Volautomatische centrifugale microfluïdische apparaat voor Ultragevoelige Protein Detection uit volbloed
16 april 2016
Dit protocol toont hoe femto molaire detectiegevoeligheid van eiwitten in 10 µL vol bloed binnen 30 minuten kan worden bereikt. Dit kan worden bereikt door het gebruik van elektrogesponnen nanovezelmatten geïntegreerd in een lab-on-a-disc, die een groot oppervlak biedt evenals effectief mengen en wassen voor een verbeterde signaal-ruisverhouding.
Het algemene doel van deze procedure is om de detectiegevoeligheid van ELISA te verbeteren met behulp van natuurlijk gesponnen nanovezels. Deze video laat zien hoe femtomolair detectiegevoeligheid van eiwitten in 10 microliter volbloedmonsters binnen 30 minuten kan worden bereikt. In een lab-on-a-disc platform wordt de centrifugale kracht gebruikt om de vloeistof door kamers te verplaatsen, en het totale proces is volledig geautomatiseerd.
De detectiegevoeligheid kan sterk worden verbeterd door de integratie van nanovezels. Het probleem was echter dat de nanovezel erg kwetsbaar is en moeilijk te hanteren. In deze video introduceren we een eenvoudig proces om kwetsbare titaandioxide nanovezelmatten op een plastic schijf te bevestigen.
Om titaandioxide nanovezelmatten op siliconensubstraat door middel van electrospinning te fabriceren, wordt het siliconensubstraat eerst gesilaaniseerd, bedekt met PDMS en voorverhard. Een nanovezelmat wordt vervolgens overgebracht naar dit voorverharde PDMS en dit product wordt geponst om een cirkelvormig stuk voor bevestiging te produceren. Bekleed de reactiekamer met een druppel PDMS als kleefmiddel en bevestig het cirkelvormige stuk aan de onderkant van de kamer.
Kuren vervolgens de PDMS in de oven. Monteer ten slotte de schijflagen in één compleet apparaat voor ELISA. Deze nanovezeloverdrachtstechniek stelt ons in staat om het hoge oppervlak van nanovezels voor bioanalyse te gebruiken.
Het centrifugale microphylitische apparaat biedt de volledige integratie en automatisering van alle processen die nodig zijn voor ELISA. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere bestaande methoden is dat het femtomolair concentraties van eiwitten kan detecteren uit slechts 10 microliter volbloed. Bereid de voorloperoplossingen voor zoals beschreven in het bijbehorende testprotocol.
Laad vervolgens de oplossing in de electrospinner en fabriceer de nanovezels door middel van electrospinning, met behulp van de optimale omstandigheden. Wanneer de polymeer nanovezelmatten zijn voorbereid, calcineren ze deze in een oven onder vacuüm. Na calcinatie zijn de titaandioxide nanovezelmatten eindelijk klaar.
Bereid de microphylitische lay-out voor door gebruik te maken van 3D-ontwerpsoftware zoals SOLIDWORKS en breng het ontwerp over naar de CNC-freesmachine. Gebruik de CNC-freesmachine om de schijf met kanalen en kamers te fabriceren. De schijf en nanovezelmat zijn nu klaar om te worden geïntegreerd.
Bereid een vacuümkamer, siliconensubstraat en fluorosilaan voor. Silaaniseer het siliconensubstraat met fluorosilaan onder vacuüm gedurende 30 minuten. Bereid de gast PDMS voor door een voorpolymeer met een hardener in een verhouding van 10 tot 1 te bereiden en op het gesilaaniseerde siliconensubstraat aan te brengen met 650 RPM gedurende 60 seconden.
Kuren de op het gesilaaniseerde wafer aangebrachte PDMS bij 65 graden Celsius gedurende 10 minuten om het plakkerig te maken. Breng vervolgens die nanovezelmatten over op de PDMS-gecoate siliconen door geschikte druk uit te oefenen met behulp van een vlak object zoals een glazen plaat. Bak het monster gedurende één uur bij 80 graden Celsius om de plakkerige PDMS volledig uit te harden.
Spuit een paar druppels ethanol op de nanovezelmatten die aan de PDMS-laag zijn bevestigd en maak een zes millimeter diameter gat met een PunchIt. Schil vervolgens de geponste nanovezelmatten die aan de PDMS zijn bevestigd van het siliconensubstraat. Bekleed vervolgens de bindingsreactiekamer in de schijf met ongeveer 20 microliter PDMS-mengsel en plaats de nanovezels die aan de PDMS zijn bevestigd in de kamers.
Vervolgens incubeert u de nanovezelmat geïntegreerde schijf gedurende één uur bij 80 graden Celsius. Bereid 1% volume per volume oplossing van GPDES in ethanol. Behandel vervolgens de nanovezels in de schijf met zuurstofplasma.
