Name: Stencil micropatterning van menselijke pluripotente stamcellen voor Probing ruimtelijke organisatie van Differentiatie Fates (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Leer stencil-micropatronering van menselijke pluripotente stamcellen om ruimtelijke milieugradiënten te genereren die differentiatiepatronen beheersen. Deze eenvoudige methode vereist geen extra oppervlaktemodificatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door NUS Start subsidie ​​(R-397-000-192-133) en ETPL Gap Fund (R-397-000-198-592). GS is een NUS Research geleerde. Auteurs willen bedanken Dr. Jiangwa Xing voor haar technische ondersteuning op de mobiele micropatterning.

LET OP: Dit protocol beschrijft de fabricage van PDMS stencil met 1000 micrometer patronen door lasersnijden en micropatterning van de hESC lijn, H9 met behulp van de PDMS stencil. 1. Ontwerp en fabricatie van PDMS Stencil voor micropatterning <ol><li> Ontwerp de sjabloneren blad met doorgaande gaten van de gewenste geometrie en grootte (bijvoorbeeld 1000 micrometer cirkels) en de pakking stencil met behulp van computer-aided design software 10. </li><li> Laser-snijd de sjabloneren blad en pakking op 120-150 pm en 2 mm dik polydimethylsiloxaan (PDMS) bladen respectievelijk met behulp van een CO 2 laser-cutter 10. </li><li> Binden de PDMS pakking met de PDMS stencil vel met behulp van vloeibare niet uitgeharde PDMS en bakken bij 60 ° C gedurende 3-4 uur naar het PDMS stencil voor micropatterning verkrijgen. </li><li> Steriliseer de PDMS sjabloon autoclaaf bij 120 ° C gedurende 30 minuten en drogen in een oven te gebruiken. </li></ol> 2. hESCs Mainonderhoud <ol><li> Cultuur hESC lijnen in een feeder-vrij onderhoudsmedium op 1 x hESC gekwalificeerde basaalmembraan matrix gecoate celcultuur platen bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Passage de hESCs als ze ongeveer 70% confluent door 3 minuten incubatie bij 37 ° C met dispase behandeling en mechanisch dissociëren de hESC kolonies in 100-200 urn klonten. De plaat hESCs klonten met een dichtheid van 30-50 klonten per 9,6 cm2 groeigebied op basaalmembraan matrix gecoate weefselkweek polystyreen op 1: 6 splitsverhouding. </li></ol> 3. Stencil micropatterning van menselijke embryonale stamcellen <ol><li> Voorbereiding voorafgaand aan patroonvorming cel <ol><li> Zegel een PDMS stencil op een 60 mm petrischaal door het afgeven van 700 ul 70% analytische kwaliteit ethanol in ultrapuur water in de petrischaal en het plaatsen van de stencil bovenop. </li><li> Plaats de petrischaal binnenkant bioveiligheid kast &#39;s nachts te laten tHij ethanol droog. </li><li> Controleer geen bel bestaat onder de sjabloon zodat de sjabloon vormt een goede afdichting met de Petrischaal. Dit voorkomt lekkage van ECM bekledingsoplossing. Dicht de petrischaal en opslag onder steriele omstandigheden totdat het klaar is voor het zaaien van cellen. </li><li> Bereid hoeveelheden van hESC-gekwalificeerde basaal membraan matrix volgens de Certificate of Analysis. Zorgen dat elk aliquot levert 1 × hESC gekwalificeerde basaalmembraan matrix oplossing verdund in 25 ml Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12) volgens productblad fabrikant. </li><li> Bereid de ECM coating oplossing door het toevoegen van een hoeveelheid van hESC-gekwalificeerde basaal membraan matrix in 16,7 ml DMEM / F12 tot 1,5 × hESC gekwalificeerde basaal membraan matrix oplossing te maken. Houd alle ECM bekledingsoplossing op ijs gelering te voorkomen. </li><li> Supplement hESC onderhoud medium met 10 pM ROCK-remmer (Y27632). </li></ol></li><li><strong&gt; ECM coating op het gestencilde substraat <ol><li> Behandel de petrischaal met 100 WO 2 plasma voor 90 sec. Om steriliteit te verzekeren, maar opent de petrischaal deksel in de plasmakamer vóór de plasmabehandeling, en snel terug bedekken de petrischaal na beëindiging van de behandeling. Dit vergemakkelijkt oppervlaktebevochtiging en voorkomt dat lucht belvorming in de micropatroon doorgaande gaten bij de toevoeging van ECM bekledingsoplossing. </li><li> Voeg 450 ul van 1,5 x hESC gekwalificeerde basaal membraan matrix oplossing voor het hele stencil te dekken. Verzegel de petrischaal met zelf-lasbare film, zoals Parafilm, te voorkomen dat de oplossing uitdroogt en incubeer gedurende 5 uur bij 37 ° C vóór gebruik. </li></ol></li><li> Seeding hESCs op het gestencilde substraat <ol><li> Onderzoek hESC kolonies in 6-well plaat om de gedifferentieerde celgebieden Verliesresultaten typische hESC morfologie identificeren (bijvoorbeeld verlies afgeronde, strak packed epitheliale morfologie, hoge kern / cytoplasma verhouding met prominente nucleoli). Verwijder gedifferentieerde regio&#39;s met behulp van een vacuüm aspirator. </li><li> Was tweemaal met 2 ml DMEM / F12 per putje. </li><li> Voeg 1 ml spijsverteringsenzymen, zoals Accutase, per putje van 6-well plaat en incubeer bij 37 ° C gedurende 8 min. Tik de plaat voorzichtig om alle kolonies los te maken van substraat. </li><li> Spoel elk putje met ten minste 4 ml DMEM / F12 per 1 ml van spijsverteringsenzymen en verzamel de celsuspensie in 15 ml conische buis. </li><li> Centrifugeer de celsuspensie bij 200 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Zuig aan het supernatant te verwijderen en voeg 400 ul van hESC onderhoud medium aangevuld met ROCK-remmer (Rocki) om opnieuw te schorten de cellen. Pipet de celsuspensie op en neer 3 keer zachtjes klonten breken in enkele cellen. </li><li> Meng de enkele celsuspensie goed en verdun 10 ul van de cel monsters in 190 ul DMEM / F12 (1:20 verdunning). Gebruik een hemocytometer naar de cel dichtheid in de voorraad celsuspensie te bepalen. </li><li> Bereken het vereiste cel zaaidichtheid gedurende een be- paalde stencil. Opmerking: Zo hebben we experimenteel bepaalde cel entdichtheid het verkrijgen van een confluente monolaag van afzonderlijke cellen is ongeveer 4444 cellen / mm2. Zo zal een sjabloon met een oppervlakte van 450 mm2 en zaaien volume van 400 pi celsuspensie