Name: Levering van therapeutische siRNA het CZS gebruiken kationische en anionische liposomen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Leer hoe u therapeutische siRNA naar het centrale zenuwstysteem levert met kationische en anionische liposomen. Deze methode minimaliseert neuronale schade en biedt nieuwe mogelijkheden voor de behandeling van neurodegeneratieve ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen de volgende financieringsbronnen bedanken: het CSU Infectious Disease Translational Research Training Program (ID:TRTP) en het NIH onderzoekssubsidieprogramma (R01 NS075214-01A1). We willen het Telling lab bedanken voor het gebruik van hun monoklonale antilichaam PRC5. We willen ook het Dow lab bedanken voor DOTAP liposomen, en voor het delen van hun expertise in het genereren van liposomen.

Alle muizen werden gefokt en gehouden op Lab Animal Resources, geaccrediteerd door de Vereniging voor evaluatie en accreditatie van het laboratorium Animal Care International, in overeenstemming met protocollen door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Colorado State University goedgekeurd. 1. Bereiding van LSPCs <ol><li> Met een 1: 1 DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propaan): cholesterol ratio voor LSPCs. Voor een 4 nmol liposoompreparaat, meng 2 nmol DOTAP en 2 nmol cholesterol in 10 ml van een 1: 1 chloroform: methanol oplossing in een kolf. </li><li> Damp 9 ml van de chloroform: methanol oplossing met behulp van N2 gas in een zuurkast. Damp de laatste 1 ml oplosmiddel in een zuurkast &#39;s nachts zonder gas. Zich aan een dunne lipidefilm op de bodem van de kolf. </li><li> Verhit 10 ml van een 10% sucrose oplossing van 55 ° C. </li><li> Giet het verwarmde 10% sucrose oplossing op de dunne lipide film langzaam met 1 ml / min, terwijl gently wervelende de kolf. Handhaaf de 10% sucrose en fles met lipiden bij 55 ° C zodat de lipide moleculen in de gel-vloeistoffase blijven. Rehydratatie resulteert in de vorming van multilamellaire blaasjes (MLV). </li><li> Sta lipiden te hydrateren bij 55 ° C gedurende ten minste één uur voor de dimensionering van de liposomen. </li><li> Monteer een extruder instructies van de fabrikant met 1,0 urn filters of gebruik 1,0 pm spuitfilters voor maatvoering. </li><li> Voeg 1 ml van de verwarmde liposoomsuspensie één van de spuiten op de extruder, en passeert de suspensie tussen de twee spuiten 11 maal. Zorg ervoor dat de schorsing in de tegenovergestelde spuit dan het starten van de spuit na de 11 passeert. </li><li> Grootte de liposomen weer door 0,45 urn dan 0,2 urn filters om grote unilamellaire vesicles (LUV&#39;s) te genereren. Houd het liposoom suspensie verwarmd eenvoudiger maatvoering. </li><li> Incubeer 20 ui van het 4 nmol liposoomsuspensie (200 uM) met 200 pi van een 20 pM (4nmol totaal) stock siRNA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Incubeer 80 ul van een 500 uM (40 nmol totaal) stock RVG-9R oplossing met de siRNA / liposoom oplossing 10 minuten bij kamertemperatuur. LSPCs moet zo snel mogelijk worden gebruikt maar kunnen worden gebruikt om verschillende uur na bereiding. LSPCs opslag bij 4 ° C