Name: Genome bewerken in Astyanax mexicanus Met behulp van transcriptie Activator-achtige Effector Nucleases (Talens) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Leer gerichte genmutagenese in Astyanax mexicanus met behulp van TALENs. Deze methode onderzoekt de genetische basis van grottaanpassingen en helpt evolutiebiologen bij het begrijpen van genfunctie in holvissen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de afdeling Genetica, Ontwikkeling en Celbiologie en Iowa State University en door NIH-subsidie ​​EY024941 (WJ) .Dr. Jeffrey Essner verstrekt commentaar op het manuscript.

Alle dierlijke procedures waren in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Iowa State University en de Universiteit van Maryland. 1. TALEN Ontwerp <ol><li> Input gewenste doelsequentie naar een TALEN ontwerp website. (Bijvoorbeeld: <a href="https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen">https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen</a> ). Input gekozen spacer / herhalen reeks lengtes. <ol><li> Kopieer de genoomsequentie in het vak &quot;Sequence&quot;. </li><li> Binnen het tabblad &#39;Zorg voor Custom Spacer / RVD Lengths &quot;selecteert u de lengte van de tussengroep en de vele lengte. Opmerking: Spacer lengte van 15 basenparen en herhaal scala lengtes van 15-17 werk goed en maakt de montage minder complex. </li></ol></li><li> Selecteer een TALEN paar. TALEN paren rond een unieke restrictie-enzym plaats zorgen voor genotypering door restrictie-enzym digestieeen PCR product. </li><li> Ontwerp primers aan de genomische regio rond de TALEN beoogde plaats met behulp van een website, zoals Primer3 30-32 versterken. Wanneer genotyperen met een restrictie-enzym, ontwerp primers voor een gebied dat de restrictie enzymplaats eenmalig bevat amplificeren. Aanbevolen wordt deze regio geamplificeerd en gesequenced voorafgaand aan TALEN constructie één polymorfismen in de A. identificeren mexicanus lab bevolking worden gebruikt voor micro-injectie. </li></ol> 2. TALEN Assembly (Gewijzigd van de TALEN Kit Protocol) 33,34 Voor meer informatie en het oplossen van problemen, zie het protocol 34. <ol><li> Bereiden en sequentie noodzakelijke plasmiden uit de TALEN kit volgens instructies van de fabrikant. </li><li> Stel de # 1 reacties voor reacties A en B. opnemen herhaalde variabele diresidues (RVDS) 1-10 en de bestemming vector pFUS_A in reactieschema A. opnemen RVDS 11- (N-1) en ee bestemmingsvector pFUS_B (N-1) in reactieschema B waarbij N het totale aantal RVDS in TALEN. <ol><li> Naar elke reactie: 1 pi van elk plasmide dat elke RVD (100 ng / gl), de bestemming vector (100 ng / ul), 1 ui Bsa I restrictie-enzym, 1 ul runderserumalbumine (BSA) (2 mg / ml ), 1 ui ligase, 2 ui 10X ligasebuffer en x gl water voor een totaal volume van 20 pl. Bijvoorbeeld, zie tabel 1. Opmerking: Half reacties kunnen ook worden gebruikt. </li><li> Plaats reacties in een thermocycler en start de cyclus: 10 keer (37 ° C / 5 min + 16 ° C / 10 min) + 50 ° C / 5 min + 80 ° C / 5 min. </li></ol></li><li> Incubeer de reacties met nuclease. Om elke reactie voeg 1 pl 25 mM ATP en 1 pi nuclease. Incubeer reacties bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Transform reacties. <ol><li> Transformatie 2,5 pi van elke reactie in 25 gl chemisch competente cellen. Opmerking: Homemade bevoegde cells kan worden gebruikt. Echter kunnen cellen met lage competentie resulteren in een gebrek aan kolonies. <ol><li> Meng 2,5 ul van de reactie met 25 ul van chemisch competente cellen. Incubeer op ijs gedurende vijf minuten. Incubeer de cellen gedurende 30 seconden bij 42 ° C. </li><li> Plaats de buizen op ijs gedurende 2 minuten. Voeg 125 ul van Super Optimal bouillon met katabolische repressie (SOC). Schud de buizen bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li></ol></li><li> Plaat 100 ul van de getransformeerde cellen op LB-platen met spectinomycine (50 ug / ml), X-gal en isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Grow O / N bij 37 ° C. </li></ol></li><li> Pick 2-3 witte kolonies voor elke reactie en controleren door kolonie PCR met behulp van primers pCR8_F1 en pCR8_R1 (tabel 2). <ol><li> Maak een master mix van de reagentia. Bijvoorbeeld, zie tabel 3. </li><li> Kies een kolonie en smeer het in de bodem van een PCR-buis, en zet dan de overblijfselen van de kolonie in 2 ml LB met spectinomycine(50 ug / ml). Plaats 15 ul van de master mix in de buis met de kolonie. </li><li> Voer het volgende PCR-programma (Tabel 4) </li><li> Controleer de PCR (run het hele volume) op een 1,5% agarosegel door elektroforese. De juiste klonen zal een band bij de verwachtte grootte en een uitstrijkje en een ladder van bands. Voor een voorbeeld van de juiste uitstrijkje, zie 34,33. </li><li> Kweek 2 ml kweken van de juiste klonen in LB media O / N bij 37 ° C in een schudincubator. </li></ol></li><li> Miniprep de plasmiden volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Sequentie TALEN sequentie te controleren met pCR8_F1 en pCR8_R1. Volg de eerder beschreven methoden 35. </li><li> Met de juiste klonen geverifieerd door sequentiebepaling, het opzetten van de reactie # 2 (TALEN kit), die de RVDS van de A- en B-vectoren en de uiteindelijke RVD plaatst in de bestemming vector. <ol><li> Bereiden mix voor reactie 2 (Tabel 5). Opmerking: HaAls reacties kunnen worden gebruikt. </li><li> Leg de reacties in een thermocycler en voer het volgende programma: 37 ° C / 10 min + 16 ° C / 15 min + 37 ° C / 15 min + 80 ° C / 5 min. </li></ol></li><li> Transform reacties. <ol><li> Transformatie 2,5 pi van elke reactie in 25 gl chemisch competente cellen. <ol><li> Meng 2,5 ul van de reactie met 25 ul van chemisch competente cellen. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten. Heat shock de cellen gedurende 30 seconden bij 42 ° C. </li><li> Plaats de buizen op ijs. Voeg 125 gl SOC. Plaats de buizen in een schudincubator bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li></ol></li><li> Plaat 100 ul van de getransformeerde cellen op LB-platen met ampicilline (100 ug / ml), X-gal en IPTG. Grow O / N bij 37 ° C </li></ol></li><li> Pick 1-3 witte kolonies voor elke reactie en controleren door kolonie PCR met behulp van primers TAL_F1 en TAL_R2 (tabel 2). <ol><li> Voeg een oplossing van de polymerase mastermix, water en primers zoalsin tabel 3 beschreven. Kies een kolonie en smeer deze in de bodem van een PCR-buis, en vervolgens de restanten van de kolonie in 2 ml LB met ampicilline (100 ug / ml). Plaats 15 gl van de oplossing in de buis met de kolonie. </li><li> Voer het PCR-programma (Tabel 6). </li><li> Controleer de PCR op een 1,5% agarosegel door elektroforese. De juiste klonen een versmeringsfilter en een ladder van bands. Voor een voorbeeld van de juiste uitstrijkje, zie 34,33. </li><li> Kweek 2 ml kweken van de juiste klonen in LB media O / N bij 37 ° C in een schudincubator. </li></ol></li><li> Miniprep de plasmiden volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Sequentie TALEN sequentie te controleren met TAL_F1 en TAL_R2 volgende eerder beschreven werkwijzen 35. </li></ol> 3. mRNA transcriptie van Talens <ol><li> Digest 4 ug-sequentie geverifieerd sjabloon met 2 pi SacI gedurende 2 uur bij 37 ° C. </li&gt; <li> Run 2 ui van het SacI gedigereerde plasmide op een 1,5% agarosegel door elektroforese. Plasmiden die correct worden verteerd zal een enkele band weer te geven. </li><li> Zuiver het resterende SacI gedigereerde plasmide na het PCR zuivering kit protocol. Was tweemaal met de wasoplossing vóór elutie. Elueren in 30 ul nuclease-vrij water. </li><li> Volg het standaardprotocol voor T3 mRNA-productie. <ol><li> Opzetten half reacties onder gebruikmaking van 0,5 ug gelineariseerd template (hierboven bereide). Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur. </li><li> Voeg 0,5 gl DNase (inbegrepen in kit) en incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten. </li></ol></li><li> Zuiver het mRNA, volgens de instructies van de fabrikant. Elueren in 30 ul nuclease-vrij water. </li><li> Voer een 1,5% agarosegel door elektroforese aan het mRNA controleren. <ol><li> Maak de gel apparaat met een product om RNase verontreiniging weg te werken en voor te bereiden een 1,2% gel. </li><li> Meng 1 pl mRNA + 4 &amp;# 181; l nuclease-vrij water + 5 ui glyoxyl laden kleurstof. Incubeer monsters bij 50 ° C gedurende 30 minuten. Centrifuge de buizen kort en leg ze op het ijs voordat u de gel. </li></ol></li><li> Controleer de concentratie onder toepassing van een werkwijze voor het kwantificeren van nucleïnezuur concentraties en bewaar het RNA in monsters bij -80 ° C. Kies een portie grootte zodanig dat RNA niet is bevroren / meer dan een keer ontdooid. Let op: Concentraties van 500-1.000 ng / nl zijn meestal verkregen. RNA met een lagere concentratie kan worden gebruikt zolang RNA behouden blijft (zoals beoordeeld door een band in plaats van een vlek op de gel). </li></ol> 4. Injecteer Astyanax mexicanus Embryo&#39;s met TALEN mRNA <ol><li> Bereid Tools for Injection. <ol><li> Pour injectie platen door uitgieten 1,2% agarose in viswater (water geconditioneerd met natriumbicarbonaat en zeezout op pH 7,4 en geleidbaarheid 700 uS) in een petrischaal. Plaats een mal (plastic stuk met projecties putten voor vissen makeneieren) in de schotel. Verwijder de mal als de agarose uitharden en bewaar bij 4 ° C. Voor meer informatie over de mal te zien 36. </li><li> Pull naalden voor injectie met een naald trekker volgens de instructies van de fabrikant. Opmerking: Geschikte naaldlengte belangrijk voor injecties. Naalden die te lang zijn zullen ook flexibel voor injecties. Het protocol voor het trekken naalden zal variëren met de gebruikte naalden trekken materiaal. Een voorbeeld van een geschikte naald wordt getoond in figuur 1. Voor onze apparatuur, we trekken naalden die 5-6 cm lang en hebben een buitendiameter aan het uiteinde van ongeveer 0,011 mm of gebroken. Er moet echter worden gekalibreerd naalden (stap 4.3.4) om openingsbreedte bepalen. Voorbeeld programma voor het trekken naalden zijn te vinden in tabel 7. </li><li> Bereid glazen pipetten voor embryotransplantatie door het breken van de pipet zodat de opening is groot genoeg om een ​​ei te passeren. Vlam het gebroken einde totdatHet is niet meer scherp. Opmerking: Het is belangrijk glas pipetten en glaskommen wanneer gewerkt met A. mexicanus eieren en embryo&#39;s als ze zijn plakkerig en zal zich houden aan plastic. </li></ol></li><li> Verzamel 1-cel Stage Eieren. <ol><li> Breed A. mexicanus volgende standaard protocollen 37. Let op: Als er bijvoorbeeld vissen op een 14 licht worden gehouden: 10 donker-cyclus en het gebruik van Zeitgerber tijd (ZT) met Zt0 als lichten aan en ZT14 als lichten uit, onze oppervlakte vissen paaien tussen ZT15 en ZT19. Exact paaitijd moet worden bepaald voor elke individuele lab. </li><li> Induceren paaien door overvoeding vis voor 3-4 dagen voorafgaand aan de paring en het vissen in zoet water. Verhoog de temperatuur 2 ° C. Let op: Onze eerste temperatuur van het water is ongeveer 74 ° C. </li><li> Verzamel oppervlak vis eieren in het donker, het controleren van elke 15 minuten naar eieren op de 1-cel stadium te verkrijgen. Honderden eieren kunnen worden verkregen uit een enkel paar oppervlak vis. </li><li> Verzameleneieren in glazen schalen te voorkomen vasthouden aan kunststof oppervlakken en sorteren om embryo&#39;s in het 1 cellig stadium isoleren vóór injectie door het observeren eieren onder de microscoop en het verzamelen van eieren die een enkele cel. Bewaar eieren in zoet water systeem (tank water waarin volwassen vissen worden gehuisvest, dat is behandeld voor pH en geleidbaarheid). </li></ol></li><li> Injecteren TALEN mRNA. <ol><li> Injecteer verschillende hoeveelheden totaal mRNA (gelijke hoeveelheden van elke TALEN in het paar) om de optimale concentratie te bepalen voor injectie als toxiciteit en doeltreffendheid verschillen per TALEN paar. Start door het injecteren concentraties van totaal mRNA die 400-800 pg. Verdunnen en combineren mRNA tot gewenste concentraties voor het injecteren van 1,5 nl. </li><li> Load verdund mRNA in de achterkant van de naald en bevestig de naald op een micro-injector. </li><li> Breek de naald met behulp van een tang. </li><li> Kalibreren van de naald. Bijvoorbeeld, uit te werpen 10 keer en het verzamelen van de daaruit voortvloeiende daling van een micro capillair. Voor 10 x 100 wegwerp 1.081, l, 32 mm micro capillair, moet de daling van de micro capillair te vullen tot 0,5 mm 1,5 nl / 1 injectie. Stel de injectietijd en druk nodig. </li><li> Steek de naald in de cel en injecteer het mRNA. Injecteer het mRNA direct in de cel, niet in de dooier. </li><li> Verzamel geïnjecteerde embryo&#39;s in glazen kommen. Houd embryo bij 23-25 ​​° C. Het verwijderen van dode embryo&#39;s (embryo&#39;s die bewolkt en onregelmatig gevormde worden) regelmatig voor de eerste paar dagen na de injectie. Record aantal doden en misvormde embryo&#39;s uit controle (uninjected) en geïnjecteerd platen. Let op: verhoogde mRNA concentratie kan leiden tot verhoogde toxiciteit en misvorming / overlijden van embryo&#39;s. Zo mag toxiciteit versus efficiëntie worden gebalanceerd om de beste concentratie van mRNA vast te injecteren. </li></ol></li></ol> 5. Fenotype Oprichter Fish and Evalueer TALEN Efficiency <ol><li> Offer embryo&#39;s volgens de institutionele dier protocol. Let op: We euthanaserenembryo&#39;s snel afgekoeld op ijs. </li><li> Verzamel embryo&#39;s in 0,8 pi PCR-strip buizen met behulp van een overdracht pipet. Opmerking: Genotypering kan worden uitgevoerd op individuele embryo&#39;s of pools van embryo. </li><li> Extract DNA. <ol><li> Plaats embryo&#39;s in 100 ui 50 mM natriumhydroxide (NaOH) en incubeer bij 95 ° C gedurende 30 min, daarna afkoelen tot 4 ° C. </li><li> Voeg 1/10 volume (10 pl) van 1 M Tris-HCl pH 8. </li></ol></li><li> Voer een PCR op het gebied met de primers van stap 1,3 (zie de tabellen 8 en 9 voor voorbeeldprotocollen). Voor individuele embryo 1 pl DNA is voldoende voor de PCR-reactie. </li><li> Digest het verkregen PCR-product met het geschikte restrictie-enzym en uitvoeren van een 1,5% agarosegel door elektroforese. <ol><li> Bijvoorbeeld, voor de genotypering oculocutaan albinisme 2 (OCA2) locus geïnjecteerde embryo verteren het PCR product met de restrictie-enzym Bsr I door toevoeging 00,5 ui Bsr I direct naar 12,5 ui van de PCR-reactie voltooide, incuberen bij 65 ° C gedurende 2 uur. Voer de onverteerde en verteerde product op een gel. Restrictie-enzym resistent banden (dwz groepen die niet verteren) geven aan dat TALEN geïnduceerde mutaties aanwezig (figuur 2). </li></ol></li><li> (Optioneel) Bereken percentage mutatie snelheid door het bepalen van het percentage van de ongesneden product door het analyseren van beelden van de gels in Fiji 38 gebruik van de gel analyse-instrument om de intensiteit waarde van elke band te berekenen, zoals eerder 29 beschreven. </li><li> Bepaal de volgorde van mutante allelen door TA klonering de gel gezuiverd restrictie-enzym resistent mutant band en sequencing klonen. <ol><li> Gel zuiveren het restrictie-enzym resistent mutant band volgens de instructies van de fabrikant. TA kloon de band volgens de instructies van de fabrikant. Pick kolonies en groeien in 1,5 ml LB O / N bij 37 ° C in een schuddendincubator. </li><li> Miniprep culturen de instructies van de fabrikant. Stuur het DNA voor sequentiebepaling. </li><li> Een programma zoals aap, lijn de