eisen dat bij een dichtheid van 2 miljoen cellen / 400 pl. </li><li> Verdun de voorraad celsuspensie om de vereiste zaaien dichtheid (zie stap 3.3.8 NB) met hESC kweekmedium aangevuld met Rocki. </li><li> Voeg een aangewezen hoeveelheid celsuspensie die het vereiste aantal cellen in elk sjabloon en laat de petrischaal ongestoord in kap gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te regelen. </li><li> Breng de petrischaal in de incubator en incubeer gedurende 1 uur om voor celhechting. Zorg ervoor dat de petrischaal niveau tijdens de te houdenoverdracht proces waardoor cellen als monolaag in het sjabloon blijven. </li></ol></li><li> Stencil verwijdering en passiveren van unpatterned substraat <ol><li> Onderzoek de petrischaal onder een microscoop om te controleren of de cellen goed zijn bevestigd op het onderliggende substraat. </li><li> Aspireren weg celsuspensie van het stencil. </li><li> Voeg 2 ml / schaal van 0,5% celkweek compatibel niet-ionogene oppervlakteactieve stof in DMEM / F12 met de omgeving van het stencil. </li><li> Gebruik een paar geautoclaveerd pincet om voorzichtig afpellen van de stencil. Zwenk de niet-ionogene oppervlakteactieve oplossing rond de sjabloon afgepeld te voorkomen dat de cellen uitdrogen. Visueel waarnemen de micropatterned-cellen in de petrischaal. </li><li> Incubeer de micropatterned-cellen in 0,5% niet-ionische surfactant-DMEM / F12 gedurende 10 min bij 37 ° C. </li><li> Aspireren weg de niet-ionische surfactant-DMEM / F12 oplossing. Was 3 maal met 2 ml / schaal van DMEM / F12. </li><li> Voeg 2 ml / schotel van hESConderhoud medium aangevuld met rocki en incubeer bij 37 ° C overnacht. </li><li> Na incubatie gedurende de nacht, zuig hESC onderhoud medium aangevuld met rocki, eenmaal wassen met DMEM / F12 en induceren mesoendoderm differentiatie door toevoeging van 2 ml / schaal van differentiatie medium gesupplementeerd met 100 ng / ml activine, 25 ng / ml BMP4 en 10 ng / ml FGF2 . </li><li> Evalueer de micropatterns met behulp van fase contrast beeldvorming en bereken de gemiddelde Brachyury- (T) intensiteit profielen voor elk patroon, zoals eerder beschreven 8. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Graf, T., Stadtfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+embryonic+and+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of embryonic and adult stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 480-483 (2008).</li>
<li>Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).</li>
<li>Guilak, F., Cohen, D. M., Estes, B. T., Gimble, J. M., Liedtke, W., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+stem+cell+fate+by+physical+interactions+with+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix.</a> Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).</li>
<li>Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+nanotopography+and+integrin-matrix+interactions+to+influence+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate.</a> Nat Mater. 13 (6), 558-569 (2014).</li>
<li>Joddar, B., Ito, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+niche+substrates+for+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Artificial niche substrates for embryonic and induced pluripotent stem cell cultures.</a> J Biotechnol. 168 (2), 218-228 (2013).</li>
<li>Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+recapitulate+early+embryonic+spatial+patterning+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 11 (8), 847-854 (2014).</li>
<li>Peerani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-mediated+control+of+human+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation.</a> EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).</li>
<li>Lee, L. H., Peerani, R., Ungrin, M., Joshi, C., Kumacheva, E., Zandstra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+of+human+embryonic+stem+cells+dissects+the+mesoderm+and+endoderm+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Micropatterning of human embryonic stem cells dissects the mesoderm and endoderm lineages.</a> Stem Cell Res. 2 (2), 155-162 (2009).</li>
<li>Hwang, Y. S., Chung, B. G., Ortmann, D., Hattori, N., Moeller, H. C., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwell-mediated+control+of+embryoid+body+size+regulates+embryonic+stem+cell+fate+via+differential+expression+of+WNT5a+and+WNT11%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (40), 16978-16983 (2009).</li>
<li>Toh, Y. C., Xing, J., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+integrin+and+E-cadherin-mediated+adhesions+to+spatially+control+heterogeneity+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modulation of integrin and E-cadherin-mediated adhesions to spatially control heterogeneity in human pluripotent stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 50 (0), 87-97 (2015).</li>
<li>Xing, J., Toh, Y. C., Xu, S., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+human+teratogen+detection+by+geometrically+confined+cell+differentiation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A method for human teratogen detection by geometrically confined cell differentiation and migration.</a> Sci Rep. 5, 10038(2015).</li>
<li>Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+engineering+approaches+to+micropattern+surfaces+for+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays.</a> Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).</li>
<li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+human+embryonic+stem+cell+colony+and+aggregate+size+heterogeneity+influences+differentiation+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li>
<li>Khademhosseini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+human+embryonic+stem+cells+with+murine+embryonic+fibroblasts+on+microwell-patterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates.</a> Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).</li>
