek insert systeem dat BCSFB nabootst. Dit modelsysteem toelaat om interacties van pathogenen met de in vivo desbetreffende basolaterale celkant en de daaropvolgende cellulaire respons studie.

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>4&acute;,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>12-well plates</td><td>Starlab</td><td>CC7682-7512</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Starlab</td><td>CC7682-7524</td><td></td></tr><tr><td>Anti Neisseria meningitidis &alpha;-OMP</td><td></td><td></td><td>Deze antistof was een geschenk van Drs. H. Claus en U. Vogel (Universiteit van Würzburg, Duitsland)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit)</td><td>Invitrogen</td><td>A21441</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit)</td><td>Invitrogen</td><td>A21442</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 660 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22285</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine (BSA)</td><td>Calbiochem</td><td>12659</td><td></td></tr><tr><td>Chocolate agar plates</td><td>Biomerieux</td><td>43109</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Sigma</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES</td><td>Gibco</td><td>31330-095</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred</td><td>Gibco</td><td>11039-047</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum (FCS)</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Inulin</td><td>Sigma</td><td>F3272</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>19278</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>2393</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>55761</td><td></td></tr><tr><td>PBS + Mg + Ca</td><td>Gibco</td><td>14040-174</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670049</td><td></td></tr><tr><td>Polyvitex</td><td>Biomerieux</td><td>55651</td><td></td></tr><tr><td>Proteose peptone</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>Serum-free medium</td><td>Gibco</td><td>10902-096</td><td></td></tr><tr><td>Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 &micro;m</td><td>Greiner</td><td>662630</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture flask 75 cm&sup2; red cap sterile</td><td>Greiner</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode</td><td>Millipore</td><td>MERSSTX00</td><td></td></tr></tbody></table>

een choroid plexus epitheliale-cell gebaseerde model van het menselijk bloed-cerebrospinale vloeistof barrier om bacteriële infectie studie uit het basolaterale side

A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side

De epitheliale cellen van de choroïde plexus (CP), gelegen in het ventrikelsysteem van de hersenen, vormen de bloed-hersenvochtbarrière (BCSFB). De BCSFB functioneert door het scheiden van het hersenvocht (CSF) van het bloed en het beperken van de moleculaire uitwisseling tot een minimum. Een in vitro model van de BCSFB is gebaseerd op cellen afgeleid van een humaan choroïde plexus papilloma (HIBCPP). HIBCPP cellen vertonen typische barrièrefuncties, inclusief de vorming van strakke verbindingen (TJs), de ontwikkeling van een trans-epitheliale elektrische weerstand (TEER), evenals kleine doorlaatbaarheden voor macromoleculen. Er zijn verschillende pathogenen die het centrale zenuwstelsel (CZS) kunnen binnendringen via de BCSFB en vervolgens ernstige ziekten zoals meningitis kunnen veroorzaken. Een van deze pathogenen is Neisseria meningitidis (N. meningitidis), een mens-specifiek bacterie. Het gebruik van de HIBCPP cellen in een omgekeerd cellencultuur filter inzet systeem maakt het mogelijk om interacties van pathogenen met cellen van de BCSFB vanaf de basolaterale celzijde te bestuderen, wat relevant is in vivo. In dit artikel beschrijven we het zaaien en kweken van HIBCPP cellen op cellencultuur inserts. Verder wordt infectie van de cellen met N. meningitidis samen met analyse van binnengedrongen en aangehechte bacteriën via dubbele immunofluorescentie gedemonstreerd. Aangezien de cellen van de CP ook betrokken zijn bij andere ziekten, inclusief neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer en Multiple Sclerose, evenals tijdens hersenmetastase van tumorcellen, kan het modelsysteem ook worden toegepast in andere onderzoeksgebieden. Het biedt het potentieel om moleculaire mechanismen te ontcijferen en nieuwe therapeutische doelwitten te identificeren.

Hier beschrijven we kweken en infectie van HIBCPP cellen in een omgekeerde celkweek insert systeem. Dit model stelt ons invasie mechanismen en de onderliggende moleculaire signaalwegen bestuderen van de basolaterale celkant reproduceren van een fysiologische toestand van bacteriën te verspreiden en die epitheelcellen via de bloedbaan (figuur 1). De HIBCPP cellen vertonen bepaalde barrière functies, die hen in ...

De epitheliale cellen van de choroïdale plexus (CP) vormen de bloed-hersenwaterbarrière (BCSFB). Een in vitro model van de BCSFB gebruikt humane choroïdale plexuspapilloom (HIBCPP) cellen. Dit artikel beschrijft het kweken en basolaterale infectie van HIBCPP cellen met behulp van een cellencultuur filterinzetsysteem.

