Het bestuderen van de Supramoleculaire organisatie van Photosynthetic Membranen binnen Freeze-gebroken Leaf Tissues door Cryo-Scanning Electron Microscopy
June 23rd, 2016
Hier beschrijven we een procedure voor het bestuderen van bevroren-gebarsten plantweefsels. Bladmonsters die op hoge druk zijn bevroren, worden bevroren-gebarsten en dubbel gecoat, waardoor goed bewaarde bevroren-gehydrateerde monsters ontstaan die worden afgebeeld met behulp van de cryo-scannen electronenmicroscoop op hoge vergroting met minimale stralingsschade.
Het algemene doel van deze techniek is om de supramoleculaire organisatie van fotosynthetische membranen te bestuderen met behulp van cryo-scanning elektronenmicroscopie van bevroren-gebroken bladweefselmonsters. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de celbiologie, zoals de morfologische karakterisering van cellen en organellen, de verdeling van membraan-integrerende eiwitcomplexen en lokalisatie van biomineralen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het bevriezen-breken wordt uitgevoerd op bladweefsels, en dus wordt de supramoleculaire organisatie van thylakoïdemembraan onderzocht binnen de native orgaan- en celcontext.
Hoewel deze methode hier wordt gedemonstreerd voor een biologisch monster, kan deze ook worden toegepast op bijvoorbeeld gels, polymeren en medicijnafgiftesystemen. Over het algemeen moeten personen die nieuw zijn bij deze procedures zich ervan bewust zijn dat niet alle monsters goed bevroren of goed gebroken zullen zijn. Om cryofixatie van bladweefsels uit te voeren door hoogdrukbevriezing, begint u door de hoek van een scheermesje te gebruiken om de bodem van de 0,1-millimeter holte van een 0,1-tot-0,2-millimeter aluminium plaatje te krabben.
Bereid ten minste een dozijn plaatjes voor zes monsters voor. Gebruik vervolgens absoluut ethanol om de plaatjes te wassen en bewaar ze in een schone schaal. Nadat u de hoogdrukbevriezingsmachine hebt voorbereid, vult u de monsterdoos met vloeibare stikstof.
Snijd met een scheermesje een klein stukje blad van de plant en gebruik pincetten om het weefsel in een microcentrifugebuisje te plaatsen dat half gevuld is met één hexadecaantje. Om de intercellulaire ruimtes van het bladweefsel te infiltreren, steekt u de punt van het infiltratieapparaat, zoals beschreven in het tekstprotocol, in het gaatje in het deksel van het microcentrifugebuisje en trekt u de zuiger om vacuüm te creëren. Na ongeveer 30 seconden laat u de zuiger los.
Vervolgens verwijdert u met pincetten het bladstukje uit de buis. Gebruik de scheermes om een stukje te snijden dat klein genoeg is om in een plaatje te passen. En trim indien nodig het blad tot een dikte van minder dan 0,2 millimeter.
Om weefselingroei te voorkomen, worden bladeren geïnfiltreerd met vloeistof voorafgaand aan hoogdrukbevriezing. De monsterdikte wordt onder de 200 micron gehouden om de kans te maximaliseren om een gevitrificeerd monster te verkrijgen. Plaats een schoon plaatje met de kraszijde naar boven in de houder van de bevriezingsmachine.
En plaats vervolgens het gesneden stuk blad in het plaatje. Gebruik één hexadecaantje om de resterende ruimte van het plaatje te vullen voordat u een ander plaatje gebruikt met de krassen naar het blad toe om de sandwich te sluiten. Sluit en draai de houder vast.
Bevriez het monster door op de jet-knop te drukken. Breng vervolgens snel de houder over in vloeibare stikstof. Gebruik voorgekoelde pincetten om de sandwich uit de houder te verwijderen, zorg ervoor dat deze niet breekt.
Er zijn twee kritische stappen in de procedure: bevriezen-breken, wat een willekeurig proces is en het succes ervan kan alleen worden beoordeeld in de cryo-SEM'en dubbele laagcoating, die nodig is om beelden met hoge vergroting te verkrijgen met minimale straalschade. Terwijl u de bevriezen-breekmachine plaatst en programmeert volgens de instructies van de fabrikant, plaatst u de platina koolstof, of Pt/C pistool, op 45 graden en de koolstof pistool op 90 graden. Koel de bevriezen-breeksysteemtrap tot min 140 of min 160 graden Celsius.
Bevestig vervolgens de vacuüm cryo transfer shuttle aan de machine en vul de shuttle kamer met vloeibare stikstof. Plaats een bevriezen-breekspecimen houder in de laadstation en vul de laadstationkamer met vloeibare stikstof. Laad vervolgens met behulp van hoogprecisie-tweezers een bevroren sandwich op de houder en draai deze vast op zijn plaats.
Keer vervolgens de houder om om te controleren of de sandwich op zijn plaats is bevestigd en herhaal dit voor een tweede sandwich. Trek de gekoelde shuttle los van de bevriezen-breekmachine en verbind deze met het laadstation. Open vervolgens de shuttleklep, introduceer de terugtrekkende arm in de houder, vergrendel hem op zijn plaats en introduceer de arm met de houder opnieuw in de shuttle.
Nadat u de shuttle opnieuw hebt bevestigd aan de bevriezen-breekmachine, introduceert u de houder in de kamer, met behulp van de terugtrekkende arm. Richt nu het mes van de bevriezen-breekmicrotoom op een hoogte zodanig dat het de bovenste plaatjes van de sandwiches zal afslaan. Met het mes van de microtoom, breekt u snel de sandwiches.