gedurende enkele uren na bereiding. </li></ol> 2. Voorbereiding van PALETS <ol><li> Gebruik een 55: 40: 5 molverhouding hetzij DSPE (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfo): cholesterol: DSPE-PEG of DOTAP: cholesterol: DSPE-PEG voor PALETS. Voor een 4 nmol liposoompreparaat, meng 2,2 nmol van hetzij DSPE- of DOTAP, 1,6 nmol cholesterol en 0,2 nmol DSPE-PEG in 10 ml van een 2: 1 chloroform: methanol oplossing in een kolf. </li><li> Bereid liposoomsuspensie precies zoals beschreven in stap 1.1 en 1.2 hierboven. Rehydrateren DSPE liposomen in 10 ml 1x PBS verwarmd tot 75 ° C, toevoegen van 1 ml / min. Sta lipiden te hydrateren bij 75 ° C gedurende tenminimaal 1 uur voordat de grootteklasse. </li><li> Grootte de liposoomsuspensie precies zoals beschreven in stap 1,6-1,8. </li><li> Pipetteer 20 ul van elk van de 4 nmol (200 uM) liposoomsuspensies in afzonderlijke aliquots na DOTAP en DSPE liposomen formaat, en lyofiliseren gedurende 30 min met een benchtop vriesdroger (figuur 2). </li><li> Incubeer 200 pi van een 20 pM (4 nmol totaal) stock siRNA oplossing met 1,4 pi van een oplossing van 26,6 uM protaminesulfaat gedurende 10 min bij kamertemperatuur siRNA dat moet worden ingekapseld in liposomen DSPE PALETS. </li><li> Hydrateren de DOTAP PALETS liposomen met 200 ul van een 4 nmol voorraad oplossing van siRNA of rehydrateren DSPE PALETS liposomen met 201,4 ul van de siRNA / protamine oplossing. Incubeer liposoom / siRNA oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 10 ul van 60 mM 1-ethyl-3- oplossing (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) aan de liposoom / siRNA oplossing voor zowel DOTAP en DSPE PALETS. </li><li> Voeg 10 ul van een 150 mM N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) oplossing van het liposoom / siRNA oplossing voor zowel DOTAP en DSPE PALETS. </li><li> Incubeer de EDC en sulfo-NHS de siRNA / liposoom suspensie gedurende 2 uur bij KT. </li><li> Incubeer 80 ul van een 500 uM (40 nmol totaal) stock RVG-9R oplossing met de siRNA / liposoom verknoping gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. OPMERKING: De EDC / sulfo-NHS maakt het RVG-9 R covalent binden aan de PEG-lipiden. Gebruik PALETS binnen een paar uur na de bereiding. PALETS opslag bij 4 ° C gedurende enkele uren na bereiding. </li><li> Om siRNA inkapseling efficiëntie van PALETS te bepalen: <ol><li> Meet de concentratie van siRNA vóór en na de toevoeging van protamine en liposomen onder toepassing van een spectrofotometer ingesteld op 260 nm. </li><li> Filter de ingekapselde siRNA van het liposoom / ingekapselde siRNA ophanging met behulp van 50 kDa centrifugale filters. Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 20 min. </li><li> Meet de concentratie vaningekapselde siRNA in het filtraat en de concentratie van ingekapselde siRNA in het retentaat met een spectrofotometer bij 260 nm. </li></ol></li></ol> 3. Injecteren Muizen met LSPCs of PALETS <ol><li> Expose muizen voor 5-10 min tot een warmtelamp om bloedvaten te verwijden. </li><li> Verdoven muis met een 2-3% isofluorane / zuurstof vloeien 5-10 minuten vóór de injectie, en tijdens de injectie. Bevestig verdoving