Name: Functionele karakterisering van regulerende macrofagen die de transplantaatreactieve immuniteit verhinderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Leer hoe je regulerende macrofagen uit getransplanteerde harten isoleert en karakteriseert met flowcytometrie. Deze techniek helpt onderzoekers de immunomodulerende rol van deze cellen te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij erkennen de technische bijdragen van de Flow Cytometry, Microchirurgie, en Bio-repository / Patologie Centra of Excellence in onderzoek in Mount Sinai. Dit werk werd ondersteund door de COST Action BM1305: Actie om de Tolerogene Therapieën van de Cel te concentreren en te versnellen (FACTT), de ontwikkelingsfondsen van het Sinai Recanati / Miller Transplantatie Instituut, Ministerio de Ciencia en Innovacion SAF2013-48834-R en SAF2016-80031-R JO

<html> In deze studie zijn muizen gehuisvest in overeenstemming met de richtlijnen van de Verenigde Staten van Landbouw en de aanbevelingen van de Public Health Service Guide voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren. Alle experimentele technieken met betrekking tot dierlijk gebruik werden uitgevoerd in overeenstemming met de protocols van de Sinai School of Medicine van de Instituut voor Dierenartsen en Inrichtingen (IACUC). 1. Media Voorbereiding <ol><li> Bereid compleet RPMI 1640 medium met 10% FBS en 1% penicilline streptomycine (10.000 U / ml) op met 2 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 0,1 mM niet essentiële aminozuren, 5 mM HEPES en 0,05 mM 2 mercaptoëthanol. </li></ol> 2. Allograft Isolatie en een-cel Suspensie OPMERKING: De transplantatie- en anastomose-techniek van de longslagader en de inferieure cava ader werd aanvankelijk beschreven door Corry en medewerkers en kan worden geïllustreerd in Liu &amp; KangS = &quot;xref&quot;&gt; 10 , 11 ( Figuur 1A ). <ol><li> Verdoof een getransplanteerde muis met 4-5% isofluraan in een inductiekamer. Offer het door cervicale dislocatie. </li><li> Maak een middelste buikopname met standaardschaar en verwijder de buikinhoud om de aorta te lokaliseren. OPMERKING: Het getransplanteerde hart staat aan de rechterkant van de ontvanger abdominale aorta ( Figuur 1B ). </li><li> Trek het transplantaat zachtjes uit met behulp van fijne scherpe tandenpennen en plaats het onmiddellijk in ijskoud RPMI-medium. OPMERKING: Het gebruik van een chirurgische schaar om het transplantaat van de aorta te scheiden, kan het transplantaat beschadigen en ervoor zorgen dat er een weefsel aan de ontvanger blijft. </li><li> Nadat alle transplantaten zijn verzameld, verplaatsen ze in een steriele kweekkap voor weefselverwerking. Plaats het transplantaat in een petri schotel en doei het weefsel in kleine stukken (1 mm) met behulp van steriele, stompe, microchirurgische scharen. </li><li> Met scherpe tanden forcEps, de stukken overbrengen naar een 50 ml buis met 5 ml collagenase A (0,1 mg / ml collagenase in steriele 1x PBS). Incubeer het gedurende 1 uur in een 37 ° C bad. </li><li> Voeg 5 ml RPMI-medium toe om de collagenase te neutraliseren en het monster over te brengen door een 100 μm filter met behulp van de zuiger van een 1 ml spuit. </li><li> Spoel het monster gedurende 4 minuten bij 400 xg bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de pellet in 1 ml ACK lysis buffer. Meng goed en incubeer gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Voeg 1 ml RPMI-medium toe om de lysisbuffer te neutraliseren en de monster gedurende 5 m bij 4 ° C naar 400 xg te draaien. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 200 μl RPMI-medium en overbreng deze naar een 5 ml polypropyleen ronde bodembuis. OPMERKING: Polypropyleenbuizen ondersteunen minder aanhechting. Ook de handhaving van de cellen bij lage temperatuur, zoals 4 ° C, vermindert de hechting. </li></ol> 3. Isolatie van graft-infiltrerende macrofagen met behulp van fluorescentie-geactiveerde cel sorterening <ol><li> Blokkeer ongewenste specifieke binding op myeloïde cellen door gebruik te maken van Fc-receptor blokkerende mAb (rat anti-muis CD16 / 32). Voeg 1-2 μL per monster toe, 15 min voor het oppervlakkleuren. </li><li> Vlek met anti-muis CD11b Percp / Cy5.5 (0,6 μg / μL eindconcentratie in het RPMI-medium), anti-muis CD45 