En verhoog vervolgens onmiddellijk het mes om besmetting van de monsters door puin dat aan het mes kleeft te voorkomen. Plaats de gekoelde sluiter boven het nieuw blootgestelde vlak om de monsters te beschermen tegen mogelijke besmetting door watermoleculen in de kamer. Om de monsters met platina te coaten, drukt u op Setup om Laag 1 op het scherm te tonen.
Schakel vervolgens het Pt/C pistool in door op de GUN 1-knop te drukken gevolgd door de ON-knop. Controleer de verdampingssnelheid en zodra deze 0,02 tot 0,04 nanometer per seconde bereikt, drukt u op de Meet-knop om de dikte van de afgescheiden laag te controleren terwijl u de monsters gelijktijdig bloot stelt. Om met koolstof te coaten, selecteert u GUN 2 gevolgd door de ON-knop.
Zodra de verdampingssnelheid ongeveer 0,1 nanometer per seconde is, drukt u op de Meet-knop en beweegt u tegelijkertijd de sluiter om de monsters bloot te stellen. Wanneer de coating voltooid is, verwarmt u de trap tot min 120 graden Celsius. Om de rasterelektronenmicroscoop voor cryowerk voor te bereiden, selecteert u vanuit het hoofdmenu Trap, Trap Initialiseren en bevestigt u.
Klik onder het vacuümtabblad op de Vent-knop om de microscoopkamer te ontluchten. Select
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een techniek voor het bestuderen van de supramoleculaire organisatie van fotosynthetische membranen in plantenweefsels met behulp van cryo-scanning elektronenmicroscopie. De methode omvat het vriesbreken van onder hoge druk bevroren bladmonsters, wat gedetailleerde beeldvorming met minimale schade mogelijk maakt.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Plantenfysiologie
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- Het begrijpen van de structuur van fotosynthetische membranen is cruciaal voor de celbiologie.
- Vriesbreektechnieken behouden de native staat van biologische monsters.
- Hogedrukbevriezing minimaliseert schade tijdens monstervoorbereiding.
- Deze methode kan worden toegepast op verschillende materialen buiten biologische monsters.
Doel van het onderzoek
- Om de organisatie van thylakoïdenmembranen in hun native context te onderzoeken.
- Om cellulaire structuren en organellen te karakteriseren.
- Om de verdeling van membraangebonden eiwitcomplexen te analyseren.
Gebruikte methoden
- Hogedrukbevriezing van bladweefsels.
- Vriesbreken van monsters voor beeldvorming.
- Dubbellaagse coating van monsters ter bescherming.
- Cryo-scanning elektronenmicroscopie voor hoog-resolutie beeldvorming.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van goed bewaarde bevroren-gehydrateerde monsters.
- Gedetailleerde morfologische karakterisering van thylakoïdenmembranen.
- Inzichten in de lokalisatie van biomineralen en eiwitcomplexen.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de methode op andere materialen.
Conclusies
- De techniek biedt waardevolle inzichten in plantencelcstructuren.
- Het verbetert het begrip van de organisatie van fotosynthetische membranen.
- Deze methode kan worden aangepast voor verschillende wetenschappelijke toepassingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This technique enables high-resolution imaging of membrane protein complexes in their native cellular context, supporting target validation in photosynthetic systems. By preserving supramolecular organization under near-native conditions, it provides mechanistic insights into protein localization and dynamics relevant to energy transduction pathways. The method aids in de-risking early-stage target hypotheses by visualizing functional membrane architecture without artifacts from chemical fixation or staining.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of photosystem II and light-harvesting complex distribution within thylakoid membranes.
- Scientific Value: Supports interrogation of therapeutic hypotheses by mapping protein reorganization during dehydration stress.
- Scientific Value: Provides mechanistic de-risking through correlation of supramolecular changes with functional states in energy transduction.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, high-magnification (>100,000X) imaging data suitable for assay standardization.
- Operational Value: Double-layer coating minimizes beam damage and charging, enabling reproducible data acquisition.
- Operational Value: Facilitates platform reuse across biological and non-biological systems such as gels, polymers, and drug delivery systems.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers disease-relevant system insights by studying resurrection plant adaptation mechanisms.
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment through in situ localization of protein complexes during stress responses.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by linking structural changes to functional outcomes in photosynthetic efficiency.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to mechanistic validation, particularly for membrane-associated targets in energy metabolism pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing nanoscale organization of membrane-integral protein complexes.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible imaging outputs with minimal artifacts for reliable target engagement assessment.
- Analytics: Enables quantitative comparison of protein density and distribution across experimental conditions (e.g., hydrated vs. dehydrated states).
- Translational Research: Connects structural observations to functional continuity in stress response pathways relevant to crop resilience and bioenergy applications.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized platform for membrane protein characterization across diverse sample types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in membrane protein organization.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized high-pressure freezing and double-layer coating protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct structural evidence to de-risk early-stage targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by enabling early detection of conformational or organizational changes in target complexes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryofixation, freeze-fracture, and cryo-SEM operation.
- Dependent on access to high-pressure freezers, freeze-fracture units, and cryo-SEM systems with low-temperature stages.
- Necessitates cross-team standardization for sample preparation, coating, and imaging parameters.
- Involves adaptation considerations for varying sample thickness and conductivity across model systems.
- Limited by sample-specific freezing and fracturing success rates, which affect data yield and consistency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Cryo-fixation of Leaf Tissues by High-pressure Freezing
3:43
Freeze Fracture and Double-layer Coating
7:10
Cryo-scanning Electron Microscopy
10:52
Results: Cryo-scanning Electron Microscopy Analysis of Photosynthetic Membranes in Freeze-fractured Leaf Tissues
12:57
Conclusion