wanneer dier niet meer ambulant en ademhaling hebben vertraagd door het doen van een teen knijpen. Plaats de muis op zijn rug of zij toegang krijgen tot de staartader. Gebruik vet zalf op de ogen muis om uitdroging te voorkomen en tegelijkertijd onder verdoving. </li><li> Veeg / spuit de staart met 70% EtOH en injecteer 300 ul van LSPCs of PALETS op de staartader van de muis met behulp van een 26 G insulinespuit. Begin het injecteren distaal in de staartader en proximaal bewegen als de ader instort of breuken. </li><li> Plaats de muis in een schone kooi totdat hij onderhoudt borstligging. Plaats geen mogebruiken met andere mates kooi totdat deze volledig is hersteld. Muizen moeten herstellen in 5 tot 15 minuten. Ze kunnen op een verwarmingselement of onder een warmtelamp om de lichaamstemperatuur te handhaven indien herstel langer duurt worden geplaatst. Muizen moeten nauwlettend worden gevolgd om te beschermen tegen oververhitting. </li><li> Monitor het dier enkele uren na de injectie te waarborgen verdoving uitgewerkt, en er zijn geen nadelige effecten van de behandeling. Laat de LSPCs of PALETS circuleren gedurende tenminste 24 uur. </li></ol> 4. Analyse van eiwitexpressie via flowcytometrie <ol><li> Euthanaseren muizen met een 20% CO2 stroomsnelheid gedurende 15 min. </li><li> Ontleden halve hemisfeer van de hersenen door het wegsnijden van de huid en de schedel van de muis met een schaar. Afpellen halve hemisfeer van de hersenen verwijderd uit de schedel met een tang of het einde van een schaar. </li><li> Druk halve hemisfeer van de hersenen van elke muis door een 40 urn maas zeef gebruik 2,5 ml FACS-buffer (1x, PBS, 1% foetaal runderserum, 10 mM EDTA) in een Petri schaal met de zuiger van een injectiespuit. </li><li> Spoel de cel zeef en de petrischaal met een extra 2,5 ml FACS buffer. Zet de enkele celsuspensie in een 15 ml conische buis op ijs. </li><li> Pipetteer 100 ul van het 5 ml enkelvoudige celsuspensie in een 1,5 ml microcentrifuge buis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 350 x g. Verwijder het supernatant en resuspendeer celpellet in 1 ml FACS buffer. Spin bij 350 xg gedurende 5 minuten. Herhalen met een andere 1 ml FACS buffer. Houd de celsuspensie op ijs. </li><li> Incubeer de cellen in 100 pl 1: 100 verdunning van een 0,5 mg / ml rat anti-muis Fc blok in FACS buffer gedurende 30-60 min op ijs. Pellet en was de cellen zoals in stap 4,5. Houd de celsuspensie op ijs. </li><li> Incubeer de cellen in 100 ul van een 20 ug / ml fluorescent antilichaam tegen muizen PrP C in 7% muizenserum in FACS-buffer op ijs gedurende 30-60 min. Pellet en was de cellen zoals in stap 4,5. Houd de celsuspensieop ijs. </li><li> Pellet en resuspendeer de cellen in 1 ml RBC lysis buffer (1x PBS, 155 mM NH4CI, 12 mM NaHCO 3, 0,1 mM EDTA) gedurende 1 min. Pellet in stap 4,5 en resuspendeer de cellen in 1 ml FACS buffer. Houd de celsuspensie op ijs. </li><li> Analyseer PrP expressie C met een flow cytometer zoals hiervoor 10 beschreven. Gate levende cellen van de totale celpopulatie. Gate PrP C + cellen uit levende cellen populatie MFI (mediaan fluorescentie-intensiteit) te bepalen. </li></ol>

