Name: Het bevorderen van 3-D Aggregation van FACS Gezuiverd thymus epitheelcellen met EAK 16-II / EAKIIH6 Self-assembleren Hydrogel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Leer hoe je thymus epitheelcellen isoleert via FACS en aggregeert met EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel voor 3-D structuren. Deze methode ondersteunt celoverleving en functie in thymus bio-engineering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund in het kader van de National Institutes of Health subsidies R21 AI113000 (WSM) en R01 AI123392 (YF).

Alle gebruikt in de experimenten dieren werden ondergebracht in het dier faciliteit in Allegheny-Singer Research Institute in het kader van het protocol beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Allegheny Health Network / Allegheny Singer Research Institute. 1. verteren de Thymus met collagenase <ol><li> Harvest thymus klieren. <ol><li> Euthanize 3-5 weken oude C57BL6 / J-muizen in een koolstofdioxide (CO2) kamer naar thymusklier oogsten. In detail, plaatst de muizen in de kamer onder CO 2 inductie voor de 3-5 minuten en bevestig de dood door te controleren of hart- of ademstilstand. </li><li> Lag het karkas op zijn rug en bevochtig het lichaam met 70% ethanol. Maak een kleine horizontale incisie met een scherpe, rechte ontleden schaar op haar buik door de huid. Trek de huid aan beide uiteinden (hoofd en benen) zodat het binnenstebuiten gekeerd. </li><li> Maak een horizontale snede met het ontleden van een schaar net onderde laagste rib en dwars door het middenrif zijwaarts. Houd de processus xiphoideus met een pincet en snijd het midden van de ribben verloopt aan beide zijden. Trek de ribben / borstbeen zodat de thymus duidelijk zichtbaar. Opmerking: Thymus ligt direct op het hart bestaat uit 2 lobben en is een witte doorschijnende kleur. </li><li> Met behulp van een gebogen pincet voorzichtig schep en trek de thymus lobben off van het bindweefsel en de overdracht in wasoplossing (zie lijst van materialen). </li></ol></li><li> Bereid ontsluitingsoplossing door mengen 9 ml RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute medium-1640), 0,025 mg / ml gezuiverd collagenase, 10 mM HEPES [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur] en 0,2 mg / ml DNase I in een 50 ml centrifugebuis. Houd de vertering oplossing 37 ° C waterbad tot gebruik. Opmerking: De hoeveelheid ontsluitingsoplossing bereid is voldoende voor vijf volwassen muis thymi, die samen in een 5 ml polystyreen rond- kunnen worden geïncubeerdbottom buis. </li><li> Breng de thymus een 60 mm weefselkweekplaat met 5-6 ml RPMI-1640. </li><li> Ontleden de thymus met 28 G insulinespuit naald in kleine stukjes (ongeveer 1 mm 3 vierkant) te laten de lymfocyten stromen. </li><li> Spoel de thymus stukken met RPMI-1640 dat in de petrischaal met glazen Pasteur pipet. Kantel het gerecht en laat de thymus fragmenten naar de bodem. Langzaam zuigen en gooi de RPMI-1640 supernatant met behulp van een glazen pipet. Herhaal deze spoelstap met 5-6 ml RPMI-1640 voor 4-5 keer met glazen pipet totdat de oplossing minder opaak. Opmerking: Glas pipetten aanbevolen bij deze stap, aangezien thymus fragmenten meestal bij kunststof, waardoor overmatig verlies van thymus weefsel. Voor de rest van de procedure, gebruik maken van plastic pipetten. </li><li> Na