Levering van therapeutische siRNA het CZS gebruiken kationische en anionische liposomen

Het algemene doel van deze procedure is om een afleversysteem te ontwerpen dat kleine molecuulmedicijnen zoals siRNA naar de hersenen kan brengen. Deze methode kan sleutelvragen in het gebied van neurodegeneratie beantwoorden, zoals: Is siRNA een haalbare therapeutische optie voor eiwitmisvormingsziekten? en Kunnen we een betrouwbaar geneesmiddelafleversysteem naar de hersenen ontwerpen?

Het belangrijkste voordeel van het creëren van een liposomaal geneesmiddelafleversysteem is dat we onze siRNA intraveneus of via de bloedbaan kunnen toedienen in plaats van direct via neuronaal weefsel, wat leidt tot neuronaal letsel. De implicaties van deze techniek strekten zich uit tot therapeutische toepassingen en diagnostiek van neurodegeneratieve ziekten, omdat deze techniek een specifieke aflevering over de bloed-hersenbarrière mogelijk maakt, specifiek naar acetylcholine-producerende neuronen. Visuele demonstratie van deze techniek is cruciaal, omdat muisstaartvene-injecties moeilijk te leren zijn vanwege de kleine afmetingen van de muisstaartvene.

Begin met het bereiden van een DOTAP tot cholesterol-verhouding van een-op-een. Voor een preparatie van vreemde dierenliposomen, meng twee nanomolen DOTAP en twee nanomolen cholesterol in tien milliliter van een een-op-een chloroform tot methanol-oplossing. Vervolgens, verdampt negen milliliter van de chloroform en methanol-oplossing met behulp van stikstofgas.

Verdampt de laatste milliliter oplosmiddel in een afzuigkap gedurende een nacht zonder gas. De volgende dag zou een dunne lipidenfilm zichtbaar moeten zijn op de bodem van de kolf. Verwarm zowel deze kolf met de lipidenfilm als tien milliliter van een tien procent suikeroplossing tot 55 graden Celsius.

Pipetteer vervolgens langzaam de verwarmde suikeroplossing op de dunne lipidenfilm terwijl u de kolf voorzichtig laat ronddraaien. Monteer vervolgens een extruder met één micron-filters volgens de instructies van de fabrikant. Voeg vervolgens één milliliter van de verwarmde liposomensuspensie toe aan een van de spuiten op de extruder.

Leidt vervolgens de suspensie elf keer door de twee spuiten. Terwijl u de liposomensuspensie verwarmd houdt voor een gemakkelijkere groottebepaling, bepaalt u de grootte van de liposomen door een 45 micron- en een 2 micron-filter. Om grote, unilamellaire vesikels te genereren, voegt u vervolgens 20 microliter van de vier nanomolen liposomensuspensie toe aan 200 microliter van een 20 micromolaire siRNA-voorraadoplossing en incubeert u gedurende tien minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 80 microliter van een 500 micromolaire voorraadoplossing van RVG-9R-targetpeptide toe aan de siRNA-liposomenoplossing en incubeer gedurende tien minuten bij kamertemperatuur.

Bereid een suspensie van vreemde dierenliposomen voor door 2,2 nanomolen van DSPE of DOTAP te mengen in tien milliliter van een twee-op-één chloroform tot methanol-oplossing met 1,6 nanomolen cholesterol en 2 nanomolen DSPE peg. Breng vervolgens stikstofgas aan en wanneer het meeste oplosmiddel is verdampt, laat u de kolf gedurende een nacht in de afzuigkap. Voeg vervolgens langzaam tien milliliter van 1X PBS verwarmd tot 75 graden Celsius toe aan de dunne lipidenfilm.

Laat de lipiden gedurende ten minste een uur rehydreren bij 75 graden Celsius voordat u de liposomensuspensie bepaalt met behulp van een extruder zoals eerder. Pipetteer 20 microliter van elk van de vier nanomolen liposomensuspensies in enkele gebruiksalikequoten en lyofiliseert u gedurende 30 minuten met behulp van een tafelvriesdroger. Voeg vervolgens 1,4 microliter van een 26,6 micromolaire oplossing van protaminesulfaat toe aan 200 microliter van een 20 micromolaire siRNA-voorraadoplossing en incubeert u gedurende tien minuten bij kamertemperatuur om de siRNA te condenseren.

Na de incubatie, rehydrateer DSPE palets met 201,4 microliter van siRNA protamine-oplossing. Rehydrateer de DOTAP palets met 200 microliter van een voorraadoplossing van siRNA van vreemde dieren. Incubeer elke liposomen-siRNA-oplossing gedurende tien minuten bij kamertemperatuur.

Voeg vervolgens tien microliter van een 60 millimolaire EDC-oplossing toe aan elk buisje van de gehydrateerde liposomen. Voeg vervolgens tien microliter van 150 millimolair sulfo-NHS-oplossing toe aan de liposomen-siRNA-oplossing voor zowel DOTAP- als DSPE-pallets. Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur.

Voeg ten slotte 80 microliter van een 500 micromolaire voorraadoplossing van RVG-9R-peptide toe aan de siRNA-liposomenkruislinkoplossing en incubeer gedurende tien minuten bij kamertemperatuur. Na het anestheseren van een muis met twee tot drie procent isofluraangebruik in zuurstof, bedek de ogen van de muis met een oftalmische zalf en bevestig een anesthesie door een teenprik uit te voeren. Ga pas door als er geen reactie is.

Terwijl u de anesthesie behoudt, plaatst u de muis op zijn rug of op zijn zij om de staartvene te benaderen. Veeg de staart af met 70 procent ethanol en gebruik vervolgens een insulinespuit van 26 gauge om 300 microliter van LSPC's of pallets in de staartvene te injecteren. Begin distaal te injecteren en beweeg proximaal als de vene inzakt of scheurt.

Plaats de muis in een schone kooi totdat deze in sternal liggende positie verkeert. Bewaak het dier gedurende enkele uren na de injectie om ervoor te zorgen dat de anesthesie afneemt en er geen nadelige effecten van de behandeling zijn. Nadat u de LSPC's of pallets ten minste 24 uur heeft laten circuleren en de muis vervolgens euthanasieert, verwijdert u een halve hersenhelft.

Plaats vervolgens de halve hersenhelft en 2,5 milliliter fax-buffer op een 40 micron mesh celstrainer en gebruik de plunjer van een spuit om het weefsel door de filter in een petrischaal te drukken. Spoel de celstrainer en petrischaal af met een extra 2,5 milliliter fax-buffer. Breng vervolgens de enkele celsuspensie over in een 15 milliliter conische buis en plaats deze op ijs.

Pipetteer vervolgens