Name: Snelle en vereenvoudigde methode voor High Through-put Isolatie van miRNA uit Highly Purified high density lipoproteïne (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Leer een snelle methode voor high-throughput isolatie van miRNA uit gezuiverd HDL uit menselijk plasma. Deze techniek verbetert het onderzoek naar cardiovasculaire beschermende mechanismen en hepatologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund, geheel of gedeeltelijk, door NIH-subsidies R01 AA 020758-04, U01DK 061731-13 en T32 DK 007150-38 aan AJS en T32 DK 007150-38 aan AA. Dit is origineel werk en wordt nergens anders beoordeeld voor publicatie.

1. Het verzamelen van bloedmonsters <ol><li> Verzamel vasten perifere veneuze bloedmonsters in 10 ml plastic buizen die anticoagulant Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (dit kan enkele voordelen boven andere anticoagulantia heeft) door standaard venapunctie een prominente ader in de antecubitale fossa. </li><li> Centrifugeer de bloedmonsters bij 1600 xg gedurende 20 min bij 4 ° C in een tafelblad centrifuge plasma vrij van rode bloedcellen en kleine hoeveelheden RNA te verkrijgen. </li><li> Opeenvolgend centrifugeer het supernatant bij 3000 g (4 ° C) in een swinging bucket rotor gedurende 10 min WBC en bloedplaatjes en bijkomende 15 min verwijderen respectievelijk verwijderen van alle resterende celresten. </li><li> Meet de dichtheid van het plasma met een densitometer bij kamertemperatuur volgens vervaardiging instructies. OPMERKING: Aanpassing van de dichtheid (d = 1,023 g / ml) met 0,9% zoutoplossing vereist kan na verwijdering van exosomen maar vóór dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie. </li></ol&gt; 2. exosome Verwijdering van Plasma <ol><li> Verwijder de circulerende exosomes dat een dichtheid vergelijkbaar HDL hebben en vormen een kwantitatief belangrijke bron van miRNA 3. <ol><li> Do hierop door 252 pi precipitatie exosome oplossing van 1 ml plasma, gevolgd door incubatie gedurende 30 min bij 4 ° C. Om pellet de exosomes, centrifuge het mengsel gedurende 30 minuten bij 1500 g bij 4 ° C. </li><li> HDL, breng 1 ml van de supernatant tot een polycarbonaat dikwandige ultracentrifuge buis voor verdere verwerking met dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie isoleren (zie hieronder). </li></ol></li></ol> 3. dichtheidsgradiëntcentrifugatie (figuur 1). <ol><li> Te scheiden HDL gebruik van een 3-staps proces waarbij een vloer ultracentrifuge met vaste hoek rotor werkt bij 448.811 x G en 8 ° C. </li><li> Bereid drie verschillende dichtheid oplossingen sequentieel en fris voor elke isolement. <ol><li> Bereid Oplossing A (isolatie van VLDL, d = 1,006 g / ml) door het oplossen van 11,4 g NaCl (NaCl: 0,195 mol), 0,1 g EDTA2Na en 1 ml 1N NaOH in 1000 ml van geautoclaveerd gedestilleerd water. Voeg vervolgens nog eens 3 ml geautoclaveerd gedestilleerd water. </li><li> Bereid Oplossing B (isoleren van LDL, d = 1,182 g / ml) door toevoeging van 25,2 g NaBr aan 100 ml oplossing A (0,195 mol NaCl, NaBr 2,44 mol). </li><li> Bereid Oplossing C (isoleren van HDL, d = 1,470 g / ml) door mengen van 78,8 g NaBr met 100 ml oplossing A (0,195 mol NaCl, NaBr 7,7 mol). Bevestig de juiste dichtheid bij kamertemperatuur met behulp van een densitometer. Houd alle oplossingen bij 4 ° C tot verder gebruik. </li></ol></li></ol> 4. Isolatie van VLDL <ol><li> Meng 1 ml plasma (gemiddelde dichtheid = 1,023 g / ml) en nuclease vrij 200 gl Fat Red 7B in een 6,5 ml polycarbonaat dikwandige buis ultracentrifuge. </li><li> Vervolgens voorzichtig laag 5 ml oplossing A bovenop het mengsel. Indien nodig, voeg extra Fat Red 7B op de top van de oplossing A to balanceren het gewicht van elke buis. Centrifugeer gedurende 2 uur (versnelling - 5), (vertraging - 7). LET OP: Tijdens het centrifugeren, worden de lipoproteïnen opgebouwd als een band bij hun evenwicht dichtheid. </li><li> Aan het einde van de run te observeren 2 lagen. Verwijderen 1,5 ml van de VLDL breuk welke de toplaag en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Bovendien zullen, met een pipet overdracht 4 ml van de bodem van de buis met het LDL, HDL, albumine en vetzuurfractie in nieuw polycarbonaat buis LDL isolatie. </li></ol> 5. Isolatie van LDL <ol><li> Meng 2 ml oplossing B en 100 ul nuclease vrij Fat Red 7B in de buis met de LDL en HDL-fractie (hoofdstuk 4), respectievelijk. </li><li> centrifugeren vervolgens gedurende 3 uur (9 versnelling, vertraging 7). Daarna