Kinetic Meet- en Real Time Visualisatie van Somatic herprogrammeren
30 juli 2016
Het protocol in dit onderzoek beschrijft werkwijzen voor de real-time monitoring herprogrammering progressie via de kinetische meting van positieve en negatieve pluripotente stamcel markers gebruikt flowcytometrie analyse. Het protocol bevat ook de imaging-gebaseerde beoordeling van de morfologie, en merker of reporter expressie tijdens iPSC generatie.
Het algemene doel van deze procedures is om de progressie van reprogrammering van somatische cellen naar geïnduceerde pluripotente stamcellen of iPSC te visualiseren en te volgen. Deze methode kan worden gebruikt om belangrijke vragen in het iPSC-veld te beantwoorden, zoals hoe de reprogrammeringskinetica en reprogrammeringsefficiënties worden gewijzigd door de gebruikte somatische weefsels, de toegepaste reprogrammeringstechnologieën en de gebruikte matrix- en mediacombinaties. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het celoppervlaktemarkers gebruikt om de overgangen van somatische cellen naar iPSC's te bekijken, zodat u deze technologie kunt gebruiken om de reprogrammeringsgebeurtenissen in realtime te monitoren.
Op dag zeven na de transductie, was de fibroblasten met twee milliliter DPBS per put en voeg 0,5 milliliter 37 graden Celsius 05% EDTA toe aan elke put voor een incubatie van drie tot vijf minuten bij 37 graden Celsius. Wanneer de cellen rond zijn geworden, stopt u de reactie met twee milliliter 37 graden Celsius fibroblastmedium per put en pipetteer het medium voorzichtig over de bodem van elke put om de cellen los te maken. Breng de fibroblasten van elke put over in individuele 15 milliliter conische buisjes en verzamel ze door centrifugatie.
Resuspendeer de pellets in twee milliliter vers 37 graden Celsius fibroblastmedium en tel de cellen uit elke kweekconditie. Zaai vervolgens een keer 10 tot de vijfde cellen in voorbereide feeder-onafhankelijke geconditioneerde putjes in een zes-puts weefselkweekplaat en incubeer de getransduceerde cellen in de celkweekincubator overnacht. De volgende dag vervangt u het medium in elke put door het geschikte medium voor de celtoepassing.
Plaats vervolgens de plaat in de imager en stel de software in om continue fasecontrast- en fluorescentiebeelden van het hele putje voor elke put om de zes tot acht uur gedurende de volgende 14 dagen te vangen. Aan het einde van het reprogrammeringsexperiment, wast u de putjes een keer met twee milliliter 37 graden Celsius DMEM/F12-medium. Gooi de wassing weg en label de cellen met één milliliter per put van de geschikte primaire antilichamen in vers DMEM/F12-medium gedurende 45 minuten bij 37 graden Celsius in de incubator.
Aan het einde van de incubatie, wast u de cellen twee keer met 37 graden Celsius DMEM/F12-medium. Gooi vervolgens de wassing weg en label de cellen met één milliliter van de geschikte secundaire antilichamen in 37 graden Celsius DMEM/F12-medium gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, wast u de cellen nog twee keer met DMEM/F12-medium.
Vervolgens vervangt u de wassing in elke put door twee milliliter vers 37 graden Celsius DMEM/F12-medium. Plaats de schaal in de imager en open de beeldvormingssoftware. Om scans in te stellen op de software van het beeldvormingssysteem, selecteert u eerst de positie van de te gebruiken tray en selecteert u het type schaal dat moet worden gescand.
Selecteer vervolgens Whole Well Imaging, het patroon voor het scannen van de gewenste putten en de juiste fluorescentiekanalen voor de real-time identificatie van de oppervlaktemarkers van belang. Label vervolgens het experiment dat moet worden gescand en stel de tijdstippen en intervallen in voor de monsters die elke dag moeten worden gescand. Om een set gescande experimenten te analyseren, selecteert u het gewenste experiment en selecteert u Nieuwe analysetaak starten.
Selecteer vervolgens de geschikte verwerkingsdefinitie voor het type analyse volgens de kanalen die voor de beeldvorming worden gebruikt, bijvoorbeeld PSC Phase Colony Count. Geef de analysetaak een naam. En selecteer het tijdsbereik voor de analyse en de putten die moeten worden geanalyseerd.
Start vervolgens de analysetaak. Om de gewenste reprogrammeringstijdstippen van individuele putten te meten, wast u de betreffende put eenmaal met twee milliliter DPBS. Vervolgens vervangt u de wassing door één milliliter voorverwarmde 37 graden Celsius 05% trypsin-EDTA-oplossing.
