Name: Het bestuderen van de Supramoleculaire organisatie van Photosynthetic Membranen binnen Freeze-gebroken Leaf Tissues door Cryo-Scanning Electron Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 52 s
Description: Leer de supramoleculaire organisatie van fotosynthetische membranen in bladweefsels bestuderen met cryo-scanningelektronenmicroscopie. Deze methode behoudt de native toestand van thylakoïde membranen voor gedetailleerde celbiologische analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Andres Kaech (Universiteit van Zurich) voor zijn nuttig advies over het scannen van elektronen microscopie beeldvorming. Dit werk werd ondersteund door de Verenigde Staten en Israël binationale Agricultural Research and Development Fund (verlenen no. US-4334-10, ZR), de Israel Science Foundation (verlenen nr. 1034/12, ZR) en het Human Frontier Science Program (RGP0005 / 2013, ZR). De elektronen microscopie studies werden uitgevoerd bij de Irving Moskowitz en Cherna Center for Nano en Bio-Nano Imaging aan het Weizmann Institute of Science.

1. Cryo-fixatie van Leaf Tissues door Hogedruk Bevriezing Opmerking: Dit deel beschrijft hoe uit te voeren onder hoge druk bevriezing van blad weefsels voor een freeze-fractuur experiment. Voor de overwegingen in verband met planten monsters te zien 29. Dit kan worden aangepast voor andere typen weefsels of monsters met enkele wijzigingen. <ol><li> Gebruik de hoek van een scheermesje, krassen op de bodem van de 0,1 mm holte van een 0,1 / 0,2 mm aluminium plaatjes (figuur 1). Maak minstens tien bloedplaatjes (6 monsters). Wees voorzichtig mes merken te creëren op de omtrek van de schijf. <ol><li> Na krabben, wassen schijven in absolute ethanol, laten drogen en bewaren op een schone schotel. </li></ol></li><li> Bereid de hoge druk bevriezing machine volgens de instructies van de fabrikant. Vul het hoge druk bevriezing machine alcohol kamer met isopropanol. </li><li> Bereid een zelfgemaakte vacuüm bijgestaan ​​infiltration apparaat om gas te vinden in het blad weefsel met vloeibare vervangen. <ol><li> Aansluitbare verbinding een 200 ul pipetpunt het einde van een 10 ml spuit. Snijd ~ 1 cm van de tip. Maak een gat in de dop van een 1,5 ml microcentrifugebuis om strak de cut tip. Vacuüm kan in de buis worden gemaakt door aan de zuiger van de spuit. </li></ol></li><li> Snijd een klein stukje blad van de plant met behulp van een scheermesje en met een pincet plaatst het blad in een microcentrifugebuis half gevuld met 1-hexadeceen. Infiltreren in de intercellulaire ruimten van het blad met de vloeistof door zachtjes trekken van de zuiger om vacuüm te creëren, houdt ongeveer 30 seconden, en dan langzaam de zuiger los. </li><li> Verwijder het blad stuk uit de buis met behulp van een pincet. Trim het blad met een scheermesje in geval is dikker dan 0,2 mm en snijd een klein stukje dat past in een bloedplaatjes. </li><li> Plaats een schone bloedplaatjes met de bekraste kant naar boven in de houder van de bevriezing machine en plaats de cut stuk leaf in de bloedplaatjes. Vul de resterende ruimte rondom het blad met 1-hexadeceen. Sluit de sandwich met een andere plaatjes, met de krassen tegenover het blad. </li><li> Sluit en draai de houder en steek hem in de kamer van de machine. Druk vervolgens op de &#39;Jet&#39; knop te bevriezen (~ 2100 staven voor 300-500 msec), en snel de houder te zetten in vloeibare stikstof. Haal de bevroren sandwich uit de houder met behulp van pre-gekoelde pincet, het verzorgen van de sandwich niet te breken. Opmerking: Gesloten bevroren broodjes kunnen bevriezen gebroken onmiddellijk of bewaard in vloeibare stikstof voor later gebruik. Gebruik beschermende kleding en een veiligheidsbril bij het hanteren van vloeibare stikstof. </li></ol> 2. Freeze-breuk en Double-layer Coating 27,28 <ol><li> Bereid de bevriezing breuk machine voor gebruik, zowel pistolen voor de verdamping van platina / koolstof (Pt / C) en koolstof, volgens de instructies van de fabrikant. Plaats de Pt / C pistool op 45 graden eennd de carbon pistool op 90 graden. <ol><li> Pre-programma een bekleding schema van een 2-nm laag van Pt / C (bekledingssnelheid 0,02-0,04 nm / sec) en een 6-nm laag van koolstof (bij ~ 0,1 nm / sec). <ol><li> Voer de setup op het scherm van de freeze-fractuur machine. Selecteer een gebruikersnummer waar de coating-systeem wordt opgeslagen. </li><li> Kies Pt / C &quot;Layer 1 &#39;. Selecteer een tijdsbestek, bijv., 5 min (de noodzakelijke tijd nodig om de coating te voltooien overschrijden). Gebruik de omhoog-omlaag om een ​​dikte van 2 nm te bepalen. </li><li> Druk op de &#39;Layer&#39; knop om naar 2. Herhaal stap 2.1.1.2 Laag, behalve dat je koolstof en definiëren een dikte van 6 nm. </li></ol></li><li> Te testen en aan te passen pistool operatie. <ol><li> Selecteer &#39;Layer 1&#39;. Selecteer de Pt / C pistool door het indrukken van de &#39;gun1 &quot;knop en druk op de&quot; ON &quot;knop op de verdamping regeleenheid van de freeze-fractuur machine. Bewaken van de verdampingssnelheid en stel met behulp van de spanning en emissie knoppen until bereiken van een snelheid van 0,02-0,04 nm / sec. Druk op &#39;UIT&#39; de Pt / C pistool uit te schakelen. </li><li> Selecteer &#39;Layer 2&#39;. Herhaal 2.1.2.1, behalve dat je &#39;GUN2&#39; en aan te passen voor een verdampingssnelheid van ~ 0,1 nm / sec. </li></ol></li></ol></li><li> Koel de bevriezing breuk systeem etappe naar -140 ° C of -160 ° C (voor gehydrateerd of gedroogde bladeren, respectievelijk). Bevestig het vacuüm cryo shuttle transfer naar de machine en vul de kamer met vloeibare stikstof. De druk in de gekoelde vries-breuk kamer ligt gewoonlijk tussen 1-8 x 10 -7 mbar. </li><li> Plaats een freeze breken preparaathouder (geschikt voor 3-mm bloedplaatjes) in het laadstation. Overspoelen de laadstation kamer met vloeibare stikstof. </li><li> Plaats twee bevroren broodjes op de houder één voor één met behulp van hoge-precisie-kwaliteit pincet. Draai de eerste sandwich in de houder en klap de houder over om te controleren of het past stevig op zijn plaats. Herhaal dit voor de tweede sandwich. </li><li> Detach de afgekoelde shuttle van het bevriezen breuk machine en sluit deze aan op het laadstation. Open de shuttle ventiel, introduceren de terugtrekkende arm in de houder en zet deze op zijn plaats. Opnieuw in te voeren de arm met de houder in de shuttle en sluit de shuttle klep met behulp van de laadstation knop. Bevestig de shuttle naar de freeze-fractuur machine en de houder te introduceren in de kamer met het terugtrekken arm. Maak de shuttle uit de machine. </li><li> Lijn de bevriezing breuk microtoom mes om een ​​zodanige hoogte dat het zal kloppen de top plaatjes van de broodjes. </li><li> De microtoom mes snel breken de broodjes, en onmiddellijk op- getrokken tot contaminatie van monsters door puin vasthouden voorkomen dat het mes en draai de gekoelde sluiter boven de nieuw blootgestelde vlak op de monsters van mogelijke verontreiniging te beschermen door watermoleculen in de Kamer. </li><li> Coat de