APC / eFluor780 (0,6 μg / μl), anti-muis Ly6C APC (2 μg / μl) En anti-muis Ly6G Pe / Cy7 (2 μg / μl). Bedek de buizen met aluminiumfolie om de fluorescerende antilichamen tegen licht te beschermen en de buizen in de koelkast bij 45 ° C bij 4 ° C te incuberen. OPMERKING: Voor eenvlekcompensaties, berei een negatieve controlebuis (geen vlek) en buizen op met cellen die enkel met elk van de fluorochromen gemerkt zijn. Om de poort op te zetten, kunnen de isotype controles vooral worden gebruikt voor Ly6C (IgG2a) en Ly6G (IgG2b). </li><li> Was de cellen tweemaal met RPMI-medium en draai ze 5 minuten bij 400 ° C bij 4 ° C. Tel de cellen met behulp van trypan blauw en een hemocytometeR en verdun ze in 1 ml RPMI medium per 1 x 106 cellen. Voordat u de sortering doorlaat, steek de monsters over via een 5 ml, 70 μm cilinderbuiskap. Voeg DAPI (1 μg / ml) als een cel levensvatbaarheidsmerker toe en ga verder met sorteren. </li><li> Omdat macrofagen gevoelige en kwetsbare cellen zijn, stelt u de sorteeromstandigheden in op 20 psi en gebruikt u een 100 μm spuitmaten om macrofagen te isoleren met een 4-weg zuiverheidsmodus. </li><li> Bereid de collectiebuizen op met 1 ml RPMI-medium in een 5 ml polypropyleenbuis. </li><li> Met behulp van de sorteringssoftware opent u een nieuw experiment en selecteert u leeg experiment met een leeg paneel om instellingen te definiëren. </li><li> Stel een puntplot op die de voorwaartse (FSC) versus ( vs. ) zijverspreiding (SSC) en poort op alle leukocyten toont, met uitzondering van puin en klontjes met de laagste voor- en zijkantverdeling. Vanuit deze ouderpoort maak je een nieuw stipplot dat SSC versus DAPI en poort op DAPI-cellen toont. <ol><li> Op deze nieuwe gated bevolking, maak een advertentieOt plot die CD11b versus CD45 en poort toont op dubbele positieve (CD11b + CD45 + ) macrofagen en neutrofielen. </li><li> Maak hiervandaan een definitief puntplot dat Ly6C versus Ly6G weergeeft en de gewenste populaties halen: Ly6C hi Ly6G-, Ly6Clo Ly6G- en Ly6C int Ly6G + ( Figuur 2 ). </li></ol></li><li> Controleer na het sorteren op de zuiverheid en de levensvatbaarheid van de cel (&gt; 90%) en draai de collectiebuizen bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Tel de cellen met behulp van trypanblauw en een hemocytometer en zet ze opnieuw op bij de gewenste concentratie ( bijv. 1 x 10 6 macrofagen / ml) in compleet RPMI-medium. </li><li> Platte 50 x 10 3 macrofagen per putje in een 96-putjes ronde bodemplaat met een eindvolume van 100 μl volledig RPMI-medium. Laat de cellen ongestoord blijven gedurende minstens 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2. </li></ol> 4. IsolatioN van T-cellen met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering OPMERKING: C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / Jn is een X-linked gerichte inklapbare muisstam die co-merken voor cellen die het Foxp3-gen (voorhoofd P3) uitdrukken met monomeer rood fluorescent eiwit (mRFP). <ol><li> Verdoof en offer C57BL / 6 en C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J (H-2b) muizen zoals eerder beschreven in stap 2.1. Isoleer de milt en lymfeklieren (LN: inguinale, lumbale, axillaire, brachiale en cervicale) en plaats ze snel in ijskoud RPMI-medium. </li><li> Om de LN te isoleren, zet de muis in de rugpositie, maak een onderkant van de onderkant van de onderkant naar boven, snijd het peritoneum zorgvuldig en verdeel de huid zachtjes uit elkaar. Zodra alle ingewanden, lumbale, okselvormige, brachiale en cervicale LN zijn verzameld ( Figuur 1C , rood gekleurd), snijd het peritoneum en isoleer de milt aan de linkerbovenkant van de darm. </li><li> Ontmelt de milt en LN met behulp van een 100 μm filter geplaatstBoven op een 50 ml buis. Druk met behulp van de plunjer van een 1 ml injectiespuit voorzichtig op het weefsel. Spoel het filter met RPMI-medium zo vaak als nodig totdat het schoon is. OPMERKING: LN en milt van elke muis kunnen in dezelfde buis samengevoegd worden. </li><li> Spin bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de pellet in 2 ml ACK lysis buffer. Meng goed en incubeer gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Voeg 2 ml RPMI medium toe om de lysisbuffer te neutraliseren. Spin bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 