Name: Detectie van RNA-bindende eiwitten door In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Cultuur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Leer een geoptimaliseerd RNA pull-down protocol om RNA-bindende eiwitten te detecteren in bruin vetweefsel. Deze methode gebruikt AR 3-Prime UTR fragmenten en is eenvoudig uit te voeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door Singapore NRF Fellowship (NRF-2011NRF-NRFF001-025) als CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).

Opmerking: Het RNA van belang in het kader van dit onderzoek is een fragment van AR 3&#39;UTR. 1. Bereiding van biotine-gelabelde RNA <ol><li> Aan het RNA te verkrijgen, amplificeren T7-AR-oligo met PCR, gevolgd door in vitro transcriptie met behulp van een commerciële kit en volgens instructies van de fabrikant 11. OPMERKING: Primers voor PCR zijn opgesomd in Tabel 4: T7-AR-F en T7-AR-R. </li><li> Voor niet-specifieke binding control, amplificeren van een gedeeltelijke sequentie van de vuurvlieg luciferase (FL) DNA met PCR uit psiCHECK-2 plasmide, gevolgd door in vitro transcriptie. OPMERKING: Primers voor PCR zijn opgesomd in Tabel 4: hluc (+) - T7-probe-F en hluc (+) - R-probe Tabel 4 Sequenties van matrijs en primers voor PCR-amplificatie... </li><li> Voor een 50 ul PCR reactie, meng 50 ng DNA (oligo of plasmide), 4 pl dNTPs (2,5 mM van elk dNTP), 5 ui 10x reactiebuffer, 1 ui 2,5 U / &amp; #181; l DNA polymerase, 2 pi 10 pM forward primer, 2 pl 10 uM reverse primer, en nuclease-vrij water. <ol><li> Run PCR-amplificatie in een thermocycler met de volgende programma. Stap 1: één cyclus van 95 ° C gedurende 2 min; Stap 2: 35 cycli van 95 ° C gedurende 30 sec, 55 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 30 sec (AR) of 60 seconden (FL); Stap 3: één cyclus van 72 ° C gedurende 10 minuten. </li></ol></li><li> Synthetiseren gebiotinyleerd RNA een in vitro transcriptie kit volgens de instructies van de fabrikant 11. In dit experiment gebruikt PCR-producten als matrijzen voor RNA synthese. Voor een 20 pl in vitro transcriptiereactie, meng 200 ng PCR geamplificeerd DNA, 2 pi van elk NTP, 1 gl 10 mM biotine-CTP, 2 ui 10x reactiebuffer en 2 pi T7 RNA polymerase. Incubeer het mengsel bij 37 ° C gedurende 4 uur. </li><li> Na in vitro transcriptie, behandel reactiemengsel met 1 pi 2 U / ul DNase op 37 &amp; #176; C gedurende 15 minuten om matrijs-DNA af te breken. Tenslotte verdunnen de gebiotinyleerde RNA tot een totaal volume van 60 pi voor daaropvolgende zuivering. </li><li> Zuiver gebiotinyleerd RNA&#39;s zouten en opgenomen nucleotiden verwijderen met zuiveringskolommen volgens de instructies van de fabrikant 12. Meet RNA-concentratie en bewaar bij -80 ° C voor daaropvolgende pull-down tests. </li><li> Voor een goede secundaire structuur van RNA plaats in RNA-eiwit interactie, warmte 50 pl gebiotinyleerd RNA (50 pM) waarborgen bij 90 ° C gedurende 2 min, chill op ijs gedurende 2 minuten, daarna voorzien van 50 ul 2x RNA structuur buffer (Tabel 3), en laat de RNA vouwen bij kamertemperatuur gedurende 30 min 13,14. </li></ol> 2. Bereiding van RNA-geconjugeerde kralen OPMERKING: Gebruik een magnetische standaard voor het scheiden van de magnetische kralen en supernatant. <ol><li> Resuspendeer de met streptavidine beklede magnetische korrels in de originele flacon door kortstondig VorteXing volgende instructies van de fabrikant. Transfer 150 ul geresuspendeerd kralen een 1,5 ml buis. Plaats de buis op de magneet voor 1 min. Teruggooi supernatant. Houd kraal pellet. LET OP: In RNA pull-down assays, wanneer aliquoting geresuspendeerd kralen uit originele flacon, gebruik 50 ul kralen voor een test, gevolgd door western blotting, en 200 ul kralen voor een test, gevolgd door