monsters met platina en koolstof. <ol><li> Voer &#39;Layer 1&#39; op de screen. Schakel de Pt / C pistool door het indrukken van de &#39;gun1&#39; knop, gevolgd door de &#39;ON&#39; knop. Onderzoek de verdampingssnelheid en als het eenmaal heeft bereikt 0,02 - 0,04 nm / sec, tegelijkertijd bloot de monsters en druk op de &#39;Measure&#39; om de dikte van de afgezette laag te bewaken. Opmerking: Gun wordt automatisch uitgeschakeld wanneer de dikte van de vooraf ingestelde waarde heeft bereikt. </li><li> Bedek de monsters met een foto wanneer Pt / C verdamping is voltooid. </li><li> Druk op de &#39;Layer&#39; knop om naar &#39;Layer 2&#39;. Herhaal stap 2.8.1 en 2.8.2, behalve selecteren &#39;GUN2&#39; (voor koolstof) en een verdampingssnelheid van ~ 0,1 nm / sec. </li></ol></li><li> Verwarm de bevriezing breuk systeem etappe naar -120 ° C. </li></ol> 3. Cryo-scanning elektronenmicroscopie <ol><li> Bereid de scanning elektronenmicroscoop voor cryo werk. <ol><li> Selecteer Stage / Stage initialiseren in het hoofdmenu en bevestig. </li><li> Selecteer Extra / GotO-paneel en open het paneel &#39;Airlock&#39; door deze in de lijst te selecteren. Klik op &#39;Sluiten Column Chamber Valve&#39; knop. Vent de microscoop kamer door te klikken op de Vent knop onder het tabblad &#39;Vacuum&#39;. </li><li> Selecteer Extra / Goto Configuratiescherm en open de &#39;Stage Points List&#39; panel. Selecteer de cryo-uitwisseling plaats op het podium te verplaatsen naar de juiste coördinaten voor het accepteren van de monsterhouder. Opmerking: De &quot;cryo-uitwisselstand &#39;is ingesteld om in aanpassing aan de positie van het vacuüm transporteenheid. </li><li> Open het monster kamer met een schone paar handschoenen en steek de cryo-podium op het grote podium van de microscoop. Sluit de kamer en klik op de knop Pump onder het &#39;Vacuum tabblad&#39;. </li><li> Koel de microscoop naar -120 ° C. Vul het microscoop Dewar met vloeibare stikstof. Activeer de functie hitte op de cryo-overdracht regeleenheid -120 ˚C zodra de temperatuur van het podium daalt tot onder -120 ° C. </li></ol></li><li> attACH de cryo-overdracht shuttle naar de microscoop en de overdracht van de monsterhouder met behulp van de terugtrekkende arm in de microscoop cryo fase (zoals in stap 2.5). Maak de shuttle van de microscoop. </li><li> Klik op de &#39;Open Column Chamber Valve&#39; knop in het Airlock Panel. </li><li> verplaats de monsterhouder in de buurt van het objectief (werk afstand 1-2 mm) voorzichtig met behulp van de joystick. Selecteer een 10-um opening in het tabblad &#39;openingen&#39;. Dubbelklik op het veld EHT in het tabblad &#39;Gun&#39;. Voer 10 (kV) voor de EHT target en klik op OK. Klik op het tabblad onderkant EHT en selecteer &#39;EHT On&#39;. </li><li> Selecteer &#39;InLens&#39; uit de detectoren drop-down lijst in het tabblad &#39;detectoren&#39;. Optimaliseer imaging voorwaarden (focus, helderheid en contrast, de koplampen, astigmatisme), naargelang het geval. </li><li> Klik op het tabblad &#39;Scannen&#39;. Kies een snelle scan ( &#39;Scan Speed ​​= 1&#39;, wat overeenkomt met een verblijftijd van 100 nanoseconden per pixel) te stralen schade te minimaliseren, eneen &#39;Store resolutie &quot;van 1024 x 768 pixels. Selecteer &#39;Line Gem&#39; in de &#39;Noise Reduction&#39; drop-down lijst. Stel de waarde van N tot 20 - 30 lijnen voor het zoeken. Verplaats het monster met behulp van de functie van het &#39;Centre Point&#39; (door te drukken op de controle-tab op het toetsenbord) om te zoeken naar regio&#39;s met een gebroken cellen en chloroplasten (Figuren 2A en 2B). </li><li> Acquire beelden van gebroken chloroplasten bij lage vergrotingen (50-70 kX) (figuur 2C en 2D). Gebruik de functie &#39;Centre Feature&#39; (door te drukken control-shift-tab op het toetsenbord) in interessante chloroplast breuk gezichten te zoomen en afbeeldingen te verwerven bij hoge vergrotingen (100-200 kX figuren 3 en 4). Gebruik dezelfde parameters als in stap 3.6 voor het verwerven, maar verander de Line Gem waarde N&gt; 100 voor ruisonderdrukking 30. <ol><li> Druk op Freeze op de belangrijkste microscoop controle-eenheid of in het tabblad &#39;Scannen&#39; om het scannen te stoppen en op te slaanhet beeld door te drukken op de &#39;Save TIFF&#39; knop. </li></ol></li></ol> 4. Beeldanalyse Opmerking: Dit deel beschrijft een korte procedure voor segmentatie van membraan deeltjes uit freeze-fractuur SEM beelden met behulp van de Fiji-31 open-source-pakket. Soortgelijke resultaten kunnen worden verkregen met andere beeldanalyse software. <ol><li> Open afbeelding met Fiji door image-bestand te slepen naar het hoofdvenster van het programma. Omzetten op de afbeelding om 8-bit door het selecteren van Image / Type / 8-bit. Kies Afbeelding / Aanpassen / Helderheid / Contrast en pas als dat nodig is (figuur 5A). </li><li> Met behulp van de rechte lijn gereedschap, trek een lijn van de grootte van de ingesloten afbeelding schaal bar. Selecteer Analyseren / Set Scale. Voer de juiste schaal informatie (bekend afstand en de Eenheid van de lengte) en klik op OK. Sla deze geschaald beeld aangepast. </li><li> Select Process / Filters / Gaussiaanse vervaging (1,5 nm straal) en klik op OK (Figuur 5B). </li><li> Afbeelding selecteren / aanpassen / Auto Lokale Threshold (met behulp van de Niblack methode) en klik op OK (figuur 5C). </li><li> Selecteer Bewerken / omkeren en vervolgens Proces / Binary / Watershed (figuur 5D). </li><li> Teken een rand rond de regio van belang (ROI) met het gereedschap Selectie uit vrije hand. Voeg de selectie om de ROI manager door Bewerken / Selectie / Voeg toe aan Manager of door &#39;t&#39; klikken. </li><li> Selecteer Bewerken / Clear Outside (Figuur 5E). </li><li> Selecteer Analyseren / Set Metingen, kiest u de juiste parameters (bijv gebied, fit ellips). </li><li> Selecteer Analyze / Analyseer Deeltjes. Voer een passend aanbod voor de grootte van de deeltjes en markeer &#39;Toon resultaten&#39;, &#39;Toevoegen aan Manager&#39; en, indien nodig, de &#39;Uitsluiten op de randen&#39; optie en klik op OK. Het resultaat wordt getoond in figuur 5F. </li><li> Open het opgeslagen geschaald afgebeeld bestand (stap 4.2). Selecteer &#39;Show All&#39; en schakel &#39;Labels&#39; in de ROI Manager. Geef je mening over de geselecteerde particles gelegd op het oorspronkelijke beeld en handmatig toevoegen of verwijderen van selecties met behulp van de &#39;toevoegen&#39; of &#39;Verwijderen&#39; knoppen van de ROI Manager. Corrigeer selecties nodig met behulp van de functie Selectie uit vrije hand en de knop &#39;Update&#39; van de ROI Manager (Figuren 5G en 5H). </li><li> Analyseer de gegevens waarbij de verkregen metingen. In het venster Resultaten, klikt u op Resultaten / Vat te verkrijgen, bijvoorbeeld, de gemiddelde omgeving, en de gemiddelde Major en Minor assen van de in de ROI Manager opgenomen deeltjes. Klik Uitslagen / Distribution, selecteer een parameter (zoals Area) en klik op OK om een ​​histogram voor deze parameter te bekijken. </li></ol>