<li>Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+microwell+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3-D microwell culture of human embryonic stem cells.</a> Biomaterials. 27 (36), 6032-6042 (2006).</li>
<li>Yao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+as+microscaled+multilayered+colonies+leading+to+enhanced+homogeneity+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Hepatic differentiation of human embryonic stem cells as microscaled multilayered colonies leading to enhanced homogeneity and maturation.</a> Small. 10 (21), 4311-4323 (2014).</li>
<li>Mei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+development+of+biomaterials+for+clonal+growth+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells.</a> Nat Mater. 9 (9), 768-778 (2010).</li>
<li>Melkoumian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+peptide-acrylate+surfaces+for+long-term+self-renewal+and+cardiomyocyte+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 28 (6), 606-610 (2010).</li>
<li>Evans, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+stiffness+affects+early+differentiation+events+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells.</a> Eur Cell Mater. 18, 1-13 (2009).</li>
<li>Carter, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haptotactic+islands%3A+a+method+of+confining+single+cells+to+study+individual+cell+reactions+and+clone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Haptotactic islands: a method of confining single cells to study individual cell reactions and clone formation.</a> Exp Cell Res. 48 (1), 189-193 (1967).</li>
<li>Jimbo, Y., Robinson, H. P., Kawana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+intracellular+calcium+and+electrical+activity+from+patterned+neural+networks+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of intracellular calcium and electrical activity from patterned neural networks in culture.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 40 (8), 804-810 (1993).</li>
<li>Wright, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reusable%2C+reversibly+sealable+parylene+membranes+for+cell+and+protein+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning.</a> J Biomed Mater Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).</li>
<li>Jinno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+multilayer+parylene-C+stencils+for+the+generation+of+patterned+dynamic+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Microfabricated multilayer parylene-C stencils for the generation of patterned dynamic co-cultures.</a> J Biomed Mater Res A. 86 (1), 278-288 (2008).</li>
<li>Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+elastomeric+membranes+as+dry+resists+and+for+dry+lift-off%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off.</a> Langmuir. 15 (8), 2973-2984 (1999).</li>
<li>Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+elastomeric+stencils+for+micropatterning+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures.</a> J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication-based+modulation+of+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation.</a> Lab Chip. 7 (8), 1018-1028 (2007).</li>
<li>Choi, J. H., Lee, H., Jin, H. K., Bae, J. S., Kim, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+of+neural+stem+cells+and+Purkinje+neurons+using+a+polydimethylsiloxane+%28PDMS%29+stencil%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Micropatterning of neural stem cells and Purkinje neurons using a polydimethylsiloxane (PDMS) stencil.</a> Lab Chip. 12 (23), 5045-5050 (2012).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuroArray%3A+a+universal+interface+for+patterning+and+interrogating+neural+circuitry+with+single+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">NeuroArray: a universal interface for patterning and interrogating neural circuitry with single cell resolution.</a> Sci Rep. 4, 4784(2014).</li>
<li>Guvanasen, G. S., Mancini, M. L., Calhoun, W. A., Rajaraman, S., DeWeerth, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polydimethylsiloxane+Microstencils+Molded+on+3-D-Printed+Templates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microelectromech+S%22%5BJournal%5D)">Polydimethylsiloxane Microstencils Molded on 3-D-Printed Templates.</a> J Microelectromech S. 23 (5), 1045-1053 (2014).</li>
<li>Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+polydimethylsiloxane+substrates+with+tunable+elastic+modulus+to+study+cell+mechanobiology+in+muscle+and+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve.</a> PLoS One. 7 (12), 51499(2012).</li>
<li>Chowdhury, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Material+properties+of+the+cell+dictate+stress-induced+spreading+and+differentiation+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells.</a> Nat Mater. 9 (1), 82-88 (2010).</li>
<li>Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Epithelial-Mesenchymal+Transition+by+Transmission+of+Mechanical+Stress+through+Epithelial+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenviron%22%5BJournal%5D)">Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues.</a> Cancer Microenviron. 5 (1), 29-38 (2012).</li>
<li>Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4201-4213 (2010).</li>
<li>Eroshenko, N., Ramachandran, R., Yadavalli, V. K., Rao, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+substrate+stiffness+on+early+human+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Effect of substrate stiffness on early human embryonic stem cell differentiation.</a> J Biol Eng. 7 (1), 7(2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Fabricage van micropatterning stencils Stencil micropatterning biedt een ideale methode om HPSC micropatterns te genereren voor het onderzoeken van niche-gemedieerde differentiatie patronen. Het belangrijkste voordeel van stencil patronen micropatterning boven andere technieken, zoals microcontactprinten en photopatterning, is dat het niet oppervlaktemodificatie vereist en kan worden uitgevoerd op conventionele TCPS substraten. Daarom kan geoptimaliseerd kweekmedium...