MS. </li><li> Was parels eenmaal door opnieuw suspenderen bead pellet met 1 ml van de fabrikant aanbevolen 1x W &amp; B (binding en wassen) buffer (tabel 3), gevolgd door het roteren van de buis gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in een rotator. Teruggooi supernatant. Houd kraal pellet. </li><li> RNase inactivering op kralen, kralen wassen tweemaal telkens met resuspenderen kraal pellet met 400 ui buffer A. Buffer A een alkalische oplossing die 0,1 M NaOH en 0,05 M NaCl (tabel 3). Draai de buis gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur in een rotator. Teruggooi supernatant. Houd kraal pellet. </li> &lt;li&gt; NaOH verwijderen van kralen, parels wassen tweemaal telkens met resuspenderen kraal pellet met 400 ul buffer B (tabel 3), gevolgd door het roteren van de buis gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur in een rotator. Teruggooi supernatant. Houd kraal pellet. </li><li> Resuspendeer kraal pellet met 300 pi 2x W &amp; B buffer, split kralen even en de overdracht in drie 1,5 ml buizen (100 pi korrels per buisje). Leveren de kraal-bevattende buizen met 100 ul RNase vrij water, 100 ul gebiotinyleerd FL RNA en 100 ul gebiotinyleerde AR 3&#39;UTR RNA, respectievelijk. </li><li> Incubeer elke kraal mengsel gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met rotatie. Plaats buisjes op magneet gedurende 1 min. Gooi alle supernatant. Houd kraal pellets. </li><li> Wassen kralen tweemaal telkens met resuspenderen elke kraal pellet met 400 pl 1x W &amp; B buffer, gevolgd door het roteren buizen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in een rotator. </li><li> Plaats buisjes op magneet gedurende 1 min. Gooi alle supernatant. Resuspendeer elke kraal pellet met 50 gl nucleaire isolatie buffer (tabel 3). </li></ol> 3. preadipocyt Isolatie en Adipogenese Inductie <ol><li> Zoals beschreven in eerdere publicaties 5, ontleden preadipocyten uit de interscapular bruin vet pad (C57BL6 wild type muizen, 3 weken oud). </li><li> Groeien en in vitro differentiëren preadipocyten 5. De cellen zijn klaar voor downstream toepassing 4-5 dagen na aanvang van differentiatie. </li></ol> 4. Voorbereiding van Cellular Lysate van Primary adipocyten LET OP: Zorg ervoor dat alle procedures van cellysaat bereiding worden gemaakt op het ijs, en alle buffers worden gekoeld op ijs. Pre-chill dounce glas homogenisatoren op ijs. <ol><li> Groeien en te differentiëren preadipocyten in 15 cm schalen 5 (zie paragraaf 3.2). Elk gerecht biedt voldoende cellen voor een RNA-pull-down test. Op dag 4 of 5 dagen van differentiatie, teruggooi celkweekmedium, en was ceLLS een keer met 1x PBS. </li><li> Cellen oogsten, voeg 10-15 ml 1x PBS om cellen te schrapen cellen in een 50 ml buis en pellet cellen te verzamelen door centrifugatie bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi supernatant met 1 ml pipet. </li><li> Hersuspenderen celpellet in 2 ml hypotone buffer (tabel 3) en incubeer cellen op ijs gedurende 15 min. Overdracht cellen om een ​​15 ml Dounce homogenisator glas en afschuiving cellen mechanisch op ijs met 20 slagen. </li><li> Pellet celkernen door centrifugatie bij 3300 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Houd kernen pellet op ijs voor verder gebruik (zie rubriek 4.6). Transfer supernatant 1,5 ml buizen, voeg 3M KCl aan supernatant tot een eindconcentratie van 150 mM en rotatie verkrijgen bij 20.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Na het centrifugeren, verwijder voorzichtig lipidlayeron de top met behulp van 1 ml pipet, en het verzamelen van bovenstaande vloeistof als de cytoplasmatische cellulaire lysaat. </li><li> Resuspendeer kernen pellet (zie paragraaf 4.4) in 1 ml nucleaire isolatie buffer. Transfer kernen een 15 ml dounce glashomogenisator gebruik 1 ml pipet, en afschuiving kernen mechanisch op ijs met 100 slagen. Pellet nucleaire afval door centrifugatie bij 20.