<ol><li>Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+consequences+of+grana+stacking+of+thylakoid+membranes+in+vascular+plants%3A+a+personal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Aust.+J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Insights into the consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: a personal perspective.</a> Aust. J. Plant Physiol. 26 (7), 625-639 (1999).</li>
<li>Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fracture+Faces+of+Frozen+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Fracture Faces of Frozen Membranes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 55 (5), 1048-1056 (1966).</li>
<li>Branton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-Etching+Nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Freeze-Etching Nomenclature.</a> Science. 190 (4209), 54-56 (1975).</li>
<li>Goodenough, U. W., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Differentiation+of+Stacked+and+Unstacked+Chloroplast+Membranes+-+Freeze-Etch+Electron+Microscopy+of+Wild-Type+and+Mutant+Strains+of+Chlamydomonas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural Differentiation of Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes - Freeze-Etch Electron Microscopy of Wild-Type and Mutant Strains of Chlamydomonas.</a> J. Cell Biol. 48 (3), 594-619 (1971).</li>
<li>Simpson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-Fracture+Studies+on+Barley+Plastid+Membranes+.6.+Location+of+the+P700-Chlorophyll+a-Protein-1%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .6. Location of the P700-Chlorophyll a-Protein-1.</a> Eur. J. Cell Biol. 31 (2), 305-314 (1983).</li>
<li>Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+Particle+Movements+Associated+with+Unstacking+and+Restacking+of+Chloroplast+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Invitro.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversible Particle Movements Associated with Unstacking and Restacking of Chloroplast Membranes.</a> Invitro. J. Cell Biol. 71 (1), 136-158 (1976).</li>
<li>Miller, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Chloroplast+Membrane+Lacking+Photosystem-I+-+Changes+in+Unstacked+Membrane+Regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">A Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-I - Changes in Unstacked Membrane Regions.</a> Biochim. Biophys. Acta. 592 (1), 143-152 (1980).</li>
<li>Miller, K. R., Cushman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+Membrane+Lacking+Photosystem-II+-+Thylakoid+Stacking+in+the+Absence+of+the+Photosystem-II+Particle%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-II - Thylakoid Stacking in the Absence of the Photosystem-II Particle.</a> Biochim. Biophys. Acta. 546 (3), 481-497 (1979).</li>
<li>Miller, K. R., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Thylakoid+Outer+Surface+-+Coupling+Factor+Is+Limited+to+Unstacked+Membrane+Regions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Thylakoid Outer Surface - Coupling Factor Is Limited to Unstacked Membrane Regions.</a> J. Cell Biol. 68 (1), 30-47 (1976).</li>
<li>Simpson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-Fracture+Studies+on+Barley+Plastid+Membranes+.3.+Location+of+the+Light-Harvesting+Chlorophyll-Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Carlsberg+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .3. Location of the Light-Harvesting Chlorophyll-Protein.</a> Carlsberg Res. Commun. 44 (5), 305-336 (1979).</li>
<li>Olive, J., Recouvreur, M., Girardbascou, J., Wollman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+Identification+of+the+Exoplasmic+Face+Particles+on+the+Freeze-Fractured+Thylakoid+Membranes+-+a+Study+Using+Double+and+Triple+Mutants+from+Chlamydomonas-Reinhardtii+Lacking+Various+Photosystem-Ii+Subunits+and+the+Cytochrome+B6%2FF+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Further Identification of the Exoplasmic Face Particles on the Freeze-Fractured Thylakoid Membranes - a Study Using Double and Triple Mutants from Chlamydomonas-Reinhardtii Lacking Various Photosystem-Ii Subunits and the Cytochrome B6/F Complex.</a> Eur. J. Cell Biol. 59 (1), 176-186 (1992).</li>
<li>Olive, J., Vallon, O., Wollman, F. A., Recouvreur, M., Bennoun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+Cytochrome+B6%2FF+Complex+.2.+Localization+of+the+Complex+in+the+Thylakoid+Membranes+from+Spinach+and+Chlamydomonas-Reinhardtii+by+Immunocytochemistry+and+Freeze-Fracture+Analysis+of+B6%2FF+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Studies on the Cytochrome B6/F Complex .2. Localization of the Complex in the Thylakoid Membranes from Spinach and Chlamydomonas-Reinhardtii by Immunocytochemistry and Freeze-Fracture Analysis of B6/F Mutants.</a> Biochim. Biophys. Acta. 851 (2), 239-248 (1986).</li>
<li>Armond, P. A., Staehelin, L. A., Arntzen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Relationship+between+Light+Harvesting+Complex+and+Photosystem-1+and+Photosystem-2+in+Stacked+and+Unstacked+Chloroplast+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatial Relationship between Light Harvesting Complex and Photosystem-1 and Photosystem-2 in Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes.</a> J. Cell Biol. 70 (2), 400-418 (1976).</li>
<li>Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+structure%3A+from+chlorophyll+granules+to+supra-molecular+architecture+of+thylakoid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynth.+Res%22%5BJournal%5D)">Chloroplast structure: from chlorophyll granules to supra-molecular architecture of thylakoid membranes.</a> Photosynth. Res. 76 (1-3), 185-196 (2003).</li>
<li>Nevo, R., Charuvi, D., Tsabari, O., Reich, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition%2C+architecture+and+dynamics+of+the+photosynthetic+apparatus+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Composition, architecture and dynamics of the photosynthetic apparatus in higher plants.</a> Plant J. 70 (1), 157-176 (2012).</li>
<li>Platt, K. A., Oliver, M. J., Thomson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membranes+and+Organelles+of+Dehydrated+Selaginella+and+Tortula+Retain+Their+Normal+Configuration+and+Structural+Integrity+-+Freeze-Fracture+Evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Membranes and Organelles of Dehydrated Selaginella and Tortula Retain Their Normal Configuration and Structural Integrity - Freeze-Fracture Evidence.</a> Protoplasma. 178 (1-2), 57-65 (1994).</li>
<li>Platt-Aloia, K. A., Thomson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+the+use+of+intact+plant+tissues+in+freeze-fracture+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc.+Tech%22%5BJournal%5D)">Advantages of the use of intact plant tissues in freeze-fracture electron microscopy.</a> J. Electron Microsc. Tech. 13 (4), 288-299 (1989).</li>
<li>Carson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+technical+elements+of+freeze-fracture%2Ffreeze-etch+in+biological+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy.</a> J. Vis. Exp. (91), e51694(2014).</li>
<li>Kirchhoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-light-induced+formation+of+semicrystalline+photosystem+II+arrays+in+higher+plant+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Low-light-induced formation of semicrystalline photosystem II arrays in higher plant chloroplasts.</a> Biochemistry. 46 (39), 11169-11176 (2007).</li>
<li>Johnson, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoprotective+Energy+Dissipation+Involves+the+Reorganization+of+Photosystem+II+Light-Harvesting+Complexes+in+the+Grana+Membranes+of+Spinach+Chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Photoprotective Energy Dissipation Involves the Reorganization of Photosystem II Light-Harvesting Complexes in the Grana Membranes of Spinach Chloroplasts.</a> Plant Cell. 23 (4), 1468-1479 (2011).</li>
<li>Kirchhoff, H., Tremmel, I., Haase, W., Kubitscheck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+photosystem+II+organization+in+grana+thylakoid+membranes%3A+evidence+for+a+structured+arrangement%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Supramolecular photosystem II organization in grana thylakoid membranes: evidence for a structured arrangement.</a> Biochemistry. 43 (28), 9204-9213 (2004).</li>
<li>Belgio, E., Ungerer, P., Ruban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+Light-harvesting+superstructures+of+green+plant+chloroplasts+lacking+photosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Environ%22%5BJournal%5D)">V Light-harvesting superstructures of green plant chloroplasts lacking photosystems.</a> Plant Cell Environ. , (2015).</li>
<li>Goral, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-harvesting+antenna+composition+controls+the+macrostructure+and+dynamics+of+thylakoid+membranes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Light-harvesting antenna composition controls the macrostructure and dynamics of thylakoid membranes in Arabidopsis.</a> Plant J. 69 (2), 289-301 (2012).</li>
<li>Charuvi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoprotection+Conferred+by+Changes+in+Photosynthetic+Protein+Levels+and+Organization+during+Dehydration+of+a+Homoiochlorophyllous+Resurrection+Plant%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Photoprotection Conferred by Changes in Photosynthetic Protein Levels and Organization during Dehydration of a Homoiochlorophyllous Resurrection Plant.</a> Plant Physiol. 167 (4), 1554-1565 (2015).</li>
<li>Farrant, J. M., Brandt, W., Lindsey, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Overview+of+Mechanisms+of+Desiccation+Tolerance+in+Selected+Angiosperm+Resurrection+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Stress%22%5BJournal%5D)">An Overview of Mechanisms of Desiccation Tolerance in Selected Angiosperm Resurrection Plants.</a> Plant Stress. 1 (1), 72-84 (2007).</li>
<li>Walther, P. High-resolution cryoscanning electron microscopy of biological samples. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalther%2C+P+%22Biological+Low-Voltage+Scanning+Electron+Microscopy%22">Biological Low-Voltage Scanning Electron Microscopy</a>. Schatten, H., Pawley, J. B. , Springer. New York. 245-261 (2008).</li>
<li>Walther, P., Müller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-layer+coating+for+field-emission+cryo-scanning+electron+microscopy--present+state+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Double-layer coating for field-emission cryo-scanning electron microscopy--present state and applications.</a> Scanning. 19 (5), 343-348 (1997).</li>
<li>Walther, P., Wehrli, E., Hermann, R., Müller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-layer+coating+for+high-resolution+low-temperature+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Double-layer coating for high-resolution low-temperature scanning electron microscopy.</a> J. Microsc. 179, (Pt 3) 229-237 (1995).</li>
<li>Hess, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreparation+methodology+for+plant+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">Cryopreparation methodology for plant cell biology.</a> Cell. Electron Microsc. 79, 57-100 (2007).</li>
<li>Schertel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+FIB-SEM%3A+Volume+imaging+of+cellular+ultrastructure+in+native+frozen+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens.</a> J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Walther, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+freeze-fracturing+of+high-pressure+frozen+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples.</a> J. Microsc. 212 (1), 34-43 (2003).</li>
<li>Nevo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+Thylakoid+Membrane+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+Photosynth%22%5BJournal%5D)">Architecture of Thylakoid Membrane Networks.</a> Lipids Photosynth. 30, 295-328 (2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De in dit document beschreven techniek maakt onderzoek gevries- gebroken membranen in de context van goed bewaarde hogedruk bevroren plantenweefsel door cryo-scanning elektronenmicroscopie. Het grote voordeel van het gebruik van deze procedures is dat de bereiding van de monsters is puur lichamelijk; geen stappen met chemische stoffen of uitdroging zijn noodzakelijk. Zo staat het bestuderen van biologische structuren op een near-native state 26,32. Het voordeel van bladweefsel is dat informatie over de totale...

