Karakteriseren Multiscale mechanische eigenschappen van hersenweefsel met behulp van Atomic Force Microscopy, Impact Inspringen en reometrie
September 6th, 2016
We presenteren een reeks technieken om de visco-elastische mechanische eigenschappen van de hersenen te karakteriseren op micro-, meso- en macro-schalen.
Het algemene doel van deze mechanische karakteriseringstechnieken is om de visco-elastische eigenschappen van biologisch weefsel te meten op verschillende lengte-schalen en laadsnelheden. Deze methoden kunnen worden gebruikt om belangrijke vragen in de biologische techniek te beantwoorden. Bijvoorbeeld, hoe vervormt de hersenen onder zeer hoge laadsnelheden, of hoe beïnvloeden ziekten zoals multiple sclerose of autisme de mechanische eigenschappen van hersenweefsel.
Het belangrijkste voordeel van deze technieken is voor materialen met een zeer lage stijfheid en zeer hoge hydratatie, zoals biologisch weefsel, kunt u testen over een breed scala aan laadcondities, en u kunt ook testen over een breed scala aan materiaalvolumes, tot op het niveau van een enkele cel, en tot op het niveau van een hele hersenen. De implicaties van deze technieken strekken zich uit tot het modelleren van de respons van de hersenen tijdens verwondingen, wat belangrijk is voor het ontwikkelen van beschermende strategieën. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de mechanische eigenschappen van de hersenen, kan deze ook worden toegepast op andere compliante biologische weefsels, zoals hart en lever.
Tijdens de mechanische karakterisering van compliante weefsels is het vaststellen van een juiste contact tussen de meetpomp en het weefsel cruciaal. Laad zorgvuldig een AFM-pomp met een nominale veerconstante van 0,03 newton per meter en een borosilicaatkraal met een diameter van 20 micrometer in de pomphouder. Plaats een in een petrischaal gemonteerde hersensnede op een op een AFM-trap gemonteerde verwarming die is voorverwarmd tot 37 graden Celsius.
Voeg vervolgens ongeveer twee milliliter voorverwarmd medium toe. Voeg vervolgens voorzichtig een druppel medium toe aan de AFM-pomp om het te beschermen tegen breken door oppervlaktespanning wanneer het in het medium rond de hersensnede wordt neergelaten. Vervolgens positioneert u de AFM-kop opnieuw op de trap en begint u de kop te laten zakken totdat deze ondergedompeld is in het medium.
Gebruik de optische microscoop om de trap zo te verplaatsen dat het gebied van belang zich onder de gekalibreerde AFM-pomp bevindt, laat vervolgens de AFM-pomp zakken om contact te maken met het oppervlak van het weefsel. Om de kruipcompliance-experimenten uit te voeren, bouwt u een toegepaste krachtfunctie in de functie-editor van de software. De functie bestaat uit een 0,1 seconde ramp tot een ingestelde waarde van 5 nanonewton die 20 seconden wordt vastgehouden, gevolgd door een ramp van één seconde tot nul nanonewton.
De software registreert gegevens over de indrukking van de AFM-pomp in het weefsel tijdens de toegepaste krachtfunctie. Na het uitvoeren van het kruipcompliance-experiment, voert u krachtrelaxatie-experimenten uit door een toegepaste indrukkingsfunctie in de software te maken. Voer deze functie uit terwijl de software gegevens verzamelt over de kracht die de AFM-pomp ervaart terwijl deze in het weefsel wordt ingedrukt.
Om impactindrukkingstests te beginnen, past u een sferische pomp aan door deze met behulp van pincetten op het slinger te schuiven. Bevestig vervolgens de gefuseerde kwartsmonsterpost op de plaat en schroef de plaat in de translationele trap. Om dynamische impactexperimenten op gehydrateerde hersenweefsels mogelijk te maken, voert u eerst de liquid cell-kalibratie uit.
Ga naar het kalibratiemenu in de software, selecteer Liquid Cell en volg de softwareaanwijzingen om contact te maken met het gefuseerde kwartsmonster. Selecteer vervolgens Normaal voor de Indenter Type en gebruik de standaardwaarde van 0,05 millinewton voor de Indenter Load. Klik vervolgens op Doorgaan om de kalibratie voor de normale indenterconfiguratie uit te voeren.
Verplaats nu de monsterstap minimaal vijf millimeter terug en monteer de hefboom. Herhaal de liquid cell-kalibratie in de nieuwe configuratie door Liquid Cell te selecteren voor het indentertype. Klik op Doorgaan om de liquid cell-kalibratiefactor te verkrijgen.
Verhoog vervolgens de condensorplaatafstand. Het verhogen van de condensorplaatafstand zal de maximale meetbare diepte verhogen, wat noodzakelijk is bij het testen van zeer compliante materialen. Draai met een sleutel de drie moeren die de condensorplaatafstand regelen met kleine stapjes met de klok mee.
Na elke volledige draai met de klok mee, selecteert u Bridge Box Adjustment onder het onderhoudsmenu en verkrijgt u een goede slingertest. Ga door met het langzaam aanpassen van de moeren totdat de Approx. Depth Calibration een waarde van 70.000 nanometer per volt of hoger leest.
Positioneer vervolgens een nieuwe eindstop aan de onderkant van de slinger die kan worden in- en uitgeschakeld via een voeding. Trek de originele eindstop die achter de slinger zit, om een mogelijke obstructie van de slingerbeweging te verwijderen en hogere slagsnelheden en hogere penetratiedieptes in compliante monsters mogelijk te maken. Schakel de voeding voor de solenoïde in en stel deze in op 10 volt.
Ga vervolgens naar het Experimentmenu en selecteer Impact en Impulse Displacement aanpassen. Volg de software-instructies om de zwaaiafstand van de slinger te kalibreren. Wanneer de impactindrukkingsopstelling volledig is voltooid, aspireer het medium en droog de hersensnede.