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C en verzamel de supernatant nucleaire cellulaire lysaat. </li><li> Ofwel combineren de nucleaire en cytoplasmatische cellysaten, of gebruik maken van elke fractie afzonderlijk, voor downstream pull-down toepassing. In deze demonstratie experiment werden deze twee fracties van cellysaat gecombineerd in een volumeverhouding van 1: 1. </li><li> Voeg RNase inhibitor deze gefractioneerde cellysaat tot een eindconcentratie van 0,5 U / pl te verkrijgen. Zet opzij 100 pl cellysaat als input control voor western blotting 15. </li></ol> 5. Binding en Elutie van RBP <ol><li> Cellysaat splitsen in drie gelijke porties (1 ml cellysaat in een 1,5 ml buis) en incubeer met blanco, FL RNA-geconjugeerde en AR 3&#39;UTR RNA-geconjugeerde kralen (zie paragraaf 2.8), respectievelijk, gedurende 3 uur bij 4 ° Cmet rotatie. </li><li> Plaats buisjes op magneet gedurende 1 min. Verzamel supernatant met een pipet 1 ml, gevolgd door RNA isolatie van RNA supernatant volledigheid bevestigen. Isoleer RNA met behulp van een zuur guanidinium thiocyanaat-fenol-oplossing volgens de instructies van de fabrikant (Tabel 2). Beoordeel de RNA intact door het analyseren van 28S en 18S subeenheden van ribosomaal RNA. Houd kraal pellets op het ijs. </li><li> Was de magnetische korrels zes keer, telkens met resuspenderen elke kraal pellet met 1 ml nucleaire isolatie buffer bevattende 40 U RNase-remmer en 0,25% IGEPAL, gevolgd door roterende buizen gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur in een rotator. Gebruik een magnetische standaard voor het scheiden van de magnetische kralen en supernatant. Gooi alle supernatant. Houd kraal pellets op het ijs. </li><li> Gebruik de volgende stappen om RNA-eiwitcomplexen elueren uit kralen voor western blotting. Eerst, resuspendeer elke korrel pellet in 75 ul nucleaire isolatiebuffer; dan, voeg 25 ul 4x western blot laden buffer (met SDS) tot een totaal volume van 100 ul te verkrijgen. Tenslotte kook kralen in deze 100 ul oplossing bij 95 ° C gedurende 5 minuten. LET OP: Gebruik volgende stappen om RNA-eiwitcomplexen elueren uit kralen voor MS. Stap 1: resuspendeer elke korrel pellet in 100 ui elutiebuffer (tabel 3); Stap 2: incubeer bead monsters gedurende 2-3 uur bij kamertemperatuur met rotatie; Stap 3: centrifuge en het verzamelen van eiwithoudende supernatant; Stap 4: concentreer eiwit oplossingen voor 20-30 ul vóór inzending voor MS. </li><li> Centrifugeer elk 100 pl kralen monster bij 12.000 xg gedurende 30 seconden bij 4 ° C en verzamel supernatant. Aliquot 15 ul supernatant voor western blot analyse (zie paragraaf 6.1 en 6.2). Probe het resulterende membraan met de verdunde Hur muis monoklonaal antilichaam (1: 1000 verdunning), &#39;s nachts. </li></ol> 6. Western Blotting voor Verificatie van RBP <ol><li> RBPs gescheiden door SDS-PAGE onder toepassing van standaardtechnieken. </li><li> voeren wijstern blotten met behulp van standaard technieken door peilen naar de RBPs verband met het RNA van belang. LET OP: In deze demo experiment, was Hur muizen monoklonaal antilichaam dat wordt gebruikt voor de immunodetectie van Hur eiwit. </li><li> Incubeer de verkregen membraan met verdunde Hur antilichaam (1: 1000 verdunning) in 5% w / v niet-vette droge melk, 1 x TBS, 0,1% Tween - 20 4 ° C onder zacht schudden, &#39;s nachts. Was membraan driemaal met TBST 1x. Incubeer het membraan met het secundaire antilichaam (geit anti-muis IgG-HRP) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Wassen membraan. Ontwikkelen en op te nemen signaal. </li></ol>