Na vijf minuten bij 37 graden Celsius, spoelt u het trypsine tegen de bodem van de put om de cellen te dissociëren in een enkele celsuspensie en brengt u de cellen over in een 15 milliliter conische buis. Gebruik drie milliliter DPBS om eventuele resterende cellen uit de put te wassen en trek ze in de 15 milliliter buis. Voeg een extra 10 milliliter DPBS toe aan de cellen en centrifugeer ze neer.
Resuspendeer de pellet in één milliliter DMEM/F12-medium voor het tellen. Verdun vervolgens de celsuspensie tot een keer tiende van de zes cellen per milliliter concentratie en verdeel één milliliter cellen per buis voor het juiste aantal monsters. Label vervolgens de cellen met de primaire antilichamen van belang in één milliliter DMEM/F12-medium gedurende 30 tot 45 minuten bij kamertemperatuur met mengen.
Aan het einde van de incubatie, wast u de cellen twee keer in 37 graden Celsius DMEM/F12-medium. Resuspendeer de pellets in één milliliter DPBS en breng de monsters over in individuele FACS-buisjes. Verkrijg de flowcytometrieprofielen van de geprogrammeerde platen.
Breng vervolgens de FCS-bestanden over naar een computer en importeer de bestanden in de geschikte analysesoftware. Open het eerste controlebestand in een forward by side scatter plot en stel de y-as in op een logaritmische schaal. Creëer vervolgens een polygonale poort rond de levende populatie.
Maak vervolgens een side scatter-gebied door scatter height plot met de levende cellen en stel een rechthoekige poort in om de dubbels uit te sluiten. Gebruik vervolgens deze poorten om de experimentele steekproefbestanden te analyseren onder de juiste fluorescentiekanalen om de populaties van belang in hun respectieve kwadranten te identificeren. Reprogrammering van BJ-fibroblasten met Sendai-reprogrammeringsvirussen genereert SSEA4+CD44-cellen met een andere snelheid dan reprogrammering van DF1-fibroblasten, wat aantoont dat een vroege vergelijking van het percentage pluripotente stamcel-achtige SSEA4+CD44-cellen kan worden gebruikt om de reprogrammeringsprogressie te volgen.
In een flowcytometrie tijdsverloop, vormen CD24-CD44+en EpCAM negatieve CD44+fibroblasten dubbel negatieve populaties die later overgaan in CD24+CD44-en EpCAM positieve CD44-pluripotente stamcel-achtige cellen respectievelijk, waarbij de reprogrammeringsprogressie verder wordt geschetst. Real-
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor real-time monitoring van de herprogrammering van somatische cellen naar geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) met behulp van flowcytometrie. Hierbij ligt de nadruk op de kinetische meting van pluripotente stamcelmarkers en assessments op basis van imaging tijdens de generatie van iPSCs.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk vakgebied
- Stamcelbiologie
- Celreprogrammering
- Flowcytometrie
Achtergrond
- Het begrijpen van de generatie van iPSC's is essentieel voor de regeneratieve geneeskunde.
- De kinetiek van herprogrammering kan variëren afhankelijk van de somatische weefsels en de gebruikte technologieën.
- Het monitoren van celoppervlaktemerkers helpt bij het volgen van overgangen tijdens de herprogrammering.
- Real-time analyse verbetert het inzicht in de efficiëntie van herprogrammering.
Doel van de studie
- Om de voortgang van somatische celreprogrammering te visualiseren en te volgen.
- Om te beoordelen hoe verschillende factoren de kinetiek van de reprogrammering beïnvloeden.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het real-time monitoren van de generatie van iPSC's.
Gebruikte methoden
- Flowcytometrie voor kinetische meting van pluripotente markers.
- Beeldgebaseerde beoordeling van celmorfologie en marker-expressie.
- Analyse van celoppervlaktemarkers om transities tijdens herprogrammering te monitoren.
- Gedetailleerde protocollen voor het hanteren en analyseren van fibroblasten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle real-time monitoring van de generatie van iPSC's is bereikt.
- Variaties in de herprogrammeringsefficiëntie werden waargenomen op basis van de somatische weefsels.
- Flowcytometrie volgde effectief de expressie van pluripotente markers.
- Beeldvorming leverde inzicht in morfologische veranderingen tijdens de herprogrammering.
Conclusies
- Het protocol biedt een robuuste methode voor het bestuderen van iPSC-reprogrammering.
- Real-time monitoring kan het onderzoek in de stamcelbiologie aanzienlijk verbeteren.