Oxygenic fotosynthese, van oorsprong uit het oude cyanobacteriën, werd overgenomen door algen en landplanten door endosymbiotic gebeurtenissen die hebben geleid tot de ontwikkeling van de chloroplast organel. In alle hedendaagse oxygenic fototroof zijn fotosynthetische elektronen transport en het genereren van proton-motive force en het verminderen van de macht binnen afgeplatte sac-achtige blaasjes zogenaamde &#39;thylakoid&#39; membranen uitgevoerd. Deze membranen huis van de eiwitcomplexen die de light-driven reacties van fotosynthese uit te voeren en een medium voor energie transductie. De thylakoïdmembranen van planten en (sommige) algen worden onderverdeeld in twee afzonderlijke morfologische domeinen: strak appressed membraan regio genaamd &#39;grana&#39; en gestapelde membranen die de grana met elkaar te verbinden, de zogenaamde &#39;stroma lamellen &quot;1. Diverse freeze-fractuur studies van planten en algen thylakoïdmembranen zijn uitgevoerd, te beginnen in de vroege jaren 1970. Bij bevriezing gebroken, membranenverdelen langs hun hydrofobe kern 2, genereren van een exoplasmatische vlak (EF) en een protoplasma vlak (PF), afhankelijk van de cellulaire compartiment dat helft membraan grenzen, zoals oorspronkelijk bedacht door Branton et al. . in 1975 3 Plant en algen thylakoiden hebben vier verschillende breuk gezichten: EF, efu, PF en PFU, met een &#39;s&#39; en &#39;u&#39; aanduiding &#39;gestapeld&#39; en &#39;gestapelde&#39; membraan regio&#39;s, respectievelijk. Het membraan eiwitcomplexen, die niet gesplitst of gebroken, hebben de neiging met ofwel de E of P zijde van het membraan blijft. De initiële observaties dat de verschillende breukvlakken van de thylakoiden bevatten deeltjes van verschillende afmetingen en dichtheden 4, en de talrijke onderzoeken die volgde, leidde tot de identificatie en correlatie tussen de waargenomen deeltjes en het membraaneiwit complexen die de lichtreacties uitvoeren 5-13 (beoordelingen zie ook 14,15). Freeze-fractuur experimenten van thylakoïdmembranen worden gewoonlijk uitgevoerd over de voorbereidingen van de chloroplasten of geïsoleerde thylakoïdmembranen (maar zie 16,17), met het risico van een wijziging in de structurele en / of supramoleculaire organisatie die zich kunnen voordoen tijdens de isolatie procedure. Na breuk worden replica&#39;s bereid door verdamping van platina / koolstof (Pt / C), vervolgens een dikke laag koolstof (C), en tenslotte digestie van het biologische materiaal 18. Replica&#39;s zijn gevisualiseerd door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). De traditionele freeze-fractuur-replica techniek blijft om te dienen als een belangrijk instrument voor het bestuderen van de supramoleculaire organisatie van de fotosynthetische membranen en hun aanpassing aan verschillende, bijv., Licht, condities 19-23. In onze recente studie van de homoiochlorophyllous opstanding fabriek Craterostigma pumilum 24, we gericht op de veranderingen in de supramoleculaire organisatie o onderzoekenf thylakoïdmembranen, evenals de totale cellulaire organisatie gedurende dehydratatie en rehydratatie. Het unieke van homoiochlorophyllous opstanding soort is dat ze in staat zijn om de voorwaarden van uitdroging overleven in hun vegetatieve weefsels (bladeren), met behoud van hun fotosynthese-apparaat. Zodra water beschikbaar is, deze planten herstellen en hervatten fotosynthetische activiteit in uren tot enkele dagen 25. Voor dit onderzoek, cryo-EM scanning (SEM) beeldvorming van gevries- gebroken bladmonsters werd gecombineerd met hogedruk freezing sample cryo-immobilisatie. Deze procedures bieden een middel om de bevroren gehydrateerd biologische monsters te visualiseren in een staat dicht bij hun natieve toestand 26. Een belangrijk voordeel is dat de monsters direct na bevriezen-breuk en coating zonder verschillende stappen worden onderzocht. Dit is vooral relevant voor het onderzoek van planten op verschillende relatieve inhoud water (RWC), als hun hydratie toestand tijdens de bereiding wordt gehandhaafd. Hoeooit een belangrijke nadeel is dat bevroren gehydrateerd monsters tijdens beeldvorming kunnen lijden aan beam opleveren, met name wanneer gescand bij hoge vergrotingen, vereist voor nauwkeurige meting van de grootte van fotosynthetische complexen. Om dit te overwinnen, een methode genaamd &#39;double-layer coating&#39; (DLC) 27,28 gecombineerd met specifieke cryo-SEM beeldvorming omstandigheden werden gebruikt. Deze resulteerden in monsters die zijn aanzienlijk minder beam-gevoelig en toegestaan ​​voor de opheldering van waardevolle informatie over fotosynthetische eiwit supramoleculaire organisatie en andere cellulaire bestanddelen van de opstanding fabriek C. pumilum bij hoge vergrotingen in situ.