de laatste spoeling, gooi het supernatant zoals beschreven in stap 1.5. Voeg 3 ml verteringsoplossing en breng de thymus stukken en de oplossing in een 5 ml rondbodem polystyrene buis. </li><li> De buis wordt op een buis rotator en incubeer bij 37 ° C gedurende 6 minuten bij een rotatiesnelheid van 12 rpm. </li><li> Na incubatie liet de thymus fragmenten naar de bodem van de buis door de zwaartekracht. Verzamel de bovenstaande vloeistof met Pasteur pipet overgebracht in een 50 ml centrifugebuis met 10 ml wasoplossing. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 ml wasoplossing. Houd op het ijs. </li><li> Herhaal stappen 1.6-1.8 tweemaal op de thymus fragmenten in 5 ml ronde bodem polystyreen buis. Verzamel de supernatant op dezelfde 50 ml buis. Opmerking: Centrifugeren is niet noodzakelijk voor de tweede en derde maal. </li><li> Na de laatste digestie pipet op en neer met 2 ml plastic serologische pipet resterende fragmenten in de buis en overdracht af te breken tot de 50 ml centrifugebuis. </li><li> Centrifugeer de 50 ml buis bij 300 g gedurende 5 minuten, zuig de supernatant, resuspendeer in 10 ml wassen Buffer en filter door middel van 100 micrometer cel zeef. Houd op het ijs. </li></ol> 2. Verrijking van TEC&#39;s met discontinue dichtheidsgradiënt <ol><li> Bereid 21% dichtheidsgradiënt oplossing door het mengen van 2,4 ml dichtheidsgradiënt medium (60% w / v iodixanol in water) en 9,6 ml wasoplossing. </li><li> Centrifugeer de gedissocieerde cellen in de thymus verzameling 50 ml buis uit stap 1,11 bij 300 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer in 2,5 ml wasbuffer. </li><li> Voeg 20 ml RPMI-1640 medium aan de celsuspensie. </li><li> Vul 12 ml 21% dichtheidsgradiënt oplossing in een 10 ml serologische pipet met een elektronische pipet. Plaats het uiteinde van de serologische pipet op de bodem van de 50 ml centrifugebuis bevattende cellen, en laat de dichtheidsgradiënt oplossing kan afvloeien naar de bodem van de buis via zwaartekracht. <ol><li> Voorzichtig verdrijven de dichtheidsgradiënt oplossing uit de pipet te eindigen genereren van de twee lagen van verschillende dichtheden. </li></ol></li><li> Centrifugeer bij 600 xg for 20 min bij kamertemperatuur in een swingende-bucket rotor. Stel de vertraging snelheid de langzaamste niveau. </li><li> Breng de bovenste laag en de interface naar een nieuwe 50 ml buis. Opmerking: De meeste van de TEC&#39;s blijven in de interface. Lymfocyten precipiteren op de bodem van de buis na centrifugeren. Wanneer deze cellen worden gebruikt voor andere doeleinden, spoel de pellet met 20 ml wasoplossing driemaal. Resuspendeer de cellen in 10 ml wasbuffer. </li><li> Voeg wasoplossing tot 40 ml aan de buis in stap 2,6 en centrifugeer bij 400 xg gedurende 6 min bij 4 ° C. Om de bovenstaande vloeistof, aspireren met een pipet verwijderen. </li><li> Herhaal het wassen en aspiratie meer 2 keer zoals beschreven in stap 2.7. </li><li> Resuspendeer in 2 ml wasoplossing en tel de cellen met een hemocytometer. </li></ol> 3. Isoleren TEC&#39;s met FACS <ol><li> Pas cellen van stap 2,9 bij een concentratie van 1x10 6 cellen / 100 pl wasoplossing met en overdrachtde cellen een 5 ml rondbodem buis (polypropeen of polystyreen, zoals aanbevolen door de instructies van de stroming sorter). </li><li> Voeg 2 ul anti-Fc receptor IgG per 