<ol><li>Huot, M. É, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sam68+STAR+RNA-binding+protein+regulates+mTOR+alternative+splicing+during+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis.</a> Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNAs+regulate+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNAs regulate adipogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).</li>
<li>Engreitz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+exploits+three-dimensional+genome+architecture+to+spread+across+the+X-chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome.</a> Science. 341 (6147), 1237973(2013).</li>
<li>Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long+noncoding+RNA+transcriptional+regulatory+circuit+drives+thermogenic+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation.</a> Mol Cell. 55, 372-382 (2014).</li>
<li>Alvarez-Dominguez, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+reconstruction+of+adipose+tissue+transcriptomes+reveals+long+non-coding+RNA+regulators+of+brown+adipocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development.</a> Cell Metab. 21, 764-776 (2015).</li>
<li>Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HADHB%2C+HuR%2C+and+CP1+bind+to+the+distal+3-untranslated+region+of+human+renin+mRNA+and+differentially+modulate+renin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).</li>
<li>Yeap, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+binding+of+HuR+and+poly%28C%29-binding+protein+to+a+conserved+UC-rich+motif+within+the+3%C2%B4+untranslated+region+of+the+androgen+receptor+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3´ untranslated region of the androgen receptor messenger RNA.</a> J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).</li>
<li>König, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-RNA+interactions%3A+new+genomic+technologies+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives.</a> Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).</li>
<li>Ferrè, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+protein-lncRNA+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Revealing protein-lncRNA interaction.</a> Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).</li>
<li>McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+comprehensive+experimental+identification+of+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions.</a> Genome Biol. 15 (1), 203(2014).</li>
<li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AU-rich+element-binding+protein+negatively+regulates+CCAAT+enhancer+binding+protein+mRNA+stability+during+long+term+synaptic+plasticity+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).</li>
<li>Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+genome+engineering+using+designer+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse genome engineering using designer nucleases.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li>
<li>Tsai, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Noncoding+RNA+as+Modular+Scaffold+of+Histone+Modification+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes.</a> Science. 329 (5992), 689-693 (2010).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+and+variation+of+RNA+secondary+structure+across+the+human+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome.</a> Nature. 505, 706-709 (2014).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mRNA+binding+proteins+that+regulate+the+stability+of+LDL+receptor+mRNA+through+AU+rich+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements.</a> J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).</li>
<li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li>
<li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Discovery+of+Xist+RNA+Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li>
<li>Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+to+probe+functions+and+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+Polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