verwijdert 1,5 ml van de LDL fractie die de bovenste laag en laten 4 ° C en bewaar bij -80 ° C. Breng tenslotte 4 ml van de bodem van de buis met het HDLfractie om een ​​nieuwe polycarbonaat buis. </li></ol> 6. Isolatie van HDL <ol><li> Meng 2 ml oplossing C, 100 ul nuclease vrij vet Red 7B en 15 pl 98% β-mercaptoethanol in de buis met de HDL-fractie, respectievelijk. </li><li> Centrifugeer gedurende 3 h (9 versnelling, vertraging 7). Daarna verwijdert 2 ml van de HDL-fractie die de bovenste laag en deze behouden bij 4 ° C en bewaar bij -80 ° C. </li></ol> 7. Het ontzouten en concentratie van lipoproteïnefracties <ol><li> Om interferentie met daaropvolgende agarose gelelektroforese en PCR vermijden de buitensporig zout toegevoegd tijdens dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie middels centrifugale filterinrichtingen met het geschikte molecuulgewicht cutoff (3K buis VLDL en 10K buis LDL / HDL) volgens de instructies van de fabrikant. <ol><li> Kort na het toevoegen van 2,5 ml koude PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) centrifugalege de gehele VLDL-fractie verzameld tijdens dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie bij 4 ° C gedurende 60 min met een swinging bucket rotor. </li><li> Ontzouten de LDL fractie tweemaal met 10 ml ijskoud PBS gedurende 30 minuten elk. Gebruik vervolgens 13 ml ijskoud PBS twee keer voor het ontzouten van de HDL-fractie. Hoe hoger volume PBS moet mobiliteit agarosegelelektroforese verbeteren. Na centrifugeren, verwijderen lipoproteïne bevattende opgeloste stoffen en bewaar bij 4 ° C en bewaard bij -80 ° C. </li></ol></li></ol> 8. agarosegelelektroforese <ol><li> Perfrom lipoproteïne agarosegelelektroforese onder toepassing van de kit met kleine modificaties van de instructies van de fabrikant als volgt. OPMERKING: Deze stap is alleen maar om de kwaliteit en zuiverheid van de geconcentreerde lipoproteïne monsters te beoordelen. <ol><li> In het kort verkrijgen 6 ui van het ontzoute lipoproteïne fractie met dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie en laden op een prefab lipoproteïne gel. Gebruik menselijke lipopProtein normen voor VLDL, LDL en HDL als maat referentie. Uit te voeren elektroforese bij KT bij 100 V gedurende 60 min met behulp van Rep Prep buffer. </li><li> Droog de gel gedurende 10 minuten en daarna kleur wordt 10 minuten bij kamertemperatuur met Fat Red 7B. Destain de gel in een mengsel van methanol-water 75:25 (v / v) en droog weer gedurende 5 minuten. </li></ol></li></ol> 9. RNA extractie en zuivering <ol><li> Perfrom isolatie van miRNA door gezuiverde humane HDL met behulp van de serum / plasma miRNA isolatie en zuivering kit. <ol><li> Kort samengevat, voeg 1 ml RNA lysis reagens 200 gl gezuiverd HDL, mengen met een vortexer en vervolgens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om complete dissociatie van nucleoproteïne complexen en inactiveren van RNasen waarborgen. </li><li> Spike dan 3,5 pi van synthetische Caenorhabditis elegans microRNA (CEL-miR-39; 1,6 x 10 8 kopieën / ul) in het mengsel. Voer daarna RNA extractie volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol></li><li> Voer purificatiop geëxtraheerde-miRNA met elueren spinkolommen volgens instructies van de fabrikant. Meet de concentratie van miRNA uit gezuiverd HDL met een spectrophorometer. LET OP: Elutie van miRNA uit de spin-kolommen toegepast 16 pi RNase-vrij water. </li></ol> 10. Reverse transcriptie (RT-PCR) <ol><li> Isoleren 100 ng van het miRNA van HDL verrijkt met synthetische miRNA (CEL-miR-39) en reverse getranscribeerd in een 20 pl reactievolume onder toepassing van de reverse transcriptie en kit volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Voer de juiste controles zonder template miRNA (NTC) en zonder reverse transcriptase-enzym mix (NRT). </li></ol> 11. Real-time PCR (qRT-PCR) <ol><li> Perfrom real-time PCR in een totaalvolume van 20 pi met 2 ui van een 1: 2 verdunning van de cDNA, 10 pi PCR-mix, 2 gl universele primer 2 ui miRNA primers en 4 pi RNase-vrij water. </li><li> Voer het Reaction in 96-well platen bij 95 ° C gedurende 15 min, gevolgd door 45 cycli van 94 ° C gedurende 15 sec en 55 ° C gedurende 30 s en verlenging fase bij 70 ° C gedurende 30 s.ec alle reacties in drievoud perfrom . </li><li> Vervolgens calcuate relatieve hoeveelheden miRNA met de 2 -ΔΔ Ct werkwijze na normalisatie naar de synthetische huishoudgen volgens instructies van de fabrikant. </li></ol>