Spuit 100 microliters GPDES-oplossing op elke nanovezelmat en incubeer gedurende twee uur op kamertemperatuur in een afgesloten container. Verwijder na de incubatie de GPDES-oplossing door de schijf op een doek te tikken. Was met ethanol, verwijder en bak bij 80 graden Celsius gedurende één uur.
Na het bakken, was met ethanol en tik om te verwijderen. Herhaal dit proces en droog af met een stikstofstroom. Voor antilichaam immobilisatie, doseer verdunde gevangen antilichaamoplossing.
Bewaar de schijven in een bevochtigde kamer en incubeer gedurende vier uur bij 37 graden. Was de resterende oplossing af met wasbuffer. Monteer nu de schijf met behulp van een dubbelzijdig plakband.
Breng redelijk druk aan om de lagen in een complete schijf te monteren. Vul de bindingsreactiekamers met blokkerende buffer en incubeer gedurende één uur bij 37 graden Celsius. Was twee keer met wasbuffer en bewaar de schijf bij 40 graden Celsius tot gebruik.
Laad de reagentia, wasbuffers en 10 microliter volbloed in de reagentia- en monsterkamers. Plaats de schijf in een op maat gemaakte visualisatiemachine voor geautomatiseerde immunoassay. Het visualisatiesysteem bevat een rotor die is verbonden met een computer voor geautomatiseerde schijfbediening, samen met een stroboscooplicht en een CCD-camera voor het maken van afbeeldingen.
Draai de schijf gedurende 60 seconden met 3.600 RPM om de rode bloedcellen te scheiden. Meng plasma met de detectieantilichamen. Breng het mengsel over naar de reactiekamer geïntegreerd met titaandioxide nanovezelmat.
Na immunoreactie, was de nanovezels door de wasbuffer naar de reactiekamer over te brengen. Breng vervolgens de chemiluminescente substraatoplossing over naar de bindingsreactiekamer en incubeer gedurende één minuut in een mengmodus. Ten slotte brengt u de gereacteerde substraatoplossing over naar de detectiekamer.
Wanneer alle reactie is voltooid, brengt u de schijf over naar een detectiesysteem en leest u het chemiluminescente signaal met behulp van op maat gemaakte software. De schijfbediening en het detectiesysteem kunnen worden geïntegreerd in één platform. Door spanning en fluoride te optimaliseren, werden uniforme nanovezelmatten verkregen zoals getoond in deze SEM-afbeelding.
Om de PDMS-uithardingstijd te optimaliseren, werd de hechtingskracht gemeten. Als het te kort was, werd de nano
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol demonstreert hoe femtomolaire detectiegevoeligheid van eiwitten in 10 µL volbloed kan worden bereikt binnen 30 minuten. De methode maakt gebruik van elektrogesponnen nanofiber-matten geïntegreerd in een lab-on-a-disc-platform, waardoor de signaal-ruisverhouding wordt verbeterd door effectief mengen en wassen.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Biotechnologie
- Eiwitdetectie
- Nanotechnologie
Achtergrond
- ELISA is een veelgebruikte methode voor eiwitdetectie.
- Het verbeteren van de detectiegevoeligheid is cruciaal voor nauwkeurige diagnostiek.
- Natuurlijk gesponnen nanovezels kunnen de gevoeligheid verhogen, maar zijn fragiel.
- Geautomatiseerde lab-on-a-disc-systemen kunnen het proces stroomlijnen.
Doel van de studie
- Om de detectiegevoeligheid van ELISA te verbeteren.
- Om het gebruik van nanovezels in een lab-on-a-disc opstelling aan te tonen.
- Om een methode te bieden voor het hanteren van fragiele nanovezelmatten.
Gebruikte methoden
- Integratie van titaniumdioxide-nanovezelmatten op een plastic schijf.
- Gebruik van centrifugale kracht om vloeistoffen door kamers te transporteren.
- Automatisering van het gehele detectieproces.
- Evaluatie van de detectiegevoeligheid in volbloedmonsters.
Belangrijkste resultaten
- Femtomolaire gevoeligheid bereikt voor proteïnedetectie.
- Effectieve meng- en wascapaciteiten aangetoond.
- De haalbaarheid van het gebruik van fragiele nanovezels in een praktische toepassing aangetoond.
- Het geautomatiseerde proces voor snelle analyse gevalideerd.
Conclusies
- De integratie van nanovezels verhoogt de detectiegevoeligheid aanzienlijk.
- Lab-on-a-disc-technologie biedt een veelbelovende benadering voor eiwitassays.
