Name: Bepaling van Biofilm Initiatie on-virus geïnfecteerde cellen door bacteriën en schimmels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: Leer hoe je biofilm-initiatie door bacteriën en schimmels op virus-geïnfecteerde HeLa-cellen bepaalt. Deze methode kwantificeert de hechting van Staphylococcus aureus en Candida albicans aan HSV-geïnfecteerde cellenmonolagen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd ondersteund door Midwestern University, IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) en Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).

1. HSV Stammen en Handling Opmerking: Recombinant niet-verspreiding van HSV-1 (KOS) gL86 en HSV-2 (KOS) 333gJ - met beta-galactosidase reporter-activiteit gebruikt werden verstrekt door V. Twiari 36,37. <ol><li> Gebruik virus van eenzelfde partij en bewaar bij -80 ° C met een 1: 1 verhouding van Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) met 20% foetaal runderserum (FBS) en magere melk tot gebruik. Voordat virale veel opslag bepalen virusconcentratie met o-nitrofenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) en 5-broom-4-chloor-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) assay. </li><li> Bepalen virus levensvatbaarheid en multipliciteit van infectie (MOI) van X-Gal kleuring voor elke experimentele test run behulp reporter virusingang assay zoals eerder beschreven (figuur 1) 14. </li><li> Verdunde virus (Opt-MEM) gewenste MOI. Fix monolagen (paraformaldehyde; 0,5 ml / putje) voor kleuring. Plaats virus levensvatbaarheid controles in een andere microtiter plaat parallel met polymicrobiële assay platen. </li></ol> 2. HeLa 299 Cell Handling <ol><li> Groeien bij 37 ° C, 5% CO2 in DMEM met 4,5 g / l glucose, 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), gentamicine (50 ug / ml) en L-glutamine. Passage cellen bij 80% confluentie met trypsine oplossing (ethyleendiaminetetra-azijnzuur, 0,53 M EDTA, 0,05% trypsine; 5 ml / fles). </li></ol> 3. C. albicans Handling Opmerking: C. albicans verkregen uit een klinisch laboratorium bron wordt bewaard bij -80 ° C in Remmel taptemelk 2x medium. <ol><li> Cultuur bevroren voorraad op Sabouraud Dextrose Medium (37 ° C). Na 24 uur subcultuur de C. albicans op Fungisel medium (37 ° C, 48 uur) gebruikt. </li><li> Genereer kiem buis (GT) vormen (pick representatieve koloniën, 3 ml FBS, 3 uur, 37 ° C, Abs 600, 0,3). Na incubatie, wassen GT (HBSS; 2x, 4000 XG). Voeg gewassen GT aan opgewarmd HBSS (37 &amp;# 176; C; 0,32 Abs 600). GT formulieren 99% van de cellen waargenomen zoals bepaald door telling hemocytometer. </li><li> Maak gistvorm (YF) stock suspensies door het oppakken vertegenwoordiger Fungisel kolonies (HBSS, 3 ml; 0,32 Abs 600). Tel het aantal formulieren YF / ml microscopisch met behulp van een hemocytometer. YF formulieren 99% van de cellen waargenomen zoals bepaald door telling hemocytometer. </li><li> Maak werken schimmel voorraad (250 ul van GT of YF voorraad in 25 ml HBSS; 37 ° C; 10 5 CFU / ml) </li></ol> 4. S. aureus Handling <ol><li> Store S. aureus ATCC 25.923 (-80 ° C; Remmel magere melk 2x). Cultuur op schapenbloed-agar (5%; 37 ° C, 24 uur). Pick representatieve koloniën en over te dragen aan zouten medium mannitol binnen 2 dagen voor de voorraad (37 ° C, 18 uur). </li><li> Maak S. aureus voorraad suspensie (3 ml HBSS; 1,32 Abs 600; 10 8 CFU / ml) <ol><li> Het werken S. aureus voorraad (100 plvan de voorraad in 25 ml HBSS; 10 5 CFU / ml). </li></ol></li></ol> 5. Candida en S. aureus Schorsingen <ol><li> Maak gemengde C. albicans en S. aureus suspensie (250 pl YF of GT voorraad en 100 ui S. aureus voorraad in 25 ml HBSS). </li></ol> 6. polymicrobiologische Biofilm Assay <ol><li> Zaad 96 putjes met 200 ui 2 x 10 5 HeLa cellen / ml (85% confluentie niveau). Rotsplaten (30 - 45 min, 37 ° C) voor incubatie (37 ° C, 5% CO2 incubator 18 uur). Wassen monolagen (1x, Opt-MEM) dan zaad met HSV (HSV-1 (KOS) gL86 of HSV-2 (KOS) 33 gJ - in 100 gl Opt-MEM, MOI 50 en 10). Incubeer de platen (3 uur; 37 ° C, 5% CO2). Gebruik slechts één virale stam per dag. </li><li> Wassen