Verwijdering van exogene materialen uit het buitenste gedeelte van Frozen Cores tot de Oude Biologische Gemeenschappen koesterde Inside Onderzoek

De cryosfeer biedt toegang tot geconserveerde organismen die hebben overleefd onder vroegere omgevingsomstandigheden. Het algemene doel van deze procedure is om verborgen diversiteit te ontsluiten door succesvol exogeen materiaal uit bevroren kernen te verzamelen en te verwijderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van waardevolle historische vragen over specifieke tijdsperioden door organismen te identificeren die zijn teruggewonnen uit gletsjerijs en permafrost.

Het verzamelen van een aseptische kern in het veld is uitdagend vanwege de hoge waarschijnlijkheid van contaminatie. Daarom is het belangrijkste voordeel van deze techniek dat de verwijdering van contaminanten plaatsvindt in een gecontroleerde laboratoriumomgeving. Een visuele demonstratie van dit protocol is essentieel, aangezien de stappen voor het afschrapen en ontsmetten relatief moeilijk aan te leren kunnen zijn.

Het is echt een klus voor twee personen, dus het vereist vooral veel geduld en teamwork. Deze procedure wordt gedemonstreerd door twee ondersteunende wetenschappers uit mijn laboratorium, Karen Foley en Robert Jones. Dit protocol vereist uiterste hygiëne.

Gebruik een oven die is ingesteld op 450 graden Celsius om het volgende gedurende vier uur te bakken: steriele, nucleïnezuurvrije metalen rekken, glaswerk, metalen pincetten en glaswol. Gebruik een wikkel van zware folie om herbesmetting te voorkomen.

Steriliseer vervolgens 85% ethanol en ultrapuur water door middel van filtratie met gebruik van 0,22 micron filters. Deze vloeistoffen moeten op of onder vier graden Celsius blijven, anders kunnen er scheurtjes in het monster ontstaan, waardoor het vatbaarder wordt voor contaminatie. Bewaar de ethanol bij minus 20 graden Celsius.

Bewaar het water bij vier graden Celsius. Steriliseer vervolgens een plastic liniaal met 70% ethanol, gevolgd door een DNA-decontaminatieweefsel en een RNase-decontaminatieweefsel. Veeg elke oplossing onmiddellijk af na het aanbrengen.

Bewaar de liniaal vervolgens in een steriele, nucleïnezuurvrije Whirl-Pak zak. Bereid daarna de ruimte in de koude kamer voor door eerst de wanden, vloeren en een metalen werkbank aldaar te schrobben met 1% bleekmiddel. Stel vervolgens de kamertemperatuur in op ongeveer min 11 graden Celsius.

Draag, zodra alles is voorbereid, lichte overalls, nitrilhandschoenen en mondmaskers in de koelruimte om elke kans op contaminatie van de ruimte of de monsters te verminderen. Deze procedure vereist dat twee personen in tandem werken. Dit kan uitdagend zijn gezien de vele mogelijkheden voor recontaminatie.

Om succes te garanderen, houden we elkaar in de gaten, communiceren we en vervangen we regelmatig de handschoenen. Wanneer alles is voorbereid, brengen we de gesteriliseerde materialen en monsters naar de koelruimte en zetten we deze op de met bleek gereinigde tafel. Dit omvat de voorbereide culturen van S.marcescens.

Eerst wordt de permafrostkern op een voorbereid vel aluminiumfolie geplaatst. Vervolgens wordt de buitenkant van de kern licht geïnoculeerd met een verdunde cultuur van S.marcescens met behulp van een steriele schuimprop. Plaats daarna de kern op een steriel metalen rek boven een tray.

Vervolgens wordt het stalen microtoommes steriel afgeveegd met 70% ethanol, een DNA-decontaminatieoplossing en een RNase-decontaminatieoplossing. Daarna reinigt onderzoeker A de nitril handschoenen op dezelfde manier. Vervolgens houdt A de core onder een hoek van 45 graden boven de tray.