<ol><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li>
<li>Arroyo, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute2+complexes+carry+a+population+of+circulating+microRNAs+independent+of+vesicles+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 5003-5008 (2011).</li>
<li>Vickers, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nat Cell Biol. 13 (4), 423-433 (2011).</li>
<li>Wagner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+levels+and+cellular+transfer+of+circulating+lipoprotein-bound+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 1392-1400 (2013).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+185%2C+96%2C+and+223+repress+selective+high-density+lipoprotein+cholesterol+uptake+through+posttranscriptional+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs 185, 96, and 223 repress selective high-density lipoprotein cholesterol uptake through posttranscriptional inhibition.</a> Mol Cell Biol. 33 (10), 1956-1964 (2013).</li>
<li>Rayner, K. J., Moore, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+control+of+high-density+lipoprotein+metabolism+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA control of high-density lipoprotein metabolism and function.</a> Circ Res. 114 (1), 183-192 (2014).</li>
<li>Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+endosomal-derived+vesicles+shipping+extracellular+messages%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosomes: endosomal-derived vesicles shipping extracellular messages.</a> Curr Opin Cell Biol. 16 (4), 415-421 (2004).</li>
<li>Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+plasma+lipoproteins+by+density-gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation.</a> Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).</li>
<li>Foreman, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+human+serum+lipoproteins+by+single-spin+gradient+ultracentrifugation%3A+quantification+of+apolipoproteins+B+and+A-1+and+lipid+components%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Fractionation of human serum lipoproteins by single-spin gradient ultracentrifugation: quantification of apolipoproteins B and A-1 and lipid components.</a> J Lipid Res. 18, 759-767 (1977).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+LDL-+and+HDL-cholesterol+determined+by+ultracentrifugation+and+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Serum LDL- and HDL-cholesterol determined by ultracentrifugation and HPLC.</a> J Lipid Res. 52, 383-388 (2011).</li>
<li>Tong, H., Knapp, H. R., VanRollings, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((low+temperature+flotation+method+to+rapidly+isolate+lipoproteins+from+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">low temperature flotation method to rapidly isolate lipoproteins from plasma.</a> J Lipid Res. 39, 1696-1704 (1998).</li>
<li>Fless, G. M., ZumMallen, M. E., Scanu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+properties+of+apolipoprotein+%28a%29+and+lipoprotein+%28a-%29+derived+from+the+dissociation+of+human+plasma+lipoprotein+%28a%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Physicochemical properties of apolipoprotein (a) and lipoprotein (a-) derived from the dissociation of human plasma lipoprotein (a).</a> J Biol Chem. 261, 8712-8718 (1986).</li>
<li>Brownie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elimination+of+primer-dimer+accumulation+in+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The elimination of primer-dimer accumulation in PCR.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3235-3241 (1997).</li>
<li>Alton, E., Inyoul, L., Leroy, H., David, G., Kai, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+microRNA%3A+a+new+source+of+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular microRNA: a new source of biomarkers.</a> Mutat Res. 717 (1-2), 85-90 (2011).</li>
<li>Stefanie, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+biomarker+profiling+with+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cancer biomarker profiling with microRNAs.</a> Nature Biotechnology. 26, 400-401 (2008).</li>
<li>Prasun, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+promising+biomarkers+in+cancer+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as promising biomarkers in cancer diagnostics.</a> Biomarker Research. 2 (19), (2014).</li>
<li>Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+and+extracellular+communicators+in+cardiovascular+disease%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease?</a> Circ Res. 110, 483-495 (2012).</li>
<li>Jonathan, S., Martin, S., Eric, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJonathan%2C+S+%22miRNA+profiling+from+blood+-challenges+and+recommendations%22">miRNA profiling from blood -challenges and recommendations</a>. , 
 <a target="_blank" href="www.qiagen.com">www.qiagen.com</a> (2015).</li>
<li>Francesco, M., Paola, D. C., Anna, T., Jesper, T., Sergio, A., Riccardo, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+circulating+microRNA+expression+data+obtained+by+quantitative+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR.</a> Brief Bioinform. 3, 1-9 (2015).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%2C+novel+biomarkers+of+acute+myocardial+infarction%3A+a+systemic+review%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Emerg+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs, novel biomarkers of acute myocardial infarction: a systemic review.</a> World J Emerg Med. 3, 257-260 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Identificatie van nieuwe biomarkers uit bloed zal helpen bij de klinische diagnose en prognose van verschillende ziekten. MicroRNA&#39;s zijn bekend bij alle kwaliteiten van biomarkers te bezitten en er is aangetoond in diverse studies 14-17. In deze studie hebben we aangetoond dat een snelle en eenvoudige eenvoudige methode om miRNA isoleren van HDL. Conventionele dichtheidsgradiënt ultra-centrifugatie isolatiemethode van VLDL, LDL en HDL afhankelijk nauwkeurige bemonstering van plasma, nauwkeurige opstellin...