Een Choroid Plexus Epitheliale-Cell gebaseerde model van het menselijk bloed-cerebrospinale vloeistof Barrier om bacteriële infectie studie uit het basolaterale Side

The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The ...

Het algemene doel van deze methode is het genereren van een model van de menselijke bloed-hersenvochtbarrière op basis van epitheelcellen van de plexus choroidea. Hiermee kan worden onderzocht hoe bacteriële infecties vanuit de basolaterale zijde verlopen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over infectieziekten van het centrale zenuwstelsel, zoals welke processen betrokken zijn bij bacteriële interacties met het epitheel van de plexus choroidea.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het analyse van de interacties van pathogenen met de basolaterale zijde van epitheelcellen mogelijk maakt. Deze methode kan ook worden toegepast op andere studies, zoals het onderzoek naar de transmigratie van immuuncellen en tumorcellen door het epitheel van de plexus choroidea. Ik kreeg voor het eerst het idee om het menselijk choroid plexus papilloom, of HIBCCP-cellen, voor deze methode te gebruiken toen ik het manuscript uit 2005 van Shibata et al. las.ter beschrijving van de cellijn. Begin met het plaatsen van steriele pincetten om cellijnfilter-inserts met een groeioppervlak van 0,33 vierkante centimeter en poriën van drie micron ondersteboven in individuele putjes van een plaat met twaalf putjes te plaatsen. Vul vervolgens, met een serologische pipet, het putje met ongeveer drie milliliter van het voorverwarmde medium en aspireer alle overtollige vloeistof totdat het onderste compartiment precies gevuld is.Voeg vervolgens 100 micrometers subcultuurmedium van 37 graden, aangevuld met tien procent FCS, toe bovenop het filter. Bij het toevoegen van het medium is het zeer belangrijk om de vorming van luchtbellen te voorkomen, aangezien bellen zullen verhinderen dat de cellen voldoende worden gevoed. Wanneer het medium aan alle inserts is toegevoegd, wordt de plaat afgedekt en worden de inserts overgebracht naar een incubator van 37 degree Celsius en vijf procent CO2.Was nu een kolf met HIBCPP-cellen twee keer met tien milliliter PVS door te zwenken. Voeg na de tweede wasbeurt drie milliliter 0,25 procent tripsyn EDTA toe aan de cellen en zwenk de kolf. Incubeer de cellen vervolgens gedurende ongeveer twintig minuten.Bevestig aan het einde van de incubatie dat de cellen van de bodem van de fles zijn losgekomen en een ronde vorm vertonen. De cellen laten niet volledig van elkaar los en komen vaak voor in agglomeraten. Resuspendeer de cultuur met 17 milliliter medium om de reactie te stoppen en breng de suspensie over naar een buis van 50 milliliter.Centrifuge vervolgens de cellen en resuspendeer het pellet in een geschikt volume medium voor het tellen. Verdun daarna de cellen tot een concentratie van 1 x 10⁶ cellen per milliliter en keer de buis om om de cellen gelijkmatig te verdelen. Voeg vervolgens 80 µL cellen toe aan de bovenkant van elk filterinzetje.Wanneer alle inzetten zijn gezaaid, wordt de plaat afgedekt en teruggeplaatst in de incubator voor een overnachtcultuur. Voeg de volgende dag één milliliter medium toe aan elke put van een 24-wellplaat. Til vervolgens elke inzet met een pincet op, verwijder het medium in de inzet en plaats de inzetten met de opening naar boven in individuele putten van de 24-wellplaat.Wanneer de filterinserts vanuit de 12-wells plaat in de 24-wells plaat worden geplaatst, dient men er zorg voor te dragen het filtermembraan waarop de cellen groeien niet aan te raken. Vul de inserts met 0,5 milliliters vers medium en plaats de plaat terug in de incubator. Verplaats de inserts elke twee dagen naar een nieuwe 24-wells plaat met vers medium, waardoor het medium in het bovenste compartiment wordt vervangen.Om de transepitheliale elektrische weerstand, of TEER, van de cellen te meten, dompelt u eerst de elektrodepunten van een epitheelweefsel-volt-ohmmeter in 80 procent ethanol. Verwijder de elektrode na 15 minuten uit de ethanol om deze te laten drogen. Plaats de punten vervolgens gedurende nog eens 15 minuten in een aliquot subcultuurmedium.Wanneer de elektrode is geëquilibreerd, positioneert u de langere arm zodat deze de bodem van het onderste