<table><tbody><tr><td>Ethanol abs</td><td>Bio-Lab</td><td>052505</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Bio-Lab</td><td>162605</td><td></td></tr><tr><td>1-hexadecene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7009</td><td></td></tr><tr><td>0.1/0.2 Platelets</td><td>Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland</td><td>241</td><td>Platelets zijn van 3 mm diameter en 0,5 mm dik (Type A) met 0,1/0,2 mm diepe holtes (met een diameter van 2 mm). Vergelijkbare platelets kunnen worden verkregen van Leica Microsystems.</td></tr><tr><td>High-precision-grade tweezers</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72706-01</td><td>Dumont (Zwitserland) Durostar stijl #5 pincetten; Kan worden vervangen door andere hoge precisie pincetten.</td></tr><tr><td>High-pressure freezing machine</td><td>Bal-Tec</td><td>HPM 010</td><td>High-pressure freezing alternatieven: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems.</td></tr><tr><td>Freeze-fracture systeem</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM BAF 060</td><td></td></tr><tr><td>Cryo voorbereiding laadstation</td><td>Leica Microsystems</td><td>16770228</td><td></td></tr><tr><td>Specimen houder voor universele freeze fracturing</td><td>Leica Microsystems</td><td>16LZ04746VN</td><td>Klemhouder voor specimen carriers met een diameter van 3 mm</td></tr><tr><td>Vacuum cryo-transfer shuttle</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM VCT 100</td><td></td></tr><tr><td>Scanning elektronenmicroscoop</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 055</td><td></td></tr><tr><td>Cryo SEM-platform</td><td>Leica Microsystems</td><td>16770299905</td><td></td></tr><tr><td>Beeldverwerkingssoftware</td><td>SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beeldanalysesoftware</td><td>Fiji/Image J, National Institute of Health</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td><td></td></tr></tbody></table>

het bestuderen van de supramoleculaire organisatie van photosynthetic membranen binnen freeze-gebroken leaf tissues door cryo-scanning electron microscopy