MicroRNA's zijn endogene niet-coderende kleine RNA-soorten die sterk geconserveerd zijn en worden beschouwd als sleutelrolspelers bij de regulatie van verschillende biologische processen door het afbreken of onderdrukken van specifieke doelwitten van boodschapper-RNA's1. Omdat miRNA's intracellulair werken, zijn ze onderzocht als weefselafgeleide biomarkers, wat leidde tot de ontdekking van weefselspecifieke functies van deze miRNA's. Echter, miRNA's worden ook extracellulair gevonden, hetzij geassocieerd met eiwitten of in exosomen/microvesikels die ze effectief kunnen beschermen tegen afbraak door extracellulaire RNases2. Recentere studies hebben aangetoond dat het beschermende effect van HDL mogelijk niet nauw verbonden is met zijn vermogen om cholesterolefflux te bevorderen, maar eerder met zijn niet-cholesterolvracht, in het bijzonder als een circulerende miRNA-drager 3, 4. Deze miRNA's kunnen niet alleen het lipidenmetabolisme moduleren, maar zijn ook geassocieerd met anti-inflammatoire, antioxiderende en antitrombotische effecten van het HDL-miRNA-complex 5, 6.
Om de rol van miRNA's in HDL-deeltjes verder te onderzoeken, moet een eenvoudig en gemakkelijk protocol worden vastgesteld voor miRNA-extractie uit geïsoleerde, hoog gezuiverde HDL voor gebruik in de klinische praktijk. Er zijn talrijke methoden beschreven om HDL te isoleren. Deze methoden zijn ofwel zeer tijdrovend of vereisen grote volumes plasma die mogelijk sample-pooling, uitgebreide dialyse voor het ontzouten van geïsoleerde lipoproteïnen vereisen en ze verwijderen exosomen niet volledig als bron van miRNA's3, respectievelijk. Hier beschrijven we een eenvoudige en snelle methode die miRNA kan isoleren uit hoog gezuiverd HDL met behulp van kleine volumes bloedmonsters op grotere schaal. We geloven dat deze methode kan dienen als goede referentie om onderzoek naar de rol van circulerende miRNA's te bevorderen en in het bijzonder de rol van HDL bij het faciliteren van communicatie tussen verschillende cellen en organen.

