Karakteriseren Multiscale mechanische eigenschappen van hersenweefsel met behulp van Atomic Force Microscopy, Impact Inspringen en reometrie

Het algemene doel van deze mechanische karakteriseringstechnieken is het meten van de visco-elastische eigenschappen van biologisch weefsel op verschillende lengteschalen en belastingsnelheden. Deze methoden kunnen worden gebruikt om kernvragen in de biologische engineering te beantwoorden. Bijvoorbeeld: hoe vervormt het brein bij zeer hoge belastingsnelheden, of hoe beïnvloeden ziekten zoals multiple sclerose of autisme de mechanische eigenschappen van het hersenweefsel.

Het belangrijkste voordeel van deze technieken is dat u voor materialen met een zeer lage stijfheid en een zeer hoge hydratatie, zoals biologisch weefsel, kunt testen over een breed scala aan belastingsomstandigheden en over een breed scala aan materiaalvolumes, van het niveau van een enkele cel tot het niveau van een volledige hersenstructuur. De implicaties van deze technieken strekken zich uit tot het modelleren van de reactie van de hersenen tijdens letsel, wat essentieel is voor het ontwikkelen van beschermende strategieën. Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in de mechanische eigenschappen van de hersenen, kan ze ook worden toegepast op andere compliant biologische weefsels, zoals het hart en de lever.

Tijdens de mechanische karakterisering van compliant weefsel is het essentieel om een correct contact tussen de meetprobe en het weefsel tot stand te brengen. Laad voorzichtig een AFM-probe met een nominale veerconstante van 0,03 N/m en een borosilicaatkraal met een diameter van 20 µm in de probehouder. Plaats een hersensnede, gemonteerd in een petrischaal, op een op het AFM-podium gemonteerde verwarming die is voorverwarmd tot 37 °C.

Voeg vervolgens ongeveer twee milliliter voorverwarmd medium toe. Voeg daarna voorzichtig een druppel medium toe op de AFM-probe om te voorkomen dat deze breekt door oppervlaktespanning wanneer deze in het medium rondom de hersendoorsnede wordt gelaagd. Plaats vervolgens de AFM-kop opnieuw op de tafel en begin de kop te laten zakken tot deze is ondergedompeld in het medium.

Verplaats met de optische microscoop de tafel zodat het gebied van interesse zich onder de gekalibreerde AFM-probe bevindt, en laat de AFM-probe vervolgens zakken tot deze contact maakt met het weefseloppervlak. Om de experimenten naar kruipcompliantie uit te voeren, stelt u in de functie-editor van de software een functie voor de aangebrachte kracht op. Deze functie bestaat uit een ramp van 0,1 seconde naar een ingesteld punt van 5 nanonewton, die gedurende 20 seconden wordt vastgehouden, gevolgd door een ramp van één seconde terug naar nul nanonewton.

De software zal gegevens registreren over de indentatie van de AFM-probe in het weefsel tijdens de toegepaste krachtfunctie. Na het uitvoeren van het creep-compliance-experiment worden krachtrelaxatie-experimenten uitgevoerd door een toegepaste indentatiefunctie in de software aan te maken. Voer deze functie uit terwijl de software gegevens verzamelt over de kracht die op de AFM-probe wordt uitgeoefend tijdens de indentatie in het weefsel.

Om te beginnen met de impact-indentatietests, plaatst u een bolvormige probe op de pendule door deze met een pincet erop te schuiven. Bevestig vervolgens de monsterhouder van gesmolten kwarts op de plaat en schroef de plaat vast in de translationele trapone. Voer eerst de kalibratie van de vloeistofcel uit om dynamische impactexperimenten op gehydrateerde hersenweefsels mogelijk te maken.

Ga in de software naar het kalibratiemenu, selecteer Liquid Cell en volg de aanwijzingen van de software om contact te maken met het monster van gesmolten kwarts. Selecteer vervolgens Normal bij Indenter Type en gebruik de standaardwaarde van 0,05 millinewtons voor de Indenter Load. Klik daarna op doorgaan om de kalibratie voor de normale indenterconfiguratie uit te voeren.

Verplaats nu de monstertafel minstens vijf millimeter terug en monteer de hefboomarm. Herhaal de kalibratie van de vloeistofcel in de nieuwe configuratie door Liquid Cell te selecteren als indentertype. Klik op Continue om de kalibratiefactor van de vloeistofcel te verkrijgen.

Vergroot vervolgens de afstand tussen de condensatorplaten. Het vergroten van de afstand tussen de condensatorplaten vergroot de maximaal meetbare diepte, wat noodzakelijk is bij het testen van zeer compliant materiaal. Draai met een steeksleutel de drie moeren waarmee de afstand tussen de condensatorplaten wordt geregeld in kleine stappen met de klok mee.

Selecteer na elke volledige slag rechtsom Bridge Box Adjustment in het onderhoudsmenu en voer een correcte pendeltest uit. Ga door met het langzaam bijstellen van de moeren totdat de Approx. Depth Calibration een waarde van 70 000 nanometers per volt of hoger aangeeft.