- Deze methode kan worden aangepast voor diverse diagnostische toepassingen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Deze technologie speelt in op de cruciale behoefte aan ultrasensitieve proteïnedetectie in klinische monsters met een laag volume, waardoor vroege biomarkerontdekking mogelijk wordt gemaakt vanuit minimale hoeveelheden volbloed. Door elektrogesponnen nanovezels te integreren in een centrifugaal microfluïdisch platform, wordt een femtomolaire sensitiviteit binnen 30 minuten bereikt, wat de detectielimiet aanzienlijk verbetert ten opzichte van conventionele ELISA. Deze vooruitgang ondersteunt targetvalidatie en leadidentificatie door het aantal fout-negatieven bij het screenen van eiwitten met een lage abundantie te verminderen, wat een directe impact heeft op preklinische risicoreductie en beslissingen over portfolioprioritering.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt analyse van proteïnedoelwitten met een lage abundantie in volbloed mogelijk, waardoor de betrouwbaarheid van associaties tussen doelwitten en ziekten wordt verbeterd.
- Operationele waarde: Vermindert het monsterverbruik tot 10 µL, waardoor kostbare klinische monsters voor meerdere assays kunnen worden gemultiplexed.
- Voorspellende waarde: De femtomolaire detectielimiet verbetert de signaal-ruisverhouding, wat zorgt voor een betrouwbaardere kwantificering van biomarkers in discovery-workflows.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een gestandaardiseerd, geautomatiseerd platform voor de ontwikkeling van immunoassays met reproduceerbare vloeistofbehandeling en menging.
- Operationele waarde: Elimineert handmatige pipetteerstappen, waardoor de variabiliteit wordt verminderd en de doorvoer voor antilichaamscreeningcampagnes wordt verhoogd.
- Assay-gereedheid: Ondersteunt gemultiplexte analyse met minimaal reagentieverbruik, wat validatie van targets op basis van panels vergemakkelijkt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekking en preklinische validatie door consistente proteïnekwantificering over verschillende monstertypes en volumes mogelijk te maken.
- Risicobeperking: Hoge gevoeligheid verkleint de kans op het missen van vroege farmacokinetische of farmacodynamische signalen in ziektemodellen.
- Preklinisch nut: Compatibel met kleine bloedvolumes van dieren, wat longitudinale studies zonder terminale bemonstering ondersteunt.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen het continuüm van vroege ontdekking en ondersteunt hypothesegedreven targetvalidatie via kwantitatieve eiwitdetectie in klinisch relevante matrices.
- Discovery Biology: Vergemakkelijkt mechanische risicoreductie door de detectie van pathway-specifieke biomarkers in volbloed mogelijk te maken, wat het vertrouwen in het target vergroot.
- Screening: Levert automatisering-klare immunoassay-prestaties met precieze vloeistofdosering en wasstappen, essentieel voor reproduceerbare hit-validatie.
- Analytics: Genereert kwantitatieve chemiluminescente uitlezingen over zes grootteordes, waardoor een nauwkeurige vergelijking van eiwitexpressie onder verschillende condities mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de afstemming van biomarkers door klinisch relevante eiwitten (bijv. CRP, cTnI) in minimaal bewerkt bloed te detecteren.
- Enterprise Reuse: Het lab-on-a-disc-ontwerp maakt platformadaptatie voor verschillende immunoassays mogelijk, wat de standaardisatie van reagentia en workflows bevordert.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door verbeterde detectielimieten en een breder dynamisch bereik.
- Operationele waarde: Volledige automatisering vermindert de handmatige tijd en gebruikersvariabiliteit, waardoor de reproduceerbaarheid van de assay tussen verschillende locaties wordt verbeterd.
- Strategische waarde: Maakt go/no-go-beslissingen mogelijk op basis van robuuste biomarkergegevens uit beperkte monsters, wat het risico op uitval in een laat stadium verlaagt.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang door betrouwbare kwantificering van targets met een lage abundantie vroeg in de pijplijn te bieden.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in electrospinning, de hantering van nanovezels en microfluidisch ontwerp voor een succesvolle fabricage.
- Is afhankelijk van toegang tot CNC-frezen, plasmabehandeling en vacuümapparatuur voor de bereiding van de schijven en de nanovezelmatten.
- Maakt standaardisatie van PDMS-coating- en uithardingsprotocollen noodzakelijk om een consistente adhesie van nanovezels tussen batches te garanderen.
- Aanpassing aan alternatieve eiwitdoelen vereist heroptimalisatie van de oppervlaktechemie en incubatiecondities.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van gecontroleerde omgevingscondities tijdens de overdracht van nanovezels en potentiële variabiliteit in de uniformiteit van de vezelmat.