<table><tbody><tr><td>Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R&nbsp;</td><td>75004261</td><td></td></tr><tr><td>Densito 30PX densitometer</td><td>Mettler Toledo</td><td>MT51324450</td><td></td></tr><tr><td>ExoQuick solution&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>4484451</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube</td><td>Thermo Scientific</td><td>O3237</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX100 ultracentrifuge&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>46902</td><td></td></tr><tr><td>Fat Red 7B&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201618</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K</td><td>Millipore</td><td>UFC800308</td><td></td></tr><tr><td>QuickGel Lipo kit&nbsp;</td><td>Helena Laboratories&nbsp;</td><td>3344,3544T</td><td></td></tr><tr><td>Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL</td><td>LipoTrol; Helena Laboratories</td><td>5069</td><td></td></tr><tr><td>Rep Prep buffer&nbsp;</td><td>Helena Laboratories&nbsp;</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute spin columns&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 analyzer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Touch real-time PCR detection system</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Kit</td><td>QIAGEN</td><td>217184</td><td></td></tr><tr><td>miScript Primer Assays</td><td>QIAGEN</td><td>141078139</td><td></td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCR Kit&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>218073</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control</td><td>QIAGEN</td><td>219610</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>480878</td><td></td></tr><tr><td>0.20 &#181;M sterile syringe filter</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z227536</td><td></td></tr></tbody></table>

snelle en vereenvoudigde methode voor high through-put isolatie van mirna uit highly purified high density lipoproteïne

Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein

Kleine niet-coderende RNA's (miRNA's) zijn betrokken gebleken bij verschillende menselijke ziekten, waaronder metabole syndromen. Ze kunnen worden gebruikt als biomarkers voor diagnose en prognose of kunnen respectievelijk dienen als doelwitten voor medicijnontwikkeling. Onlangs is aangetoond dat miRNA's worden vervoerd in lipoproteïnen, met name in lipoproteïnen met hoge dichtheid (HDL) en worden afgeleverd aan receptorcellen voor opname. Dit werpt de mogelijkheid op dat miRNA's een kritische en centrale rol spelen in cel- en orgaanfunctie via regulatie van genexpressie, evenals boodschapper voor cel-celcommunicatie en interactie tussen organen. De huidige methoden voor miRNA-isolatie uit gezuiverde HDL zijn onpraktisch bij het gebruik van kleine monsters op grote schaal. Dit komt grotendeels door de tijdrovende en arbeidsintensieve methoden die worden gebruikt voor lipoproteïne-isolatie. We hebben een vereenvoudigde aanpak ontwikkeld om snel gezuiverd HDL te isoleren dat geschikt is voor miRNA-analyse uit plasmamonsters. Deze methode zou onderzoek naar de rol van miRNA's in gezondheid en ziekte moeten vergemakkelijken en in het bijzonder nieuwe inzichten moeten bieden in de verscheidenheid aan biologische functies, buiten de omgekeerde cholesteroltransport, die aan HDL zijn toegeschreven. Ook kunnen de miRNA-soorten die aanwezig zijn in HDL waardevolle informatie bieden over klinische biomarkers voor de diagnose van verschillende ziekten.