1x10 6 cellen en incuberen bij 4 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Add anti-CD45 (1: 150 verdunning, 10 ul per monster) en anti-EpCAM (1: 100 verdunning, 10 ul per monster) antilichamen en incuberen bij 4 ° C gedurende meer dan 20 minuten. </li><li> Was de cellen met 2 ml wasoplossing en centrifugeer bij 400 xg gedurende 6 min bij 4 ° C. Zuig het supernatant met een pipet. </li><li> Resuspendeer de cellen in 1 ml 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Filteren door middel van 100 urn zeef. </li><li> Breng de cellen aan de sorteerinrichting instrument. Selecteer de lymfocyt en TEC bevolking met uitzondering van de kleinste cellen op zijdelings verstrooid licht (SSC) / forward-verstrooid licht (FSC) paneel (dode cellen), dan poort aan de geselecteerde populatie van CD45- EpCAM + voor het sorteren 13. </li></ol> 4. GENERATIE van TEC / EAK Aggregaten Opmerking: Voer reagens voorbereiding en stappen waarbij cel mengen onder de laminaire kap. <ol><li> Bereid pA / G adapter complexen door mengen van 4 ui van anti-His-tag IgG, 8 pl anti-EpCAM IgG en 2,6 pl pA / G in een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Pas de gesorteerde TEC uit stap 3,7 tot 5x10 4 cellen / ml met het wassen oplossing en pipet 100 ul één putje van een laag door verdamping, 96 putjes met ronde bodem weefselkweek plaat. Voeg 14,6 ul pA / G adapter complexen aan de cellen. Plaats de plaat op een schudapparaat gedurende 20 minuten bij 4 ° C. </li><li> Was eenmaal met 200 pi wasoplossing. Centrifugeer de plaat bij 400 g gedurende 6 minuten. Verwijder het supernatant met een micropipet. </li><li> Was eenmaal met 200 ui 10% sucrose-oplossing. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 6 min. Verwijder het supernatant met een micropipet. </li><li> Resuspendeer cellen in 30 ui 10% sterile sucrose oplossing per well. </li><li> Voeg 10 ul van EAKIIH6 (7,5 mg / ml) en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 20 ul van EAK16-II (10 mg / ml) aan het mengsel TEC. </li><li> Voeg 100 ul volledig medium om het systeem te starten gelering. Plaats de plaat op een platform schudmachine gedurende 15-20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Plaats de plaat in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2. Na 2-4 uur, voeg nog eens 100 ul volledig medium. </li><li> Wijzig medium om de andere dag tot gebruik. <ol><li> Verzamelbak 100 ui van het medium van het oppervlak zonder de gel te storen met een micropipet en voorzichtig 100 ul voorverwarmde medium toevoegen door het plaatsen van de pipetpunt aan de wand van de put. </li></ol></li></ol> 5. Analyse van de TEC / EAK Aggregaten <ol><li> Om de functie van de TEC / EAK aggregaten in vivo onderzoeken, verzamel de TEC / EAK hydrogel na O / N kweek en transplantatie onder de nier capsule van een athymische naaktmuis, met behulp van eerder beschreven procedure 11,14. </li><li> Bewaken van de ontwikkeling van T-cellen in de periferie door het oogsten van 50-100 pl bloedmonsters in de EDTA bevattende bloedafnamebuis van naakt muizen 4-6 weken na transplantatie en vlek met een cocktail van anti-CD4, -CD8, -CD45 en -CD3 antilichamen 12. </li><li> Analyseer het percentage T-lymfocyten in het perifere bloed leukocyten met flowcytometrie (FCM), waarbij een enkelvoudige cel analysesoftware 12. </li></ol>