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning elektronenmicroscopie (SEM) van-freeze gebroken monsters maakt onderzoek naar biologische structuren op near native omstandigheden. We beschrijven een techniek voor het bestuderen van supramoleculaire organisatie van fotosynthetisch (thylakoid) membranen binnen bladmonsters. Dit wordt bereikt door hoge druk bevriezing van bladweefsel, vries-breken, double-layer coating en tenslotte cryo-SEM beeldvorming. Gebruik van een dubbele-bekleding werkwijze maakt het verkrijgen hoge vergroting (&gt; 100,000X) met minimaal beam schade aan de bevroren gehydrateerd monsters en minimale effecten opladen. Met behulp van de beschreven procedures die we onderzoek gedaan naar de veranderingen in de supramoleculaire distributie van fotosysteem en lichte oogsten antenne eiwitcomplexen die plaatsvinden tijdens uitdroging van de opstanding fabriek Craterostigma pumilum in situ.

Figuur 1 toont cryo-SEM beelden van plaatjes met hoge druk bevroren, bevriezen-gebroken Craterostigma pumilum blad stukken. In sommige monsters worden grote gebieden van gebroken cellen verkregen (Figuur 1A). In andere gevallen blijft het blad stuk strak gebonden aan de bovenste schijf en wordt geklopt met zich mee (Figuur 1B). Zelfs in het tweede geval kunnen sommige bladweefsel blijft vastzitten aan het mes groeven op de bloed...

Hier beschrijven we een procedure voor het bestuderen van bevroren-gebarsten plantweefsels. Bladmonsters die op hoge druk zijn bevroren, worden bevroren-gebarsten en dubbel gecoat, waardoor goed bewaarde bevroren-gehydrateerde monsters ontstaan die worden afgebeeld met behulp van de cryo-scannen electronenmicroscoop op hoge vergroting met minimale stralingsschade.