mutante sequenties van de wildtype sequentie. <ol><li> Kopieer en plak beide sequenties in APE. Kies de &quot;Align twee sequenties&quot; tool uit het menu &quot;Extra&quot;. </li><li> Geef de twee DNA-sequenties met behulp van de dropdown menu&#39;s. Opmerking: De omgekeerde complement van de gekloneerde sequentie moet worden gebruikt afhankelijk van de richting waarin de PCR ging in de kloneringsvector. Als de sequenties niet af te stemmen, herhaalt u stap het vakje &quot;Rev-Com&quot; in het vak &quot;Align DNA&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Evalueer oprichter vis voor fenotypes op de juiste fase en het gebruik van passende methoden voor het verwachte fenotype 29 (bijvoorbeeld figuur 3). Werkwijzen voor fenotypering wordt gebaseerd op het verwachte fenotype voor het gen doelwit van de onderzoeker die het protocol. </li></ol> 6. scherm voor kiembaantransmissie Opmerking: A. mexicanus geslachtsrijp bij 4-8 maanden. <ol><li> Steek seksueel volwassen oprichter vis tot wild type vis. </li><li> Scherm embryo&#39;s en volwassen vis met werkwijzen stappen 5,1-5,7 (figuur 4). Voor volwassen vissen, kan een stukje van de staart worden geknipt na verdoving. <ol><li> Verdoven vis vissen door onderdompeling in een oplossing van tricaïne (3-aminobenzoëzuur ethylester) om stress te verminderen tijdens fin knippen. Na fin knippen, laat vis te herstellen in zoet water. Vis terug te snel; observeren totdat ze hersteld zijn (worden normaal zwemmen). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Protas, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+cavefish+reveals+molecular+convergence+in+the+evolution+of+albinism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism.</a> Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).</li>
<li>Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+amino+acid+mutation+contributes+to+adaptive+beach+mouse+color+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A single amino acid mutation contributes to adaptive beach mouse color pattern.</a> Science. 313 (5783), 101-104 (2006).</li>
<li>Chan, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+evolution+of+pelvic+reduction+in+sticklebacks+by+recurrent+deletion+of+a+Pitx1+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer.</a> Science. 327 (5963), 302-305 (2010).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+specific+modifications+of+the+Drosophila+genome+by+means+of+an+easy+TALEN+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Genet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Efficient and specific modifications of the Drosophila genome by means of an easy TALEN strategy.</a> J Genet Genomics. 39 (5), 209-215 (2012).</li>
<li>Bannister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALENs+mediate+efficient+and+heritable+mutation+of+endogenous+genes+in+the+marine+annelid+Platynereis+dumerilii%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">TALENs mediate efficient and heritable mutation of endogenous genes in the marine annelid Platynereis dumerilii.</a> Genetics. 197 (1), 77-89 (2014).</li>
<li>Lei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+gene+disruption+in+Xenopus+embryos+using+engineered+transcription+activator-like+effector+nucleases+%28TALENs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted gene disruption in Xenopus embryos using engineered transcription activator-like effector nucleases (TALENs).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17484-17489 (2012).</li>
<li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li>
<li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+gene+targeting+in+zebrafish+using+customized+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).</li>
<li>Ansai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+mutagenesis+in+medaka+using+custom-designed+transcription+activator-like+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted mutagenesis in medaka using custom-designed transcription activator-like effector nucleases.</a> Genetics. 193 (3), 739-749 (2013).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+doublesex-+and+mab-3-related+transcription+factor+6+and+its+involvement+in+spermatogenesis+in+tilapia%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Isolation of doublesex- and mab-3-related transcription factor 6 and its involvement in spermatogenesis in tilapia.</a> Biol Reprod. 91 (6), 136(2014).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li>
<li>Gross, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+origin+of+Astyanax+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">The complex origin of Astyanax cavefish.</a> BMC Evol Biol. 12, 105(2012).</li>
<li>Wilkens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+genetics+of+epigean+and+cave+Astyanax+fasciatus+%28Characidae%2C+Pisces%29+-+support+for+the+neutral+mutation+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces) - support for the neutral mutation theory.</a> Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).</li>
<li>Teyke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+differences+in+neuromasts+of+the+blind+cave+fish+Astyanax+hubbsi+and+the+sighted+river+fish+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Evol%22%5BJournal%5D)">Morphological differences in neuromasts of the blind cave fish Astyanax hubbsi and the sighted river fish Astyanax mexicanus.</a> Brain Behav Evol. 35 (1), 23-30 (1990).</li>
<li>Schemmel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetische+Untersuchungen+zur+Evolution+des+Geschmacksapparates+bei+cavernicolen+Fischen%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Zool+Syst+Evolutionforsch%22%5BJournal%5D)">Genetische Untersuchungen zur Evolution des Geschmacksapparates bei cavernicolen Fischen.</a> Z Zool Syst Evolutionforsch. 12, 196-215 (1974).</li>
<li>Burchards, H., Dolle, A., Parzefall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggressive+behavior+of+an+epigean+population+of+Astyanax+mexicanus+%28Characidae%2C+Pisces%29+and+some+observations+of+three+subterranean+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Processes%22%5BJournal%5D)">Aggressive behavior of an epigean population of Astyanax mexicanus (Characidae, Pisces) and some observations of three subterranean populations.</a> Behavioral Processes. 11, 225-235 (1985).</li>
<li>Parzefall, J., Fricke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alarm+reaction+and+schooling+in+population+hybrids+of+Astyanax+fasciatus+%28Pisces%2C+Characidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Memoires+e+Biospeologie%22%5BJournal%5D)">Alarm reaction and schooling in population hybrids of Astyanax fasciatus (Pisces, Characidae).</a> Memoires e Biospeologie. , 29-32 (1991).</li>
<li>Schemmel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+Genetics+of+Feeding+Behavior+in+the+Cave+Fish+Astyanax+mexicanus+F.+anoptichthys%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Tierpsychol%22%5BJournal%5D)">Studies on the Genetics of Feeding Behavior in the Cave Fish Astyanax mexicanus F. anoptichthys.</a> Z. Tierpsychol. 53, 9-22 (1980).</li>
<li>Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocortin+4+receptor+mutations+contribute+to+the+adaptation+of+cavefish+to+nutrient-poor+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9668-9673 (2015).</li>
<li>Protas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-trait+evolution+in+a+cave+fish%2C+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Evol+Dev%22%5BJournal%5D)">Multi-trait evolution in a cave fish, Astyanax mexicanus.</a> Evol Dev. 10 (2), 196-209 (2008).</li>
<li>Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Mc1r+in+the+parallel+evolution+of+depigmentation+in+independent+populations+of+the+cavefish+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus.</a> PLoS Genet. 5 (1), e1000326(2009).</li>
