Detectie van RNA-bindende eiwitten door In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Cultuur
22 juli 2016
Een RNA-pull-down protocol is hier geoptimaliseerd voor detectie van interacties tussen RNA-bindende eiwitten (RBPs) en niet-coderende en coderende RNAs. Een RNA fragment uit androgeenreceptor (AR) werd gebruikt als een voorbeeld om te demonstreren hoe de RBP halen uit lystate primaire bruine adipocyten.
Het algemene doel van dit experiment is het ophalen van RNA-bindende eiwitten van een RNA-transcript uit bruin vetweefsel. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in dit veld, zoals, wat zijn de regulerende mechanismen van RNA dat langdurig codeert, en geassocieerde RNA-eiwitten. Het grote voordeel van deze tactiek is dat het eenvoudig uit te voeren is.
Het RNA dat wordt gebruikt om deze procedure te demonstreren, is een fragment van de Antigen Receptor 3-Prime Untranslated Region, hierna te noemen de AR 3-Prime UTR. Begin met het amplificeren van de T7 AR oligo en de gedeeltelijke sequentie van het vuurvliegje luciferase DNA vanuit de psiCHECK-2 plasmide. De gebruikte primers en parameters staan gedetailleerd in het bijbehorende document.
Na amplificatie, gebruik de PCR-producten als sjablonen om biotinyleren RNA's te synthetiseren met behulp van een in vitro transcriptiekit, volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar vervolgens het mengsel gedurende vier uur bij 37 graden Celsius. Na in vitro transcriptie, voeg één microliter Dnase toe aan de reactie en bewaar het gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius om het sjabloon-DNA af te breken.
Breng vervolgens het totale volume op 60 microliter met water. Breng de biotinyleren RNA's aan op zuiveringskolommen om het zout en niet-geïncorporeerde nucleotiden te verwijderen. Na het meten van de RNA-concentratie, bewaar de RNase bij min 80 graden Celsius voor latere pull-down-assays.
Op de dag van de test, ontdooi het bevroren biotinyleren RNA op ijs. Zorg er vervolgens voor dat het RNA van belang de juiste secundaire structuur heeft door 50 microliter ervan gedurende twee minuten op 90 graden Celsius te verwarmen. Koel gedurende twee minuten op ijs.
Voeg vervolgens 50 microliter 2X RNA structuur buffer toe en laat het RNA gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur vouwen. Hervat vervolgens streptavidin-gecoate magnetische kralen in hun oorspronkelijke fles door ze kort te vortexen. Breng vervolgens 150 microliter van de hervatte kralen over naar een 1,5 milliliter buis.
Plaats de buis in een magnetische standaard gedurende één minuut om de magnetische kralen en het supernatant te scheiden. Gebruik een pipet om het supernatant te verwijderen en weg te gooien. Bewaar de kraalpellet.
Was de kralen eenmaal door de kraalpellet op te schroeien in één milliliter van de aanbevolen 1X bindings- en wasbuffer van de fabrikant en plaats vervolgens de buis gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op een roterende stand. Was met buffer A en buffer B twee keer. Na de incubatie, gooi het supernatant weg en bewaar de kraalpellet.
Hervat vervolgens de kraalpellet in 300 microliter 2X was- en bindingsbuffer. Verdeel de kralen gelijkmatig in drie 1,5 milliliter buizen met 100 microliter kralen per buis. Voeg 100 microliter RNase-vrij water, 100 microliter biotinyleren vuurvliegje luciferase RNA en 100 microliter biotinyleren AR 3-Prime UTR RNA toe.
Bewaar elke kraalmengsel gedurende één uur bij kamertemperatuur met rotatie. Plaats vervolgens de buizen gedurende één minuut op de magneet. Verwijder en gooi het supernatant weg.
Bewaar de kraalpellets. Was vervolgens de kralen twee keer, elke keer de kraalpellets opnieuw opgeschroeid in 400 microliter 1X was- en bindingsbuffer en plaats ze vervolgens gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op de roterende stand. Plaats de buizen gedurende één minuut op een magneet.
Verwijder en gooi vervolgens al het supernatant weg. Hervat elke kraalpellet in 50 microliter nucleair isolatiebuffer. Zorg er in voorbereiding op het volgende deel van het protocol voor dat alle buffers, evenals de dounce glazen homogenisatoren op ijs worden gekoeld.
De cellysaat bereiding moet op ijs worden uitgevoerd. Voor elke RNA pull-down test die wordt uitgevoerd, bereid een 15-centimeter schaal voor met gedifferentieerde preadipocyten van drie weken oude C57 Black Six wild type muizen. Voeg vier tot vijf dagen later, om de cellen te oogsten, 10 tot 15 milliliter PBF toe en gebruik vervolgens een celschraper om de cellen van de schaal te verwijderen.
Breng ze over in een 50 milliliter buis en pellet ze vervolgens door centrifugatie bij 200 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Na het centrifugeren, gebruik een 1 milliliter pipet om het supernatant af te zuigen en weg te gooien. Hervat vervolgens het celpellet in twee milliliter hypotone buffer en bewaar de cellen op ijs gedurende vijftien minuten.
Breng de cellen over in een 15 milliliter dounce glazen homogenisator en snijd de cellen mechanisch op ijs met 20 slagen. Pellet de celkernen door centrifugatie bij 3300 keer G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Na het centrifugeren, breng het supernatant over naar 1,5 milliliter buizen en bewaar het pellet op ijs voor later gebruik.