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs), waaronder embryonale stamcellen (hESCs) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), wordt gebruik moeten regeneratieve geneeskunde en experimentele modellering van normale en zieke organogenese vanwege hun differentiatie potentieel in cellijnen van drie kiem lagen 1,2. De differentiatie lot van hPSCs zijn zeer gevoelig voor lokale omgevingsfactoren die autocriene of paracriene signalen 1 en mechanotransductie processen gemedieerd door fysische signalen 3-5 kunnen moduleren. Micropatterning cel omvat een reeks technieken die zijn ontwikkeld om ruimtelijk organiseren van de geometrie en de locatie van een celpopulatie als een middel om de lokale cellulaire micro-omgeving regelen, zoals cel-cel interacties 6 en cel-matrix interacties 3. In de context van hPSCs is cel micropatterning toegepast om belangrijke inzichten in hoe niche-afhankelijk krijgenent autocriene signalering moduleert hESC pluripotentie-differentiatie beslissingen 7 en organisatie in de vroege embryonale differentiatie patronen 6. 2D en 3D micropatterned hPSCs zijn gebruikt om de kolonie grootte van multicellulaire patronen, waardoor differentiatie factoren van invloed zijn op de drie kiemlagen 8,9 beheersen. We hebben multicellulaire HPSC micropatterns toegepast om de mate van cel-cel en cel-matrix interacties te moduleren bij een HPSC kolonie sonderen hoe integrine-E-cadherine overspraak tot lot van de cel heterogeniteit 10 kunnen geven. De demonstratie van de bovenstaande rapporten opent nieuwe wegen naar de toepassing van meercellige micropatterns van hPSCs als experimentele modellen voor geneesmiddeltoxiciteit screenen op ontwikkelingsziekten 11, om het effect van groeifactoren en hormonen studie tijdens weefsel of orgaan ontwikkeling en de vorming van ontrafelen weefsel patronen. Een groot aantal cel micropatterning technieken ontwikkeld zoals beoordeeld door Falconnet et. al. 12, maar slechts een handvol, zoals micro-contact afdrukken 7,8,13, microwell cultuur 14,15, photopatterning 6 en microstencils 16 zijn met succes geïmplementeerd hPSCs. De uitdaging met micropatterning hPSCs ligt in hun kwetsbaarheid en een strenge eis van specifieke extracellulaire matrix (ECM) en de groeiomstandigheden voor celhechting en overleving. 2D HPSC patronen, micro-contactdruk is een van de meest gebruikte methoden voor HPSC micropatterns met weefselkweek en glassubstraten 13 genereren. De werkwijze kan worden gebruikt om gemeenschappelijke patroon ECM gebruikt HPSC cultuur, zoals laminine en basaalmembraan matrices, zoals Matrigel. Het vereist echter typisch een tweestaps bekledingswerkwijze geholpen door Poly-D-Lysine en specifieke behoeften inerte atmosfeer en vochtigheidsgraad stabiele ECM micropatterns maken hPSCs te bevestigen op 6,13. De belangrijkste overweging van elk micropatterning methode is de vraag of de modificatie van het oppervlak regime HPSC-lijm ECM patronen op de gewenste geometrische resolutie kan genereren, terwijl het minimaliseren aspecifieke celhechting naar de omliggende gebieden. Hier melden wij het gebruik van stencil micropatterning een eenvoudige methode om HPSC micropatterns genereren zonder andere oppervlaktemodificatie stappen voor de generatie van lijm patronen voor ECM hPSCs te bevestigen op. De cel stencil bestaat uit een dun membraan, bijvoorbeeld polydimethylsiloxaan (PDMS) plaat, met micron op maat doorlopende gaten verzegeld op een celcultuur substraat fysiek ECM coatings en ​​vervolgens uitgezaaid hPSCs bevatten millimeter. Stencilsets patroonvorming werkt door het fysiek beperken van de locatie waar HPSC direct naar onderliggende ECM beklede substraat toegang en voeg deze methode is geschikt voor diverse substraten die HPSC culturen kunnen ondersteunen. De enige requirement is dat de keuze van sjabloon materiaal een omkeerbare afdichting met het substraat kan vormen. Deze substraten omvatten gebruikelijke weefselkweek polystyreen (TCPS) 17, ligand geconjugeerd substraten 18, alsook elastomere substraten met instelbare stijfheid (bijv., PDMS) 19. Deze methode maakt het ook mogelijk coating van verschillende ECM, zoals vitronectine (of VTN eiwit), laminine en basaal membraan matrices (bijv Matrigel en Geltrax) te zorgen voor een goede hechting en differentiatie van hPSCs. Daarom kunnen we doorzenden geoptimaliseerde ECM-substraat configuraties voor een specifiek HPSC lijn stencil micropatterning optimale cel-matrix hechting, overleving en differentiatie. Onlangs heeft een soortgelijke werkwijze ook gerapporteerd hepatische differentiatie micropatterning hESCs behulp poly (methylmethacrylaat) (PMMA) micro-arrays