Het bestuderen van de Supramoleculaire organisatie van Photosynthetic Membranen binnen Freeze-gebroken Leaf Tissues door Cryo-Scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Het algemene doel van deze techniek is om de supramoleculaire organisatie van fotosynthetische membranen te bestuderen met behulp van cryo-scanning elektronenmicroscopie van vriesbreukmonsters van bladweefsel. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de celbiologie, zoals de morfologische karakterisering van cellen en organellen, de distributie van membraangeïntegreerde proteïncomplexen en de lokalisatie van biomineralen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de vriesbreuk wordt uitgevoerd op bladweefsels, waardoor de supramoleculaire organisatie van het thylakoïdmembraan kan worden onderzocht binnen de natuurlijke context van het organel en de cel.Hoewel deze methode hier wordt gedemonstreerd voor een biologisch monster, kan deze ook worden toegepast op zaken als gels, polymeren en drug-deliverysystemen. Over het algemeen moeten personen die nieuw zijn aan deze procedures er rekening mee houden dat niet alle monsters volledig bevroren of correct gefractureerd zullen zijn. Om cryofixatie van bladweefsels door middel van hogedrukvriezen uit te voeren, begint u met het bekrassen van de bodem van de 0,1-millimeter holte van een 0,1-tot-0,2-millimeter aluminium plaatje met de hoek van een scheermesje.Bereid minstens een dozijn bloedplaatjes voor voor zes monsters. Was de bloedplaatjes vervolgens met absolute ethanol en bewaar ze in een schone schaal. Nadat de hoogdruk-vriesmachine is voorbereid, vult u de monsterbox met vloeibare stikstof.Snijd met een scheermesje een klein stukje blad van de plant en plaats het weefsel met een pincet in een microcentrifugebuisje dat voor de helft is gevuld met hexadecaan. Om de intercellulaire ruimtes van het bladweefsel te infiltreren, steekt u de punt van het infiltratieapparaat, voorbereid zoals beschreven in het tekstprotocol, in het gat in de dop van het microcentrifugebuisje en trekt u aan de zuiger om een vacuüm te creëren. Laat de zuiger na ongeveer 30 seconden weer los.Verwijder vervolgens met een pincet het bladstuk uit de buis. Gebruik het scheermesje om een stukje af te snijden dat klein genoeg is om in een plaatje te passen. Trim het blad indien nodig tot een dikte van minder dan 0,2 millimeter.Om weefselcollaps te voorkomen, worden bladeren vóór het invriezen onder hoge druk geïnfiltreerd met vloeistof. De dikte van het monster wordt onder de 200 micron gehouden om de kans op het verkrijgen van een gruitig monster te maximaliseren. Plaats een schoon plaatje met de bekraste zijde naar boven in de houder van de vriesmachine.Plaats vervolgens het afgesneden stukje blad in de plaat. Gebruik hexadecaan om de resterende ruimte van de plaat te vullen, voordat een andere plaat, met de krassen naar het blad gericht, wordt gebruikt om de sandwich te sluiten. Sluit de houder en draai deze vast.Bevries de sample door op de jet-knop te drukken. Plaats vervolgens de houder snel in vloeibare stikstof. Gebruik voorkoelde pincetten om de sandwich uit de houder te verwijderen, waarbij u er goed op let dat deze niet breekt.Er zijn twee kritische stappen in de procedure: vriesbreuk, wat een willekeurig proces is waarvan het succes alleen in de cryo-SEM kan worden beoordeeld, en de dubbellaagse coating, die vereist is voor het verkrijgen van beelden met een hoge vergroting en minimale schade door de elektronenbundel. Plaats bij het voorbereiden en programmeren van het vriesbreukapparaat volgens de instructies van de fabrikant het platina-koolstofkanon, of Pt/C-kanon, onder een hoek van 45 graden en het koolstofkanon onder een hoek van 90 graden. Koel de tafel van het vriesbreuksysteem tot min 140 of min 160 graden Celsius.Bevestig vervolgens de vacuüm-cryotransfer-shuttle aan de machine en vul de shuttlekamer met vloeibare stikstof. Plaats een specimenhouder voor freeze-fracturing in het laadstation en vul de kamer van het laadstation met vloeibare stikstof. Plaats daarna, met behulp van precisie-pincetten, een bevroren sandwich op de houder en draai deze stevig vast.Keer de houder vervolgens om om te controleren of de sandwich stevig is vastgezet, en herhaal dit voor een tweede sandwich. Koppel de gekoelde shuttle los van de freeze-fracturemachine en sluit deze aan op het laadstation. Open vervolgens het shuttleventiel, breng de intrekarm in de houder, vergrendel deze en plaats de arm samen met de houder opnieuw in de shuttle.Nadat de shuttle opnieuw aan de freeze-fracturemachine is bevestigd, wordt de houder met behulp van de terugtrekarm in de kamer gebracht. Stel nu de hoogte van het freeze-fracturemicrotoommes zo in dat de bovenste plaatjes van de sandwiches worden afgestoten. Breek de sandwiches vervolgens snel met het microtoommes.Til het mes vervolgens onmiddellijk op om contaminatie van de monsters door aan het mes klevend vuil te voorkomen. Positioneer de gekoelde sluiter boven het nieuw blootgelegde vlak om de monsters te beschermen tegen mogelijke contaminatie door watermoleculen in de kamer. Druk vervolgens op Setup om Laag 1 op het scherm weer te geven om de monsters met platina te coaten.Zet vervolgens het Pt/C-kanon aan door op de knop GUN 1 te drukken, gevolgd door de knop ON. Controleer de verdampingssnelheid en zodra deze 0,02 tot 0,04 nanometer per seconde bereikt, druk dan op de knop Measure om de dikte van de afgezette laag te monitoren terwijl de monsters gelijktijdig worden blootgesteld. Om met koolstof te coaten, selecteert u GUN 2 gevolgd door de knop ON.Zodra de verdampingssnelheid ongeveer 0,1 nanometers per seconde bedraagt, drukt u op de knop Measure en schuift u tegelijkertijd het sluiterpaneel weg om de monsters bloot te stellen. Wanneer de coating voltooid is, warmt u de tafel op naar -120 °C. Om de scanningelektronenmicroscoop voor cryo-werk voor te bereiden, selecteert u in het hoofdmenu Stage, Stage Initialize, en bevestigt u dit.Klik onder het tabblad Vacuum op de knop Vent om de vacuümkamer van de microscoop te ontluchten. Selecteer vervolgens Tools, Goto Panel, en open het paneel Stage Points List. Selecteer de positie CRYO EXCHANGE om de tafel naar de juiste coördinaten te bewegen voor het plaatsen van de monsterhouder.Open met een schoon paar handschoenen aan de monsterkamer en plaats de cryostage op de hoofdtafel van de microscoop. Sluit de kamer en klik onder het tabblad Vacuum op de knop Pump. Koel vervolgens de microscoop af door de duor van de microscoop te vullen met vloeibare stikstof.Zodra de temperatuur van de tafel onder min 120 graden Celsius daalt, activeert u de verwarmingsfunctie van de cryo-transferunit om de tafel op te warmen tot min 120 graden Celsius. Bevestig nu de cryo-transfer-shuttle aan de microscoop en plaats de monsterhouder met de intrekbare arm in de cryo-tafel van de microscoop. Verplaats de specimenhouder met de joystick voorzichtig dicht bij de objectieflens.Selecteer in het tabblad Apertures de apertuur van 10 micron. Dubbelklik vervolgens in het tabblad Gun op het veld EHT Target, voer 10 kilovolt in als EHT-doelwaarde en klik op OK. Klik daarna op het onderste EHT-tabblad en selecteer EHT On om de versnellingsspanning in te schakelen. Selecteer in het tabblad Detectors de optie InLens uit de vervolgkeuzelijst. Klik vervolgens op het tabblad Scanning en kies een scansnelheid van één (een snelle scan om beamschade te minimaliseren) en een opslagresolutie van 1024 bij 768 pixels.Selecteer in de vervolgkeuzelijst Ruisreductie de optie Lijngemiddelde en stel de waarde van n in op 20 tot 30 lijnen voor het zoeken. Gebruik vervolgens de centerpoint-functie door de Ctrl- en Tab-toetsen op het toetsenbord in te drukken om het monster naar gebieden van belang te verplaatsen, terwijl u gelijktijdig inzoomt om regio's met gefractureerde cellen te identificeren. Nadat u regio's met gefractureerde cellen heeft geïdentificeerd, scant u het monster onder vergroting om een gefractureerde chloroplast te vinden.Verhoog vervolgens de gemiddelde n-waarde van de lijn naar meer dan 100 voor ruisonderdrukking. Druk in het tabblad Scanning op Freeze om het scannen te stoppen. Door Control Shift Tab op het toetsenbord in te drukken, wordt de center-feature-functie gebruikt om in te zoomen op interessante chloroplast-breukvlakken; vervolgens worden beelden met een hoge vergroting verkregen met dezelfde parameters als voorheen.Druk ten slotte op de knop Save TIFF om de afbeelding op te slaan. Voer de beeldanalyse uit volgens het tekstprotocol. Deze figuur toont een cryo-SEM-afbeelding van een platelet die een onder hoge druk bevroren en gevries-gefractureerd stukje blad van Craterostigma Pumilum bevat met een groot gebied van gefractureerde cellen.In dit voorbeeld ontbreekt het bladerstukje; maar er bleef wat bladweefsel achter, vastgehecht aan de mesgroeven op het plaatje. Nadat een succesvolle breuk is gevonden, worden afbeeldingen van cellen bij lage vergroting gemaakt om regio's van interesse te identificeren, zoals gefractureerde chloroplasten. Er worden afbeeldingen van enkelvoudig gefractureerde chloroplasten gemaakt om de breukvlakken van het thylakoïdmembraan te identificeren.In dit voorbeeld wordt een afbeelding met hoge vergroting getoond van thylakoïdmembranen in bladeren van C.Pumilum. De vier verschillende breukvlakken kunnen worden onderscheiden. De exoplasmische breukvlakken van gestapelde en ongestapelde membranen, respectievelijk EFs en EFu, en de protoplasmische vlakken van gestapelde en ongestapelde membranen, respectievelijk PFs en PFu.Fotosysteem II, of PS2, bevindt zich zowel in de gestapelde grana-membraanregio's van de EFs als in de stromalamellaire membraanregio's van de EFu. Bij hydratatie is de PS2-dichtheid in de EFs ongeveer drie keer zo hoog als in de EFu, wat de twee zijden van elkaar onderscheidt. Tijdens dehydratie van C.Pumilum neemt de dichtheid van PS2 in de EFs geleidelijk af, tot ongeveer de helft van de dichtheid onder gehydrateerde omstandigheden.Opvallend is dat bij verdere uitdroging tot een relatief watergehalte van 5 tot 10%, PS2-complexen zich organiseren in rijen en arrays. De ontwikkeling van de vriesbreuk-replicatechniek maakte de weg vrij voor het bestuderen van de grootte van membraanproteïnecomplexen en hun rangschikking binnen biologische membranen. De combinatie van vriesbreuk met hogedrukvriezen in cryo-SEM maakt het mogelijk om diverse soorten monsters op verschillende schalen te onderzoeken, van weefsel- en cellulair niveau tot op macromoleculair niveau in een bijna-natieve staat.Naast de hier getoonde techniek kunnen methoden zoals energiedispersieve röntgenspectroscopie, EDS, ook worden toegepast in de cryo-SEM; bijvoorbeeld voor het alkaliseren van biomineralen.