compartiment van één putje van de celkweekplaat raakt, en de kortere arm zodat deze in het compartiment van de filterinsert reikt. Meet de weerstandswaarden van de celkweekfilterinserts in medium zonder cellen om de blanco waarden te bepalen. Meet vervolgens de TEER van elk van de ingezaaide inserts.Plaats de elektrode na het meten gedurende 15 minuten terug in 80 procent ethanol, gevolgd door bewaring in een droge buis. Wanneer de TEER-waarden van de gezaaide HIBCPP-inserts 70 ohms per vierkante centimeter overschrijden, dient het medium te worden vernieuwd met vers kweekmedium aangevuld met vijf microgram per milliliter insuline en één procent FCS, waarna de plaat gedurende één nacht in de celkweekincubator wordt teruggeplaatst. Om de paracellulaire permeabiliteit van de insert-culturen te bepalen, wordt 50 microgram per milliliter vers bereide FITC-inuline in vers serumarm kweekmedium toegevoegd aan het bovenste filtercompartiment van elke insert, waarna de cellen worden teruggeplaatst in de incubator.Wanneer de culturen een TEER van rond de 500 ohm per vierkante centimeter hebben bereikt, worden de cellen geïnfecteerd met een bacteriële suspensie naar keuze bij een multiplicity of infection van tien, waarna de cellen voor de juiste kweekperiode terug in de incubator worden geplaatst. Was vervolgens de cellen drie keer door het filter over te brengen naar een nieuwe put met één milliliter serumvrij medium. Plaats telkens 500 µL van hetzelfde medium in het filtercompartiment. Bepaal tot slot de concentratie inuline die na de bacteriële infectie vanuit het filtercompartiment door de cellaag is gepasseerd door mediummonsters te verzamelen uit de onderste put van elke cellucrefilterinsert en alle monsters te meten in een microplatereader tegen tien standaardverdunningen van FITC-inuline in een 1:10 en 1:100 verhouding.HIBCCP-cellen vertonen specifieke barrièrefuncties waardoor zij in staat zijn hun moleculaire uitwisselingen tot op zekere hoogte te beperken. Zo tonen immunofluorescentie-analyses van de type-junctions geassocieerd met de eiwitten ZO-1, Occludin en Claudine-1 een ononderbroken signaal op de plaatsen van cel-celcontact. Dit illustreert de onderlinge verbondenheid van de cellen door continue strengen van tight junctions.Wanneer ze onder de juiste omstandigheden worden gekweekt, vertonen HIBCPP-cellen een hoog membraanpotentiaal, dat zonder behandeling tot ongeveer 500 ohm per vierkante centimeter reikt, waarbij de typische barrièrefuncties van de bloed-hersenvochtbarrière behouden blijven, zoals de vorming van een membraanpotentiaal en een lage permeabiliteit voor macromoleculen. Wanneer echter toenemende concentraties DMSO worden toegepast, nemen de TEER-waarden dosisafhankelijk af, waarbij een vergelijkbare significante daling van de TEER-waarde wordt waargenomen na behandeling met Cytochalasin D. Bovendien leidt de toevoeging van twee volumeprocent DMSO, of Cytochalasin D, tot een overeenkomstige significante toename van de permeabiliteit voor FITC-inulineflux.Verder resulteert de bacteriële infectie van de HIBCCP-cellen in een significante invasie van de cellaag door twee pathogene bacteriële stammen: MC58 en de capsule-deficiënte mutant daarvan. Daarentegen wordt slechts een geringe invasie waargenomen voor de apathogene alpha 14-stam.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om erop te letten dat u het filtermembraan niet aanraakt nadat de cellen zijn gezaaid, aangezien de intacte HIBCCP-laag door het contact zou worden verstoord. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals in vitro transmigratie-assays, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de mechanismen van immuun- en tumorcelmigratie door choroid plexus-epitheelcellen. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de farmacologie om de overdracht van substraten over het choroid plexus-epitheel in vitro te bestuderen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een HIBCCP-celgebaseerd model van de bloed-hersenvochtbarrière kunt voorbereiden voor basolaterale infectie met pathogenen. Vergeet niet dat het werken met humane pathogenen uiterst gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het werken onder een geschikte veiligheidskap, altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