geïnfecteerde monolagen (1x Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 2 Mg en Ca 2; 100 ui). Vervang PBS met warm HBSS verlaten van 25 &amp; #181; l in elk putje. <ol><li> Voeg YF, GT en / of S. aureus werkende suspensies (100 ul, doelgroep tot cel verhouding = 5: 1; n = 16). zoals aangegeven in tabel 1 Incubeer de platen (statisch 30 min, 37 ° C, 5% CO2). </li></ol></li><li> Na incubatie, zuig één kolom tegelijk onmiddellijk navullen met 300 ul PBS met Mg 2 en Ca 2. Herhaal deze stap twee keer voeg dan radio-immunoprecipitatie assay lysisbuffer (RIPA; filter gesteriliseerd; 200 ui van een 1:50 verdunning). </li><li> Snel vermaal de HeLa cellysaat plaats dan 50 gl op mannitol zouten (MS) en / of Fungisel (F) media (figuur 2). Spreid het lysaat met behulp van een glazen staaf gebogen in een hoek van 90 °. Incubeer de platen (18 uur bij 37 ° C). Handmatig tellen het aantal kolonies per plaat. Controles bestaan ​​uit S. aureus en / of C. albicans naleving van HSV-niet-geïnfecteerde HeLa-cellen. </li></ol> 7. Imaging Studies &lt;/ P&gt; <ol><li> Was elke ronde glazen dekglaasje (12 mm, 50 ml aceton in bekerglas van 100 ml). Droog en steriliseer dekglaasjes (Kimwipes; glas petrischaaltjes). Plaats droge steriele dekglaasjes in de putjes van steriele 24 wells platen met alcohol vlammen gesteriliseerde pincet. </li><li> Voeg HeLa-cellen (1 ml, 5 x volume voor 96 putjes) aan de wells van 24 well platen bevattende de gewassen steriele ronde glazen dekglaasjes. Voeg het virus, bacteriën en schimmels volgens de template (tabel 2) aan 5x het volume voor de 96 well platen, vervolgens incubeer en zoals beschreven in de stappen 6.2.1 tot 6.4. </li><li> Na de laatste wasbeurt, bevestig de cellen voor microscopie door overstromingen van de dia met methanol en te laten verdampen. Bewaar de platen bij RT tot kleuring. </li><li> Voor helder veld microscopie (1000x finale oorspronkelijke vergroting) vult de putjes die-methanol gefixeerd dekglaasjes met gedemineraliseerd water. Onmiddellijk aspireren water. Bedek elk dekglaasje met Gram kristalviolet. Wash coverslips vrij van niet-gebonden vlek (gedemineraliseerd water). Droge dekglaasjes in situ dan houden ze met harde set montage medium om een label dia (figuur 3). </li><li> Voor fluorescentie microscopie (100x objectief; 1000x laatste oorspronkelijke vergroting) coverslips vrij van methanol in wezen wassen zoals beschreven in stap 7.4. Droog de dekglaasjes in de putjes. <ol><li> Na het drogen, verwijder de dekglaasjes en plaats ze op het label dia&#39;s. voeg een voldoende 1:20 verdunning van fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) geconjugeerd Herpes Simplex Virus type 1 + 2 gD antilichaam aan het dekglaasje dekking (1-5 ui). </li><li> Incubeer de glaasjes in een vochtkamer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Na incubatie was de dekglaasjes in 4 veranderingen van PBS. </li><li> Na de laatste wasbeurt, de terugkeer van de dekglaasje aan de gelabelde dia. Kleuren met 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; vochtkamer; 37 ° C gedurende 30 min). Na incubatie was de dekglaasjes in 4 chanGES van PBS, vervolgens aan te brengen op de gelabelde dia met harde set montage medium. </li><li> Laat het fixeermiddel uitharden gedurende 24 uur bij KT in het donker. Onderzoek de dekglaasjes onder olie doelstelling op ofwel een helder veld microscoop of fluorescentiemicroscoop met FITC en DAPI cutoff filters. Onderzoek Foto ten minste 50 gebieden (100 cellen per organisme minimum) voor co-lokalisatie (figuur 4). </li></ol></li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Momenteel is er geen informatie beschikbaar over complexe interacties tussen vaste semi-permanente leden van de ontvangende microbiome taxonomische die meerdere domeinen, dat wil zeggen, prokaryotische, eukaryotische en virale steken. Daarom ontwikkelden we een nieuw in vitro model systeem om biofilm initiatie door S. bestuderen aureus en C. albicans HSV-1 of HSV-2 geïnfecteerde HeLa 229 (HeLa) cellen 38. De HeLa cel modelsysteem presenteert een uniek voordeel. Dit...

