Stencil micropatterning van menselijke pluripotente stamcellen voor Probing ruimtelijke organisatie van Differentiatie Fates
17 juni 2016
Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) hebben de intrinsieke vermogen om onderscheid te maken en zichzelf organiseren in verschillende weefsel patronen; hoewel dit vereist de presentatie van ruimtelijke milieu-hellingen. Wij presenteren stencil micropatterning als een eenvoudige en robuuste methode om biochemische en mechanische gradiënten genereren voor het besturen van HPSC differentiatie patronen.
Het algemene doel van deze stencil-gebaseerde micropatroneringsmethode voor humane pluripotente stamcellen is om een eenvoudige en robuuste manier te bieden om ruimtelijke omgevingsgradiënten te genereren die de differentiatiepatronen van stamcellen controleren. Deze methode kan u helpen om belangrijke vragen te beantwoorden over weefselpatronering met behulp van een humaan stamcelmodel, zoals hoe ruimtelijke gradiënten in cel-cel en celmatrix adhesiekrachten kunnen helpen om de differentiatieloten van stamcellen te organiseren. Het voordeel van deze methode is dat het geen aanvullende oppervlaktemodificatie vereist om cellulaire adhesieve ECM-patronen voor cellen te genereren om aan te hechten.
Dit betekent dat de methode compatibel is met verschillende ECM- en substraatconfiguraties, specifiek voor elke cellijn. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de micropatroneringsstappen moeilijk te leren zijn. Omdat het nauwkeurige en zorgvuldige omgang met de stencil en de cellen vereist.
Voor deze procedure moeten de PTMS-stencils al ontworpen en vervaardigd zijn. Evenzo, moeten humane EFC-cellen groeien op basement membraanmatrix, zodat de kolonies klaar zullen zijn voor zaaien later in de procedure. Om te beginnen, laadt u een schaal met 700 microliter 70% analytische-kwaliteit ethanol, in ultra-puur water.
Plaats vervolgens de PDMS-stencil op de oplossing en zet de schaal in een bioveiligheidskast om overnacht te drogen. Controleer de volgende dag of er geen bubbels onder de stencil zijn gevormd. Bewerk vervolgens de schaal totdat de cellen op de stencil kunnen worden gezaaid.
Bereid een aliquot van humane ESC-kwaliteit basement membraanmatrix voor door 16,7 milliliter DMF12 toe te voegen om een 1,5x-oplossing te maken en houd deze op ijs. Behandel het substraat met 100 watt zuurstofplasma gedurende 90 seconden. Open de schaal niet totdat deze zich in de plasmakamer bevindt en dek deze snel af na de behandeling.
Deze behandeling voorkomt dat er zich bubbels vormen wanneer het substraat in oplossing wordt ondergedompeld. Bedek vervolgens de stencil met 450 microliter van de voorbereide 1,5x basement membraanmatrix-oplossing. Verzegel de schaal vervolgens met parafilm en incubeer deze gedurende vijf uur.
Controleer voordat u verder gaat de zes putjes van de bereide HESC-kolonies. Identificeer en aspireer kolonies van gedifferentieerde cellen die hun typische HESC-morfologie hebben verloren. Ze moeten allemaal rond zijn, een strak verpakte epitheelmorfologie hebben en een hoog nucleus-tot-cytoplasma-verhouding met prominente nucleoli hebben.
Was vervolgens elke put van geplateerde cellen twee keer met twee milliliter DMF12. Voeg na de tweede wassing een milliliter van spijsverteringsenzymen toe aan elke put, zoals accutase en incubeer de plaat gedurende acht minuten bij 37 graden Celsius. Na de incubatie, tikt u zachtjes op de plaat om alle kolonies los te maken van het substraat.
Spoel vervolgens elke put af met minimaal vier milliliter media voor elke milliliter van het op de put toegepaste spijsverteringsenzym, en verzamel de celsuspensies in een enkele 15 milliliter conische buis. Centrifugeer de cellen bij 200 g gedurende drie minuten bij kamertemperatuur om een cellaire pellet te vormen. Amputeer vervolgens het supernatant en suspendeer de cellen opnieuw in 400 microliter HESC-onderhoudsmedium, aangevuld met 10 micromolair van rock-remmer.
Tritureer de cellen voorzichtig drie keer om de klonters te breken. Corrigeer vervolgens de dichtheid van de suspensies. Meng het goed en maak een 200 microliter 1:20 verdunning in media.
Tel de cellen in de verdunning met behulp van een hemocytometer. Verdun vervolgens de hoofdsuspensie indien nodig, met behulp van media met rock-remmer. Voeg om verder te gaan het vereiste aantal cellen toe aan elke voorbereide stencil.