<ol><li>Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-positive+epithelium+and+mesenchyme+cells+are+both+required+for+T-cell+development+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus.</a> Nature. 362, 70-73 (1993).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus-specific+deletion+of+insulin+induces+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes.</a> The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).</li>
<li>Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+the+thymus+is+required+to+maintain+delta-like+expression+necessary+for+inducing+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development.</a> J Immunol. 176, 730-734 (2006).</li>
<li>Pinto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organotypic+coculture+model+supporting+proliferation+and+differentiation+of+medullary+thymic+epithelial+cells+and+promiscuous+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression.</a> J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).</li>
<li>Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+colloidal+suspension+of+hydrophobic+compounds+with+an+amphiphilic+self-assembling+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).</li>
<li>Jun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+the+ionic+peptide+EAK16%3A+the+effect+of+charge+distributions+on+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly.</a> Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).</li>
<li>Saunders, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+fluorogen+activating+proteins+into+self-assembling+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials.</a> Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).</li>
<li>Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+assembly+of+a+self-complementary+oligopeptide+to+form+a+stable+macroscopic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+of+the+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane.</a> Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).</li>
<li>Wen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coassembly+of+amphiphilic+peptide+EAK16-II+with+histidinylated+analogues+and+implications+for+functionalization+of+beta-sheet+fibrils+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo.</a> Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peptide-based+material+platform+for+displaying+antibodies+to+engage+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells.</a> Biomaterials. 32, 249-257 (2011).</li>
<li>Tajima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+mini+functional+thymic+units+with+EAK16-II%2FEAKIIH6+self-assembling+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel.</a> Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+Thymus+Organoids+to+Restore+Thymic+Function+and+Induce+Donor-Specific+Immune+Tolerance+to+Allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts.</a> Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus-specific+deletion+of+insulin+induces+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes.</a> The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compromised+central+tolerance+of+ICA69+induces+multiple+organ+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity.</a> J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).</li>
<li>Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+proinsulin-producing+medullary+thymic+epithelial+cell+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones.</a> Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).</li>
<li>Williams, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+complex+thymus+stromal+cell+populations%3A+rapid+thymic+epithelia+preparation+characterizes+radiation+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury.</a> Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).</li>
<li>McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+isolation+of+adult+thymic+epithelial+cell+subsets+for+multiparameter+flow+cytometry+and+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis.</a> J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).</li>
<li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+methods%22%5BJournal%5D)">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).</li>
<li>Xing, Y., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+identification%2C+and+purification+of+murine+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells.</a> J Vis Exp. , e51780(2014).</li>
<li>Graham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+monocytes+from+whole+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22ScientificWorldJournal%22%5BJournal%5D)">Separation of monocytes from whole human blood.</a> ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).</li>
<li>Li, X., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+subcellular+membrane+vesicles+of+epithelial+and+nonepithelial+cells+by+OptiPrep+density+gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation.</a> Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).</li>
<li>Mita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+method+using+iodixanol+%28OptiPrep%29-based+density+gradient+significantly+reduces+cytokine+chemokine+production+from+human+islet+preparations%2C+leading+to+prolonged+beta-cell+survival+during+pretransplantation+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture.</a> Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).</li>
<li>Anderson, G., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+epithelial+cells%3A+working+class+heroes+for+T+cell+development+and+repertoire+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection.</a> Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).</li>
<li>Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+central+role+for+central+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">A central role for central tolerance.</a> Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).</li>
<li>St-Pierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+sequencing+of+neonatal+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells.</a> Sci Rep. 3, 1860(2013).</li>
</ol>