<html> De menselijke microbiome omvat diverse organismen uit meerdere taxonomische koninkrijken die geografische regio&#39;s in het lichaam te delen. Aanhankelijkheid aan celoppervlakken is een essentiële eerste stap in de vorming van biofilm, die deel uitmaakt van de microbiome kolonisatie proces. In de microbiome kunnen virussen die chronische en persistente infecties. De chronische cel infectie door deze virussen kunnen een verandering veroorzaken bij vermoedelijke beschikbaarheid receptor. 1,2 Daarnaast celinvoer door intracellulaire pathogenen kan ook van invloed zijn gastheer membraan vloeibaarheid / hydrofobiciteit die op hun beurt de bevestiging van andere leden microbiome, waaronder bacteriën en schimmels kunnen veranderen . Om de interacties die optreden tussen deze meerdere pathogenen die co-lokaliseren in dezelfde geografische gebieden van de menselijke gastheer begrijpen moeten we in staat om de interactie van ziekteverwekkers die het spectrum van taxonomische rijken bij het slijmvliesoppervlak vertegenwoordigen bestuderen. t &quot;&gt; De Herpesviridae zijn een familie van microben in 100% van de mens als permanente leden van de microbiome 3,4. Bovendien kunnen ze ook voortdurend vergoten zowel in de aanwezigheid en afwezigheid van symptomen. Specifiek, herpes simplex virus-1 en herpes simplex virus 2 (HSV-1 en HSV-2, respectievelijk) permanent lid van de microbiome in de oronasopharynx en voortplantingsorganen. in immuuncompetente individuen, zowel HSV-1 en HSV-2 veroorzaken gingivostomatitis, alsmede genitale herpes 5-8. op deze sites HSV veroorzaakt een latente infectie wordt gekenmerkt door chronische persistente asymptomatische virale verspreiding 9. notitie van HSV in cellen leidt tot veranderingen in oppervlakte-expressie van nectins, heparansulfaat, rafts en herpesvirus ingang mediator / tumornecrose factor receptor (HVEM / TNFr) 10-25. Deze potentieel vertegenwoordigen gedeeld receptoren voor bacteriën en schimmels, bijvoorbeeld S. aureus en C. albicans, terwijl die opportunistische pathogenen,kan ook wonen als lid van de mucosale microbiome van de oronasopharynx 26,27. Binnen de oronasopharynx S. aureus en C. albicans bezetten twee verschillende locaties van de kolonisatie. In gastheren met natuurlijke tanden, is het mondslijmvlies gedeeld door HSV-1 en C. albicans, terwijl de voorste neus neusgaten bezet door S. 28 aureus. Ondanks het in vitro onderzoek dat S. aureus hecht aan mond epitheelcellen, 29,30 S. aureus is zelden geïsoleerd van orale monsters als normaal weefsel aanwezig 29,30 is. Er is weinig bekend met betrekking tot het genitaal co-kolonisatie niches buiten de klinische bevindingen dat S. aureus wordt geassocieerd met aerobe vaginitis, gekenmerkt door genitale ontsteking, ontlading en dyspareunie, terwijl C. albicans produceert mucosalaesies vergelijkbaar met dat in de mondholte 31-35. Dus, hoewel deze leden van de mondelinge en genitale Microbiome kruis taxonomische rijken weinig bekend over hun interactie het invloed hun vermogen om biofilmvorming te leiden tot hechting aan de gastheercel oppervlak 5. Dit protocol daadwerkelijk is toegepast op de functionele gevolgen van co-kolonisatie / infectie te bepalen.