200 μl RPMI-medium en overbreng deze naar een 5 ml polystyreen ronde bodembuis. </li><li> Vlek voor anti-muis CD4 APC (0,6 μg / μl) en / of anti-muis CD8 PeCy7 (2 μg / μL). Bedek de buizen met aluminiumfolie om de fluorescerende antilichamen tegen licht te beschermen en de buizen in de koelkast te incuberen bij 4 ° C gedurende 45 minuten. OPMERKING: Voor eenvlek compensaties, maak een negatieve controlebuis (geen vlek) enBuizen met cellen gemerkt afzonderlijk met elk van de fluorochromen. </li><li> Was de cellen tweemaal met RPMI-medium en draai ze 5 minuten bij 400 ° C bij 4 ° C. Tel de cellen met behulp van trypan blauw en een hemocytometer. OPMERKING: CFSE-kleurstof wordt standaard aangeboden als carboxyfluoresceendiacetaatsuccinimidylesterpoeder, bij 50 μg. Voeg 18 μL DMSO toe aan een injectieflacon van CFSE voor een laatste voorraadoplossing van 5 mM en houd het bij een paar maanden bij -20 ° C. </li><li> Voor CFSE-labeling, resuspendeer CD8-gekleurde cellen bij een concentratie van maximaal 10 6 cellen per ml in PBS bij een uiteindelijke werkconcentratie van 5 μM CFSE uit de voorraadoplossing. Incubeer ze gedurende 5 minuten in een bad bij 20 ° C zoals eerder beschreven 6 . OPMERKING: (CRITISCHE STAP) Voor cellen met een lage concentratie (≤10 6 per ml) is het van essentieel belang dat de cellen worden gemerkt in aanwezigheid van toegevoegde eiwitten om de giftige effecten van CFSE te bufferen. Daarom kan PBS 5% FBS bevatten. Merk op dat als ikDium wordt gebruikt, kunnen vrije aminozuren de etiketteringsefficiëntie verlagen door te concurreren voor CFSE. </li><li> Neutraliseer de CFSE met 2 ml RPMI-medium. Spin bij 400 xg gedurende 5 min bij 4 ° C. Voeg 1 ml RPMI medium per 1 x 10 6 CD8 T-cellen toe. </li><li> Voordat u het sorteren, steek het monster door een 70 μm celfilter op een 5 ml buisdop. Voeg 50 μL 1x DAPI (1 μg / ml) als een cel levensvatbaarheidsteken toe en ga verder met sorteren. OPMERKING: 1x betekent 1: 1 verhouding van het reagens met respect voor ander bestanddeel. </li><li> Stel de sorteeromstandigheden bij 20 psi en 100 μm nozzle grootte in om dubbele positieve CD8 + CFSE + T cellen te isoleren ( Figuur 3A ). </li><li> Bereid de collectibuizen met 1 ml RPMI-medium in een 5 ml polypropyleenbuis en ga verder met sorteren. </li><li> Met behulp van de sorteringssoftware opent u een nieuw experiment en selecteert u leeg experiment met een leeg paneel om instellingen te definiëren. </li><li> Voor CD4 + T-celisolatie, stel een dotplot op die dat isSpeelt de FSC vs SSC en de poort op lymfocyten, met uitzondering van puin en grote granulaire cellen, zoals dendritische cellen. <ol><li> Vanuit deze ouderpoort maak je een nieuw stipplot dat SSC versus DAPI en poort op DAPI-cellen toont. </li><li> Op deze nieuwbevolkte populatie creëert u een dotplot die SSC vs. CD4 weergeeft om alle CD4 + -cellen te isoleren ( Figuur 3B ). Als alternatief kan een anti-CD3 mAb worden gebruikt om isolatie van pure T-celpopulaties te waarborgen. OPMERKING: een kleine fractie van alle CD4 + T-cellen (5-10%) moet Foxp3 + mRFP + zijn . </li></ol></li><li> Controleer na het sorteren op de zuiverheid en de levensvatbaarheid van de cel (&gt; 90%) en draai de collectiebuizen bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Tel de cellen met behulp van trypan blauw en een hemocytometer. Resuspenderen met 1 ml volledig RPMI-medium per 2x10 6 T-cellen. </li><li> Onderdrukkingstest opstellen door T cellen te cultiveren met eerder gesorteerd macrofagen. Plaat 10 x 10 4 CD4 + T en 10 x 10 4 CD8 + CFSE + T-cellen in dezelfde put in een eindvolume van 100 μl volledig RPMI-medium. Incubeer bij 37 ° C en 5% C02 gedurende 96 uur. OPMERKING: Macrofagen en T-cellen werden gebruikt in een 1: 4 verhouding. </li><li> Stimuleer T-celverdeling door het wassen van T-cel-activator CD3 / CD28 magnetische kralen in 2 ml PBS voordat u ze gebruikt om de azide bevattende buffer te verwijderen. Voeg 5 μl muis T-cel-activator CD3 / CD28 kralen per put toe. OPMERKING: Magnetische kralen hebben een soortgelijke grootte als antigeen presenterende cellen en zijn gekoppeld aan anti-CD3 en anti-CD28 mAb, waarbij een eenvoudige methode voor de activatie en uitbreiding van T-cellen wordt aangeboden. </li></ol>