stencil 16 sturen. Cell stencils kunnen worden vervaardigd van verschillende materialen, waaronder ontmoetteals 20,21, poly (p-xylyleen) polymeren 22,23, 16 en PMMA meest, PDMS 24-28. Silicium en poly (p-xylyleen) polymeren mallen vereisen directe etsen van de doorgaande gaten met 20-23 gespecialiseerde apparatuur, die de toegankelijkheid beperkt tot biologische gebruikers. PDMS mallen kunnen worden vervaardigd door verschillende methoden, afhankelijk van de functie vereiste grootte, die typisch varieert van 3 urn tot 2000 urn 11,26-29. Als kleine functies gewenst zijn, kan dunne sjabloneren platen worden geproduceerd door persvormen PDMS pre-polymeer op een microfabricated silicium template met reliëfs van de micropatterns 28. Voor elementen&gt; 1000 urn, een CO 2 lasersnijmachine biedt een eenvoudige en goedkope manier om de patronen op een vooraf gegoten PDMS plaat tijdens fabricage stencil direct gesneden. De recycleerbaarheid van PDMS sjablonen maakt ze rendabel een reeks experimenten met voldoende consistentie voeren. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Hier presenteren we de gedetailleerde methodologie voor de fabricage van een PDMS stencil met 1000 urn kenmerken door lasersnijden en het genereren van hESC micropatterns. Deze hESC micropatterns werden gebruikt voor het moduleren van de omvang van integrine en E-cadherine gemedieerde verklevingen in een hechte hESC kolonie om zo te onderzoeken hoe ruimtelijke polarisatie van celadhesie resulteerde in cel lot heterogeniteit 10.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;2 mm dikke PDMS-plaat</td><td>Specialty Silicone Products Inc., USA</td><td>SSPM823-.005</td><td>Gebruikt om reservoir voor stencil te vormen</td></tr><tr><td>120-150 &mu;m dikke PDMS-plaat</td><td>Specialty Silicone Products Inc., USA</td><td>SSPM823-.040</td><td>Gebruikt om stencil te vormen&nbsp;</td></tr><tr><td>60 mm Petri-schaal</td><td>Nunc Nunclon Delta</td><td>150326</td><td>Substraat voor micropattering</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Accutase, Merck Millipore, Singapore</td><td>SCR005</td><td>Enzym om H9 cellen in enkele cellen te breken</td></tr><tr><td>Activine&nbsp;&nbsp;</td><td>R&amp;D Systems, Singapore</td><td>338-AC-010</td><td>Groeifactor voor H9 differentiatie</td></tr><tr><td>BMP4&nbsp;</td><td>R&amp;D Systems, Singapore</td><td>338-BP-010</td><td>Groeifactor voor H9 differentiatie</td></tr><tr><td>Plasma systeem&nbsp;</td><td>Femto Science, Korea</td><td>CUTE-MP</td><td>Voor plasma oxidatie van stencil</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>StemCell&trade; Technologies, Singapore</td><td>7923</td><td>Enzym gebruikt om de cel-ECM-adhesie tijdens passagering te verzwakken</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO, USA</td><td>11330032</td><td>Basismedium voor H9 cellen</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>R&amp;D Systems, Singapore</td><td>233&ndash;FB&ndash;025</td><td>Groeifactor voor H9 differentiatie</td></tr><tr><td>H9 cellijn</td><td>WiCell Research Institute, Inc., USA</td><td>WA09</td><td>Menselijke embryonale stamcellen</td></tr><tr><td>hESC-gekwalificeerde basement membraan matrix</td><td>Matrigel, BD Biosciences, Singapore</td><td>354277</td><td>Extracellulaire matrix coating om de groei van H9 cellen te ondersteunen</td></tr><tr><td>Inverteer microscoop</td><td>Leica Microsystems, Singapore</td><td>DMi1</td><td>Voor het vastleggen van helderveldbeelden</td></tr><tr><td>Laser snijder</td><td>Epilog Helix 24 Laser System</td><td></td><td>Gebruikt om doorlopende gaten in PDMS-plaat te genereren</td></tr><tr><td>mTeSR&trade;1 medium&nbsp;</td><td>StemCell&trade; Technologies, Singapore</td><td>5850</td><td>Onderhoudsmedium voor H9 cellen</td></tr><tr><td>PDMS&nbsp;</td><td>SYLGARD&reg; 184, Dow Corning Co., USA</td><td>3097358-1004</td><td>Gebruikt voor het bevestigen van de PDMS stencil en reservoir</td></tr><tr><td>ROCKi Y27632</td><td>Calbiochem, Merck Millipore, Singapore</td><td>688000</td><td>Houdt H9 cellen als enkele cellen&nbsp;</td></tr><tr><td>STEMdiff&trade; APEL&trade; medium&nbsp;</td><td>StemCell&trade; Technologies, Singapore</td><td>5210</td><td>Differentiatiemedium voor H9 cellen</td></tr><tr><td>Polyethyleen tereftalaat film</td><td>SureMark Singapore</td><td>SQ-6633</td><td>Gebruikt om stencil te vormen&nbsp;</td></tr><tr><td>Celcultuur compatibele niet-ionische oppervlakteactieve stof</td><td>Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore</td><td>P2443</td><td>Passiveringsreagens om celadhesie op niet-micropatterende substraten af te stoten</td></tr></tbody></table>