Plaats vervolgens een nieuwe eindstop onderaan de pendel die via een voeding aan en uitgeschakeld kan worden. Verwijder de oorspronkelijke eindstop achter de pendel om een mogelijke belemmering van de beweging van de pendel weg te nemen, zodat hogere impactsnelheden en grotere penetratiedieptes in compliant monsters mogelijk zijn. Schakel de voeding voor de solenoïde in en stel deze in op 10 volt.

Ga vervolgens naar het menu Experiment en selecteer Impact and Adjust Impulse Displacement. Volg de instructies van de software om de zwaaibaan van de pendel te kalibreren. Wanneer de opstelling voor de impactindentatie volledig is voltooid, wordt het medium geaspireerd en de hersensnede gedroogd.

Gebruik vervolgens een dunne laag cyanoacrylaatlijm om het gesneden brein op de aluminium monsterhouder te bevestigen. Schuif daarna de vloeistofcel over de tweede O-ring op de monsterhouder en vul de vloeistofcel met vijf milliliter koolstofdioxide-onafhankelijk medium om het weefsel volledig onder te dompelen. Verplaats het bad in de negatieve X-richting totdat de punt van de hefboomarm correct boven het bad is gepositioneerd.

Beweeg vervolgens in de positieve Z-richting tot de tip volledig in het bad is ondergedompeld en zich voor het monster bevindt. Maak voorzichtig contact via het venster Sample Stage Control en beweeg de tafel vervolgens ongeveer 30 micrometer van het monsteroppervlak weg. Klik onder het menu Experiment op Impact en stel een impactexperiment in.

Kies een specifieke impulslast die direct gerelateerd is aan de resulterende impactsnelheid op basis van de kalibratie van de zwaaiboomafstand. Voer vervolgens het geplande experiment uit. Wanneer de pendel terugzwaait en het sample-oppervlak doorbeweegt naar het meetvlak, schakelt u de onderste eindschakelaar uit.

De verplaatsing van de probe als functie van de tijd zal door de software worden geregistreerd. Bevestig schuurpapier aan de meetprobe met een diameter van 25 millimeter. Bevestig vervolgens het thermische systeem en monteer de probe.

Bevestig ten slotte een ander stuk schuurpapier aan de bodemplaat, uitgelijnd met de bovenplaat. Kalibreer de rheometer volgens de instructies van de fabrikant. Zet eerst de kracht op de probe op nul.

Stel vervolgens contact vast tussen de probe en de bodemplaat. Meet daarna de traagheid van de probe. Voer tot slot een motorafstelling uit.

Laat vervolgens de meetplaat langzaam zakken. Wanneer de plaat zich binnen een millimeter van het weefsel bevindt, laat u deze in stappen van 0,1 millimeter zakken tot de plaat volledig in contact staat met het bovenoppervlak van het weefsel en de gemeten normaalkracht de gewenste waarde heeft bereikt. Pipetteer een klein volume medium op de randen van het monster om de hydratatie tijdens de procedure te behouden.

Laat de thermische kap zakken. Klik vervolgens op Bestand, Nieuw, en selecteer onder het tabblad Gel de optie Frequentiesweep. Klik daarna op window measurement one frequency sweep en dubbelklik op het oscillatievak.

Voer het frequentiebereik, de rek en het aantal punten in. Selecteer ten slotte OK en klik op Start om de frequentiescan te starten. Hier zijn representatieve responsen van indentatie en kracht versus tijd voor zowel kruikcompliancie- als krachtrelaxatie-experimenten.

Met behulp van deze gegevens en de geometrie van het systeem kunnen de kruipcompliance en de krachtrelaxatiemoduli voor verschillende hersengebieden worden berekend. Impactindentatie meet de mechanische eigenschappen van het weefsel bij hoge snelheden van ruimtelijk en temporeel geconcentreerde belasting. De resulterende impactrespons-parameters kunnen worden gekwantificeerd bij verschillende impactsnelheden, wat een methode biedt om de snelheidsafhankelijke eigenschappen van het weefsel te bestuderen.

Rheologie meet de frequentieafhankelijke visco-elastische eigenschappen van bulkweefsel in termen van de opslag- en verliesmoduli. De opslagmodulus is bij lage frequenties bijna een orde van grootte groter dan de verliesmodulus, wat aangeeft dat elastische eigenschappen het gedrag van hersenweefsel domineren. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het weefsel adequaat gehydrateerd te houden of ondergedompeld in een vloeistof die het weefsel helpt zijn juiste structuur te behouden.

De ontwikkeling van deze gedemonstreerde technieken heeft de weg vrijgemaakt voor materiaalkundigen om synthetische gels te ontwerpen en te optimaliseren die de mechanische respons van de hersenen kunnen nabootsen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe indentatie via een atoomkrachtmicroscoop, impact-indentatie en reologie worden gebruikt om de visco-elastische mechanische eigenschappen van weefsel te karakteriseren. Houd bij het interpreteren van de verzamelde gegevens rekening met de onderliggende aanname dat het gedeformeerde volume van het weefsel structureel homogeen en elastisch isotroop is.

Dit is niet noodzakelijkerwijs waar voor alle biologische weefsels. Naarmate uw vragen over de mechanica van biologische weefsels beter gedefinieerd worden, kunt u een of meer van deze mechanische experimenten kiezen om de vraag te beantwoorden op de relevante lengteschaal of tijdschaal.