<table><tbody><tr><td>C.albicans</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BBL Sabouraud Dextrose</td><td>BD</td><td>211584</td><td></td></tr><tr><td>Fungisel Agar</td><td>Dot Scientific</td><td>7205A</td><td></td></tr><tr><td>S.aureus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mannitol Salt Agar</td><td>Troy Biologicals</td><td>7143B</td><td></td></tr><tr><td>Sheep blood agar</td><td>Troy Biologicals</td><td>221239</td><td></td></tr><tr><td>Hela cellen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x DMEM (Dubelcco's Gemodificeerd Eagle Medium, met 4,5 g/L glucose en L-glutamine, zonder natriumpyruvaat</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin 50 mg/ml</td><td>Sigma</td><td>1397</td><td>50 &micro;g/ml eindconcentratie in het volledige DMEM</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA (0,05% Trypsin, 0,53 M EDTA) Oplossing 1x</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>10% eindconcentratie in het volledige DMEM</td></tr><tr><td>Ander medium en reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Thermo Scientific</td><td>34055</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Pure X gal</td><td>Invitrogen</td><td>15520-018</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution)</td><td>Corning</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Dot Scientific</td><td>30042-500</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lysis</td><td>Life Technologies</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>Kleuren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A433P-4</td><td></td></tr><tr><td>HSV 1&amp;2, specifiek voor gD</td><td>ViroStat</td><td>196</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D8417-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Gram Crystal Violet</td><td>Troy Biologicals</td><td>212527</td><td></td></tr><tr><td>Benodigdheden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal 100 x 15</td><td>Dot Scientific</td><td>229693&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal 150 x 15</td><td>Kord Valmark</td><td>2902</td><td></td></tr><tr><td>96-Well platen</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8030-01F</td><td></td></tr><tr><td>24-well platen</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8044-01F</td><td></td></tr><tr><td>Cultuurbuisjes 100 x 13</td><td>Thomas Scientific</td><td>9187L61</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes, 12 mm</td><td>Deckglaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr></tbody></table>

bepaling van biofilm initiatie on-virus geïnfecteerde cellen door bacteriën en schimmels

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

De studie van polymicrobiale interacties langsheen de taxonomische rijken die schimmels, bacteriën en virussen omvatten niet eerder onderzocht met betrekking tot hoe virale leden van de microbiome invloed daaropvolgende microbe interacties met dit virus geïnfecteerde gastheercellen. De co-bewoning virus met bacteriën en schimmels is hoofdzakelijk aanwezig op de mucosale oppervlakken van de orale holte en voortplantingsorganen. Slijmvliescellen, met name die met aanhoudende chronische of persistente latente virale infecties, kan een aanzienlijke invloed op de leden van de microbiome virusoverdracht verandering in aantal en type receptoren tot expressie gebracht hebben. Wijziging in gastheercelmembraan architectuur zou resulteren in veranderde vermogen van verdere leden van de normale flora en opportunistische pathogenen aan de eerste stap van biofilmvorming, dwz hechting initiëren. Deze studie beschrijft een methode voor kwantificering en visueel onderzoek van het effect HSV op de inleiding van biofilformatie m (therapietrouw) van S. aureus en C. albicans.