Auteurs verklaren geen belangenconflict.

Terwijl TEC de overheersende populatie van de thymus stroma en spelen een essentiële rol voor de structuur en functie van de thymus, zij slechts ongeveer 0,1-0,5% van de totale thymus cellulariteit. Ze zijn ook kwetsbaar cellen zo hoog percentage celdood worden soms waargenomen na digereren door collagenase, dat wil zeggen, de behandeling TEC van de extracellulaire matrix (ECM) dissociëren. Hun zeldzaamheid (~ 200.000 per muis thymus) en kwetsbaarheid maakte het een uitdagende taak om TEC te isoleren. De recent...

De thymus is de belangrijkste lymfoïde orgaan verantwoordelijk voor het genereren van een gediversificeerde populatie van pathogeen-reactieve, zelfverdraagzaam T-cellen die essentieel is voor de functie van het verworven immuunsysteem. Het is een dynamisch orgaan waarin ontwikkelingslanden thymocyten immigreerden uit het beenmerg als lymfocyten progenitorcellen, migreren door het sponsachtig driedimensionale (3-D) matrix van de thymus stroma ondergaan lijn-specificatie en differentiatie, en uiteindelijk emigratie als rijpe T-cellen. Het succes van deze goed geprogrammeerde proces hangt grotendeels af van de overspraak tussen de migrerende thymocyten en de residentiële thymus epitheelcellen (TEC), de overheersende bevolking van de thymus stroma die essentieel zijn voor het opzetten en onderhouden van de integriteit van de thymus micromilieu zijn. Op basis van hun anatomische locatie en unieke functie, kan TEC worden verdeeld in twee subgroepen: de TEC in de cortex (cTECs) die verantwoorde-woordelijk voor het selecteren eigen MHC (major histocompatibility complex) beperkte T-cellen (positieve selectie), en de TEC in de medulla (mTECs) die essentieel zijn voor het elimineren van autoreactieve T-cellen (negatieve selectie) 1,2 zijn. Vele factoren (bijvoorbeeld, veroudering, infectie, bestraling, behandeling met geneesmiddelen) kan onomkeerbare schade veroorzaken aan de thymus epitheel, wat resulteert in een verminderde adaptieve immuniteit. Ondanks talrijke pogingen, herstel van de thymus functie uitdagend omdat het moeilijk om de thymus micro reproduceren. Met name thymus driedimensionale (3-D) configuratie is kritisch voor de overleving en functie van TEC, terwijl TEC gekweekt in een 2-D omgeving snel de expressie van genen essentieel voor thymopoiesis 3,4 te verlagen. EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) en de C-terminale histidinylated analoge EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) zijn laagmoleculaire amfifiele oligopeptiden die oplosbaar zijn in gedeïoniseerd water, maar ondergaan gelering β-fibrillen bij blootstelling aan ionsterkte lager dan 20 mM NaCl (normale zoutconcentratie in menselijk lichaamsvloeistof 154 mM). Deze reagerende eigenschap milieu maakt ze veelzijdig bouwstenen om 3D-structuren te vormen. Het His-tag on EAKII-H6 heeft een docking mechanisme, waarbij de anti-His IgG / Fc-bindend recombinant eiwit A / G (αH6: pA / G) complexen kunnen als een adapter om eiwit drugs en andere biomoleculen te verankeren te dienen ( bijvoorbeeld antilichamen) aan de hydrogel composiet 5-8. We hebben eerder aangetoond dat fluorescent-gelabelde IgG-moleculen verankerd op de hydrogel op de injectieplaats gedurende maximaal 13 dagen 9 kan worden gehandhaafd. Wanneer verder de αH6: pA / G adapters verankerd met anti-CD4 IgG&#39;s werden toegevoegd aan de EAK16-II / EAKIIH6 (EAK) hydrogel, CD4 + T-cellen werden specifiek vastgelegd 10. Met vergelijkbare techniek, hebben we onlangs aangetoond dat 3-D aggregatie van TEC could worden bevorderd EAK hydrogel met adapter complexen dragen TEC-specifieke anti-EpCAM antilichamen (αH6: pA / G: αEpCAM). Wanneer getransplanteerde nier onder de capsules van naakt muizen, kan de TEC clusters ingebed in EAK hydrogel effectief te ondersteunen de ontwikkeling van functionele T-cellen in vivo 11,12. Hier illustreren we onze methode om snel en effectief te zuiveren TEC&#39;s met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en het genereren van 3-D-TEC aggregaten met het EAK hydrogel systeem.