stencil micropatterning van menselijke pluripotente stamcellen voor probing ruimtelijke organisatie van differentiatie fates

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's), inclusief embryonale stamcellen en geïnduceerde pluripotente stamcellen, hebben de intrinsieke capaciteit om zich te differentiëren in alle drie de kiembladen. Dit maakt ze een aantrekkelijke celbron voor regeneratieve geneeskunde en experimentele modellering van normale en zieke organogenese. Echter, de differentiatie van hPSC's in vitro is heterogeen en ruimtelijk ongeordend. Technologieën voor celmicropatterning bieden mogelijkheden om de micro-omgeving van stamcellen ruimtelijk te controleren en de resulterende differentiatiebestemmingen te organiseren. Micropatterning van hPSC's moet rekening houden met de strenge vereisten voor overleving en onderhoud van hPSC's. Hier beschrijven we stencil micropatterning als een methode die zeer compatibel is met hPSC's. hPSC micropatterns worden gespecificeerd door de geometrieën van de cell stencil doorgangen, die fysiek bepalen waar hPSC's toegang kunnen krijgen en zich kunnen hechten aan het onderliggende met extracellulair matrix gecoate substraat. Vanwege deze werkingswijze is er meer flexibiliteit om substraten te gebruiken die hPSC's adequaat kunnen ondersteunen in vergelijking met andere celmicropatterning methoden. We benadrukken ook kritische stappen voor het succesvol genereren van hPSC micropatterns. Als voorbeeld laten we zien dat stencil micropatterning van hPSC's kan worden gebruikt om de ruimtelijke polarisatie van cel-cel en cel-matrix adhesies te moduleren, wat op zijn beurt de mesoendoderm differentiatiepatronen bepaalt. Deze eenvoudige en robuuste methode voor het micropatterning van hPSC's vergroot de mogelijkheden om experimentele modellen op te zetten voor onderzoek naar weefselorganisatie en patterning tijdens vroege embryonale ontwikkeling.