Voeg aan het supernatant 3-molar kaliumchloride toe om een eindconcentratie van 150 millimolair te verkrijgen. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 20.000 keer G bij vier graden Celsius. Na het centrifugeren, zal er een lipidelaag op de top zijn.
Gebruik een 1 milliliter pipet om dit voorzichtig te verwijderen. Verzamel vervolgens het cytoplasmatische cellulair lysaal supernatant. Hervat vervolgens het nucleaire pellet in één milliliter nucleaire isolatiebuffer en breng het over naar een 15 milliliter dounce glazen homogenisator.
Snijd de kernen mechanisch op ijs met 100 slagen. Pellet de nucleaire puin door centrifugatie bij 20.000 keer G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Verzamel het supernatant als het nucleaire cellulaire lysaal.
Deze kunnen worden gecombineerd met het cytoplasmatische lysaal dat eerder werd verzameld of apart worden bewaard voor latere toepassingen. Hier worden de monsters gecombineerd in een verhouding van een-op-een. Voeg RNase-remmer toe aan het niet-gefractioneerde cellysaat om een eindconcentratie van 0,5 eenheden per microliter te verkrijgen.
Stel vervolgens 100 microliter van het cellysaat opzij op ijs als een invoercontrole voor westerse
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een geoptimaliseerd RNA pull-down protocol voor het detecteren van interacties tussen RNA-bindende eiwitten (RBPs) en zowel non-coderende als coderende RNA's. De methode wordt geïllustreerd met behulp van een fragment van de androgeenreceptor (AR) om zijn RBP terug te vinden uit het lysate van primaire bruine adipocyten.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Moleculairbiologie
Achtergrond
- RNA-bindende eiwitten spelen een cruciale rol bij het reguleren van RNA-functies.
- Het begrijpen van RBP-interacties kan regulatorische mechanismen in verschillende biologische processen verhelderen.
- Deze studie richt zich op bruin vetweefsel, dat belangrijk is voor metabole regulatie.
- De AR 3-Prime UTR dient als model voor het bestuderen van RBP-interacties.
Doel van het onderzoek
- Om RNA-bindende eiwitten terug te vinden die geassocieerd zijn met specifieke RNA-transcripten.
- Om regulatorische mechanismen van langlevende coderende RNA en geassocieerde RNA-eiwitten te onderzoeken.
- Om een eenvoudige methode te bieden voor het bestuderen van RBP-interacties.
Gebruikte methoden
- Amplificatie van T7 AR oligo en gedeeltelijk sequentie van vuurvliegjesluciferase DNA.
- Gebruik van psiCHECK-2 plasmide voor RNA-fragmentdemonstratie.
- Gegevens over gedetailleerde parameters en primers zijn te vinden in het bijgevoegde document.
- Toepassing van RNA pull-down technieken om RBPs te isoleren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle terugvinding van RBPs uit bruine adipocyten lysaten.
- Demonstratie van de effectiviteit van de methode met behulp van de AR 3-Prime UTR.
- Inzichten in de interacties tussen RBPs en RNA-transcripten.
- Mogelijke implicaties voor het begrijpen van metabole regulatie.
Conclusies
- Het geoptimaliseerde RNA pull-down protocol is effectief voor het bestuderen van RBP-interacties.
- Deze methode kan verder onderzoek naar RNA regulatorische mechanismen faciliteren.
- De bevindingen kunnen bijdragen aan het begrip van metabole processen in bruin vetweefsel.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
RNA-binding protein (RBP) interactions represent a critical regulatory layer in adipocyte biology, impacting gene expression and metabolic function. The optimized in vitro RNA pull-down protocol enables precise identification of RBP partners in lipid-rich adipocyte systems, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. This capability enhances predictive confidence for portfolio decisions involving RNA-centric targets and pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of RBP–RNA interactions to clarify regulatory mechanisms in adipocyte models.
- Supports functional target validation by confirming specific protein–RNA binding events.
- Facilitates mechanistic de-risking for RNA and RBP targets in metabolic research.
Screening & Assay Development
- Prepares validated adipocyte lysates for downstream screening of RBP modulators.
- Standardizes pull-down and detection workflows for reproducible quantitative outputs.
- Enables reliable assessment of compound effects on RBP–RNA interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant adipocyte systems for translational biomarker exploration.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of RBP targets.
- Supports risk-adjusted advancement of RNA-targeted programs in metabolic disease portfolios.
Pipeline & Workflow Integration
This RNA pull-down protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical target validation in adipocyte models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of RBP–RNA regulatory mechanisms in adipose tissue.
- Screening: Provides assay-ready lysates and standardized workflows for compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative western blot outputs for comparative analysis of binding specificity.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to disease-relevant adipocyte biology.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable protocol adaptable to diverse RNA and RBP targets in metabolic research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in RBP target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for RNA–protein interaction studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying target engagement early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of RNA and RBP targets in metabolic disease pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling, adipocyte culture, and western blot analysis.
- Needs access to magnetic bead-based pull-down systems and quantitative detection infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility across experiments.
- Adaptable to both coding and noncoding RNA targets in various adipocyte models.
- High lipid content in adipocytes necessitates optimized lysate preparation and purification steps.