<table><tbody><tr><td>TEC Isolering</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701(1 Gallon)</td><td>Ethanol 200 Proof, gedeïoniseerd water</td></tr><tr><td>Dissectie schaar, recht</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Graefe pincet, recht</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>11053-10</td><td></td></tr><tr><td>Graefe pincet, gebogen</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Wasoplossing</td><td></td><td></td><td>1x PBS, 0,1% BSA, 2&nbsp;mM EDTA</td></tr><tr><td>1x PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>BSA (runde serum albumine)</td><td>Sigma</td><td>A1470-100G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (ethyleendiaminetetraazijnzuur)</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Digestie oplossing</td><td></td><td></td><td>9 ml RPMI-1640, 0,025&nbsp;mg/ml Liberase TM Research grade, 10&nbsp;mM HEPES, 0,2&nbsp;mg/ml DNaseI</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM Research Grade</td><td>Roche</td><td>05 401 127 001</td><td>bedoeld als "gezuiverde collagenase"</td></tr><tr><td>1&nbsp;M HEPES</td><td>Lonza</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>10 104 159 001</td><td></td></tr><tr><td>50&nbsp;ml Centrifuge buis</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>60&nbsp;mm weefselkweek schotel</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>1/2&nbsp;cc U-100 Insulin spuit 28&nbsp;1/2&nbsp;G</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp;ml Polystyreen ronde bodem buis</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp;ml glazen pijpje</td><td>Fisher Healthcare</td><td>13-678-27E</td><td>Gebruik voor het spoelen van de thymusfragmenten. Thymusfragmenten hebben de neiging om vast te zitten aan de wand met kunststof pipetten.</td></tr><tr><td>MACSmix buis rotator</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>100&nbsp;&micro;m Cel zeef</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Dichtheidsgradiënt medium: OptiPrep</td><td>Axis-Shield</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cel Sorteren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp;ml Polypropyleen ronde bodem buis</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Anti-muis CD16/CD32 (Fc Blok)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>Gebruik als onverdund, 2&nbsp;&micro;l per monster</td></tr><tr><td>Anti-muis CD45-PercpCy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451-80</td><td>Gebruik bij 1:150, 10&nbsp;&micro;l per monster</td></tr><tr><td>Anti-muis CD326 (EpCAM)-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5791-82</td><td>Gebruik bij 1:100, 10&nbsp;&micro;l per monster</td></tr><tr><td>BD Influx</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single cel analyse software</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EAK Gel Montage</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-His-Tag</td><td>AnaSpec</td><td>29673</td><td>"anti-His-Tag IgG"</td></tr><tr><td>Gezuiverde anti-muis CD326 (EpCAM)</td><td>BioLegend</td><td>118202</td><td>"anti-EpCAM IgG"</td></tr><tr><td>Recombinant eiwit A/G</td><td>Pierce Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5&nbsp;ml Safe-Lock Tubes, Biopur, steriele</td><td>Fisher Healthcare</td><td>05-402-24B</td><td>bedoeld als "1,5&nbsp;ml microcentrifuge buis"</td></tr><tr><td>96-well, weefselkweek plaat, Ronde bodem met laag verdamping deksel</td><td>BD Falcon</td><td>353917</td><td></td></tr><tr><td>Roterende platform: Nutator Mixer nr.1105</td><td>BD Clay Adams</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Bereid met steriele gedistilleerd water</td></tr><tr><td>EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2)</td><td>American Peptide Company&nbsp;</td><td></td><td>op maat gesynthetiseerd, 10&nbsp;mg/ml</td></tr><tr><td>EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2)</td><td>American Peptide Company&nbsp;</td><td></td><td>op maat gesynthetiseerd, 7,5&nbsp;mg/ml</td></tr><tr><td>Volledige medium</td><td></td><td></td><td>RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5&nbsp;mM HEPES, 50&nbsp;&micro;M 2-Mercaptoethanol</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Foetaal Rund Serum)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>Verwarmd ingeactiveerd voor gebruik</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine 200&nbsp;mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>NEAA (niet-essentieel aminozuur) 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>1&nbsp;M HEPES</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (100x)</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>Platform shaker: The Belly Dancer</td><td>Stovall Life Sciences Inc.</td><td>model: USBDbo</td><td></td></tr></tbody></table>

het bevorderen van 3-d aggregation van facs gezuiverd thymus epitheelcellen met eak 16-ii / eakiih6 self-assembleren hydrogel

Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel

Thymusinvolutie, geassocieerd met veroudering of pathologische aanvallen, resulteert in verminderde productie van volwassen T-cellen. Het herstellen van de functie van een falende thymus is cruciaal om een effectieve T-cel-gemedieerde verworven immuunrespons tegen binnendringende pathogenen te handhaven. Thymusregeneratie en revitalisering bleken echter uitdagend te zijn, grotendeels vanwege de moeilijkheden om de unieke 3D-micro-omgeving van het thymische stroma te reproduceren, die cruciaal is voor de overleving en functie van thymische epitheelcellen (TEC's). We ontwikkelden een nieuw hydrogelsysteem om de vorming van TEC-aggregaten te bevorderen, gebaseerd op de zelfassemblage-eigenschap van de amfifiele EAK16-II-oligopeptiden en zijn histidine-analogon EAKIIH6. TEC's werden verrijkt uit geïsoleerde thymische cellen met dichtheidsgradiënt, gesorteerd met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en gelabeld met anti-epitheliale celadhesiemolecuul (EpCAM)-antilichamen die verankerd waren, samen met anti-His IgG's, op de proteïne A/G-adaptercomplexen. De vorming van celaggregaten werd bevorderd door TEC's te incuberen met EAKIIH6 en EAK16-II-oligopeptiden en vervolgens door de ionische concentratie van het medium te verhogen om geleiding te initiëren. TEC-aggregaten ingebed in EAK-hydrogel kunnen de ontwikkeling van functionele T-cellen in vivo effectief bevorderen wanneer ze worden getransplanteerd in de atymische naakte muizen.

Om de effectiviteit van het gebruik van de dichtheidsgradiënt scheidingsprotocol de CD45- stromale cellen verrijken onderzoeken werden cellen geoogst uit zowel de interface en het neergeslagen lymfocyt korrels gekleurd met anti-CD45 en anti-EpCAM antilichamen. Zowel anti-Ulex Europaeus agglutinine 1 (UEA1) en anti-MHC Klasse II antilichamen werden ook opgenomen in de kleuring cocktail de CTEC en Mtec subsets verdere omschrijving. Zoals getoond in figuur 1, konden we rout...

Deze video toont een protocol voor het verrijken van thymische epitheliale cellen (TEC's) met dichtheidsgradiënt voor FACS-isolatie. Het laat ook het gebruik van EAK16-II/EAKIIH6-peptiden zien om de TEC-aggregatievorming te bevorderen. De micro-omgevingen van EAK16-II/EAKIIH6-hydrogel bieden de 3-D configuratie die nodig is om de overleving en functie van de TEC's te handhaven.

Het bevorderen van 3-D Aggregation van FACS Gezuiverd thymus epitheelcellen met EAK 16-II / EAKIIH6 Self-assembleren Hydrogel

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing ...

Het algemene doel van deze procedure is om het gebruik van het EAK 16-II/EAKIIH6-peptide aan te tonen bij het bevorderen van thymische epitheliale celaggregatie in een driedimensionale structuur ter ondersteuning van de eigen overleving en functie van thymische epitheelcellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van thymusbio-engineering. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het EAK-16-II/EAKIIH6-peptide gebruikt, thymische epitheliale celaggregatie bevordert, biologisch afbreekbaar is en mogelijkheden biedt voor injectiegebruik.Om de thymus te oogsten, begint u door een C57 zwarte 6J-muis van drie tot vijf weken oud in de rugligging te plaatsen en het haar met 70%ethanol te bevochtigen. Gebruik scherpe, rechte dissectiescharen om een kleine horizontale incisie door de buikhuid te maken. Trek vervolgens aan de huid aan beide zijden van de incisie om de buikholte bloot te leggen.Maak vervolgens een horizontale snede net onder de laagste rib en snijd zijwaarts naar het middenrif. Gebruik een pincet om het xiphoïde proces te trekken en snijd door het midden van de ribben langs beide zijden van de borst. Trek de ribben en h

promoting-3-d-aggregation-facs-purified-thymic-epithelial-cells-with

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In deze video de bereiding van 2-dGuo behandelde reaggregate thymus culturen is aangetoond.

Reaggregate Thymus Culturen

We presenteren protocollen voor de 3-dimensionale (3D) het inkapselen van de cellen binnen synthetische hydrogels. De inkapseling procedure is beschreven voor de twee meest gebruikte methodes van verknoping (michael-type naast en licht geïnitieerde vrije radicalen mechanismen), evenals een aantal technieken voor het beoordelen van ingekapselde cel gedrag.