<ol><li>Jose, M. D., Ikezumi, Y., van Rooijen, N., Atkins, R. C., Chadban, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+act+as+effectors+of+tissue+damage+in+acute+renal+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection.</a> Transplantation. 76 (7), 1015-1022 (2003).</li>
<li>Oberbarnscheidt, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-self+recognition+by+monocytes+initiates+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Non-self recognition by monocytes initiates allograft rejection.</a> J Clin Invest. 124 (8), 3579-3589 (2014).</li>
<li>Garcia, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytic+suppressive+cells+mediate+cardiovascular+transplantation+tolerance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Monocytic suppressive cells mediate cardiovascular transplantation tolerance in mice.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2486-2496 (2010).</li>
<li>Conde, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-SIGN%28%2B%29+Macrophages+Control+the+Induction+of+Transplantation+Tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">DC-SIGN(+) Macrophages Control the Induction of Transplantation Tolerance.</a> Immunity. 42 (6), 1143-1158 (2015).</li>
<li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny%2C+activation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).</li>
<li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescent+target+arrays+for+assessment+of+T+cell+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo.</a> J Vis Exp. (88), e51627(2014).</li>
<li>Tario, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+staining+and+proliferation+modeling+methods+for+cell+division+monitoring+using+cell+tracking+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes.</a> J Vis Exp. (70), e4287(2012).</li>
<li>Poujol, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+evaluation+of+lymphocyte+transformation+test+based+on+5-ethynyl-2%27deoxyuridine+incorporation+as+a+clinical+alternative+to+tritiated+thymidine+uptake+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric evaluation of lymphocyte transformation test based on 5-ethynyl-2'deoxyuridine incorporation as a clinical alternative to tritiated thymidine uptake measurement.</a> J Immunol Methods. 415, 71-79 (2014).</li>
<li>Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+lymphocyte+proliferation%3A+CFSE+kills+dividing+cells+and+modulates+expression+of+activation+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers.</a> Cell Immunol. 256 (1-2), 79-85 (2009).</li>
<li>Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primarily+vascularized+allografts+of+hearts+in+mice.+The+role+of+H-2D%2C+H-2K%2C+and+non-H-2+antigens+in+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection.</a> Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).</li>
<li>Liu, F., Kang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+heart+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Heterotopic heart transplantation in mice.</a> J Vis Exp. (6), e238(2007).</li>
<li>Ochando, J., Conde, P., Bronte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-Derived+Suppressor+Cells+in+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Transplant+Rep%22%5BJournal%5D)">Monocyte-Derived Suppressor Cells in Transplantation.</a> Curr Transplant Rep. 2 (2), 176-183 (2015).</li>
<li>Gallina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors+induce+a+subset+of+inflammatory+monocytes+with+immunosuppressive+activity+on+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells.</a> J Clin Invest. 116 (10), 2777-2790 (2006).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gr-1%2BCD115%2B+immature+myeloid+suppressor+cells+mediate+the+development+of+tumor-induced+T+regulatory+cells+and+T-cell+anergy+in+tumor-bearing+host%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host.</a> Cancer Res. 66 (2), 1123-1131 (2006).</li>
<li>Luan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+accumulate+in+renal+transplant+patients+and+mediate+CD4%28%2B%29+Foxp3%28%2B%29+Treg+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4(+) Foxp3(+) Treg expansion.</a> Am J Transplant. 13 (12), 3123-3131 (2013).</li>
<li>Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+immune+cell+proliferation+and+cytotoxic+potential+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft de methoden die we gebruikt om immuun-infiltrerende myeloïde cel subsets te immunocharacteriseren in een experimenteel murine model van harttransplantatie, die ook van toepassing is op andere weefsels in verschillende muizen experimentele modellen. Lage drukcellen sorteren bij 20 psi was de voorkeursmethode om een ​​goede opbrengst van subgroepen met zuivere cellen te isoleren. Het behouden van de zuiverheid van elke myeloïde subset is essentieel om afdoende resultaten van de onderdrukkende capac...