Hoe betrouwbaar gegevens verkrijgbaar uit op dit rapport beschreven wordt getoond in figuur 2 af 38. Door het gebruik van dit systeem de modulatie op Staphylococcus en schimmel interactie met viraal geïnfecteerde cellen en hun effect op elkaars hechting kan worden afgebakend. Deze types van studies nodig microscopisch onderzoek van de interactie is getoond in figuren 3 en 4 38 om te bepalen of de polymicrobiële inte...

Hier wordt een methode beschreven voor de bepaling van inter-Kingdom associatie en concurrentie (bacteriën en schimmels) voor het hechten aan virus-geïnfecteerde HeLa-celmonolagen. Dit protocol kan worden uitgebreid naar meerdere combinaties van prokaryoten, eukaryoten en virussen.

Bepaling van Biofilm Initiatie on-virus geïnfecteerde cellen door bacteriën en schimmels

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

Het algemene doel van dit experiment is om de effecten te meten die cellen die vooraf zijn geïnfecteerd met HSV hebben op de daaropvolgende aanhechting van bacteriële en fungale opportunistische pathogenen, bijvoorbeeld Staphylococcus aureus en Candida albicans. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen met betrekking tot de rol die chronische virale infectie speelt bij de regulatie van de respectievelijke leden van het microbioom van de gastheer. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de interactie van meerdere organismen kan worden onderzocht en gekwantificeerd bij de initiële stap van biofilmvorming, namelijk de adhesie.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de beheersing van koloniserende opportunistische pathogenen, aangezien de voorwaarde van HSV-infectie met asymptomatische uitscheiding aanwezig is bij de meerderheid van de menselijke populatie. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de HSV-beheersing van daaropvolgende microbiële aanhechting, kan ze ook worden toegepast op andere systemen, zoals CMV-infectie en die van adenovirus. Bepaal voor begin de levensvatbaarheid van het HSV1- of HSV2-virus en de multipliciteit van infectie, of MOI, via x-gal-kleuring voor elke experimentele assay-run met behulp van een reportervirus-entry-assay.Verdun het virus tot de gewenste MOI en plaats de controles voor viruslevensvatbaarheid in een aparte microtiterplaat parallel aan de platen voor de poly-microbiële assay. Gebruik vervolgens 100 µL paraformaldehyde-glutaraldehydebuffer om de monolagen te fixeren vóór de kleuring. Voor het onderhoud van HeLa-cellen worden deze gekweekt in DMEM met 4,5 g/L glucose, 10% hitte-inactieve FBS, 50 µg/L gentamicine en l-glutamine.Gebruik Trypsine-oplossing om de cellen te passeren bij een confluentie van 80 procent. Om C.albicans te hanteren, wordt een bevroren stock gekweekt op sub around dexterous medium bij 37 degrees celsius. Na 24 uur wordt de C.albicans gesubcultiveerd op fungicell medium en 48 uur geïncubeerd voor gebruik.Genereer kiembuis- of GT-vormen van C.albicans door representatieve fungicell-kolonies te selecteren en deze drie uur lang te kweken in drie milliliters FPS bij 37 °C. Centrifugeer de cultuur na de incubatie tien minuten bij 4 000 ×g. Was de cellen vervolgens twee keer met HBSS.Nadat de cellen met een hemocytometer zijn geteld, wordt de gewassen GT toegevoegd aan HBSS bij 37 °C tot een OD 600 van 0,32. Om voorraadsuspensies van de gistvorm, of YF, te maken, worden representatieve fungicell-kolonies