Gebruik vervolgens een dunne laag cyanoacrylaatkleefstof om de gesneden hersenen aan de aluminium monsterpost te bevestigen. Schuif vervolgens de liquid cell over de tweede O-ring op de monsterpost en vul de liquid cell met vijf milliliter koolstofdioxide-onafhankelijk medium om het weefsel volledig onder te dompelen. Beweeg het bad in de negatieve X-richting totdat de punt op de hefboom goed boven het bad is geplaatst.
Beweeg vervolgens in de positieve Z-richting totdat de punt volledig ondergedompeld is in het bad en zich voor het monster bevindt. Gebruik het Sample Stage Control-venster om voorzichtig contact te maken en trek vervolgens de trap ongeveer 30 micrometer van het monsteroppervlak weg. Klik onder het Experimentmenu op Impact en stel een impactexperiment in.
Kies een specifieke stootlading die direct verband houdt met de resulterende slagsnelheid op basis van de zwaaiafstandkalibratie. En voer vervolgens het geplande experiment uit. Wanneer de slinger terugzwaait en het monsteroppervlak zich blijft verplaatsen naar het meetvlak, schakel de ond
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert technieken om de visco-elastische mechanische eigenschappen van hersenweefsel op verschillende schalen te karakteriseren. Deze methoden zijn cruciaal voor het begrijpen hoe de hersenen reageren op verschillende belastingsomstandigheden en hoe ziekten de mechanische eigenschappen ervan beïnvloeden.
Belangrijke Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biologische Techniek
- Mechanische Karakterisering
Achtergrond
- Visco-elastische eigenschappen zijn essentieel voor het begrijpen van de hersenmechanica.
- Technieken kunnen hersenvervorming onder hoge belastingssnelheden beoordelen.
- Ziekten zoals multiple sclerose en autisme kunnen de mechanische eigenschappen van hersenweefsel veranderen.
- Inzichten kunnen beschermende strategieën tegen hersenletsel informeren.
Doel van het Onderzoek
- Om visco-elastische eigenschappen van biologische weefsels te meten.
- Om de effecten van verschillende belastingscondities op de hersenmechanica te verkennen.
- Om bevindingen uit te breiden naar andere biologische weefsels, zoals hart en lever.
Gebruikte Methoden
- Karakteriseringstechnieken voor biologische weefsels.
- Testen over een breed scala aan belastingscondities.
- Beoordeling van materiaaleigenschappen van enkele cellen tot hele hersenen.
- Modellering van hersenreactie tijdens letselscenaris.
Belangrijkste Resultaten
- Technieken meten effectief de visco-elasticiteit van hersenweefsel.
- Bevindingen onthullen hoe ziekten de mechanische eigenschappen beïnvloeden.
- Inzichten dragen bij aan het begrijpen van hersenletselreacties.
- Methoden toepasbaar op andere compliante biologische weefsels.
Conclusies
- Karakteriseringstechnieken zijn vitaal voor biologische techniek.
- Begrip van mechanische eigenschappen helpt bij letselpreventie.
- Onderzoeksimplicaties strekken zich uit tot buiten de neurowetenschappen naar andere velden.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Characterizing the viscoelastic properties of brain tissue across multiple scales enables biopharma R&D to de-risk target validation by linking mechanical phenotypes to disease mechanisms. This multiscale approach supports predictive confidence in preclinical models by providing quantitative, reproducible readouts that inform assay development and translational biomarker strategies. The techniques address a critical gap in mechanobiology research, offering enterprise-relevant tools for screening and lead identification in neurotherapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying how genetic or pharmacological perturbations alter brain tissue stiffness and viscoelastic response.
- Operational Value: Provides standardized, length-scale-specific mechanical readouts that support pathway clarification and biological de-risking of CNS targets.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that normalize pathological mechanical phenotypes in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, high-resolution mechanical data (creep compliance, force relaxation, impact response) suitable for assay standardization across microscale to macroscale models.
- Operational Value: Enables reproducible measurement of tissue mechanical properties under controlled hydration and loading conditions, supporting assay robustness and scalability.
- Screening Readiness: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline mechanical phenotypes.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links mechanical alterations in brain tissue to disease states such as multiple sclerosis and autism, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by providing cross-scale mechanical phenotyping.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying how interventions affect tissue-level mechanical properties predictive of functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical testing by providing mechanical phenotyping at relevant biological scales.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring how molecular changes affect tissue viscoelasticity at cellular and tissue levels.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative mechanical outputs (storage/loss moduli, creep compliance) that enable reliable compound evaluation across loading rates.
- Analytics: Generates frequency-dependent and time-dependent viscoelastic metrics that allow teams to compare mechanical phenotypes across conditions and genetic backgrounds.
- Translational Research: Connects mechanical changes in brain tissue to disease models, supporting preclinical continuity and biomarker development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable mechanical characterization platform applicable to multiple compliant tissues (brain, heart, liver) across projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in CNS target validation through direct phenotyping of tissue-level mechanical properties.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility across laboratories via calibrated AFM, impact indentation, and rheometry protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of neurotherapeutic candidates based on mechanical phenotype rescue.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that restore normal viscoelastic behavior in disease-relevant brain tissue models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomechanics, AFM operation, and rheological analysis to ensure accurate data acquisition and interpretation.
- Dependent on specialized instrumentation including AFM with compliant probes, pendulum-based impact indenters, and temperature-controlled rheometers.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation, hydration maintenance, and calibration procedures to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying techniques across different tissue types or disease models with varying structural integrity.
- Limited by the assumption of structural homogeneity and elastic isotropy, which may not hold in heterogeneous or pathologically altered tissues.
