Name: Kinetic Meet- en Real Time Visualisatie van Somatic herprogrammeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Leer hoe je somatische celherprogrammering naar iPSC's in realtime kunt volgen met flowcytometrie en beeldvorming. Deze methode meet kinetiek van pluripotente markers en helpt onderzoekers bij het begrijpen van herprogrammeringsefficiëntie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs danken Chad MacArthur voor nuttige discussies.

<ol><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).</li>
<li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481, 295-305 (2012).</li>
<li>Kamata, M., Liang, M., Liu, S., Nagaoka, Y., Chen, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+monitoring+of+hiPSC+generation+and+differentiation+using+differential+expression+of+endogenous+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Live cell monitoring of hiPSC generation and differentiation using differential expression of endogenous microRNAs.</a> PLoS One. 5, e11834(2010).</li>
<li>Vendrell, M., Zhai, D., Er, J. C., Chang, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+strategies+in+fluorescent+probe+development%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Combinatorial strategies in fluorescent probe development.</a> Chem Rev. 112, 4391-4420 (2012).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Quintanilla, R. H. Jr, Asprer, J. S., Vaz, C., Tanavde, V., Lakshmipathy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+is+a+negative+cell+surface+marker+for+pluripotent+stem+cell+identification+during+human+fibroblast+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CD44 is a negative cell surface marker for pluripotent stem cell identification during human fibroblast reprogramming.</a> PLoS One. 9, e85419(2014).</li>
<li>Papp, B., Plath, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+to+pluripotency%3A+stepwise+resetting+of+the+epigenetic+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Reprogramming to pluripotency: stepwise resetting of the epigenetic landscape.</a> Cell Res. 21, 486-501 (2011).</li>
<li>Nefzger, C. M., Alaei, S., Knaupp, A. S., Holmes, M. L., Polo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+marker+mediated+purification+of+iPS+cell+intermediates+from+a+reprogrammable+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell surface marker mediated purification of iPS cell intermediates from a reprogrammable mouse model.</a> J Vis Exp. , e51728(2014).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+fibroblast-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells+support+undifferentiated+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Immortalized fibroblast-like cells derived from human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth.</a> Stem Cells. 22, 972-980 (2004).</li>
<li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+the+International+Stem+Cell+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative.</a> Nat Biotechnol. 25, 803-816 (2007).</li>
<li>Singh, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+live+alkaline+phosphatase+substrate+for+identification+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Novel live alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rev. 8, 1021-1029 (2012).</li>
<li>Naujok, O., Lenzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+re-evaluation+of+CD24-positivity+of+human+embryonic+stem+cells+differentiated+into+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">A critical re-evaluation of CD24-positivity of human embryonic stem cells differentiated into pancreatic progenitors.</a> Stem Cell Rev. 8, 779-791 (2012).</li>
<li>Ramirez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+report%3A+benchmarking+human+pluripotent+stem+cell+markers+during+differentiation+into+the+three+germ+layers+unveils+a+striking+heterogeneity%3A+all+markers+are+not+equal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Brief report: benchmarking human pluripotent stem cell markers during differentiation into the three germ layers unveils a striking heterogeneity: all markers are not equal.</a> Stem Cells. 29, 1469-1474 (2011).</li>
<li>Huang, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+adhesion+molecule+%28EpCAM%29+complex+proteins+promote+transcription+factor-mediated+pluripotency+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) complex proteins promote transcription factor-mediated pluripotency reprogramming.</a> J Biol Chem. 286, 33520-33532 (2011).</li>
<li>Kolle, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+embryonic+stem+cell+surface+markers+by+combined+membrane-polysome+translation+state+array+analysis+and+immunotranscriptional+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling.</a> Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).</li>
<li>Thyagarajan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+engineered+human+embryonic+stem+cell+lines+using+phiC31+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase.</a> Stem Cells. 26, 119-126 (2008).</li>
</ol>

Alle auteurs [RHQ, JSTA, KS, en UL] zijn medewerkers van Thermo Fisher Scientific, die enkele van de reagentia en instrumenten gebruikt in dit artikel oplevert.