<ol><li>Bolton, D. C., Mckinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).</li>
<li>McKinley, M. P., Bolton, D. C., Pruisner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protease-resistant+protein+is+a+structural+component+of+the+scrapie+prion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion.</a> Cell. 35 (1), 57-62 (1983).</li>
<li>Pruisner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+proteinaceous+infectious+particles+cause+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.</a> Science. 216 (4542), 136-144 (1982).</li>
<li>Jeffrey, M., McGovern, G., Sisò, S., González, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+sub-cellular+pathology+of+prion+diseases%3A+relationship+between+morphological+changes%2C+accumulation+of+abnormal+prion+protein+and+clinical+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Cellular and sub-cellular pathology of prion diseases: relationship between morphological changes, accumulation of abnormal prion protein and clinical disease.</a> Acta Neuropathologica. 121 (1), 113-134 (2011).</li>
<li>Büeler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+devoid+of+PrP+are+resistant+to+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mice devoid of PrP are resistant to scrapie.</a> Cell. 73 (7), 1339-1347 (1993).</li>
<li>Pfeifer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivector-mediated+RNAi+efficiently+suppresses+prion+protein+and+prolongs+survival+of+scrapie-infected+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Lentivector-mediated RNAi efficiently suppresses prion protein and prolongs survival of scrapie-infected mice.</a> J Clin Invest. 116 (12), 3204-3210 (2006).</li>
<li>White, M., Farmer, M., Mirabile, I., Brandner, S., Collinge, J., Mallucci, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+treatment+with+RNAi+against+prion+protein+rescues+early+neuronal+dysfunction+and+prolongs+survival+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Single treatment with RNAi against prion protein rescues early neuronal dysfunction and prolongs survival in mice.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10238-10243 (2008).</li>
<li>Gallozzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prnp+knockdown+in+transgenic+mice+using+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Prnp knockdown in transgenic mice using RNA interference.</a> Transgenic Research. 17 (5), 783-791 (2008).</li>
<li>Mallucci, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cellular+prion+protein+reverses+early+cognitive+deficits+and+neurophysiological+dysfunction+in+prion-infected+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeting cellular prion protein reverses early cognitive deficits and neurophysiological dysfunction in prion-infected mice.</a> Neuron. 53 (3), 325-335 (2007).</li>
<li>Pulford, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome-siRNA-peptide+complexes+cross+the+blood-brain+barrier+and+significantly+decrease+PrPC+on+neuronal+cells+PrPRes+in+infected+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Liposome-siRNA-peptide complexes cross the blood-brain barrier and significantly decrease PrPC on neuronal cells PrPRes in infected cultures.</a> PLoS One. 5 (6), (2010).</li>
<li>Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+liposome-mediated+RNA+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Cationic liposome-mediated RNA transfection.</a> Proc Natl Acad Sci. 86, 6077-6081 (1989).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+efficiency+of+cationic+liposome-mediated+intravenous+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the efficiency of cationic liposome-mediated intravenous gene delivery.</a> Nat Biotechnol. 15, 167-173 (1997).</li>
<li>Freimark, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipids+enhance+cytokine+and+cell+influx+levels+in+the+lung+following+administration+of+plasmid%3A+cationic+lipid+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cationic lipids enhance cytokine and cell influx levels in the lung following administration of plasmid: cationic lipid complexes.</a> J Immunol. 160 (9), 4580-4586 (1998).</li>
<li>Balzas, D. A., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+for+use+in+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Liposomes for use in gene delivery.</a> J Drug Deliv. , (2011).</li>
<li>Srinivasan, C., Burgess, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+characterization+of+anionic+lipoplexes+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Optimization and characterization of anionic lipoplexes for gene delivery.</a> J Control Release. 136 (1), 62-70 (2009).</li>
<li>Lakkaruju, A., Dubinsky, J. M., Low, W. C., Rahman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+are+protected+from+excitotoxic+death+by+p53+antisense+oligonucleotides+delivered+in+anionic+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes.</a> J Biol Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).</li>