lncRNAs RBPs en hebben vitale rol in gezondheid en ziekte, maar de moleculaire mechanismen van deze moleculen worden slecht begrepen. Identificatie van eiwitten die interageren met lncRNA moleculen een belangrijke stap naar het ophelderen van de regulatiemechanismen. Verrijking van RBPs door RNA pull-down assay is gebaseerd op in-oplossing vangst van samenwerkend complex waardoor eiwitten uit een cellysaat selectief worden geëxtraheerd met behulp van gebiotinyleerd RNA aas gebonden aan streptavidine magnetische korrels....

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/54207/detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte">Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture</a>.
The author list has been updated from:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical &#38; Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RBPs zijn eiwitten die binden aan een dubbele of enkelstrengs RNA in cellen en participeren in het RNA-eiwitcomplexen. RBPs kunnen verschillende RNA soorten, waaronder mRNA en lange niet-coderende RNA&#39;s (lncRNAs) binden en hun invloed op post-transcriptioneel niveau uitoefenen. Zowel RBPs en lncRNAs zijn in opkomst als nieuwe regulatoren in het vet- ontwikkeling en functioneren 1,2,3. Het mechanisme van RBP- en lncRNA gemedieerde regulering van cellulaire routes begrijpen, is het vaak nodig om de interactie tussen een specifiek RNA-molecuul en één of meer RBPs detecteren, en soms het volledige spectrum van eiwit partners van een RNA identificeren vertaling. Echter, het experiment uitdaging vanwege het hoge gehalte aan lipiden in adipocyten. Het RNA pull-down protocol beschreven kunnen worden toegepast om het eiwit partners van een specifiek RNA van de adipocyten lysaten van primaire kweken 4,5 halen. Reden voor deze protocol wordt als volgt samengevat. Een RNA aas in vitro getranscribeerd vanaf een DNA-matrijs, met biotine gemerkt en geconjugeerd aan met streptavidine beklede magnetische korrels 4. Het RNA aas wordt geïncubeerd met cellysaten, teneinde de vorming van RNA-eiwitcomplexen, die vervolgens neer op een magnetische standaard worden getrokken. Meer specifiek hieronder beschreven het RNA pull-down-protocol een RNA-fragment uit AR 3&#39;UTR als aas om Hur eiwit, een universeel uitgedrukt RBP gebonden aan 3&#39;UTR van mRNA 6,7, van theadipocytelysate van primaire kweek te halen. Om de bindingsspecificiteit van deze assay wordt een niet-relevante RNAas en leeg streptavidineparels opgenomen als controle. Dit protocol is compatibel met western blotting of massaspectrometrie (MS) om de vangst van een specifieke RBP te bevestigen of het volledige repertoire van gevangen RBPs respectievelijk 8 identificeren. Verschillende technieken beschikbaar voor RNA-eiwit interactie te bestuderens. Om RNAs gebonden door een bepaalde RBP, RIP (RNA immunoprecipitatie) en CLIP (UV crosslinking en immuunprecipitatie) zichtbaar kan worden toegepast. Daarentegen eiwit partners van een bepaald RNA identificeren RNA pull-down, Chirp (chromatine isolatie van RNA zuivering), GRAFIEK (capture hybridisatie-analyse van RNA targets) en RAP (antisense RNA zuivering) kunnen worden toegepast. In vergelijking met de latere, RNA pull-down methode vergt minder inspanning te zetten. Het kan worden toegepast om eiwitten te vangen in vitro en in vivo. De in vivo benadering van RNA pull-down, dat is technisch gezien een grotere uitdaging dan de in vitro tegenhanger, behoudt RNA-eiwit interacties door het verknopen in cellen, vangt-aptameer gelabeld RNA&#39;s van de belangstelling van de cellen, en vervolgens gebonden RBPs detecteert. RNA vervolgmenu kan worden gebruikt om lage overvloedige RBPs verrijken en isoleren en identificeren van de RNA-eiwitcomplexen die verschillende functionele rollen hebben bij het ​​regelen cellulaire regulatie 9,10 </sup&gt;.

<table><tbody><tr><td>Belangrijke materialen gebruikt in dit onderzoek.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript kit</td><td>&nbsp;Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin-14-CTP&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucAway spin columns&nbsp;</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HuR (3A2) muis monoklonaal antilichaam (sc-5261)&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-muis IgG-HRP(sc-2005)&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypure moleculaire biologie kwaliteit Water (nuclease-vrij)&nbsp;</td><td>HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatbuffer Saline (1&times;PBS)</td><td>&nbsp;HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase inhibitor&nbsp;</td><td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pfu Turbo DNA polymerase&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIsure</td><td>&nbsp;Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Belangrijke apparatuur gebruikt in dit onderzoek.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R centrifuge&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1R centrifuge&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad T100 thermal cycler&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BOECO rotator Multi Bio RS-24&nbsp;</td><td>BOECO,Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteïne gelelektroforese en blotting apparaat&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 magneet&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detectie van rna-bindende eiwitten door<em&gt; in vitro</em&gt; rna pull-down in adipocyte cultuur

