Fenotypische en functionele analyse van geactiveerde regulatoire T-cellen Geïsoleerd van Chronische Lymfatische choriomeningitis-virus geïnfecteerde muizen

Het algemene doel van deze procedure is om de in vitro suppressieve functie van regulatorische T-cellen, geïsoleerd uit muizen met een chronische virusinfectie, te evalueren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen over het fenotype en de in vitro suppressieve functie van geactiveerde regulatorische T-cellen tijdens een chronische virusinfectie. Deze techniek kan het directe effect van regulatorische T-cellen evalueren op het individu met een positieve respons op T-cellen in vitro.

Dit is een groot voordeel van deze techniek. Begin door vijf keer tien tot de vijfde totaal aantal splenische lymfocyten in 50 microliter facs buffer over te brengen in elke put van een nieuwe U-vormige bodem 96-welplate, gevolgd door 150 microliter facs buffer. Centrifugeer de plaat en gooi het supernatant weg.

Schud vervolgens de celpelletten en was de cellen nog twee keer in 200 microliter facs buffer per put. Na de tweede wasbeurt, suspendeer de pellets in 50 microliter cocktailantilichamen per put, gedurende 20 minuten in het donker bij vier graden Celsius. Was vervolgens de cellen twee keer in facs buffer en gooi het supernatant weg.

Fixeer vervolgens de cellen gedurende 20 minuten in het donker bij vier graden Celsius met 100 microliter fixeerbuffer, gevolgd door twee wasbeurten met permeabilisatie wasbuffer. Na de tweede wasbeurt, suspendeer de cellen in 50 microliter anti-FOXP3 antilichaam. Om de met anti-CD3 CD28 gecoate kralen voor te bereiden, breng het juiste volume magnetische kralen over in een 15 milliliter buis, en voeg een gelijk volume PPS toe.

Meng de oplossing voorzichtig door te pipetteren en centrifugeer de magnetische kralen. Aan het einde van de wasbeurt, gooi het supernatant weg en verdun de kralen in 50 microliter compleet medium per put. Zaai vervolgens 50 microliter van een keer tien tot de vijfde CD4 positieve CD25 positieve regulatorische T-cellen per put in een 96-wel U-vormige plaat, gevolgd door 50 microliter van een keer tien tot de vijfde CD8 positieve responder T-cellen per put.

Wanneer alle cellen zijn aangebracht, voeg 50 microliter van de verdunde met anti-CD3 CD28 gecoate kralen toe aan elke put en voeg tot 50 microliter medium toe om het totale volume van elke put op 200 microliter te brengen. Bedek vervolgens de plaat met folie en plaats deze gedurende 72 uur op 37 graden Celsius in een koolstofdioxide incubator. Om de productie van CD8 positieve T-cel cytokinen te analyseren, breng na drie dagen van cultuur de supernatanten over in een andere 96-wel plaat en analyseer de supernatanten door middel van ELISA, volgens de instructies van de fabrikant.

Om de proliferatie van de CD8 positieve T-cellen te analyseren, was de plaat met cellen drie keer met facs buffer. Hersuspendeer vervolgens de pellets in 50 microliter van een geschikt cocktail van antilichamen tegen geprolifereerde CD8 positieve T-cellen gedurende 20 minuten in het donker bij vier graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, was de cellen twee keer in facs buffer en fixeer ze gedurende 20 minuten in het donker bij vier graden Celsius met 100 microliter fixeerbuffer.

Was tenslotte de cellen nog twee keer in facs buffer en hersuspendeer de pellets in 200 microliter facs buffer. Meet vervolgens het percentage proliferatie van phylaat gelabelde CD8 positieve T-cellen door middel van flowcytometrie. In splenische lymfocyten verkregen uit naïeve en geïnfecteerde muizen, wordt PD-1 specifiek opgereguleerd in zowel conventionele FOXP3 negatieve CD4 positieve als FOXP3 negatieve CD8 positieve cellen van LCMV klon 13 geïnfecteerde muizen.

De frequentie van FOXP3 positieve CD4 positieve regulatorische T-cellen is twee keer hoger in LCMV klon 13 geïnfecteerde muizen dan in naïeve muizen, waarbij de meeste van de FOXP3 positieve CD4 positieve cellen ook een geactiveerd PD-1 hoog fenotype vertonen. CD8 positieve responder T-cellen kunnen succesvol worden gescheiden zonder significante besmetting door andere immuuncellen. Na isolatie van regulatorische T-cellen, kan een dominante populatie van CD25 positieve CD4 positieve T-cellen met meer dan 80 procent zuiverheid worden verkregen.

De stimulatie van geïsoleerde regulatorische en responder T-cellen door met anti-CD3 CD28 gecoate kralen resulteert in de remming van CD8 positieve responder T-cellen op een dosisafhankelijke manier. Inderdaad, wanneer CD8 positieve responder T-cellen worden gecocultiveerd met chronische regulatorische T-cellen in een een-op-een verhouding, wordt de proliferatie van CD8 positieve responder T-cellen significant geremd. Interferon gamma productie door CD8 positieve responder cellen wordt ook significant geremd wanneer CD8 positieve responder T-cellen worden gecocultiveerd met geactiveerde regulatorische T-cellen van chronisch geïnfecteerde muizen, vergeleken met co-cultuur met rustende regulatorische T-cellen van naïeve muizen.

We hebben gevonden dat deze techniek kan worden voltooid in 80 uur als deze goed wordt uitgevoerd. Terwijl u deze procedure probeert uit te voeren, is het belangrijk om te onthouden dat u vers geïsoleerde regulatorische T-cellen onmiddellijk na hun isolatie moet gebruiken. Na deze ontwikkeling, heeft deze techniek de weg gebaand voor onderzoekers op het gebied van geneeskunde om de functie van regulatorische T-cellen in een chronische ontstekingsziekte te onderzoeken.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een in vitro regulatorische T-cel onderdrukkingsprocedure kunt opzetten, met behulp van een co-cultuursysteem van regulatorische en responder T-cellen.