<li>Tao, Y., Han, J., Dou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-targeting+gene+delivery+using+a+rabies+virus+glycoprotein+peptide+modulated+hollow+liposomes%3A+bio-behavioral+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Chem%22%5BJournal%5D)">Brain-targeting gene delivery using a rabies virus glycoprotein peptide modulated hollow liposomes: bio-behavioral study.</a> J Mater Chem. 22, 11808-11815 (2012).</li>
<li>Li, S., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+transfer+via+intravenous+administration+of+cationic+lipid-protamine-DNA+%28LPD%29+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes.</a> Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).</li>
<li>Li, S., Rizzo, M. A., Bhattacharya, S., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cationic+lipid-protamine-DNA+%28LPD%29+complexes+for+intravenous+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Characterization of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes for intravenous gene delivery.</a> Gene Ther. 5 (7), 930-937 (1998).</li>
<li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transvascular+delivery+of+small+interfering+RNA+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system.</a> Nature. 448, 39-43 (2007).</li>
<li>Voinea, M., Simionescu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+of+%27intelligent%27+liposomes+for+efficient+delivery+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Designing of 'intelligent' liposomes for efficient delivery of drugs.</a> J Cell Mol Med. 6 (4), 465-474 (2002).</li>
<li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+are+protected+from+excitotoxic+death+by+p53+antisense+oligonucleotides+delivered+in+anionic+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes.</a> J. Biol. Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).</li>
<li>Li, S., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+transfer+via+intravenous+administration+of+cationic+lipid-protamine-DNA+%28LPD%29+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes.</a> Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).</li>
<li>Büeler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+development+and+behaviour+of+mice+lacking+the+neuronal+cell-surface+PrP+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein.</a> Nature. 356 (6370), 577-582 (1992).</li>
<li>Dykxhoorn, D., Novina, C., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+the+messenger%3A+short+RNAs+that+silence+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (6), 457-467 (2003).</li>
<li>Graham, A., Ray, M., Perry, E., Jaros, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunit+expression+in+the+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Differential nicotinic acetylcholine receptor subunit expression in the human hippocampus.</a> J Chem Neuroanat. 25 (2), 97-113 (2003).</li>
<li>Kretzschmar, H. A., Prusiner, S. B., Stowring, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrapie+prion+proteins+are+synthesized+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Scrapie prion proteins are synthesized in neurons.</a> Am J Pathol. 122 (1), 1-5 (1986).</li>
<li>Moser, M., Colello, R., Pott, U., Oesch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+the+prion+protein+gene+in+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of the prion protein gene in glial cells.</a> Neuron. 14 (3), 509-517 (1995).</li>
<li>Cronier, S., Laude, H., Peyrin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+can+infect+primary+cultured+neurons+and+astrocytes+and+promote+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Prions can infect primary cultured neurons and astrocytes and promote neuronal cell death.</a> Proc Natl Acad Sci. 101 (33), 12271-12276 (2004).</li>
<li>Diedrich, J., Bendheim, P., Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrapie-associated+prion+protein+accumulates+in+astrocytes+during+scrapie+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Scrapie-associated prion protein accumulates in astrocytes during scrapie infection.</a> Proc Natl Acad Sci. 88 (2), 375-379 (1991).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dit rapport beschrijft een protocol om twee systemen voor gerichte toediening die efficiënt siRNA transporten naar het centrale zenuwstelsel te creëren. Eerdere werkwijzen leveren siRNA het CNS opgenomen injecteren siRNA / shRNA vectoren direct in de hersenen, intraveneuze injectie van gerichte siRNA of intraveneuze injectie van niet-gerichte siRNA-liposoom complexen. Injectie van siRNA / shRNA vectoren in het CZS veroorzaakt een afname doeleiwit expressieniveaus. Echter, het siRNA / shRNA niet vrij diffunderen door het...