In dit artikel beschrijven we de fabricage van een cel sjabloon met behulp van een laser cutter om 1000 urn functies te genereren. Het sjabloon bestond uit 2 delen: een dunne plaat sjabloneren (ongeveer 100-200 micrometer dik) die de micropattern doorgaande gaten en een PDMS pakking om de ECM bekledingsoplossing of celsuspensie bevatten. Hier werden 127 pm en 2 mm dik handel verkrijgbare PDMS platen respectievelijk gebruikt als sjabloneren plaat en pakking. Andere werkwijzen voor het ber...

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) hebben de intrinsieke vermogen om onderscheid te maken en zichzelf organiseren in verschillende weefsel patronen; hoewel dit vereist de presentatie van ruimtelijke milieu-hellingen. Wij presenteren stencil micropatterning als een eenvoudige en robuuste methode om biochemische en mechanische gradiënten genereren voor het besturen van HPSC differentiatie patronen.

Stencil micropatterning van menselijke pluripotente stamcellen voor Probing ruimtelijke organisatie van Differentiatie Fates

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Het algemene doel van deze op sjablonen gebaseerde micropatterning-methode voor humane pluripotente stamcellen is om een eenvoudige en robuuste manier te bieden voor het genereren van ruimtelijke omgevingsgradiënten die de differentiatiepatronen van stamcellen aansturen. Deze methode kan u helpen bij het beantwoorden van kernvragen over weefselpatronering met behulp van een humaan stamcelmodel, zoals de vraag hoe ruimtelijke gradiënten in cel-cel- en cel-matrix-adhesiekrachten kunnen helpen bij het organiseren van de differentiatiebestemmingen van stamcellen. Het voordeel van deze methode is dat er geen aanvullende oppervlaktemodificatie nodig is om celadhesieve ECM-patronen te genereren waaraan cellen zich kunnen hechten.Dit betekent dat de methode compatibel is met verschillende ECM- en substraatconfiguraties, specifiek voor elke cellijn. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de stappen voor micropatterning moeilijk aan te leren zijn, omdat ze een nauwkeurige en zorgvuldige hantering van het sjabloon en de cellen vereisen.Voor deze procedure moeten de PTMS-stencils al zijn ontworpen en gefabriceerd. Zorg er daarnaast voor dat menselijke EFC-cellen gro

stencil-micropatterning-human-pluripotent-stem-cells-for-probing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Geregisseerd differentiatie van hESC 's in de specifieke cellen heeft gegenereerd veel belangstelling voor regeneratieve geneeskunde. Wij bieden een beknopte, stap-voor-stap protocol voor het bepalen van...

Lot in kaart brengen van menselijke embryonale stamcellen door teratoom Formation

Enkele cel genexpressie test is noodzakelijk om inzicht stamcel heterogeniteiten.

Profilering Individuele menselijke embryonale stamcellen door kwantitatieve RT-PCR

Met het doel om veranderingen in miRNA's in gedifferentieerde menselijke neurale stamcellen (hNSC's) te karakteriseren, beschrijven we hNSC-differentiatie op een driedimensionaal systeem, de evaluatie van veranderingen in microRNA-expressie door miRNA PCR-array en computationele analyse voor miRNA-doelwitvoorspelling en de validatie ervan door middel van een dual luciferase-assay.