Deze studie biedt strategieën voor het monitoren en volgen van het herprogrammeringsproces met behulp van flowcytometrie en real-time beeldvormingsanalyse. De cruciale stappen in het protocol zijn het initiëren van herprogrammering, het meten van de voortgang van herprogrammering op basis van markerexpressie en real-time monitoring van herprogrammering. Elke herprogrammeringsmethode naar keuze kan worden gebruikt, maar hier richten we ons op Sendai-gebaseerde herprogrammering van menselijke fibroblasten. Het voordeel van...

-Patiënt afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) zijn veelbelovende instrumenten voor celtherapie en drug discovery. Zij een autologe bron van cellen voor de therapie. Bovendien, ze omvatten een zeer brede reeks genetische achtergronden, waardoor een gedetailleerde in vitro analyse van genetische ziekten dan huidige embryonale stamcel (ESC) lijnen mogelijk maken. Recente ontwikkelingen hebben geleid tot de ontwikkeling van verschillende methoden voor het genereren iPSCs, waaronder herprogrammering met Sendai-virus, episomale plasmiden of mRNA 1,2. Met name worden verschillende herprogrammering methoden in verband met verschillende niveaus van efficiëntie en veiligheid, en zullen waarschijnlijk verschillen op andere manieren hun geschiktheid van invloed zijn voor diverse toepassingen. Met de beschikbaarheid van een verscheidenheid aan technologieën herprogrammering, is het belangrijk geworden om methodologieën voor herprogrammering te ontwikkelen. De meeste bestaande werkwijzen vertrouwen op de kwalitatieve controle van de morfologie of vlekkenmet stamcel-specifieke kleurstoffen en antilichamen. Een recent ontwikkelde methode maakt gebruik van lentivirale fluorescentie reporters die gevoelig PSC-specifieke miRNAs of gedifferentieerde cel-specifieke mRNAs 3 zijn. Dergelijke controlemethoden vergemakkelijken van de selectie en de optimalisering van herprogrammering technieken voor verschillende situaties. Bijvoorbeeld is CDY1 gebruikt als een fluorescente probe te vroeg iPSCs om te screenen op modulators 4 herprogrammering. Het waarnemingsvermogen wensen herprogrammering experimenten is ook essentieel voor een beter begrip van het proces zelf. Zo is nu bekend dat bepaalde somatische celtypen zijn gemakkelijker te herprogrammeren anderen dan 5, en dat cellen doorlopen tussenfasen in herprogrammeren 6-8. Helaas, de onderliggende mechanismen herprogrammeringsproces nog niet volledig begrepen en derhalve de exacte verschillen tussen herprogrammering methoden ook nog worden defined. Zo methoden voor monitoring, evaluatie, en het vergelijken van herprogrammering gebeurtenissen blijven van cruciaal belang voor het veld stamcellen te zijn. De in dit protocol beschreven werkwijzen maken de controle en beoordeling van de herprogrammeringsproces en laten zien hoe deze technieken kunnen worden gebruikt om verschillende reeksen herprogrammering reagentia vergelijken. De eerste benadering houdt flowcytometrie geanalyseerd met behulp van combinaties van antilichamen tegen positieve en negatieve pluripotente stamcellen (PSC) markers. De tweede benadering koppels real-time beeldvorming en de meting van de totale samenloop (het percentage oppervlak bedekt door de cellen) en de samenvloeiing van marker-signalen (het percentage oppervlak bedekt door de fluorescerende signalen).