geselecteerd om drie milliliter HBSS te inoculeren. Kweek de culturen tot een OD 600 van 0,32; tel met een hemocytometer het aantal YF-vormen per milliliter, wat 99% van de onder de microscoop waargenomen cellen zou moeten zijn.Maak een werkvoorraad van de schimmel door 250 µL van de GT- of YF-voorraad over te brengen naar 25 mL HBSS van 37 °C. Dit resulteert in 10⁵ CFU per mL. Om SRES ATCC 25923 voor te bereiden, wordt een bevroren voorraad uitgezaaid op 5% schapenbloedagar en 24 uur lang geïncubeerd bij 37 °C.Select binnen twee dagen representatieve kolonies, breng deze over naar mannitol-zoutmedium en kweek ze gedurende 18 uur bij 37 °C. Om een SRES-voorraad aan te maken, worden representatieve kolonies gesuspendeerd in 3 mL HBSS van 37 °C tot een OD 600 van 0,132 of 10⁸ CFU per milliliter. Om een werkvoorraad voor te bereiden, worden 100 µL van de voorraadsuspensie overgebracht naar 25 mL HBSS.Dit resulteert in tien tot de vijf CFU per milliliter. De eerste kritieke stap bij het toepassen van deze methode op andere organismen of microbestammen is het bepalen van het juiste aantal bacteriën en schimmels dat moet worden toegevoegd, zodat er voldoende kolonies aanwezig zijn om te tellen. Om een polymicrobiële biofilmanalyse uit te voeren, zaait u 96-wells platen met 200 microliter van twee keer tien tot de 15de HeLa-cellen per milliliter.Schud de platen 30 tot 45 minuten bij 37 °C voordat ze 18 uur worden geïncubeerd in 5% CO2 bij 37 °C. Gebruik 1X optimum om de monolagen te wassen en zaai deze vervolgens met de enkele stam van HSV. Test slechts één stam per keer.Incubeer de platen gedurende drie uur bij 37 °C in 5% CO₂. Was de geïnfecteerde monolagen met 100 µL PBS bij 37 °C met magnesium en calcium. Vervang vervolgens de PBS door HBSS bij 37 °C.Laat 25 µL van de HBSS in elke wel achter. Voeg vervolgens de werkingssuspensie van YF, GT en/of SRES toe en incubeer de platen gedurende 30 minuten bij 37 °C in 5% CO2. Aspireer na incubatie telkens één kolom van de plaat.Vul de wells onmiddellijk opnieuw bij met 300 microliters PBS met magnesium en calcium. Nadat deze wasstap tweemaal is herhaald, voegt u aan elke well 200 microliters toe van filtergesteriliseerde RIPA-lysebuffer in een verdunning van 1 op 50. Let bij het werken met andere stammen van bacteriën of schimmels erop dat de gebruikte concentratie RIPA voldoende is voor cellyse, maar nog steeds permissief is voor het testen van de microbiële levensvatbaarheid.Tritureer het HeLa-cellysaat snel en pipetteer 50 µL op mannitol-zouten en/of fungicell-medium. Verspreid vervolgens het lysaat over het oppervlak van de plaat met een glazen staaf die in een hoek van 90 graden is gebogen. Tel na incubatie van de platen gedurende 18 uur handmatig het aantal kolonies per plaat.Controles bestaan uit SRES en/of C.albicans adhesie aan HSV-ongeïnfecteerde HeLa-cellen. Was voor beeldgevingsstudies elk rond glazen dekglas met aceton voorafgaand aan sterilisatie. Plaats vervolgens de droge, steriele dekglazen met alcohol- en vlamgesteriliseerde pincetten in de putjes van steriele 24-wells platen.Voeg HeLa-cellen toe aan de putjes van de platen die de dekglasjes bevatten. Infecteer vervolgens de cellen met het virus. Voeg na de infectie bacteriën en schimmels toe volgens het sjabloon en incubeer en verwerk de cellen zoals eerder gedemonstreerd voor de 96-wells plaat.Fixeer na de laatste