Dit protocol beschrijft in vitro technieken om de functie van weefsel-infiltrerende macrofagen die geïsoleerd zijn van cardiale allografen te bestuderen, volgens hun vermogen om T-cel responsen te moduleren. In de literatuur worden fluorescerende celopsporingskleurstoffen in combinatie met flowcytometrie beschreven, krachtige hulpmiddelen om de onderdrukkende functie van specifieke celsoorten in vitro en in vivo te bestuderen . Ons protocol volgt de carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) methode voor het monitoren van lymfocyt proliferatie in vitro . Wanneer een CFSE-gemarkeerde cel verdeelt, verwerft zijn nageslacht het halve aantal carboxyfluoresceïne-gelabelde moleculen 6 . De bijbehorende afname in celfluorescentie door flowcytometrie kan worden gebruikt om celverdeling te beoordelen, de capaciteit van onderdrukkende macrofagen te monitoren om T-cel immuunresponsen te moduleren. Aangezien CFSE een fluoresceïne-gebaseerde kleurstof is, is het compatibel met een brOad reeks van andere fluorochromen, waardoor het van toepassing is op multi-color flow cytometry. De juiste keuze van fluorochromen voor fenotyping is ook belangrijk om overmatige spectrale overlap te vermijden en het onvermogen om antilichaam-positieve cellen te herkennen, met name met zichtbare proteïne kleurstoffen zoals CFSE 7 . Er zijn vele voordelen van het gebruik van fluorescerende kleurstoffen over alternatieve technieken die cel proliferatie meten, zoals de thymidine incorporation assay, die radioactief gelabelde thymidine (TdR) 8 gebruikt . Deze bepaling maakt gebruik van tritiated thymidine ( 3 H-TdR) die in de nieuwe strengen van chromosomaal DNA is opgenomen tijdens de mitotische celdeling. Een veiligheidsprobleem in verband met deze analyse is het gebruik van radio-isotopen, aangezien een scintillatie-beta-teller gebruikt wordt om de radioactiviteit te meten in DNA die uit de cellen is hersteld om de mate van celverdeling te bepalen. Methodologisch, de tritiated thymidine assAy is niet flexibel genoeg om belangrijke klinische laboratorium beperkingen aan te passen, zoals een laag aantal cellen en vertraagde analyse na kleuring. Integendeel, CFSE-kleuring is aangetoond dat cel proliferatie voorkomt en interfereren met kritische activatie markers, zoals CD69, HLA-DR en CD25 9 . Daarom begrijpen de voordelen en beperkingen van elke methodologie, met name in multicolor studies waarbij meerdere kleurstoffen worden gebruikt om verschillende celtypes te volgen, om kritische en reproduceerbare resultaten te verkrijgen.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>10% FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>1,000x 2-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>100x Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>100x L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>100x Non Esential amino acids</td><td>Corning</td><td>25025039</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES buffer&nbsp;</td><td>Corning</td><td>25060CL</td><td></td></tr><tr><td>100 mM Sodium Pyruvate</td><td>ThermoScientific</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptavidyn</td><td>ThermoScientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Collagenese A</td><td>Roche</td><td>70381322</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (w/o calcium&amp;magnesium)</td><td>Corning</td><td>21031CV</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro;m Cell strainer</td><td>Fisher</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysis buffer</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-5mg-F</td><td></td></tr><tr><td>CFSE-FITC</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28</td><td>Life Technologies</td><td>11452D</td><td></td></tr><tr><td>96 well&nbsp; U-bottom plate</td><td>Corning</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-Ly6C-APC</td><td>eBioscience</td><td>175932-80</td><td></td></tr><tr><td>anti-Ly6G-Pe/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>127617</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD11b-Percp/Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45011282</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45-APC/Cy7</td><td>eBioscience</td><td>47045182</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4-APC</td><td>eBioscience</td><td>17004181</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8-P/ Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25008181</td><td></td></tr><tr><td>LSRII Flow Cytometer</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva Software</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J&nbsp;</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>008374</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Balb/c</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000651</td><td></td></tr></tbody></table>