<li>Yoshizawa, M., Yamamoto, Y., O'Quin, K. E., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+an+adaptive+behavior+and+its+sensory+receptors+promotes+eye+regression+in+blind+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of an adaptive behavior and its sensory receptors promotes eye regression in blind cavefish.</a> BMC Biol. 10, 108(2012).</li>
<li>Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+genetic+analysis+of+retinal+degeneration+in+the+blind+cavefish+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish Astyanax mexicanus.</a> PLoS One. 8 (2), 57281(2013).</li>
<li>Kowalko, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+in+feeding+posture+occurs+through+different+genetic+loci+in+independently+evolved+cave+populations+of+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Convergence in feeding posture occurs through different genetic loci in independently evolved cave populations of Astyanax mexicanus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), 16933-16938 (2013).</li>
<li>Kowalko, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Schooling+Behavior+in+Cavefish+through+Sight-Dependent+and+Sight-Independent+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of Schooling Behavior in Cavefish through Sight-Dependent and Sight-Independent Mechanisms.</a> Curr Biol. , (2013).</li>
<li>Gross, J. B., Krutzler, A. J., Carlson, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+craniofacial+changes+in+blind+cave-dwelling+fish+are+mediated+by+genetically+symmetric+and+asymmetric+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Complex craniofacial changes in blind cave-dwelling fish are mediated by genetically symmetric and asymmetric loci.</a> Genetics. 196 (4), 1303-1319 (2014).</li>
<li>Yamamoto, Y., Stock, D. W., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signalling+controls+eye+degeneration+in+blind+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signalling controls eye degeneration in blind cavefish.</a> Nature. 431 (7010), 844-847 (2004).</li>
<li>Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+benefit+of+albinism+in+Astyanax+cavefish%3A+downregulation+of+the+oca2+gene+increases+tyrosine+and+catecholamine+levels+as+an+alternative+to+melanin+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis.</a> PLoS One. 8 (11), e80823(2013).</li>
<li>Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+using+TALENs+in+blind+Mexican+Cavefish%2C+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus.</a> PLoS One. 10 (3), e0119370(2015).</li>
<li>Primer3 v. 0.4.0. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ ">http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ </a> (2015).</li>
<li>Untergrasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B. C., Remm, M., Rozen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3-+new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3- new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Res. 40 (15), 115(2012).</li>
<li>Koressaar, T., Remm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancements+and+modifications+of+primer+design+program+Primer3%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Enhancements and modifications of primer design program Primer3.</a> Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).</li>
<li>Cermak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+design+and+assembly+of+custom+TALEN+and+other+TAL+effector-based+constructs+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 82(2011).</li>
<li>Addgene. Golden TALEN assembly. , Available at: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/98/5a/985a6117-7490-4001-8f6a-24b2cf7b005b/golden_gate_talen_assembly_v7.pdf">https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/98/5a/985a6117-7490-4001-8f6a-24b2cf7b005b/golden_gate_talen_assembly_v7.pdf</a> (2011).</li>
<li>Addgene. Sequencing TALENs. , Available at: <a target="_blank" href="http://www.addgene.org/static/cms/filer_public/eb/d2/ebd246f3-db1e-499c-85ce-f79c023a726f/sequencing_talens.pdf">http://www.addgene.org/static/cms/filer_public/eb/d2/ebd246f3-db1e-499c-85ce-f79c023a726f/sequencing_talens.pdf</a> (2012).</li>
<li>Weinberg, E. A device to hold zebrafish embryos during microinjection. ZFIN Protocol Wiki. , Available at: <a target="_blank" href="https://wiki.zfin.org/display/prot/A+Device+To+Hold+Zebrafish+Embryos+During+Microinjection">https://wiki.zfin.org/display/prot/A+Device+To+Hold+Zebrafish+Embryos+During+Microinjection</a> (2009).</li>
<li>Hinaux, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+staging+table+for+Astyanax+mexicanus+surface+fish+and+Pachon+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish.</a> Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Bitinaite, J., Wah, D. A., Aggarwal, A. K., Schildkraut, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FokI+dimerization+is+required+for+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FokI dimerization is required for DNA cleavage.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10570-10575 (1998).</li>
<li>Elipot, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+the+enzyme+monoamine+oxidase+explains+part+of+the+Astyanax+cavefish+behavioural+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A mutation in the enzyme monoamine oxidase explains part of the Astyanax cavefish behavioural syndrome.</a> Nat Commun. 5, 3647(2014).</li>
<li>McGaugh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cavefish+genome+reveals+candidate+genes+for+eye+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss.</a> Nat Commun. 5, 5307(2014).</li>
<li>Yoshizawa, M., Goricki, S., Soares, D., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+a+behavioral+shift+mediated+by+superficial+neuromasts+helps+cavefish+find+food+in+darkness%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness.</a> Curr Biol. 20 (18), 1631-1636 (2010).</li>
<li>Blackburn, P. R., Campbell, J. M., Clark, K. J., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR+system--keeping+zebrafish+gene+targeting+fresh%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">The CRISPR system--keeping zebrafish gene targeting fresh.</a> Zebrafish. 10 (1), 116-118 (2013).</li>
<li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+gene+targeting+and+phenotyping+in+zebrafish+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).</li>
<li>Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+homologous+recombination-mediated+genome+engineering+in+zebrafish+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases.</a> Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).</li>
<li>Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR%2FCas9+vector+system+for+tissue-specific+gene+disruption+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish.</a> Dev Cell. 32 (6), 756-764 (2015).</li>
<li>Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+for+the+lens+in+cave+fish+eye+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Central role for the lens in cave fish eye degeneration.</a> Science. 289 (5479), 631-633 (2000).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Grote vooruitgang is geboekt in de afgelopen jaren naar het begrijpen van de genetische basis van de evolutie van eigenschappen. Terwijl kandidaat genen voor de ontwikkeling van een aantal eigenschappen is geïdentificeerd, is het een uitdaging om deze genen in vivo testen gebleven door het gebrek aan volgzaamheid van genetische evolutionair meest interessante soorten. Hier melden wij een methode voor het genoom bewerking in A. mexicanus, een soort die wordt gebruikt om de evolutie van de grot dieren te...