Prionen zijn ernstige neurodegeneratieve ziekten die het CZS beïnvloeden. Prionziekten voortvloeien uit het verkeerd vouwen van de normale cellulaire prioneiwit PrP C door een infectieus isomeer genaamd PrP Res. Deze ziekten treffen diverse soorten waaronder bovine spongiforme encefalopathie bij runderen, scrapie bij schapen, Chronic Wasting Disease bij hertachtigen en ziekte van Creutzfeldt-Jakob bij mensen 1-3. Prionen veroorzaken neurodegeneratie dat begint met synaptische verlies, en zich ontwikkelt tot vacuolisatie, gliosis, neuronaal verlies, en plaque deposito&#39;s. Uiteindelijk resulterend in de dood van het dier / individu 4. Al tientallen jaren, hebben de onderzoekers onderzochten verbindingen bedoeld om te vertragen of stoppen van de progressie van prionziekte. Onderzoekers hebben echter niet gevonden ofwel een succesvolle therapie of een effectieve systemische afgifte vehikel. Endogene PrP C expressie is vereist voor de ontwikkeling van prionziekten 5 </sup&gt;. Derhalve kan verminderen of elimineren van PrP C expressie resulteren in een vertraging of verbetering van de ziekte. Verschillende groepen die transgene muizen met verlaagde PrP C of geïnjecteerd lentivectors shRNA tot expressie direct in muizen hersenweefsel om de rol van PrP C expressieniveaus in prionziekte onderzocht. Deze onderzoekers vonden verminderen van de hoeveelheid neuronale PrP C leidde tot het stoppen van de geleidelijke neuropathologie van prionziekten en verlengde de levensduur van de dieren 6-9. We hebben gemeld dat de behandeling PrP C siRNA resultaten in klaring van PrP Res in de muis neuroblastoma cellen 10. Deze studies suggereren dat het gebruik van therapieën om PrP C expressieniveaus verlagen, zoals kleine interfererende RNA (siRNA), die splitst mRNA kan te vertragen de progressie van prionziekten. De meeste therapieën onderzocht voor prionziekten afgeleverd op een manier die niet praktisch zou zijnin een klinische setting. Daarom is een siRNA therapie heeft een systemische afgifte, dat intraveneus wordt geleverd en gericht op het CZS. De onderzoekers hebben het gebruik van liposomen als levering voertuigen voor gentherapie producten bestudeerd. Kationische en anionische lipiden worden zowel bij de vorming van liposomen. Kationische lipiden worden meer gebruikt dan anionogene lipiden, omdat het verschil in lading tussen de kationische lipiden en DNA / RNA maakt efficiënt verpakken. Een ander voordeel van kationische lipiden is dat het overschrijden van de celmembraan gemakkelijker dan andere lipiden 11-14. Echter, kationische lipiden zijn meer immunogeen dan anionogene lipiden 13,14. Daarom hebben onderzoekers begonnen te verschuiven gebruiken kationische lipiden in liposomen anionogene. Gentherapie producten efficiënt kunnen worden verpakt in anionische liposomen met de positief geladen peptide protaminesulfaat, waarin DNA / RNA-moleculen 15-19 condenseert. Sinds anionische Lipids minder immunogeen dan kationische lipiden zij circulatietijden toegenomen, en kunnen meer worden getolereerd in diermodellen 13,14. Liposomen gericht op specifieke weefsels middels gerichte peptiden die zijn bevestigd aan de liposomen. Het RVG-9r neuropeptide, dat bindt aan nicotinische acetylcholinereceptoren, is gebruikt om siRNA gericht en liposomen de CNS 17-20. Dit rapport schetst een protocol tot drie siRNA levering voertuigen te produceren en te verpakken en leveren de siRNA tot neuronale cellen (figuur 1). Liposoom-siRNA-peptidecomplexen (LSPCs) bestaan ​​uit liposomen met siRNA en het RVG-9R gericht peptide elektrostatisch gehecht aan het buitenoppervlak van het liposoom. Peptide gericht liposoom ingekapseld therapeutisch siRNA (PALETS) bestaan ​​uit siRNA en protamine ingekapseld in het liposoom met RVG-9 R covalent gebonden aan lipide PEG groepen. Met behulp van de onderstaande methoden om LSPCs en PALET genererenS, PrP C siRNA vermindert PrP C expressie tot 90% in neuronale cellen, die enorme belofte te genezen of aanzienlijk vertragen van het begin van prionziekte pathologie bezit.