studying-supramolecular-organization-photosynthetic-membranes-within

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We presenteren een protocol over hoe om te verzamelen en te verwerken elektronen cryo-tomogrammen van hele mitochondriën. De techniek biedt gedetailleerd inzicht in de structuur, functie en organisatie van grote membraan eiwitcomplexen in de moedertaal van biologische membranen.

Visualisatie van ATP synthase Dimeren in Mitochondriën door Electron Cryo-tomografie

Basistechnieken en verfijningen van freeze-fractuur verwerking van biologische monsters en nanomaterialen voor onderzoek door transmissie elektronenmicroscopie worden beschreven. Deze techniek is een aangewezen methode voor het onthullen ultrastructureel functies en specialisaties van biologische membranen en voor het verkrijgen van Ultrastructureel dimensionale en ruimtelijke gegevens in materials sciences en nanotechnologie producten.

Fundamentele Technische Elementen van Freeze-fractuur / Freeze-ets in Biological Electron Microscopy

Het verkrijgen van hoogwaardige transmissie-elektronenmicroscoopbeelden is een uitdaging, vooral in het geval van plantencellen, die overvloedige grote watergevulde vacuolen en beluchte ruimtes hebben. Tandem hogedrukvriestechniek en snelle vriessubstitutie verminderen de bereidingstijd van plantenmonsters voor TEM aanzienlijk, terwijl ze monsters produceren met uitstekende ultrastructurele behoud.

Tandem Hogedruk Invriezen en Quick Freeze Vervanging van plantaardige weefsels voor Transmission Electron Microscopy

Dit artikel beschrijft de cryo-elektronenmicroscopie-methodologie, die wordt gebruikt om hoogwaardige microscopische beelden van macromoleculen in hun bijna-native toestand te verkrijgen. De methode levert beelden op die geschikt zijn voor verdere computerverwerking met behulp van de single particle-benadering, bedacht om de 3D-reconstructie van een macromolecuul te genereren.

Do&#39;s en Don&#39;ts van cryo-elektronenmicroscopie: A Primer op Monstervoorbereiding en hoge kwaliteit Data Collection voor Macromolecular 3D Wederopbouw

Dit protocol wordt beschreven hoe de voorbijgaande verdichting van het DNA in cyanobacteriën visualiseren. Synchrone teelt, toezicht door fluorescentie microscopie, snelle invriezen, en hoge spanning cryo-Elektronentomografie worden gebruikt. Een protocol voor deze methodologieën wordt gepresenteerd, en toekomstige toepassingen en ontwikkelingen worden besproken.

Visualisatie van DNA verdichting in cyanobacteriën door hoogspannings-Cryo-Elektronentomografie

Het observeren van de waterdistributie binnen de Xylem geeft belangrijke informatie over de Water stromings dynamiek in bosrijke planten. In deze studie demonstreren we de praktische aanpak om Xylem waterdistributie in situ te observeren met behulp van een cryostat en Cryo-SEM, die artefactuele veranderingen in de water status elimineert tijdens de monstervoorbereiding.

Xylem water distributie in houtachtige planten gevisualiseerd met een Cryo-Scanning elektronenmicroscoop

Dit protocol beschrijft de cryoAPEX-methode, waarbij een APEX2-gelabeld membraaneiwit kan worden gelokaliseerd door transmissieelektronenmicroscopie binnen een optimaal bewaarde celultrastructuur.

De CryoAPEX-methode voor elektronenmicroscopieanalyse van membraaneiwitlokalisatie binnen ultrastructureel bewaarde cellen

Met behulp van gefocusseerde ionenbundelfrezen om glasvochtlamellen op het rooster te produceren uit bevroren biologische monsters voor cryo-elektronentomografie.

Lamellen bereiden van glasvochtbiologische monsters met behulp van een dual-beam scanning elektronenmicroscoop voor cryo-elektronentomografie

We presenteren een protocol voor lamellenpreparaat van diepgevroren biologische monsters door cryo-gerichte ionenbundelmicromachining voor structurele studies met hoge resolutie van macromoleculen in situ met cryo-elektronentomografie. Het gepresenteerde protocol biedt richtlijnen voor de bereiding van hoogwaardige lamellen met een hoge reproduceerbaarheid voor structurele karakterisering van macromoleculen in de Saccharomyces cerevisiae.

Bereiding en Cryo-FIB microbewerking van Saccharomyces cerevisiae voor Cryo-Elektronen Tomografie

Het huidige protocol beschrijft cryo-elektronentomografie op afstand met hoge resolutie data-acquisitie met behulp van Tomo5 en daaropvolgende gegevensverwerking en subtomogrammiddeling met behulp van emClarity. Apoferritine wordt als voorbeeld gebruikt om gedetailleerde stapsgewijze processen te illustreren om een cryo-ET-structuur met een resolutie van 2,86 Å te bereiken.

Cryo-elektronentomografie Gegevensverzameling op afstand en subtomogrammiddeling

Cryo-STEM-tomografie biedt een middel om organellen van intacte cellen te visualiseren zonder inbedding, sectie of andere invasieve preparaten. De verkregen 3D-resolutie ligt momenteel in het bereik van enkele nanometers, met een gezichtsveld van enkele micrometers en een toegankelijke dikte in de orde van grootte van 1 μm.

Visualisatie van organellen in situ door cryo-STEM tomografie

Leer de supramoleculaire organisatie van fotosynthetische membranen in bladweefsels bestuderen met cryo-scanningelektronenmicroscopie. Deze methode behoudt de native toestand van thylakoïde membranen voor gedetailleerde celbiologische analyse.

Het bestuderen van de Supramoleculaire organisatie van Photosynthetic Membranen binnen Freeze-gebroken Leaf Tissues door Cryo-Scanning Electron Microscopy (Video) | JoVE Journal

Het bestuderen van de Supramoleculaire organisatie van Photosynthetic Membranen binnen Freeze-gebroken Leaf Tissues door Cryo-Scanning Electron Microscopy

Meer video's verkennen