<table><tbody><tr><td>DMEM, hoge glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, embryonaal stamcel-gekwalificeerd, VS-oorsprong</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16141-061</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), fenol rood&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Mouse (ICR) Geïnactiveerde embryonale fibroblasten</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A24903</td><td></td></tr><tr><td>Attachment Factor Protein (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-006-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, Type IV, poeder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (1x), geen fenol rood&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563-011</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, geen calcium, geen magnesium&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413302</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0264</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Albumin Fraction V (7,5%-oplossing)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine (10.000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>InSolution Y-27632</td><td>EMD Millipore</td><td>688001</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16517</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Geautomatiseerde Celteller</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess Celtellingkamers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal</td><td>ATCC</td><td>CRL-2522</td><td></td></tr><tr><td>DF1 Adult Human Dermal Fibroblast</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R7799-105</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte ZOOM</td><td>Essen BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 Antilichaam, Alexa Fluor 647-conjugaat (MC813-70)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SSEA421</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 Antilichaam, Alexa Fluor 488-conjugaat (eBioMC-813-70 (MC-813-70))</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14810</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 Antilichaam (MC813-70)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41-4000</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Antilichaam (cl.A)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp;41-1000</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5-conjugaat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A27094</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit voor Live Cell Imaging</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25528</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RM-5700 (niet langer beschikbaar)</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-Muis IgG (H+L) Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 488-conjugaat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp;A-11029</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-Rat IgG (H+L) Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 594-conjugaat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp;A-11007</td><td></td></tr><tr><td>Alkaline Fosfatase Live Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14353</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit voor Live Cell Imaging</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25618</td><td></td></tr><tr><td>CD24 Muis Anti-Human mAb (clone SN3), FITC-conjugaat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MHCD2401</td><td></td></tr><tr><td>beta-2 Microglobulin Antilichaam, FITC-conjugaat (B2M-01)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A15737</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM / CD326 Antilichaam, FITC-conjugaat (VU-1D9)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A15755</td><td></td></tr><tr><td>CD73 / NT5E Antilichaam (7G2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41-0200</td><td></td></tr><tr><td>VECTOR Red Alkaline Fosfatase (AP) Substraat Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-5100</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer.Z1 microscoop&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>491912-0003-000</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Data Analysis Software</td><td>FLOJO, LLC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blauw/Rood Laser</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Gebruik Attune NXT&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>S3e\ Cel Sorter (488/561 nm)</td><td>BIO-RAD</td><td>1451006</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 12 x 75 mm Buis met Celfilterdop</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml, hoge helderheid, dome-seal schroefdop</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon T-75 Flask</td><td>Corning</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Falcon T-175 Flask</td><td>Corning</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6-well dish</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Heracell CO2 Rolling Incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51013669</td><td></td></tr><tr><td>Nonstick, RNase-vrije Microfugebuizen, 1,5 ml</td><td></td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>HulaMixer Sample Mixer</td><td></td><td>15920D</td><td></td></tr></tbody></table>

kinetic meet- en real time visualisatie van somatic herprogrammeren

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Somatische herprogrammering heeft de omzetting van volwassen cellen naar geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) mogelijk gemaakt, afkomstig uit diverse genetische achtergronden en ziektefenotypen. Recente ontwikkelingen hebben efficiëntere en veiligere methoden geïdentificeerd voor de introductie van herprogrammeringsfactoren. Er zijn echter weinig tools om de voortgang van de herprogrammering te controleren en te volgen. Huidige methoden voor het monitoren van herprogrammering zijn gebaseerd op de kwalitatieve inspectie van morfologie of kleuring met stamcelspecifieke kleurstoffen en antilichamen. Tools om de voortgang van iPSC-generatie te onderzoeken, kunnen helpen het proces beter te begrijpen onder verschillende omstandigheden van diverse celbronnen.
Deze studie presenteert belangrijke benaderingen voor kinetische meting van de voortgang van herprogrammering met behulp van flowcytometrie en realtime-monitoring via beeldvorming. Om de kinetiek van herprogrammering te meten, werd flowanalyse uitgevoerd op discrete tijdstippen met behulp van antilichamen tegen positieve en negatieve pluripotente stamcelmarkers. De combinatie van real-time visualisatie en flowanalyse maakt de kwantitatieve studie van herprogrammering in verschillende stadia mogelijk en biedt een nauwkeuriger vergelijking van verschillende systemen en methoden. Real-time, op beeld gebaseerde analyse werd gebruikt voor de continue monitoring van fibroblasten terwijl ze opnieuw worden geprogrammeerd in een feeder-vrij mediumsysteem. De kinetiek van kolonievorming werd gemeten op basis van confluentie in de fasecontrast- of fluorescentiekanalen na kleuring met live alkalische fosfatazekleurstof of antilichamen tegen SSEA4 of TRA-1-60. De resultaten wezen uit dat meting van confluentie semi-kwantitatieve metrics biedt om de voortgang van herprogrammering te controleren.