<table><tbody><tr><td>DOTAP lipid</td><td>Avanti Lipids</td><td>890890</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Lipids</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>DSPE</td><td>Avanti Lipids</td><td>850715</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG</td><td>Avanti Lipids</td><td>880125</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC268320010</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>EMD Millipore</td><td>113351</td><td></td></tr><tr><td>N2 Gas</td><td>AirGas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Avanti Lipids</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>1.0, 0.4, en 0.2 &#956;m filters</td><td>Avanti Lipids</td><td>610010, 610007, 610006</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Protamine sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10275205</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td>Geportioneerd voor éénmalig gebruik</td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>24510</td><td>Geportioneerd voor éénmalig gebruik</td></tr><tr><td>40 &#956;m Cell Strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block</td><td>BD Pharmigen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PrP antilichaam (PRC5)</td><td>Propriëtair - PRC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

levering van therapeutische sirna het czs gebruiken kationische en anionische liposomen

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Prionziekten ontstaan door het verkeerd vouwen van het normale, cellulaire prioneiwit (PrPC) tot een abnormale, protease-resistente isomeer genaamd PrPRes. De opkomst van prionziekten in wilde populaties en hun toenemende dreiging voor de menselijke gezondheid heeft geleid tot verhoogde inspanningen om een behandeling voor deze ziekten te vinden. Recente studies hebben talloze anti-prion verbindingen gevonden die ofwel de besmettelijke PrPRes isomeer kunnen remmen of de normale cellulaire prioneiwit kunnen verminderen. Echter, de meeste van deze verbindingen overschrijden de bloed-hersenbarrière niet om effectief de PrPRes vorming in hersenweefsel te remmen, zijn niet specifiek gericht op neuronaal PrPC, en zijn vaak te toxisch om in dierlijke of menselijke proefpersonen te gebruiken.
We onderzochten of siRNA dat intravasculair wordt toegediend en gericht is op neuronaal PrPC een veiligere en effectievere anti-prion verbinding is. Dit rapport beschrijft een protocol om twee siRNA liposomaal afleveringsvoertuigen te produceren, en om PrP siRNA te verpakken en af te leveren aan neuronale cellen. De twee liposomaal afleveringsvoertuigen zijn 1) complexeerde-siRNA liposoomformulering met behulp van kationische liposomen (LSPCs), en 2) ingekapselde-siRNA liposoomformulering met behulp van kationische of anionische liposomen (PALETS). Voor de LSPCs wordt negatief geladen siRNA elektrostatisch gebonden aan het kationische liposoom. Een positief geladen peptide (RVG-9r [rabiësvirus glycoproteïne]) wordt aan het complex toegevoegd, dat specifiek de liposoom-siRNA-peptide complexen (LSPCs) over de bloed-hersenbarrière (BBB) richt op acetylcholine-expresserende neuronen in het centrale zenuwstelsel (CZS). Voor de PALETS (peptide-gericht liposoom-ingekapselde therapeutische siRNA) werden de kationische en anionische lipiden gerehydrateerd door de PrP siRNA. Deze procedure resulteert in het inkapselen van de siRNA binnen de kationische of anionische liposomen. Opnieuw werd het RVG-9r neuropeptide gebonden aan de liposomen om de siRNA/liposoom complexen richting het CZS te richten. Met behulp van deze formuleringen hebben we met succes PrP siRNA afgeleverd aan AchR-expresserende neuronen en verminderden we de PrPC expressie van neuronen in het CZS.

Om de efficiëntie van inkapseling siRNA binnen anionogene PALETS verhogen, werd de siRNA gemengd met protamine. Om de beste protamine concentratie voor siRNA te bepalen werd de siRNA gemengd met verschillende concentraties protamine, van 1: 1 tot 2: 1 (Figuur 3A). Er was een 60-65% siRNA inkapselingsefficiëntie in anionische liposomen zonder het gebruik van protamine. Monsters met protamine: siRNA molverhoudingen van 1: 1 tot 1,5: 1 (133-266 nM) hadden 80-90% siRNA inkap...

Het doel van dit protocol is om cationische/anionische liposomen met een neuro-targeterend peptide te gebruiken als een CNS-afleversysteem om siRNA in staat te stellen de BBB over te steken. De optimalisatie van een afleversysteem voor behandelingen, zoals siRNA, zou meer behandelingsopties mogelijk maken voor prionen en andere neurodegeneratieve ziekten.

Levering van therapeutische siRNA het CZS gebruiken kationische en anionische liposomen

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Het algemene doel van deze procedure is het ontwerpen van een afgiftesysteem dat kleine molecuulmedicijnen, zoals siRNA, naar de hersenen kan transporteren. Deze methode kan antwoord geven op kernvragen binnen het vakgebied van neurodegeneratie, zoals: Is siRNA een levensvatbare therapeutische optie voor eiwitvouwingsziekten? en Kunnen we een betrouwbaar systeem voor geneesmiddelafgifte naar de hersenen ontwerpen?Het belangrijkste voordeel van het creëren van een liposomaal drugdelivery-systeem is dat we ons siRNA intraveneus of via de bloedbaan kunnen toedienen in plaats van rechtstreeks via het neurale weefsel, wat zou leiden tot neuronale schade. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie en diagnostiek van neurodegeneratieve ziekten, omdat deze techniek een specifieke toediening over de bloed-hersenbarrière mogelijk maakt, specifiek naar acetylcholine-expresserende neuronen. Een visuele demonstratie van deze techniek is essentieel, aangezien injecties in de staartvin van muizen moeilijk aan te leren zijn vanwege de geringe omvang van de staartvin van de muis.Begin met het voorbereiden van een verhouding van één-op-één DOTAP ten opzichte van cholesterol.

delivery-therapeutic-sirna-to-cns-using-cationic-anionic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

The drug encapsulation enhances tumor cell specificity and reduces neurotoxicity.

Convection-Enhanced Delivery of Polyethylene Glycol-Coated Charged Liposomes into a Rat Brain Tumor

Source: Ullah, I., et.al. A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates a precise intranasal administration technique for delivering neuron-targeting peptide-siRNA complexes to the mouse brain using a specialized positioning device. Anesthetized mice are secured in a head-down-and-forward position to optimize siRNA inhalation while preventing lung drainage. The targeting peptide...