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-bindende eiwitten (RBPs) ontstaan ​​als een regulerende laag in de ontwikkeling en functie van vet. RBPs spelen een sleutelrol in de regulatie van genexpressie op post-transcriptionele niveau door dat de stabiliteit en translationele efficiëntie van doelwit mRNA. RNA pull-down techniek wordt veel gebruikt om RNA-eiwit interactie die nodig is om het onderliggende mechanisme helderen (lncRNAs) functie RBPs &quot;als lange niet-coderende RNA&#39;s te bestuderen. De hoge lipide overvloed in adipocyten vormt een technisch probleem bij het uitvoeren van dit experiment. Hier een gedetailleerd RNA pull-down protocol is geoptimaliseerd voor primaire adipocyten cultuur. Een RNA-fragment uit (AR) 3 &#39;onvertaalde regio androgene receptor (3&#39;UTR) die een adenylaat-uridylate-rijk elementwas als voorbeeld gebruikt om te demonstreren hoe de RBP partner, Hur eiwit op te halen, uit adipocyten lystate. De hier beschreven methode kan worden toegepast op de interacties tussen detecterenRBPs en niet-coderende RNA&#39;s, alsook tussen RBPs en codering RNA&#39;s.

In deze demo experiment werd een AR-RNA-fragment gebruikt als aas om zijn bindende eiwit hur vast te leggen. Zowel een aas FL RNA dat niet-relevant Hur eiwit en een hoeveelheid ongeconjugeerde lege streptavidineparels dienden als negatieve controles. RNA-eiwit interacties kunnen zich voordoen in kern en cytoplasma en deze pull-down protocol kan worden toegepast op hetzij geheel of gefractioneerd (kern- of cytoplasmische) cellysaten. Van eiwitten door Western blotting toont aan dat het mo...

Een RNA-pull-down protocol is hier geoptimaliseerd voor detectie van interacties tussen RNA-bindende eiwitten (RBPs) en niet-coderende en coderende RNAs. Een RNA fragment uit androgeenreceptor (AR) werd gebruikt als een voorbeeld om te demonstreren hoe de RBP halen uit lystate primaire bruine adipocyten.

Detectie van RNA-bindende eiwitten door<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA Pull-down in Adipocyte Cultuur

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

Het algemene doel van dit experiment is het terugwinnen van RNA-bindende eiwitten van een RNA-transcript uit bruin vetweefsel. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in dit vakgebied, zoals wat de regulatiemechanismen zijn van langlevend coderend RNA en de bijbehorende RNA-eiwitten. Het belangrijkste voordeel van deze tactiek is dat deze eenvoudig uit te voeren is.Het RNA dat wordt gebruikt om deze procedure te demonstreren, is een fragment van de Antigen Receptor 3-Prime Untranslated Region, hierna aangeduid als de AR 3-Prime UTR. Begin met het amplificeren van de T7 AR-oligo en de partiële sequentie van het vuurvlieg-luciferase-DNA uit het psiCHECK-2-plasmide. De gebruikte primers en parameters zijn gedetailleerd beschreven in het bijbehorende document.Gebruik na amplificatie de PCR-producten als templates voor de synthese van gebiotinyleerde RNA's met behulp van een in vitro transcriptiekit, volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer het mengsel vervolgens vier uur bij 37 °C. Voeg na de in vitro transcriptie één µL DNase toe aan de reactie en incubeer deze 15 minuten bij 37 °C om het template-DNA af te breken.Vul vervolgens het totale volume aan tot 6

detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een stap voor stap-protocol om het isoleren en identificeren van RNA bijbehorende complexen door middel van RIP-Chip.

Werkwijze voor het isoleren en identificeren van mRNAs, microRNA en eiwitcomponenten van ribonucleoproteïne complexen uit celextracten met RIP-Chip

This video demonstrates an in vitro RNA pull-down assay to identify RNA-binding proteins (RBPs), which interact with the adenylate-uridylate-rich element (ARE) sequences in mRNA. The target RBPs from a cell lysate are mixed with an RNA probe to form RNA-protein complexes. The complexes are isolated via affinity purification utilizing the affinity of the desthiobiotin label of the RNA probe to a streptavidin-labeled magnetic bead.