B schraapt voorzichtig ongeveer vijf millimeter van de buitenkant van de gehele kern af, inclusief de uiteinden, met behulp van het steriele mesje, terwijl A de kern na elke schraapbeurt draait. Indien nodig moet het mesje opnieuw worden gereinigd met de drie oplossingen. Vervolgens giet B snel en zorgvuldig filtergesteriliseerde 95% ethanol over de kern, terwijl A de kern draait.

Vervolgens wordt de kern snel met water gespoeld. Het metalen rek boven de tray wordt nu vervangen en de kern wordt op het nieuwe rek geplaatst. De onderzoeker maakt vervolgens de nitrielhandschoenen schoon en plaatst de kern op een schoon rek boven de tray.

Ondertussen besproeit B de gehele kern met een DNA-decontaminatieloesing, gevolgd door een spoeling met filtergesteriliseerd water. Vervolgens besproeit B de gehele kern met een RNase-decontaminatieloesing, gevolgd door nogmaals een spoeling met het water. Tot slot wordt de kern in een steriele Whirl-Pak-zak geplaatst.

Begin met het plaatsen van een metalen rek over een glazen schaal in een bio-safe cabinet met laminaire luchtstroom. Plaats vervolgens de kern op het metalen rek. Laat twee tot vijf millimeter van het buitenste oppervlak van de kern gedurende ongeveer 10 minuten ontdooien.

Draai de kern tijdens deze tijd elke twee minuten 90 graden. Pak na het ontdooien met een pincet wat glaswol en veeg hiermee het gehele oppervlak van de kern af om bacteriën te verzamelen. Inoculeer vervolgens de twee platen met behulp van de glaswol.

Meet vervolgens de buitenafmetingen van de kern met de liniaal, maar raak de kern niet aan. Inoculeer daarnaast twee extra platen met de oorspronkelijke cultuur die eerder werd gebruikt om de buitenkant van de kern te dopen, om te verifiëren of het inoculum levensvatbaar was. Plaats de kern vervolgens in een grote steriele zak en bewaar deze bij -80 °C.

Incubeer de geïnoculeerde platen gedurende één week bij 23 °C en onderzoek deze vervolgens op de aanwezigheid van S.marcescens-kolonies, die bij deze temperatuur rood kleuren. Hoewel dit protocol een reeks kritieke stappen bevat, is het controleren op de groei van Serratia Marcescens een van de belangrijkste. Als er geen zichtbare S.marcescens-kolonies zijn, ga dan door met de volgende ontdooifase.

Indien er S.marcescens-kolonies aanwezig zijn, schraap dan nog eens vijf millimeter van de kern af en herhaal de procedure. Controleer of S.marcescens is gegroeid uit de oorspronkelijke cultuur die werd blootgesteld aan de lage temperaturen van de koelruimte. Monsters werden verzameld uit ijs en permafrost uit een tunnel van 110 meter gelegen in Fox, Alaska.

De tunnel bood toegang tot ijzerrijk silt en alluvium. Monsters werden in drievoud verzameld. De beschreven protocollen werden uitgevoerd in faciliteiten in New Hampshire.

Het 16S rRNA-gen werd gesequentieerd van bacteriën die uit de kernen waren gekweekt. Pseudomonas-soorten domineerden, maar er waren ook leden aanwezig die verwant waren aan Planctomycetia. Bovendien was de afwezigheid van Serratia-soorten van bijzonder belang, wat aantoont dat het contaminatieprotocol exogeen DNA voldoende heeft verwijderd.

Na het bekijken van deze video moet u een goed begrip hebben van hoe u ijs- en permafrostkernen succesvol kuntlyst contamineren. Eenmaal beheerst, kunnen de verwerkingsstappen in de koudekamer in 30 tot 45 minuten worden voltooid, mits dit correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het essentieel om u bewust te zijn van alles en elke plek die u aanraakt.

Bij twijfel kunt u simpelweg uw handschoenen vervangen en opnieuw steriliseren. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals ampliconsequencing en shotgun-metagenomica, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals wat de soortensamenstelling was voor die tijdsperiode, of welke functionele kenmerken dominant waren onder die omgevingsomstandigheden.