Inzicht in de genetische basis van trait evolutie een kritisch onderzoek doel van evolutionair biologen. Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het ​​identificeren loci grondslag liggen aan de evolutie van de eigenschappen en het opsporen van kandidaat-genen binnen deze loci (bijvoorbeeld 1-3). Echter functioneel testen van de rol van deze genen is gebleven uitdagend veel organismen gebruikt voor het bestuderen van de ontwikkeling van eigenschappen momenteel niet genetisch handelbaar. De komst van het genoom editing technologieën is sterk toegenomen genetische maakbaarheid van een breed scala van organismen. Transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens) en geclusterde regelmatig interspaced korte palindroom repeats (CRISPRs) gebruikt om gerichte mutaties in genen genereren verschillende organismen (bijvoorbeeld 4-11). Deze tools, toegepast op een evolutionair relevante systeem, hebben het potentieel om een ​​revolutie in de manier waarop evolutionair biologen onderzoek naar de genetische basis van de evolutie. Astyanax mexicanus is een vissoort die in twee vormen bestaat:. A-river woning oppervlak vorm (oppervlak vis) en multiple-grotwoning formulieren (cavefish) A. mexicanus cavefish ontstaan ​​uit het oppervlak vis voorouders (besproken in 12). Populaties van cavefish hebben een aantal eigenschappen, waaronder het verlies van de ogen, te verminderen of verlies van pigmentatie geëvolueerd, verhoogde aantallen smaakpapillen en craniale neuromasts, en veranderingen in het gedrag, zoals het verlies van het onderwijs gedrag, toegenomen agressie, veranderingen in het voeden van houding en hyperfagie 13 -19. Cavefish en oppervlakte vissen zijn interfertile, en genetische mapping experimenten zijn uitgevoerd om loci en kandidaat-genen te identificeren voor grot trekken 1,20-26. Kandidaatgenen zijn getest voor een functionele rol bij hol eigenschappen in celkweek 1,19, in modelorganismen andere soorten 21 of 27 overexpressie of transiënte knockdown uzingen morpholinos 28 in A. mexicanus. Echter, elk van deze methoden heeft beperkingen. Het vermogen om gemuteerde allelen van deze genen in A. genereren mexicanus is essentieel voor het begrijpen van de functie in de evolutie van cavefish. Aldus A. mexicanus is een ideale kandidaat organisme voor de toepassing van genoom editing technologieën. Hier schetsen we een methode voor het genoom bewerking in A. mexicanus gebruik TALENS. Deze methode kan worden gebruikt om mozaïek geïnjecteerde grondlegger vis evalueren fenotypes en voor het isoleren van leidingen vis met stabiele mutaties in genen van belang 29.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injection station</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel apparatus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle puller</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Benodigdheden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opmerking: Voor zover we weten, kunnen benodigdheden van verschillende bedrijven worden gebruikt, tenzij anders aangegeven</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0</td><td>Addgene</td><td>Kit #1000000024</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated)</td><td>Fisher</td><td>BP9724-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Teknova TET-15 in 50% EtOH</td><td>Teknova (besteld via Fisher)</td><td>50-843-314</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP2957-1</td><td></td></tr><tr><td>Super Ampicillin (1.000x oplossing)</td><td>DNA Technologies</td><td>6060-1</td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (Besteld via Fisher)</td><td>FERR0941</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP1620-1</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Fisher</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>BsaI</td><td>New England Biolabs (besteld via Fisher)</td><td>50-812-203</td><td>Gebruik BsaI, niet BsaI-HF (zoals beschreven in het Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)</td></tr><tr><td>BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>meegeleverd met restrictie-enzymen</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 ligase buffer</td><td>Promega (besteld via Fisher)</td><td>PR-C1263</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master mix</td><td>Promega (besteld via Fisher)</td><td>PRM7123</td><td>Andere Taq kan worden gebruikt, maar de reactie moet dienovereenkomstig worden aangepast</td></tr><tr><td>Quick ligatiekit</td><td>New England Biolabs (besteld via Fisher)</td><td>50-811-728</td><td>We gebruiken Quick Ligase voor alle TALEN assemblagereacties</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chemisch Competent E.coli</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-06</td><td>Andere chemisch competente cellen of zelfgemaakte competente cellen kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Esp 3I</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (Besteld via Fisher)</td><td>FERER0451</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid-Safe ATP-afhankelijke DNase</td><td>Epicentre (Besteld via Fisher)</td><td>NC9046399</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>De Qiagen-kit moet worden gebruikt voor de initiële plasmidevoorbereiding (zoals beschreven in het Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)</td></tr><tr><td>QIAquick PCR-zuiveringskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose</td><td>BioExpress</td><td>E-3119-125</td><td></td></tr><tr><td>Sac I</td><td>Promega (Besteld via Fisher)</td><td>PR-R6061</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T3 Transcriptiekit</td><td>Ambion</td><td>AM1348M</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy MinElute Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax-Gly Sample Loading Dye&nbsp;</td><td>Ambion (besteld via Fisher)</td><td>AM8551</td><td></td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Decon (besteld via Fisher)</td><td>04-355-32</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Wegwerp Soda-Lime Glass Pasteur Pipetten</td><td>Fisher</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Standaard glazen capillairen</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Microcaps</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Microloader Tips voor Femtojet Microinjector</td><td>Eppendorf (besteld via Fisher)</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-basis</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr></tbody></table>