functionele karakterisering van regulerende macrofagen die de transplantaatreactieve immuniteit verhinderen

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

Macrofage accumulatie in getransplanteerde organen is al lang herkend als een kenmerk van allograft afwijzing 1 . Immunogene monocyten infiltreren de allotransplantatie vroeg na transplantatie, bevestig een transplantaatreactieve reactie tegen het getransplanteerde orgaan en start orgaanafstoting 2 . Recente gegevens suggereren dat onderdrukkende macrofagen succesvolle langetermijntransplantatie 3 vergemakkelijken en nodig zijn voor de inductie van transplantatietolerantie 4 . Dit suggereert een multidimensionaal concept van macrofage ontogenie, activatie en functie, die een nieuwe routekaart vereist voor de isolatie en analyse van macrofage functie 5 . Vanwege de plasticiteit van macrofagen is het nodig een methode te geven om macrofagen te isoleren en te karakteriseren, afhankelijk van de weefselomgeving, en om hun functies te definiëren volgens verschillende scenario&#39;s. Hier worden we beschrevenEen protocol voor immuun karakterisering van transfusie-infiltrerende macrofagen en de methoden die we functioneerden om hun capaciteit te evalueren om CD8 + T proliferatie te remmen en om de groei van CD4 + Foxp3 + Treg in vitro te bevorderen.

De representatieve resultaten tonen de gate strategie beschreven in het bovenstaande protocol. Resultaten tonen ook de analyse van de T-cel proliferatie activiteit na de co-cultuur met transplantatie-infiltrerende macrofagen. De in vitro onderdrukkende capaciteit van macrofaag subsets werd geanalyseerd in figuur 4 . De resultaten wijzen erop dat de Ly6C lo Ly6G - macrofagen verkregen uit getolereerde ontvangers onderdrukkend zijn. De result...

Macrofagen zijn plastic cellen van het hematopoietische systeem die een cruciale rol spelen in beschermende immuniteit en homeostase. In dit rapport beschrijven we geoptimaliseerde in vitro technieken voor het fenotypisch en functioneel karakteriseren van transplantatie-infiltrerende regulerende macrofagen die zich in het getransplanteerde orgaan verzamelen onder tolerogene omstandigheden.

Functionele karakterisering van regulerende macrofagen die de transplantaatreactieve immuniteit verhinderen