Isolatie van high density lipoproteïne na verwijdering van exosomes Om miRNA verkrijgen van sterk gezuiverd HDL moet worden exosomes die een bron van verontreiniging miRNA 7 vertegenwoordigen verwijderen. Dit werd gedaan vóór dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie met een commercieel verkrijgbare kit. Voor praktische doeleinden een driestaps standaard dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie protocol ontwikkeld door commercieel gemodificeer...

MicroRNAs spelen een belangrijke regulerende rol en zijn in opkomst als nieuwe therapeutische doelen voor verschillende ziekten bij de mens. Het is aangetoond dat miRNAs worden vervoerd in high density lipoproteïnen. Wij hebben een eenvoudige methode om gezuiverd HDL geschikt voor miRNA analyse uit menselijk plasma snel isoleren ontwikkeld.

Snelle en vereenvoudigde methode voor High Through-put Isolatie van miRNA uit Highly Purified high density lipoproteïne

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for ...

Het algemene doel van deze methode is het ontwikkelen van een vereenvoudigde aanpak om snel gezuiverde high density lipoproteins uit menselijk bloedplasma te isoleren voor micro-RNA-analyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen in de hepatologie en cardiologie, zoals het begrijpen van de moleculaire mechanismen en beschermende functies van high density lipoproteins. Enkele belangrijke voordelen van deze techniek zijn dat gezuiverde HDL micro-RNA in een korte tijd worden geïsoleerd uit een kleiner samplevolume.In dit protocol wordt plasma verkregen uit nuchtere perifere veneuze bloedmonsters via meerdere centrifugatiestappen, zoals beschreven in de protocoltekst. Breng het plasma over naar een nieuwe buis. Meet vervolgens de dichtheid van het plasma met een densitometer bij kamertemperatuur, volgens de instructies van de fabrikant.Om de circulerende exosomen te verwijderen die een bron van micro RNA-contaminatie vormen, voegt u 252 µL exosomenprecipitatie-oplossing toe aan één milliliter plasma. Incubeer dit gedurende 30 minuten bij 4 °C. Centrifugeer vervolgens het mengsel 30 minuten om de exosomen te pelleteren.Breng één milliliter van het resulterende

fast-simplified-method-for-high-through-put-isolation-mirna-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde multiplex reverse transcriptase kwantitatieve PCR (qRT-PCR)-protocol in combinatie met een microfluïdisch platform als een kost en tijd efficiënte high-throughput screening tool voor microRNA (miRNA) expressie niveaus, in het bijzonder bij het werken met beperkte hoeveelheden van het monster.

High Throughput MicroRNA Profiling: Geoptimaliseerd Multiplex qRT-PCR op nanoliter Schaalverdeling op de Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

This video describes the extraction of circulating microRNA from plasma samples of colorectal cancer patients using organic extraction followed by glass-fiber column enrichment. miRNAs are stable in biological fluids such as serum and plasma, which renders them ideal circulating biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, and treatment decision-making and monitoring. This method will help identify new circulating biomarkers capable of predicting clinical outcomes in patients.

Circulating miRNA Extraction: A Method to Isolate miRNA from Plasma Samples Via Organic Extraction and Small RNA Enrichment

De aanwezigheid van stabiele microRNA (miRNA) in exosomes heeft immense belangstelling gegenereerd als een nieuwe wijze van intercellulaire communicatie, voor hun potentiële nut als biomarkers en als een route voor therapeutische interventie. Hier laten we zien exosome zuivering van het bloed en de cultuur media, gevolgd door kwantitatieve PCR om miRNA's worden vervoerd identificeren.