genome bewerken in<em&gt; astyanax mexicanus</em&gt; met behulp van transcriptie activator-achtige effector nucleases (talens)

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Het identificeren van allelen van genen die ten grondslag liggen aan evolutionaire veranderingen is essentieel om te begrijpen hoe en waarom evolutie plaatsvindt. Daarom heeft veel recent werk zich gericht op het identificeren van kandidaat-genen voor de evolutie van eigenschappen in verschillende soorten. Tot voor kort was het echter uitdagend om interessante kandidaat-genen functioneel te valideren. Recent ontwikkelde hulpmiddelen voor genetische engineering maken het mogelijk om specifieke genen in een breed scala aan organismen te manipuleren. Toepassing van deze technologie in evolutionair relevante organismen zal ongekende inzichten mogelijk maken in de rol van kandidaat-genen in de evolutie. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is een vissoort met zowel oppervlaktebewonende als grotwonende vormen. Meerdere onafhankelijke lijnen van grotwonende vormen zijn geëvolueerd van voorouderlijke oppervlaktevissen, die onderling en met oppervlaktevissen interfertile zijn, waardoor de genetische basis van groeigewoonten kan worden opgehelderd. A. mexicanus is gebruikt voor een aantal evolutionaire studies, inclusief koppelingsanalyse om kandidaat-genen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor een aantal eigenschappen. Daarom is A. mexicanus een ideaal systeem voor de toepassing van genoombewerking om de rol van kandidaat-genen te testen. Hier rapporteren we een methode voor het gebruik van transcriptie-activator-achtige effector-nucleasen (TALENs) om genen in oppervlakte A. mexicanus te muteren. Genoombewerking met behulp van TALENs in A. mexicanus is gebruikt om mutaties in pigmentatiegenen te genereren. Deze techniek kan ook worden gebruikt om de rol van kandidaat-genen voor een aantal andere eigenschappen te evalueren die zijn geëvolueerd in grotvormen van A. mexicanus.