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

Het algemene doel van deze in vitro-procedure is om macrofaagpopulaties, geïsoleerd uit allotransplantaten in een massatransplantatiemodel, fenotypisch en functioneel te karakteriseren. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen over de immuniteit die we vinden over hoe we de overleving en tolerantie van allographen kunnen verbeteren. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de studie mogelijk maakt van hoe een specifiek weefsel geïnfiltreerde hartallograaf geïsoleerde microfaagsubset het antwoord van het gastheerweefsel moduleert.Na het genereren van een enkele-cel suspensie uit het allograaf, blokkeer eventuele niet-specifieke binding op de myeloïde cellen met een tot twee microliter FC-receptor blokkerende monoklonale antilichaam gedurende 15 minuten. Aan het einde van de incubatie, kleuren de cellen met de juiste fluorescentie geconjugeerde myeloïde celoppervlakte antilichamen gedurende 45 minuten bij vier graden Celsius beschermd tegen licht. Was vervolgens de cellen twee keer in RPMI-medium door centrifugatie.En re-suspendeer het pellet in trypanblauw voor het tellen. Verdun vervolgens de cellen tot een eenmalige 10 tot de zesde cellen per milliliter concentratie in vers medium. En filter de cellen door een 70 micron zeef in een vijf-milliliter rondbodembuisje.Net voor het sorteren, kleuren de cellen met DAPI als een levensvatbaarheidsmarker en stel de flowcytometer in op de juiste macrofaagsorteerparameters. Plaats vijf-milliliter kegelbuisjes met een milliliter RPMI-medium voor het verzamelen van de gesorteerd cellen en laad het monsterbuisje op de cytometer. Selecteer in de flowcytometer software een blanco experiment met een blanco paneel, en stel een forward versus side scatter stipplot in.Gat op de leukocyten, met uitsluiting van celdebris en klonten met de laagste voorwaartse en zijwaartse verspreiding. Vanaf deze ouder gate, creëer een nieuwe stipplot die zijwaartse verspreiding versus DAPI weergeeft en gat op de DAPI negatieve cellen. Op deze nieuwe gated populatie, creëer een stipplot dat CD11b versus CD45 weergeeft, en gat op de CD11b CD45 dubbel positieve macrofagen en neutrofielen.Creëer vervolgens een laatste stipplot weergave Ly6C versus Ly6G om gating van de gewenste populatie mogelijk te maken en sorteer de cellen. Aan het einde van het sorteren, bevestig de zuiverheid en levensvatbaarheid van de monsters. Verzamel de gesorteerd cellen door centrifugatie, en re-suspendeer het pellet voor het tellen in vers RPMI-medium.Verdun de macrofaagpopulaties tot de juiste concentratie voor het zaaien vijf keer 10 tot de vierde macrofagen per 100 microliters van compleet medium per putje, in een 96-well rondbodemplaat. Plaats vervolgens de cellen in een celkweekincubator gedurende ten minste 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% CO2. Om de T te isoleren, plaats de knock-in muis in de rugligging.Maak eerst een middenlijn huidsnede, snijd voorzichtig het peritoneum en spreid de huid voorzichtig uit elkaar. Verzamel de perifere lymfeklieren en de milt, en plaats de weefsels in een 100-micrometer filter bovenop een 50-milliliter kegelbuisje. Gebruik de plunjer van een 1-milliliter spuit, druk de lymfoïde weefsels voorzichtig door de filter en spoel de filter met vers RPMI-medium totdat het gaas schoon is.Verzamel de enkele-cel suspensie door centrifugatie, en re-suspendeer het pellet in twee milliliter ACK-lysebuffer. Na vijf minuten bij vier graden Celsius, neutraliseer de lysebuffer met twee milliliter vers RPMI-medium, en centrifugeer de cellen. Re-suspendeer het pellet in 200 microliters vers medium, en breng de cellen over naar een vijf-milliliter rondbodembuisje voor het filteren met de juiste T-celoppervlakte-kleuring antilichamen.Na 45 minuten bij vier graden Celsius beschermd tegen licht, was de cellen twee keer in vers RPMI-medium en tel de cellen door trypanblauw uitsluiting. Verdun vervolgens de CD8-gekleurde cellen tot een eenmaal 10 tot de zesde cellen per milliliter concentratie in CFSE gedurende vijf minuten in een 20-graads Celsius waterbad. Aan het einde van de incubatie, neutraliseer de CFSE met twee milliliter RPMI-medium, en verzamel de cellen door centrifugatie.Re-suspendeer de cellen op een eenmaal 10 tot de zesde CD8-gekleurde T-cellen per milliliter RPMI-medium concentratie, en filter alle celmonsters door een 70-micrometer celzeef in vijf-milliliter rondbodembuisjes. Label vervolgens de cellen met DAPI en bereid de flowcytometer voor het sorteren zoals zojuist gedemonstreerd. Voor CD4 positieve T-celisolatie, stel een forward versus side scatter stipplot in voor gating op de lymfocyten, met uitsluiting van het puin evenals de grote korrelige myeloïde cellen.Vanaf deze ouder gate, creëer een stipplot die zijwaartse verspreiding versus DAPI weergeeft, en gat op de DAPI negatieve cellen. Op deze nieuwe gated populatie, creëer één stipplot die zijwaartse verspreiding versus CD4 weergeeft, en één stipplot die CD8 versus CFSE weergeeft. Sorteer vervolgens de gated T-celpopulaties.Aan het einde van het sorteren, bevestig de zuiverheid en levensvatbaarheid van de monsters, en verzamel de cellen door centrifugatie voor het tellen. Verdun de cellen tot een twee keer 10 tot de zesde T-cellen per milliliter RPMI-concentratie, en 100 microliters T-cellen in compleet RPMI-medium naar elke putje van macrofagen voor een 96-uur co-cultuur bij 37 graden Celsius en 5% CO2. Voeg tenslotte vijf microliter PBS-wash T-celactivator CD3 CD28 magnetische kralen toe aan elke putje om de T-cellen te activeren en uit te breiden.Ly6Clo Ly6G-macrofagen verkregen van getoleriseerde ontvangers oefenen een onderdrukkend effect uit op CD8 positieve T-cellen, met een bescheiden onderdrukkende activiteit ook waargenomen van Ly6C intermediaire Ly6CG positieve cellen. Alleen Ly6Clo Ly6G-cellen bevorderen echter de in vitro-uitbreiding van CD4 positieve Foxp3 positieve TReg. Samen ondersteunen deze gegevens de conclusie dat graft

functional-characterization-regulatory-macrophages-that-inhibit-graft

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Macrofagen spelen een centrale rol in homeostase en pathologie in vele weefsels. Het protocol hier gepresenteerde beschrijft methoden voor uitputting van...

Uitputting en reconstitutie van macrofagen in Muizen

We beschrijven hier een eenvoudig protocol om muis-peritoneale macrofagen te isoleren. Deze procedure wordt gevolgd door RNA-extractie om genexpressieanalyse uit te voeren na stimulatie van Toll-achtige receptoren.