- Inzicht in de kinetiek van de reprogrammering is essentieel voor het verbeteren van iPSC-technologieën.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Real-time kinetische meting van somatische herprogrammering stelt biofarmaceutische R&D in staat om de efficiëntie van iPSC-generatie kwantitatief te beoordelen over diverse celbronnen en herprogrammeringstechnologieën heen. Deze benadering ondersteunt targetvalidatie en mechanische risicoreductie door voorspellend vertrouwen in de resultaten van de herprogrammering te bieden, wat beslissingen over de portfolio bij de ontwikkeling van celtherapie ondersteunt. De methode verbetert de translationele continuïteit door vroege ontdekkingsmetrieken te koppelen aan preklinische validatie via gestandaardiseerde, reproduceerbare readouts.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door SSEA4+CD44- en CD24+CD44- populaties te volgen als kwantitatieve indicatoren van pluripotent stamcel-achtige transities.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie via flowcytometrie-gebaseerde isolatie van onafhankelijke variabelen, zoals somatisch celtype en herprogrammeringstechnologie.
- Voorspellende waarde: Faciliteert de identificatie van lead-kandidaten door herprogrammeringskinetiek over verschillende matrices en mediacombinaties te vergelijken om systemen met een hoge efficiëntie te prioriteren.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows door semi-kwantitatieve metrieken op basis van confluentie vast te stellen in fasecontrast- of fluorescentiekanalen.
- Reproduceerbaarheid: Richt zich op de standaardisatie van de assay via real-time imaging van kolonievorming en flowcytometrie-tijdreeksen waarbij dubletten worden uitgesloten en levende populaties worden gegated.
- Schaalbaarheid van screening: Benadrukt het hergebruik van het platform door continue imaging van de gehele put elke zes tot acht uur gedurende 14 dagen mogelijk te maken voor longitudinale kinetische analyse.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Bespreekt de relevantie voor ziekten door vergelijking van de voortgang van herprogrammering over diverse genetische achtergronden en ziektefenotypes mogelijk te maken.
- Preklinische afstemming: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door de uiteindelijke expressie van pluripotente positieve en fibroblast negatieve markers bij voltooiing van de herprogrammering te meten.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Bespreekt beslissingen over verdere voortgang door correlaties tussen reportergen en confluentie te gebruiken om gedeeltelijke van volledige herprogrammering te onderscheiden, zoals gezien wanneer de GFP-confluentie minder dan de helft van de totale confluentie bedroeg op dag 19.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing via lead-identificatie tot preklinisch werk, door kwantitatieve, tijdsondergeloopte gegevens over de voortgang van de herprogrammering te leveren.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode hypothesetoetsing, pathway-verduidelijking en biologische risicoreductie ondersteunt door vroege vergelijking van SSEA4+CD44- percentages over celtypen zoals BJ- en DF1-fibroblasten mogelijk te maken.
- Screening: Beschrijft de assay-gereedheid, reproduceerbaarheid en kwantitatieve outputs via flowcytometrie-analyse van levende single-cell suspensies en op beeldvorming gebaseerde confluentiemetingen.
- Analytics: Benadrukt metingen, read-outs en statistische outputs, waaronder het percentage pluripotente marker-positieve cellen, confluentiekinetiek en doublet-uitsluiting via side scatter area versus scatter height plots.
- Translational Research: Verbindt de methode met preklinische continuïteit door morfologische veranderingen en markerexpressie te volgen van fibroblast- naar iPSC-toestand, wat de afstemming van biomarkers via SSEA4- en TRA-1-60-kleuring ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit in plaats van een eenmalige techniek, toepasbaar op verschillende startende somatische celweefsels, herprogrammeringstechnologieën en combinaties van mediummatrices.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid, validatie van targets, vermindering van mechanistische ambiguïteit in herprogrammeringstrajecten.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van kinetische metingen over laboratoria en cellijnen heen.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium bij de ontwikkeling van iPSC-gebaseerde therapieën.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en besluitvorming over verdere ontwikkeling op basis van kwantitatieve herprogrammeringsefficiëntie en kinetische profielen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in flowcytometrie, immunofluorescentie en live-cell imaging.
- Behoeften aan instrumentatie en analytische infrastructuur, waaronder incubatoren, imagers met whole-well scanning en FACS-compatibele flowcytometers.
- Eisen voor standaardisatie tussen teams voor antilichaampanels, gatingstrategieën en protocollen voor beeldanalyse.
- Overwegingen voor adaptatie over verschillende modelsystemen, zoals variërende fibroblastbronnen en herprogrammeringsvectoren.
- Praktische beperkingen, waaronder de noodzaak voor zorgvuldige titratie van trypsine-EDTA om celbeschadiging tijdens dissociatie te voorkomen en het semi-kwantitatieve karakter van metrics gebaseerd op confluentie.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:47
Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC) Generation (d6)
2:14
Fibroblast Reprogramming Live Cell Imaging (d19 - 21)
4:16
Flow Cytometric Reprogramming Kinetics Measurement
6:35
Results: Representative Reprogramming Progression Monitoring
8:10
Conclusion