Monitoring herprogrammeren Kinetics Met behulp van flowcytometrie CD44 is een fibroblast marker terwijl SSEA4 is een PSC marker 6,10. Zoals verwacht van dit expressiepatroon flowcytometrie BJ fibroblasten toont een SSEA4 - CD44 + populatie die de creatie van kwadrant poorten maakt in combinatie met de ongekleurde monster. Tijdens de herprogrammering van DF1 fibroblasten met de Sendai v...

Het protocol in dit onderzoek beschrijft werkwijzen voor de real-time monitoring herprogrammering progressie via de kinetische meting van positieve en negatieve pluripotente stamcel markers gebruikt flowcytometrie analyse. Het protocol bevat ook de imaging-gebaseerde beoordeling van de morfologie, en merker of reporter expressie tijdens iPSC generatie.

Kinetic Meet- en Real Time Visualisatie van Somatic herprogrammeren

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Het algemene doel van deze procedures is het visualiseren en volgen van de progressie van somatische celreprogrammering tot geïnduceerde pluripotente stamcellen of iPSC. Deze methode kan worden gebruikt om kernvragen in het iPSC-veld te beantwoorden, zoals hoe de reprogrammeringskinetiek en reprogrammeringsefficiënties worden beïnvloed door de gebruikte somatische weefsels, de toegepaste reprogrammeringstechnologieën en de combinaties van matrix en media die hiermee worden gebruikt. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het gebruikmaakt van celoppervlaktemarkers om de overgangen van somatische cellen naar iPSC's te bestuderen, zodat u deze technologie kunt gebruiken om reprogrammeringsgebeurtenissen in real-time te monitoren.Was zeven dagen na transductie de fibroblasten met twee milliliter DPBS per putje en voeg 0,5 milliliter 37 °C 0,5% EDTA toe aan elk putje voor een incubatie van drie tot vijf minuten bij 37 °C. Wanneer de cellen zijn afgerond, wordt de reactie gestopt met twee milliliter 37 °C fibroblastmedium per putje en wordt het medium voorzichtig met een pipet over de bodem van elk putje verspreid om de cellen los te maken. Breng de fibroblasten uit elk putje

kinetic-measurement-real-time-visualization-somatic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Transcraniale magnetische stimulatie, elektromyografie en 3D-bewegingsregistratie zijn veelgebruikte niet-invasieve technieken voor het onderzoeken van neuromusculaire functies bij mensen. In dit artikel beschrijven we een protocol dat gegevens die door al deze drie tools worden gegenereerd, synchronelijk samplet, samen met de unieke toevoeging van virtuele realiteitsstimuluspresentatie en feedback.

Multifunctionele Setup voor het bestuderen van Human Motor Control Met behulp van Transcraniële Magnetische Stimulatie, Elektromyografie, Motion Capture en Virtual Reality

Een robuust protocol controleren neurale populaties time-lapse video-microscopie gevolgd door softwarematige nabewerking is beschreven. Deze methode geeft een krachtig hulpmiddel voor het identificeren van biologische gebeurtenissen in een geselecteerde populatie tijdens live imaging experimenten.

Live Imaging gevolgd door eencellige bijhouden van de biologie van de cel van de Monitor en de progressie van de bloedlijn van meerdere neurale populaties

We presenteren een roman gecombineerd gedrags en neuroimaging protocol gebruikmaking real-time video-projectie met het oog op het karakteriseren van de neurale correlaten gekoppeld spiegel therapie binnen de MRI-scanner omgeving in been Geamputeerde onderwerpen met phantom ledemaat pijn.