Zuivering en microRNA Profilering van Exosomes Afgeleid van Blood en cultuur Media

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het extraheren van kleine RNA uit menselijk serum. We hebben deze methode om microRNA kanker serum te isoleren voor gebruik in DNA arrays en ook singleplex kwantitatieve PCR. Het protocol maakt gebruik van fenol en guanidiniumthiocyanaat reagentia met modificaties van hoge kwaliteit RNA opleveren.

Isolatie van Kleine Noncoding RNA&#39;s uit humaan serum

MicroRNA's (miRNA's) zijn een wijdverspreid geconserveerde klasse van regulerende moleculen. Hier beschrijven we een miRNA-kloonmethode die afhankelijk is van twee krachtige ligatiefasen gevolgd door high-throughput sequencing. Onze methode maakt nauwkeurige genoom-wide kwantificering van miRNA's mogelijk.

Zeer efficiënte Ligatie van Kleine RNA-moleculen voor MicroRNA Kwantificering van High-throughput sequencing

Galvocht is een waardevolle bron van extracellulaire vesiclen/exosomen die potentieel belangrijke biomarkers bevatten. Dit protocol vertegenwoordigt een robuuste methode om exosomen uit menselijk gal te isoleren voor verdere analyses, inclusief miRNA-profilering.

Isolatie en profilering van MicroRNA-bevattende exosomes van Human Bile

Dit protocol beschrijft de isolatie en kwantificering van kleine RNA's met hoge dichtheidslipoproteïnen.

Isolatie van lipoproteïnen met hoge dichtheid voor niet-coderende RNA kwantificering Klein

Dit protocol voorziet een nieuwe methode van lipide druppel isolatie en zuivering van muis levers, met behulp van een gevestigde endoplasmatisch reticulum isolatie kit.

Snelle lipide Droplet isolatie Protocol met behulp van een gerenommeerd organel isolatie Kit

Hier, wordt een kwantitatief real-time op de kettingreactie-gebaseerd protocol van de polymerase voorgesteld voor de bepaling van de inheemse micro-RNA inhoud (absoluut/verwant) van lipoprotein deeltjes. Bovendien is een methode voor het verhogen van het micro-RNA-niveau, evenals een methode voor het bepalen van de cellulaire opnamesnelheid van lipoprotein deeltjes, aangetoond.

Verrijking van native lipoprotein deeltjes met microRNA en daaropvolgende bepaling van hun absolute/relatieve microRNA inhoud en hun cellulaire overdrachtssnelheid

Hier beschrijven we een stapsgewijze strategie voor het isoleren van kleine Rna's, verrijkend voor Microrna's en het voorbereiden van samples voor sequentiëren met hoge doorvoer. Vervolgens beschrijven we hoe u de volgorde leest en lijnt u deze uit op microRNAs met behulp van open source tools.

Een complete pijplijn voor het isoleren en Sequentiëren van Microrna's en het analyseren ervan met open source tools

Verschillende methoden zijn gebruikt voor het analyseren van plasma lipoproteïnen; ultracentrifugatie is echter nog steeds een van de meest populaire en betrouwbare methoden. Hier beschrijven we een methode met betrekking tot het isoleren van lipoproteïnen uit plasma met behulp van sequentiële dichtheid ultracentrifugatie en hoe de apolipoproteïnen te analyseren voor zowel diagnostische als onderzoeksdoeleinden.

Isolatie en analyse van plasma lipoproteïnen door ultracentrifugatie

Leer een snelle methode voor high-throughput isolatie van miRNA uit gezuiverd HDL uit menselijk plasma. Deze techniek verbetert het onderzoek naar cardiovasculaire beschermende mechanismen en hepatologie.

Snelle en vereenvoudigde methode voor High Through-put Isolatie van miRNA uit Highly Purified high density lipoproteïne

Meer video's verkennen