RNA-Protein Pull-Down Assay to Isolate RNA-Binding Proteins via Affinity Extraction

Hier presenteren we een protocol om RNA / eiwit interacties te analyseren. De elektroforetische mobiliteit shift assay (EMSA) is gebaseerd op de differentiële migratie van RNA / eiwit-complexen en vrij RNA in natieve gelelektroforese. Door een radioactief gemerkte RNA-probe, kan RNA / eiwit-complexen worden gevisualiseerd door autoradiografie.

Elektroforetische mobiliteit Shift Assay (EMSA) voor de studie van RNA-eiwit interacties: Het IRE / IRP Voorbeeld

RNA-eiwitinteracties liggen aan de basis van veel cellulaire processen. Hier beschrijven we een in vivo methode om specifiek RNA te isoleren en nieuwe eiwitten te identificeren die ermee geassocieerd zijn. Dit kan nieuw licht werpen op hoe RNA's in de cel worden gereguleerd.

Novel-RNA-bindende eiwitten Isolatie door de snelle Methodologie

We beschrijven een protocol te identificeren van RNA-bindende proteÃ¯nen en kaart van de regio's hun RNA-bindende in levende cellen met behulp van UV-gemedieerde photocrosslinking en massaspectrometrie.

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Hier presenteren wij een interactief capture protocol toegepast op Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasten. Deze methode berust op in vivo UV-verknoping en staat voor isolatie en identificatie van plantaardige mRNA-bindende eiwitten uit een fysiologische omgeving.

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

Desthiobiotin labeling van een synthetische 25-nucleotide RNA oligo, die een motief adenine-rijke element (ARE) bevat, kunt specifieke binding van cytosolische ARE-bindend-proteïne.

Desthiobiotin-streptavidine-affiniteit gemedieerde zuivering van eiwitten in cellen van mesothelioom RNA-interactie

Dit verslag wordt een snelle en betrouwbare methode voor het valideren van mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs beschreven. Het gebruik van de methode synthetische biotinyleerd vergrendeld nucleïnezuur LNA gebaseerde miRNA bootst te vangen target mRNA. Vervolgens daar beklede magnetische kralen pulldown worden gebruikt de doelstelling mRNA voor kwantificering van qPCR polymerase-kettingreactie.

Biotine gebaseerde Pulldown Assay te valideren mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs

Bij deze methode kwantificeren we de bindende affiniteit van RNA-bindende eiwitten (rbp's) naar verwant en niet-verwant binding sites met behulp van een eenvoudige, Live, reporter assay in bacteriële cellen. De test is gebaseerd op onderdrukking van een reporter-gen.

Een test voor het kwantificeren van eiwit-RNA-binding bij bacteriën

Hier wordt een protocol gepresenteerd om oligonucleotiden zoals klein-interfererend RNA (siRNA), micro-RNA-mimics (miRs) of anti-micro-RNA (anti-miR) af te leveren in volwassen adipocyten om eiwit- en micro-RNA-expressie te moduleren.

Een adipocytencelkweekmodel om de impact van eiwit- en micro-RNA-modulatie op de adipocytenfunctie te bestuderen

Hier presenteren we een geoptimaliseerde in vitro methode om eiwitinteractoren van specifieke RNA-sequenties te ontdekken, kwantificeren en valideren, met behulp van totaal eiwitextract uit menselijke cellen, streptavidineparels bedekt met gebiotinyleerd RNA en massaspectrometrie-analyse.

Een geoptimaliseerde kwantitatieve pull-down analyse van RNA-bindende eiwitten met behulp van kort gebiotinyleerd RNA

Leer een geoptimaliseerd RNA pull-down protocol om RNA-bindende eiwitten te detecteren in bruin vetweefsel. Deze methode gebruikt AR 3-Prime UTR fragmenten en is eenvoudig uit te voeren.

Detectie van RNA-bindende eiwitten door

Meer video's verkennen