TALEN paar injecties leiden tot binding van de RVDS specifieke DNA nucleotiden en daardoor dimerisatie van FokI domeinen, waardoor dubbelstrengs breuken 39 die kan worden gerepareerd door niet-homologe end-joining (NHEJ). NHEJ introduceert vaak fouten die leiden tot toevoegingen of weglatingen (indels). INDELs kunnen worden geïdentificeerd door het amplificeren van het gebied rondom de TALEN doelplaats en het digereren van het verkregen amplicon met een restrictie enz...

-Gen-targeting mutagenese is nu mogelijk in een breed scala van organismen, waarbij genoom montagetechnieken. Hier tonen we een protocol voor gerichte gen mutagenese met behulp van transcriptie-activator, zoals effector nucleasen (Talens) in Astyanax mexicanus, een soort vis dat oppervlak vis en cavefish omvat.

Genome bewerken in<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Met behulp van transcriptie Activator-achtige Effector Nucleases (Talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Het algemene doel van deze procedure is het introduceren van mutaties in specifieke genen bij de grottenvis Astyanax mexicanus. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen binnen het veld van de evolutionaire biologie over de genetische basis van de evolutie van grotkenmerken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het effect van het verlies van het specifieke gen nu kan worden getest in Astyanax mexicanus.Na het ontwerpen en assembleren van transcription activator-like effector nucleases, of TALENs, volgens het tekstprotocol, gebruikt u 2 µL Sac1 om 4 µg sequentie-geverifieerde template te couperen bij 37 °C gedurende twee uur. Breng 2 µL van het met Sac1 gecoupeerde plasmide aan op een 1,5% agarosegel en controleer op een enkele band om de coupering te verifiëren. Voor de T3 mRNA-productie gebruikt u 0,5 µg gelineariseerde template om halve reacties op te zetten volgens een standaardprotocol.Incubeer gedurende twee uur bij 37 °C. Voeg vervolgens 0,4 µL DNase toe en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C. Gebruik na het zuiveren van het mRNA, om de kwaliteit te controleren, een product dat RNase-contaminatie elimineert om de gelapparatuur te reinigen.Bereid vervolgens een gel van 1,2% voor. Meng 1 µL van het mRNA met 4 µL nuclease-vrij water en 5 µL glyoxal-laadkleurstof. Incubeer de monsters 30 minuten bij 50 °C.Centrifuge de buisjes vervolgens kort en plaats ze op ijs voordat de gel wordt geladen. Nadat de concentratie van het mRNA is gecontroleerd, worden er aliquoten klaargemaakt voordat ze bij minus 80 graden Celsius worden bewaard. Raadpleeg het tekstprotocol voor aanvullende details.Nadat de injectienaalden en platen volgens het tekstprotocol zijn voorbereid, wordt de kuitafgifte bij A.mexicanus geïnduceerd door de vissen drie tot vier dagen vóór de voortplanting over te voeren en de vissen in vers water te plaatsen. Verhoog de watertemperatuur met twee graden Fahrenheit tot ongeveer 76 graden Celsius. Controleer elke 15 minuten in het donker op eitjes aan het wateroppervlak en breng deze over naar glazen schalen om te voorkomen dat ze aan het oppervlak blijven plakken.Honderden eitjes kunnen worden verkregen van één enkel paar oppervlaktevissen. Sorteer de geïsoleerde eitjes onder een microscoop en breng die in het eencellige stadium over naar vers systeemwater. Laad het verdunde mRNA in de achterzijde van de naald en bevestig de naald aan een micro-injector.Breek vervolgens de naald met een pincet. Om de naald te kalibreren, injecteert u 10 keer en verzamelt u de resulterende druppel in een microcapillair. De druppel moet een wegwerp microcapillair van 10 bij 100 een microliter, 32 millimeter vullen tot 0,5 millimeter per 1,5 nanoliter injectie.Steek nu de naald in de enkele cel en injecteer het mRNA. Verzamel de geïnjecteerde embryo's in glazen schalen en incubeer ze bij 23 tot 25 °C. Verwijder dode embryo's regelmatig tijdens de eerste paar dagen na de injectie.Noteer het aantal dode en misvormde embryo's van de niet-geïnjecteerde controleplaten en de geïnjecteerde platen. Raadpleeg het tekstprotocol voor aanvullende details. Na het euthanaseren van de vissen volgens het IACUC-protocol van uw instelling, verzamelt u de embryo's in 100 µL van 50 mM natriumhydroxide voor de extractie van het DNA en incubeert u deze 30 minuten bij 95 °C.Koel vervolgens af tot 4 °C. Voeg een tiende volume van 1 M tris-HCl pH 8 toe aan de afgekoelde embryo's. Voer vervolgens PCR uit met primers, bijvoorbeeld voor het gen voor oculocutaan albinisme type 2 of het OCA2-gen.Voor individuele embryo's is één microliter DNA voldoende voor de PCR-reactie. Om de OCA2-locus te genotyperen, wordt het restrictie-enzym DSR1 gebruikt om het resulterende PCR-product te couperen door nul komma vijf microliter enzym direct toe te voegen aan twaalf komma vijf microliter van de voltooide PCR-reactie. Na incubatie bij 65 °C gedurende twee uur wordt de reactie, samen met een monster van het ongesneden PCR-product, geanalyseerd op een 1,5% agarosegel.Voer aanvullende analyses uit volgens het tekstprotocol. TALEN-injecties kunnen resulteren in dubbelstrengs DNA-breuken die hersteld kunnen worden door non-homologe eindverbinding, maar die ook inserties of deleties, oftewel INDELs, kunnen introduceren. Door middel van PCR-end restrictiedigestie om de INDELs in de TALEN-spacerregio te targeten, kunnen deze worden geïdentificeerd aan de hand van de aanwezigheid van een restrictie-enzymresistente band.TALEN-injecties kunnen biallele genmutaties veroorzaken bij A.mexicanus, waardoor sommige fenotypes kunnen worden beoordeeld bij founder-vissen. Zo is OCA2, het gen waarvan wordt verondersteld dat het verantwoordelijk is voor albinisme bij grottenvissen, geëvalueerd. Zoals hier wordt getoond, werden in vissen die geïnjecteerd waren met OCA2 TALEN albino-vlekken geïdentificeerd die niet aanwezig waren bij niet-geïnjecteerde vissen.In deze gelafbeelding werd gecontroleerd op het verlies van de restrictie-enzymplaats in PCR-producten van 306 basenparen van exon negen van OCA2 van A.mexicanus, in pools van 10 F1-vissen afkomstig van een geïnjecteerde stichtervis. Het amplicon van een controle-embryo werd gedigesteerd, terwijl een deel van het amplicon resistent was voor restrictiedigestie in F1-embryo's van geïnjecteerde vissen. Bovendien is aangetoond dat de restrictiedigestie-resistente banden INDELs bevatten.Zodra deze injecties onder de knie zijn, kunnen ze in minder dan een paar uur worden voltooid als ze correct worden uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om zorgvuldig met RNA te werken om degradatie te voorkomen en om te injecteren tijdens het eencellige stadium. Na deze procedure kan een fenotypische analyse worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of een specifiek gen ten grondslag ligt aan een belangrijk visfenotype wanneer dit gemuteerd is bij oppervlaktevissen.Deze techniek zal de weg vrijmaken voor onderzoekers in het veld van de evolutionaire biologie om de rol van kandidaatgenen in de evolutie van de grottenvis Astyanax mexicanus te karakteriseren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe Astyanax mexicanus embryo's moeten worden geïnjecteerd met TALEN mRNA.