Differentiatie van een menselijke neurale stamcellen Line op Three Dimensional Culturen, Analyse van MicroRNA en vermeende doelwit-genen

Hier presenteren we menselijke pluripotente de protocollen van de cultuur van het cel van de stam (hPSC), gebruikt om te onderscheiden van hPSCs in CD34+ hematopoietische progenitorcellen. Deze methode maakt gebruik van fase-specifieke manipulatie van canonieke WNT signalering cellen uitsluitend naar ofwel het definitieve of primitieve hematopoietische programma opgeven.

Regie van differentiatie van primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen

Presenteren we een protocol voor snelle, efficiënte en bulk chemische terugkeer van conventionele lineage-primer menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) in een epigenomically-stable naïef voor inplanting epiblast-achtige pluripotente staat. Deze methode resulteert in verminderde lineage-primer genexpressie en duidelijke verbetering gestuurde multilineage differentiatie over een breed repertoire van conventionele hPSC lijnen.

Chemische terugkeer van conventionele menselijke pluripotente stamcellen naar een naïef-achtige toestand met verbeterde Multilineage differentiatie potentie

De hier gepresenteerde methode maakt gebruik van micropatterning samen met kwantitatieve beeldvorming om de ruimtelijke ordening binnen de zoogdier culturen te onthullen. De techniek is gemakkelijk vast te stellen in een standaard laboratorium voor celbiologie en biedt een Tractable systeem om patronen in vitro te bestuderen.

De opkomende ruimtelijke ordening van zoogdiercellen in kaart brengen met behulp van micro patronen en kwantitatieve beeldvorming

Extracellulaire matrix liganden kunnen worden Gedessineerd op polyacrylamidehydrogels om de cultuur van menselijke embryonale stamcellen in kleine kolonies op conforme ondergronden mogelijk te maken. Deze methode kan worden gecombineerd met tractiekracht microscopie en biochemische testen om de wisselwerking tussen weefsel geometrie, door cellen gegenereerde krachten en de specificatie van het lot te onderzoeken.

Patroon van de geometrie van menselijke embryonale stamcel kolonies op conforme ondergronden om de mechanismen van Weefselniveau te beheersen

Celherprogrammering vereist de introductie van belangrijke genen, die de pluripotente celtoestand reguleren en onderhouden. Het protocol beschreven maakt de vorming van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) kolonies van menselijke dermale fibroblasten zonder virale/integrerende methoden, maar met behulp van niet-gemodificeerde Rna's (NM-Rna's) in combinatie met immuun ontduiking factoren vermindering van cellulaire afweermechanismen.

Isolatie van volwassen menselijke dermale fibroblasten uit de buikhuid en de aanmaak van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een niet-integrerende methode

Dit protocol introduceert een lithografievrije micropatroonmethode die eenvoudig en toegankelijk is voor mensen met een beperkte bio-engineeringachtergrond. Deze methode maakt gebruik van aangepaste laser-cut stencils om micropatroon extracellulaire matrix eiwitten in een vorm van belang voor het moduleren van cel morfologieën. De procedure voor micropatterning wordt aangetoond met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide cardiomyocyten.

Eenvoudige lithografie-vrije single cell micropatterning met behulp van Laser-Cut Stencils

We presenteren gedetailleerde protocollen voor de generatie en karakterisering van 2D en 3D human induced pluripotent stamcel (hIPSC)-gebaseerde modellen van neocorticale ontwikkeling, evenals complementaire methodologieën die kwalitatieve en kwantitatieve analyse van primaire cilium (PC) biogenese en functie mogelijk maken.

2D en 3D humane geïnduceerde pluripotente stamcelgebaseerde modellen om primaire ciliumbetrokkenheid tijdens neocorticale ontwikkeling te ontleden

Beschikbare differentiatiesystemen voor pluripotente stamcellen (PSC) naar functionele cellen worden momenteel belemmerd door problemen van ernstige variabiliteit van lijn tot lijn en van partij tot partij. Hier presenteren we, met cardiale differentiatie als belangrijkste voorbeeld, een protocol om het proces van PSC-differentiatie intelligent te monitoren en te moduleren op basis van beeldgebaseerde machine learning.

Een op live-cell beelden gebaseerde machine learning-strategie om pluripotente stamceldifferentiatie te monitoren

Leer stencil-micropatronering van menselijke pluripotente stamcellen om ruimtelijke milieugradiënten te genereren die differentiatiepatronen beheersen. Deze eenvoudige methode vereist geen extra oppervlaktemodificatie.

Stencil micropatterning van menselijke pluripotente stamcellen voor Probing ruimtelijke organisatie van Differentiatie Fates

Meer video's verkennen