Intranasal Delivery of siRNA to the Mouse Brain Using a Positioning Device

Source: Bender, H. R., et.al. Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the targeted delivery of prion protein (PrP) siRNA to neurons using liposomal siRNA-peptide complexes (LSPCs). Cationic liposomes electrostatically bind PrP-targeting siRNA, which is further stabilized by the RVG-9r peptide for receptor-mediated transport across the blood-brain barrier. Once inside the brain, LSPCs undergo endocytosis in...

Targeted siRNA Delivery to Neurons for Prion Protein Silencing Using Liposomal Complexes

Herhaalde retro-orbitale injectie van kationische complexen liposomes/siRNA/ITSN-1s in muizen, elke 72 uur gedurende 24 dagen, efficiënt siRNA duplex leveren aan de muizenlong microvasculatuur verminderen ITSN 1s-mRNA en eiwitexpressie met 75%. Deze techniek is zeer reproduceerbaar in een dierlijk model, heeft geen bijwerkingen en sterfgevallen voorkomt.

Langdurige zwijgen van Intersectin-1s in Muis Longen door Herhaalde levering van een specifiek siRNA via kationische liposomen. Evaluatie van Knockdown Effects van Electron Microscopy

We beschrijven een werkwijze om drugs te richten op het centrale zenuwstelsel door of implanteren van een katheter of het uitvoeren van een bolus injectie in de rechter laterale ventrikel in muizen. Wij richten ons specifiek op de levering van antisense oligonucleotiden. Deze techniek gemakkelijk aanpasbaar aan andere drugs en ratten.

Directe Intraventriculaire levering van drugs aan het knaagdier centrale zenuwstelsel

Levering blijft de belangrijkste uitdaging voor de therapeutische toepassing van kleine interfererende RNA (siRNA). Dit protocol omvat het gebruik van een multifunctionele en biocompatibele siRNA afleverplateau, bestaande uit arginine en polyethyleenimine geënte poreuze silicium microdeeltjes.

Poreuze Silicon Micropartikels voor Levering van siRNA Therapeutics

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van kationische nanoliposomes, die is gebaseerd op de methode van de droge-film en kan worden gebruikt voor de veilige en efficiënte levering van in vitro getranscribeerd boodschapper-RNA.

Generatie van kationische Nanoliposomes voor de efficiënte levering van In Vitro getranscribeerd Messenger RNA

Hier presenteren we een protocol met behulp van een muis positionerings apparaat dat de juiste plaatsing van muizen mogelijk maakt voor de intranasale toediening van een hersen gerichte peptide-siRNA-formulering die effectieve gen-uitschakeling in het centrale zenuwstelsel toelaat.

Een positionerings apparaat voor de plaatsing van muizen tijdens intranasale siRNA levering aan het centrale zenuwstelsel

Methoden ter voorbereiding en karakterisering van de fysisch-chemische eigenschappen en bioactiviteit van neutraal geladen, pH-responsieve siRNA nanodeeltjes worden gepresenteerd. De criteria voor succesvolle siRNA nanomedicines zoals grootte, morfologie, oppervlaktelast, siRNA lading, en gen het silencing worden besproken.

Voorbereiding van neutraal geladen, pH-responsieve polymere nanodeeltjes voor cytosolische siRNA levering

Hier beschrijven we een methode voor het leveren van geneesmiddelen aan het centrale zenuwstelsel van de rat door het implanteren van een katheter in de lumbale intrathecale ruimte van de wervelkolom. We richten ons op de levering van antisense oligonucleotiden, hoewel deze methode ook geschikt is voor de levering van andere therapeutische modaliteiten.

Intrathecale afgifte van antisense oligonucleotiden in het centrale zenuwstelsel van de rat

Leer hoe u therapeutische siRNA naar het centrale zenuwstysteem levert met kationische en anionische liposomen. Deze methode minimaliseert neuronale schade en biedt nieuwe mogelijkheden voor de behandeling van neurodegeneratieve ziekten.

Levering van therapeutische siRNA het CZS gebruiken kationische en anionische liposomen

Meer video's verkennen