wasbeurt de cellen voor microscopie door de dekglasjes te overstromen met methanol en laat dit vervolgens verdampen. Vul voor lichtveldmicroscopie de putjes met de gefixeerde dekglasjes met gedeïoniseerd water. Aspireer het water onmiddellijk en voeg voldoende kristalviolet toe om elk dekglasje te bedekken.Nadat de met kristalviolet gekleurde dekglasjes zijn gewassen met gedeïoniseerd water, moeten ze in C2 worden gedroogd voordat ze met een hardstollend montagemedium op een gelabelde objectglas worden geplakt. Voor fluorescentiemicroscopie moeten de dekglasjes, nadat ze zijn gewassen om methanol te verwijderen, in de putjes worden gedroogd voordat ze met een hardstollend montagemedium op gelabelde objectglazen worden gemonteerd. Voeg een voldoende hoeveelheid van een 1:20 verdunning van FITC-geconjugeerd HSV1 plus 2GD-antilichaam toe om het dekglasje te bedekken.Incubeer de objectglazen in een vochtkamer bij 37 °C gedurende 30 minuten. Was de dekglasjes na incubatie vier keer met PBS. Plaats de objectglazen na de laatste wasbeurt terug in de vochtkamer.Voeg dab B toe en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C. Was na de incubatie de coupes vier keer met PBS. Laat het montage-medium 24 uur uitharden bij kamertemperatuur in het donker.Onderzoek vervolgens, met een olie-immersieobjectief op een licht- of fluorescentiemicroscoop, ten minste 50 velden op colokalisatie. Representatieve resultaten van het effect van HSV op de adhesie van Staphylococcus en/of Candida albicans worden hier getoond. De aanwezigheid van HSV1 remde de adhesie van Staphylokokken aan HeLa-cellen.De aanwezigheid van kiembuisvormen van Candida, maar niet van gistvormen, herstelde de adhesieniveaus van Staphylococcen. Vergelijkbare resultaten werden gemeten voor HeLa-cellen geïnfecteerd met HSV2. Zoals in deze figuur te zien is, is het adhesieniveau van Candida-kiembuisvormen significant hoger voor met HSV2 geïnfecteerde cellen dan voor met HSV1 geïnfecteerde cellen.Het omgekeerde effect werd gemeten voor HSV1 versus HSV2 op Candida-gistvormen. Adhesiepatronen werden bepaald met behulp van kristalvioletkleuring van monoculturen om de interactie tussen bacteriën en schimmels te visualiseren. Vervolgens werd fluorescentiemicroscopie gebruikt om de aanwezigheid van HSV te bepalen in relatie tot de andere microben.In afwezigheid van HSV colocaliseerden Staphylokokken en zowel de gist- als kiembuisvormen van Candida op HeLa-cellen. Echter werd alleen Candida waargenomen op cellen die geïnfecteerd waren met HSV. Eenmaal beheerst kan deze techniek in acht tot negen uur worden voltooid, mits deze correct wordt uitgevoerd.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals differentiële fluorescerende antilichamenkleuring, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de differentiële expressie van oppervlakterecptoren die aanwezig zijn na virusintrede in de cel. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van het menselijke microbioom om post-microbe-interacties te onderzoeken in weefselkweken en orgaankweeksystemen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u een polymicrobieel interactiemodel ontwikkelt dat verschillende taxonomische koninkrijken omvat.Vergeet niet dat het werken met pathogenen extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het gebruik van niet-verspreidende virusstammen en barrièretechnieken, vereist zijn.