Er mag alleen een monolaag van cellen worden afgezet, dus spreid ze gelijkmatig uit. Laat de stencil ongestoord staan gedurende vijf minuten, zodat de cellen kunnen bezinken. Breng vervolgens de geladen stencils voorzichtig over naar een incubator, houd de schalen gedurende de overdracht op niveau.
Laat de cellen zich een uur lang aan de stencils hechten. Nadat de cellen zijn toegestaan om zich te hechten, onderzoekt u ze onder een microscoop om ervoor te zorgen dat ze dat correct hebben gedaan. Breng de stencil terug naar de kap en aspireer de niet-gehechte cellen van de stencil.
Voeg vervolgens twee milliliter 0,5% compatibele niet-ionische oppervlakteactieve stof in DMF12 toe aan het gebied rond de stencil. Zwaai de oplossing rond om de stencil te bedekken. Gebruik vervolgens een paar geautoclaveerde pincetten om de stencil voorzichtig van de schaal te pellen.
Na het verwijderen van de stencil, inspecteert u de micropatterende cellen onder een microscoop. Het niet-ionische oppervlakteactieve middel voorkomt dat deze cellen uitdrogen. Laat de micropatterende cellen gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius incuberen in de met oppervlakteactieve stof aangevulde mediaoplossing.
Aspirieer na 10 minuten de oplossing en was de plaat met twee milliliter normaal DMF12-medium, drie keer. Na de wasbeurten, voegt u twee milliliter HESC-onderhoudsmedium met rock-remmer toe. Inspecteer de cellen nogmaals om te controleren of de micropatronen correct zijn gevormd.
Vervolgens incubeert u de cellen gedurende een nacht bij 37 graden Celsius. De volgende dag aspireert u het medium, wast u de cellen eenmaal met DMF12 en voegt u vervolgens twee milliliter gesupplementeerd differentiatiemedium toe om de cellen te induceren om meso-endoderm-differentiatie te ondergaan. Analyseer later de resultaten.
De fabricage van de cell stencil met behulp van een lasersnijder, voorzag in 1000 micron-functies. De stencil bestond uit een dunne stencilingsplaat met microgepatroneerde doorgaande gaten en een PDMS-pakking om de cellen te bevatten. Met behulp van deze tool werden micropatterende HESC's onderzocht tijdens meso-endoderm-differentiatie.
De randen van H9-HESC-kolonies hebben hogere
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een op stencils gebaseerde micropatterning-methode voor menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) die ruimtelijke omgevingsgradiënten genereert om differentiatiepatronen te beheersen. De methode is eenvoudig, robuust en vereist geen aanvullende oppervlaktemodificaties voor celadhesie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Stamcelbiologie
- Tissue Engineering
- Biochemische Gradiënten
Achtergrond
- Menselijke pluripotente stamcellen kunnen differentiëren in diverse weefseltypen.
- Ruimtelijke gradiënten beïnvloeden het gedrag en het lot van stamcellen.
- Traditionele methoden voor het creëren van gradiënten kunnen complex zijn.
- Micropatterning biedt een eenvoudig alternatief.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het genereren van ruimtelijke gradiënten die de differentiatie van hPSC's beheersen.
- Om onderzoek naar weefselpatroonvorming met behulp van stamcelmodellen te faciliteren.
- Om het proces voor het creëren van celadhesieve patronen te vereenvoudigen.
Gebruikte Methoden
- Stencil-gebaseerde micropatterning-techniek.
- Toepassing van biochemische en mechanische gradiënten.
- Visuele demonstraties ter ondersteuning van het leren van de methode.
- Compatibiliteit met diverse ECM- en substraatconfiguraties.
Belangrijkste resultaten
- De methode genereert effectief gradiënten die de differentiatie beïnvloeden.
- Het maakt een nauwkeurige controle over celadhesie en -organisatie mogelijk.
- Visuele hulpmiddelen verbeteren het begrip van het micropatterning-proces.
- De techniek is aanpasbaar voor verschillende cellijnen.
Conclusies
- Stencil-micropatterning is een waardevolle tool voor stamcelonderzoek.
- De methode vereenvoudigt het creëren van ruimtelijke gradiënten.