a-choroid-plexus-epithelial-cell-based-model-human-blood

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video demonstrates an in vitro model to study pathogens crossing the blood-brain barrier (BBB). Microvascular endothelial cells, which express tight junctions, form an endothelial layer in the upper chamber, while neurons, astrocytes, and microglia represent the brain parenchyma in the lower chamber, separated by a porous membrane. Virus infection in the BBB model mimics the pathogen crossing from blood to the brain. Upon introducing a neurotropic virus, it crosses the BBB via...

An In Vitro Model for Studying Pathogen Crossing of the Blood-Brain Barrier and Brain Cell Infection

Oprichting van menselijke modellen van de bloed-hersenbarrière (BBB) ​​kan profiteren onderzoek naar hersenen voorwaarden in verband met BBB mislukking. We beschrijven hier een verbeterde techniek voor de bereiding van een contact BBB model dat coculturing menselijke astrocyten en brein endotheelcellen maakt aan de tegenovergestelde zijden van een poreus membraan.

Verbeterde werkwijze voor de bereiding van een Human-Cell gebaseerde, Contact Model van de bloed-hersenbarrière

Hier beschrijven we een menselijk bloed-hersenbarrière model dat het mogelijk maakt om de transmigratie van lymfocyten in het centrale zenuwstelsel in vitro te onderzoeken.

Analyse van lymfocyt extravasatie gebruik van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van het menselijk bloed-hersenbarrière

Geïsoleerde hersenen haarvaten van menselijk hersenweefsel kunnen worden gebruikt als een preklinische model om te studeren barrièrefunctie fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. Hier presenteren we een geoptimaliseerde protocol om te isoleren van de hersenen haarvaten van verse menselijk hersenweefsel.

Isolatie van cerebrale haarvaten van verse menselijk hersenweefsel

Hier presenteren we een protocol met een beschrijving van de instelling van een in gnudles BBB (bloed-hersenbarrière)-Minibrain polyester poreuze membraan cultuur invoegen systeem teneinde het vervoer van biomoleculen of infectieuze agentia via een menselijke BBB en hun fysiologische effect op de naburige hersencellen.

Een Model Interface menselijke Blood-Brain barrière kruisingen door ziekteverwekkers of geneesmiddelen en hun interacties met de hersenen bestuderen

Hier laten we zien hoe je een goedkope volt-Amperemeter opzetten met programmeerbare uitgangsfrequentie die kan worden gebruikt met in de handel verkrijgbare Chopstick-elektroden voor transepitheliale/endotheliale elektrische weerstand metingen.

Een eenvoudige benadering om TEER metingen uit te voeren met behulp van een zelfgemaakte volt-Amperemeter met programmeerbare uitgangsfrequentie

De menselijke bloed-hersenbarrière voorkomt selectief penetratie van hydrofiele moleculen en ziekteverwekkers in de hersenen. Verschillende pathologieën, waaronder meningitis en postoperatief delirium, worden geassocieerd met een verhoogde doorlaatbaarheid van de bloed-hersenbarrière. Hier beschrijven we een endothelial celkweekmodel om de barrièredoorlaatbaarheid te testen door microbiële traversal.

Analyseren van de permeability van de bloed-hersenbarrière door microbiële traversal door middel van microvasculaire endotheliale cellen

Dit protocol beschrijft een methode om een menselijk bloed-hersenbarrière (BBB) in vitro model vast te stellen. De endotheelcellen en pericyten worden aan elke kant van een insertfilter (bloedcompartiment) gezaaid en astrocyten worden in de onderste put (hersencompartiment) gezaaid. Het gekarakteriseerde model werd gebruikt voor nanodeeltjestransportexperimenten.

Een drievoudig kweekcelsysteem dat de menselijke bloed-hersenbarrière modelleert

Deze studie maakt gebruik van flowcytometrie en twee verschillende gating-strategieën op geïsoleerde perfused muizen hersenen choroïde plexussen; dit protocol identificeert de belangrijkste immuuncelsubsets die deze hersenstructuur bevolken.

Isolatie en karakterisering van de immuuncellen van micro-ontleedde muischoroïde plexussen

De choroïde plexus (CP), een onderbelicht weefsel in de neurowetenschappen, speelt een sleutelrol in de gezondheid en ziekte van het centrale zenuwstelsel. Dit protocol beschrijft een microdissectietechniek voor het isoleren van de CP en het gebruik van scanning elektronenmicroscopie om een algemeen beeld te krijgen van de cellulaire structuur.

Microdissectie en Whole Mount Scanning Elektronenmicroscopie Visualisatie van muis choroïde plexus

Leer een choroid plexus epitheelcelmodel van de menselijke bloed-cerebrospinale vloeistofbarrière maken met HIBCPP-cellen. Deze methode stelt onderzoekers in staat om bacteriële infecties vanaf de basolaterale zijde te bestuderen.

Een Choroid Plexus Epitheliale-Cell gebaseerde model van het menselijk bloed-cerebrospinale vloeistof Barrier om bacteriële infectie studie uit het basolaterale Side (Video) | JoVE Journal

Een Choroid Plexus Epitheliale-Cell gebaseerde model van het menselijk bloed-cerebrospinale vloeistof Barrier om bacteriële infectie studie uit het basolaterale Side

Meer video's verkennen