determination-biofilm-initiation-on-virus-infected-cells-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De test beschrijft een snelle wijze te vroeg biofilmvorming in bacteriën en schimmels te meten. Deze methode maakt gebruik van een microtiterplaat als substraat voor microbiële biofilm en de vorming van biofilm wordt gevisualiseerd met behulp van kristalviolet stam. De test geeft zowel een kwalitatieve of kwantitatieve test voor de vroege biofilmvorming.

Microtiter Dish biofilm vorming Assay

Source: Tay, S. B., et al. Anti-virulent Disruption of Pathogenic Biofilms using Engineered Quorum-quenching Lactonases. J. Vis. Exp. (2016)The video demonstrates a method to quantify biofilm biomass in a pathogenic bacterium, comparing untreated controls with samples treated with a quorum-quenching enzyme. The enzyme disrupts bacterial signaling during early incubation, reducing cell adhesion. After washing and further incubation, control wells form dense biofilms, while treated wells show...

Quantifying Enzyme-Induced Biofilm Suppression in Pathogenic Bacteria

Source: Schlafer, S, and Frost Kristensen, M. Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the cultivation of Streptococcus mutans and Candida albicans cross-kingdom biofilms under oral-like conditions to model bacterial–fungal interactions, enabling the study of microbial synergy, glucan-mediated adhesion, and acidogenic virulence in oral pathogenesis.

Establishing Bacterial–Fungal Cross-Kingdom Biofilms for Studying Oral Pathogenesis

Source: Miquel Guennoc, C., et al. New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the preparation of a fungal culture on treated cellophane membranes to support colony formation and radial growth. It then shows the cultivation and preparation of soil bacterial cells for interaction assays. Finally, it illustrates how bacterial cells adhere to the fungal colony...

Establishing a Fungal-Bacterial Co-culture for Biofilm Formation

This video illustrates the initiation of polymicrobial biofilm formation on virus-infected cells by bacteria and fungi. Herpes simplex virus infection impedes bacterial attachment to the cells, preventing bacterial-fungal co-localization. In contrast, uninfected cells display bacterial-fungal co-localization and initiation of biofilm formation.

An Assay to Determine Polymicrobial Biofilm Initiation on Virus-Infected Cells

This video describes a method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae using microscopy. Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and involve numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation.

A Method for Sample Preparation to Visualize Biofilm Forming Bacteria on Fungal Hyphae

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode te groeien en kwalitatief analyseren bacteriële biofilms op schimmeldraden door confocale en elektronenmicroscopie.

Een nieuwe methode voor Kwalitatieve Multi-schaal analyse van bacteriële biofilms op draadschimmelcel Koloniën met behulp van confocale en Electron Microscopy

Dit protocol beschrijft het gebruik van een aanpasbaar geautomatiseerde microfluidic apparaat te visualiseren van biofilm vorming in Candida albicans , onder fysiologische omstandigheden van de gastheer.

Visualisatie van Biofilm vorming in Candida albicans met behulp van een geautomatiseerd Microfluidic-apparaat

Dit protocol laat de lezer om te analyseren bile salt-geïnduceerde biofilm vorming in de darmen ziekteverwekkers met behulp van een veelzijdige aanpak om vast te leggen van het dynamische karakter van het bacteriële biofilms door beoordeling van de naleving, extracellulaire stof van polymere matrix vorming, en dispersie.

Bile Salt-geïnduceerde Biofilm vorming in de darmen pathogenen: technieken voor de identificatie en kwantificering

Dit protocol beschrijft de bereiding van het inoculum, de kwantificering van de biofilm op microtiterplaten met behulp van kristalviolette kleurstof, het aantal levensvatbare stoffen in biofilms en de visualisatie van biofilms van Acinetobacter.

Kwantificerings-, levensvatbaarheidsbeoordeling en visualisatiestrategieën voor Acinetobacter-biofilms

Leer hoe je biofilm-initiatie door bacteriën en schimmels op virus-geïnfecteerde HeLa-cellen bepaalt. Deze methode kwantificeert de hechting van Staphylococcus aureus en Candida albicans aan HSV-geïnfecteerde cellenmonolagen.

Bepaling van Biofilm Initiatie on-virus geïnfecteerde cellen door bacteriën en schimmels

Meer video's verkennen