genome-editing-astyanax-mexicanus-using-transcription-activator-like

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates a technique of zinc-finger nuclease-based genome editing in human pluripotent stem cells (hPSCs). As hPSCs can potentially be differentiated into various cell types, this technology is helpful for in vitro pathological and pharmacological studies in a patient-specific manner.

Zinc Finger Nuclease-Based Genome Editing: A Technique for Modifying Genome in Human Pluripotent Stem Cells by Double-Stranded Homology Dependant Repair Mechanism

Designer nucleasen zoals zinkvinger nucleasen (ZFNs) en transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens) kan worden gebruikt om het genoom van de muis implantatie embryo's wijzigt activeren zowel de homologe eind mee (NHEJ) en homologe recombinatie (HR) wegen. Deze voorschotten in staat de snelle generatie van muizen met precieze genetische modificaties.

Mouse Genome engineering behulp Designer Nucleasen

Transgene manipulaties en genoom editing zijn van cruciaal belang voor het functioneel testen van de rol van genen en cis van regelgevende elementen. Hier kunt u een gedetailleerde micro-injectie protocol voor het genereren van genomische modificaties (inclusief Tol2-gemedieerde fluorescerende reporter transgene constructen, Talens en CRISPRs) wordt gepresenteerd voor de opkomende model vis, de driedoornige stekelbaars.

Micro-injectie voor Transgenese en Genome Bewerken in Threespine Stekelbaarzen

Met behulp van een voorgemonteerd Cas9 is ribonucleoprotein complex (RNP) een krachtige methode voor het bewerken van nauwkeurige en efficiënte genoom. Hier, wijzen wij op het nut ervan over een breed scala van cellen en organismen, met inbegrip van de primaire menselijke cellen en beide klassieke en opkomende modelorganismen.

Verbeterde genoom bewerken met Cas9 Ribonucleoprotein in verschillende cellen en organismen

We beschrijven benaderingen voor het manipuleren van genen in het evolutionair modelsysteem Astyanax mexicanus. Drie verschillende technieken worden beschreven: Tol2-gemedieerde Transgenese, gerichte manipulatie van het genoom met behulp van CRISPR/Cas9 en knockdown van meningsuiting met behulp van morpholinos. Deze hulpmiddelen moeten vergemakkelijken het directe onderzoek van genen die ten grondslag liggen aan de variatie tussen oppervlak - en grot-woning vormen.

Manipulatie van de genfunctie in Mexicaanse Cavefish

Hier is een protocol voor het uitvoeren van tijd-en ruimtebeperkt gen knock-out in Axolotl ruggengraat koorden door het injecteren van CAS9-gRNA complex in het ruggenmerg centrale kanaal gevolgd door elektroporation.

Directe gen knock-out van Axolotl ruggenmerg neurale stamcellen via Elektroporation van CAS9 proteïne-gRNA complexen

Het doel van dit protocol is om naadloze CRISPR/Cas9-bewerking van het C. elegans-genoom mogelijk te maken met behulp van geassembleerde ribonucleoproteïnecomplexen en de dpy-10 co-CRISPR-marker voor screening. Dit protocol kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan genetische modificaties in C. elegans te maken, waaronder inserties, deleties, genvervangingen en codonsubstituties.

CRISPR/Cas9 Editing van het C. elegans rbm-3.2 Gen met behulp van de dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker en Geassembleerde Ribonucleoproteïne Complexen.

Dit protocol beschrijft hoe efficiënte adenine-basisbewerking zonder PAM-beperking kan worden uitgevoerd om een nauwkeurig zebravisziektemodel te construeren met behulp van zSpRY-ABE8e.

Efficiënte PAM-loze basisbewerking voor zebravismodellering van menselijke genetische ziekten met zSpRY-ABE8e

De efficiëntie van de Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery (I-GONAD)-methode is vergelijkbaar met traditionele micro-injectie, waarbij zygoten moeten worden verzameld bij donorvrouwtjes en moeten worden overgedragen aan pseudo-zwangere vrouwtjes. Dit protocol demonstreert zijn effectiviteit door CRISPR/Cas9-geïnduceerde mutaties te introduceren in de ROSA26-locus op chromosoom 6.

Verbeterde genoombewerking via oviductale nucleïnezuren Op levering gebaseerde in vivo elektroporatietechniek voor het genereren van knock-out muizen

De afgifte van genoomredacteuren als RNA's is een bijzonder krachtig middel om de genomen van primaire zoogdiercellen en cellijnen te modificeren. Het doel van dit protocol is om genoomeditoren als mRNA te leveren in primaire zoogdiercellen en cellenlijnen, gevolgd door gerichte Illumina-sequencing en analyse om bewerkingsuitkomsten te kwantificeren.

Genoombewerking in primaire zoogdiercellen via elektroporatie van editor-RNA

Leer gerichte genmutagenese in Astyanax mexicanus met behulp van TALENs. Deze methode onderzoekt de genetische basis van grottaanpassingen en helpt evolutiebiologen bij het begrijpen van genfunctie in holvissen.

Genome bewerken in

Meer video's verkennen