- Het opent nieuwe wegen voor het bestuderen van weefselpatroonvorming en differentiatie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Topposities
Sjabloon-micropatterning van menselijke pluripotente stamcellen maakt ruimtelijke controle over differentiatie-uitkomsten mogelijk, waarmee een belangrijke uitdaging in het modelleren van weefselorganisatie en vroege embryonale ontwikkeling wordt aangepakt. Deze methode ondersteunt mechanische risicoreductie door ruimtelijke adhesiegradiënten te koppelen aan lineage-specificatie, wat het voorspellend vertrouwen in differentiatieresultaten verbetert. Het biedt een schaalbaar, substraat-flexibel platform voor het onderzoeken van ruimtelijke patroonmechanismen die relevant zijn voor regeneratieve geneeskunde en ziektemodellering.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om ruimtelijke hypothesen bij stamceldifferentiatie te onderzoeken door cel-cel- en cel-matrix-adhesiepatronen te moduleren.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van eenvoudige stencil-gebaseerde opsluiting zonder dat oppervlaktemodificatie vereist is, waardoor de complexiteit van de assay-ontwikkeling wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Correleert geometrische kenmerken (bijv. scherpe hoeken, convexe krommingen) met gelokaliseerde integrine-tractiekrachten en mesoendoderm-differentiatie, wat bijdraagt aan het verminderen van risico's bij het selecteren van targets.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert reproduceerbare micropatronen die ruimtelijke micro-omgevingen definiëren voor gecontroleerde differentiatie, wat gestandaardiseerde read-outs mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Compatibel met diverse configuraties van de extracellulaire matrix en substraten, waardoor aanpassing aan verschillende cellijnen en experimentele condities mogelijk is.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt parallel testen van geometrische patronen om differentiatieresponsen over meerdere condities te beoordelen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele relevantie: Modelleert de ruimtelijke organisatie van de vorming van kiemblaadjes, waardoor een ziekterelateerd systeem ontstaat voor het bestuderen van patroondefecten in de vroege ontwikkeling.
- Mechanistische risicoreductie: Koppelt fysieke insluiting en adhesie-gemedieerde krachten aan differentiatie-uitkomsten, wat de causale relaties in morfogenese verduidelijkt.
- Preklinische continuïteit: Ondersteunt de overgang van in vitro ruimtelijke controle naar de validatie van differentiatietrouw in lineagespecifieke assays.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing in de stamcelbiologie tot de ontwikkeling van assays voor differentiatiescreening, waarbij de resultaten bijdragen aan beslissingen over lead-identificatie en preklinische validatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing over hoe ruimtelijke gradiënten in adhesiekrachten differentiatie-uitkomsten organiseren tijdens meso-endoderminductie.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk door gestandaardiseerde generatie van micropatronen en kwantitatieve beoordeling van differentiatiepatronen via marker-expressie (bijv. Brachyury T-positieve cellen).
- Analytica: Biedt ruimtelijke read-outs van differentiatie-intensiteit gecorreleerd aan geometrische kenmerken, waardoor vergelijking van condities op basis van gelokaliseerde biomarker-expressie mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Verbindt micropatroon-gestuurde differentiatie met preklinische relevantie door het modelleren van de ruimtelijke organisatie bij vroege embryonale weefselvorming.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: De stencilgebaseerde aanpak is herbruikbaar in verschillende experimenten en aanpasbaar aan diverse hPSC-lijnen en ECM-coatings, wat standaardisatie op platformniveau ondersteunt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit bij differentiatie door nauwkeurige ruimtelijke controle over celadhesie en de micro-omgeving mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Biedt eenvoud en robuustheid, waardoor complexe stappen voor oppervlaktepatronering worden vermeden terwijl de compatibiliteit met standaard hPSC-kweekworkflows behouden blijft.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen in differentiatiestudies door ruimtelijk opgeloste, kwantitatieve gegevens over lineage commitment te leveren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering van differentiatiecondities op basis van de getrouwheid van ruimtelijke patronering en mechanisch inzicht.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in hPSC-kweek, het hanteren van micropatronen en microscopie-gebaseerde analyse van differentiatiemarkers.
- Afhankelijk van toegang tot laser-gefabriceerde PDMS-sjablonen met gedefinieerde geometrieën en plasma-behandelingsapparatuur voor substraatpreparatie.
- Vereist standaardisatie van matrixcoating, celdigestie en aanhechtingstijden tussen cellijnen om de getrouwheid van het patroon te waarborgen.
- Omvat optimalisatie van surfactant-gebaseerde sjabloonverwijdering en wasstappen om celdetachement of uitdroging-artefacten te voorkomen.
- Beperkt door de noodzaak van zorgvuldige handmatige behandeling tijdens de sjabloonoverdracht en het zaaien van cellen om verstoring van de integriteit van het micropatroon te vermijden.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
1:02
Preparing the Stencil for Cell Seeding
2:32
Seeding Human Embryonic Stem Cells onto the Stenciled Substrate
4:39
Stencil Removal and Passivation of Unpatterned Substrate
6:20
Results: Mechanically Patterning Early Mesoendermal Differentiation
7:39
Conclusion