Cellulaire Encapsulation in 3D Hydrogelen voor Tissue Engineering

Hier beschrijven we het gebruik van een zelf-assemblage drie-dimensionale steiger aan de cultuur menselijke neurale stamcellen. We presenteren een protocol bij de cellen van de steigers vrij te worden geanalyseerd vervolgens bijvoorbeeld door flowcytometrie. Dit protocol kan worden aangepast aan andere soorten cellen om gedetailleerde mechanistisch studies uit te voeren.

Teelt van menselijke neurale progenitorcellen in een 3-dimensionale Zelf-assemblage Peptide Hydrogel

Het volgende protocol biedt technieken voor het inkapselen van pancreatische β-cellen in stap-groei PEG-peptide hydrogels gevormd door thiol-een foto-click reacties. Dit materiaal platform niet alleen een cytocompatible micro voor cel inkapseling, maar maakt ook de gebruiker gecontroleerde snelle herstel van celstructuren gevormd binnen de hydrogels.

Generatie en terugwinning van β-cel sferoïden Van Step-groei PEG-peptide Hydrogelen

Het bestuderen van medullaire thymische epitheelcellen in vitro is grotendeels onsuccesvol geweest, omdat huidige 2D-kweeksystemen het in vivo scenario niet nabootsen. Het 3D-kweeksysteem dat hierin wordt beschreven - een gemodificeerd organotypisch model voor huidcultuur - heeft zich superieur getoond in het nadoen van mTEC-proliferatie, differentiatie en het behoud van promiscue genregulatie.

3D Organotypische Co-cultuur Model Supporting Medullary Thymic epitheelcelproliferatie, Differentiatie en Promiscuous Gene Expression

Recombinant eiwit-engineered hydrogels zijn voordelig voor 3D-celkweek als ze toe voor volledige tunability van de ruggengraat van het polymeer, en dus de cel communicatie. Hier beschrijven we het proces van recombinante elastine-achtige EiwitReiniging en de toepassing ervan in 3D hydrogel cel inkapseling.

Productie van elastine-achtige eiwitten Hydrogels voor inkapselen en immunokleuring van cellen in 3D

Extracellulaire matrix liganden kunnen worden Gedessineerd op polyacrylamidehydrogels om de cultuur van menselijke embryonale stamcellen in kleine kolonies op conforme ondergronden mogelijk te maken. Deze methode kan worden gecombineerd met tractiekracht microscopie en biochemische testen om de wisselwerking tussen weefsel geometrie, door cellen gegenereerde krachten en de specificatie van het lot te onderzoeken.

Patroon van de geometrie van menselijke embryonale stamcel kolonies op conforme ondergronden om de mechanismen van Weefselniveau te beheersen

Het huidige protocol beschrijft een experimenteel platform om de effecten van mechanische en biochemische signalen op chemotherapeutische reacties van patiënt-afgeleide glioblastoomcellen in 3D matrix-mimetische culturen te beoordelen met behulp van een op maat gemaakt UV-verlichtingsapparaat dat high-throughput photocrosslinking van hydrogels met instelbare mechanische kenmerken mogelijk maakt.

Hydrogel-arrays maken een verhoogde doorvoer mogelijk voor screeningseffecten van matrixcomponenten en therapeutica in 3D-tumormodellen

Dit artikel beschrijft hoe je fototunable hydrogels in 3D bioprint om extracellulaire matrixverstijving en fibroblastactivering te bestuderen.

3D-bioprinting Phototunable Hydrogels om de activering van fibroblasten te bestuderen

Hier beschrijven we een protocol voor de vorming van humane iPSC-afgeleide thymusorganoïden gekweekt in 3D-fibrinehydrogels met als doel de rijping van thymusepitheelcellen (TEC) en langdurig onderhoud te ondersteunen, evenals thymopoëse in vitro.

Vorming van menselijke thymusorganoïden in driedimensionale fibrinehydrogels

Leer hoe je thymus epitheelcellen isoleert via FACS en aggregeert met EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel voor 3-D structuren. Deze methode ondersteunt celoverleving en functie in thymus bio-engineering.

Het bevorderen van 3-D Aggregation van FACS Gezuiverd thymus epitheelcellen met EAK 16-II / EAKIIH6 Self-assembleren Hydrogel

Meer video's verkennen