Isolatie van muizen peritoneale macrofagen uit te voeren analyse van genexpressie Bij Toll-like receptoren Stimulatie

We beschrijven een protocol voor aortische interpositie-grafting bij muizen. Het doel van het protocol is om een model te bieden waarmee pathologische processen en therapeutische strategieën kunnen worden bestudeerd die relevant zijn voor allo-immuunreacties in slagaders en de resulterende arteriële veranderingen die bijdragen aan falen van orgaantransplantatie.

Mouse Model van Allo-immuun geïnduceerde Vascular Afwijzing en Transplant Aderverkalking

Hier beschrijven we een protocol om het fenotype van regulatorische T-cellen (Treg) te analyseren die zijn geïsoleerd uit naïeve en chronisch lymphocytaire choriomeningitis-virus geïnfecteerde muizen. Daarnaast bieden we een proces om de onderdrukkende activiteit van de Treg-cellen te evalueren.

Fenotypische en functionele analyse van geactiveerde regulatoire T-cellen Geïsoleerd van Chronische Lymfatische choriomeningitis-virus geïnfecteerde muizen

Hier presenteren we een protocol bij het opwekken van tolerantie in transplantatie, en beoordelen van in vitro en in vivo de onderdrukkende capaciteit van afzonderlijke cel subsets van de ontvanger en de immuunstatus van de ontvanger naar donor of exogene antigenen.

In Vitro en In Vivo beoordeling van T-, B- en myeloïde cellen onderdrukkende activiteit en humorale reacties van transplantatie ontvangers

Antilichaam gebaseerde drugs hebben een revolutie teweeggebracht in behandeling voor inflammatoire ziekten. Naast directe gevolgen hebben voor concrete doelstellingen, kunnen antilichamen macrofagen tot anti-inflammatoire activeren. Dit protocol beschrijft hoe anti-inflammatoire macrofaag activering kan worden beoordeeld in vitro met behulp van de muis het beenmerg macrofagen en in vivo, met behulp van peritoneale macrofagen.

Beoordeling van antilichaam gebaseerde Drugs gevolgen voor lymfkliertest beenmerg en peritoneale Macrophage activering

Monocyt-afgeleide DC (MoDC) kleine hoeveelheden gevaar-geassocieerde moleculen kunnen voelen en zijn daarom gemakkelijk primer. Wij bieden een gedetailleerd protocol voor de isolatie van de MoDC uit bloed, tumoren en hun activering met immuuncomplexen terwijl het benadrukken van belangrijke voorzorgsmaatregelen die moeten worden overwogen om te voorkomen dat hun voortijdige activering.

Protocol van de isolatie van muis monocyt-afgeleide dendritische cellen en hun latere In Vitro activatie met Tumor immuuncomplexen

Hier presenteren we een methode met behulp van permeabele membraan ondersteuningen om de studie van contactloze paracrine signalering die door tumorcellen wordt gebruikt om de immuunrespons te onderdrukken te vergemakkelijken. Het systeem is vatbaar voor het bestuderen van de rol van tumor-uitgescheiden factoren bij het demping van macrofaag activering.

Het bestuderen van de effecten van door tumor uitgescheiden Paracrine liganden op macrofaag activering met behulp van co-cultuur met permeabel membraan ondersteunt

Hier wordt een protocol gepresenteerd om dynamische beelden van mesenchymale stamcel (MSC) gemedieerde regulatie van macrofaag (MΦ) fagocytose van niet-opsonized gist (zymosan) deeltjes die zijn geconjugeerd aan een pH-gevoelig fluorescerend molecuul te kwantificeren en te produceren.

Mesenchymale stamcelregulatie van macrofaagfagocytose; Kwantificering en beeldvorming

Monocyten en macrofagen zijn zeer plastische en herprogrammeerbare immuuncellen die cruciaal zijn voor gezondheid en ziekte. Ze detecteren en reageren op een breed scala aan stimuli door specifieke differentiatieprogramma's en fenotypes aan te nemen. We hebben een in-vitro model gestandaardiseerd om macrofagen polarisatie en herprogrammering te bestuderen, wat een waardevol hulpmiddel voor onderzoek biedt.

Reprogrammeringsmodel van humane monocyte-afgeleide macrofagen voor in-vitro analyses

Leer hoe je regulerende macrofagen uit getransplanteerde harten isoleert en karakteriseert met flowcytometrie. Deze techniek helpt onderzoekers de immunomodulerende rol van deze cellen te begrijpen.

Functionele karakterisering van regulerende macrofagen die de transplantaatreactieve immuniteit verhinderen

Meer video's verkennen