Real-Time Video projectie in een MRI voor karakterisering van neurale correlaten geassocieerd met spiegel therapie voor Phantom ledemaat pijn

Een procedure wordt gepresenteerd om te visualiseren van proteïne kinase een activiteiten in hoofd-vaste, gedragen muizen. Een verbeterde A-kinase activiteit Reporter, tAKARα, wordt uitgedrukt in corticale neuronen en toegankelijk gemaakt voorbeeld vorming door middel van een craniaal venster. Two-photon fluorescentie Lifetime Imaging microscopie wordt gebruikt om PKA-activiteiten in vivo te visualiseren tijdens gedwongen motoriek.

Visualisering van proteïne kinase een activiteit in hoofd-vaste muizen die in vivo twee-fotonen fluorescentie levensduur beeld microscopie gebruiken

We presenteren protocollen en analysemethoden om co-adaptieve interfaces te bouwen die signalen van het menselijk lichaam en hart in close-loop streamen, parametriseren, analyseren en wijzigen. Deze opstelling koppelt signalen afgeleid van het perifere en centrale zenuwstelsel van de persoon met externe sensorische ingangen om biofysische verandering te helpen volgen.

Real-time proxybesturing van opnieuw geparametriseerde randsignalen met behulp van een close-loop-interface

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol om arrays van 3D menselijke skeletspierenmicrotissues en minimaal invasieve downstream in situ assays van functie te produceren, inclusief contractiele kracht en calciumbehandelingsanalyses.

Beoordeling van functionele statistieken van de gezondheid van skeletspieren in microtissues van menselijke skeletspieren

Optische helderheid is een groot voordeel voor celbiologisch en fysiologisch werk bij zebravissen. Robuuste methoden voor het meten van celgroei bij individuele dieren worden beschreven die nieuwe inzichten mogelijk maken in hoe de groei van skeletspieren en naburige weefsels worden geïntegreerd met de groei van het hele lichaam.

Real-time en herhaalde meting van skeletspiergroei in individuele levende zebravissen die worden blootgesteld aan veranderde elektrische activiteit

Hier wordt een gevestigde methode beschreven om contractiliteits- en calciummetingen uit te voeren in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten met behulp van een op optica gebaseerd platform. Dit platform stelt onderzoekers in staat om het effect van mutaties en de reactie op verschillende stimuli op een snelle en reproduceerbare manier te bestuderen.

Real-time metingen van calcium- en contractiliteitsparameters in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten

Hier beschrijven we een procedure gebaseerd op het gebruik van lentivirale deeltjes voor de langetermijn genetische modificatie van neurale stamcellen en/of hun aangrenzende ependymale cellen in de volwassen ventriculair-subventriculaire neurogene niche, wat de aparte analyse mogelijk maakt van cel-autonome en niet-autonome, niche-afhankelijke effecten op neurale stamcellen.

Stabiele en efficiënte genetische modificatie van cellen in de Adult Mouse V-SVZ voor de Analyse van de neurale stamcel autonome en niet-autonome Effects

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol bij het detecteren van zowel verouderend en pluripotente stamcellen in de skeletspieren op letsel tijdens het inducerende in vivo herprogrammering. Deze methode is geschikt voor de evaluatie van de rol van cellulaire senescentie tijdens Weefselregeneratie en herprogrammering in vivo.

Evaluatie van schade-geïnduceerde senescentie en In Vivo herprogrammering in de skeletspieren

Leer hoe je somatische celherprogrammering naar iPSC's in realtime kunt volgen met flowcytometrie en beeldvorming. Deze methode meet kinetiek van pluripotente markers en helpt onderzoekers bij het begrijpen van herprogrammeringsefficiëntie.

Kinetic Meet- en Real Time Visualisatie van Somatic herprogrammeren

Meer video's verkennen