Snelle en vereenvoudigde methode voor High Through-put Isolatie van miRNA uit Highly Purified high density lipoproteïne

Het algemene doel van deze methode is het ontwikkelen van een vereenvoudigde aanpak om snel gezuiverde high density lipoproteins uit menselijk bloedplasma te isoleren voor micro-RNA-analyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen in de hepatologie en cardiologie, zoals het begrijpen van de moleculaire mechanismen en beschermende functies van high density lipoproteins. Enkele belangrijke voordelen van deze techniek zijn dat gezuiverde HDL micro-RNA in een korte tijd worden geïsoleerd uit een kleiner samplevolume.

In dit protocol wordt plasma verkregen uit nuchtere perifere veneuze bloedmonsters via meerdere centrifugatiestappen, zoals beschreven in de protocoltekst. Breng het plasma over naar een nieuwe buis. Meet vervolgens de dichtheid van het plasma met een densitometer bij kamertemperatuur, volgens de instructies van de fabrikant.

Om de circulerende exosomen te verwijderen die een bron van micro RNA-contaminatie vormen, voegt u 252 µL exosomenprecipitatie-oplossing toe aan één milliliter plasma. Incubeer dit gedurende 30 minuten bij 4 °C. Centrifugeer vervolgens het mengsel 30 minuten om de exosomen te pelleteren.

Breng één milliliter van het resulterende supernatant over naar een dikwandige polycarbonaat ultracentrifugebuis voor verdere verwerking, zoals gedemonstreerd in het volgende videosegment. De isolatie van high density lipoproteins, of HDL, wordt bereikt via een driestaps dichtheidsgradiënt ultracentrifugatieprotocol, dat een sequentiële isolatie omvat van very low density lipoproteins, of VLDL, low density lipoproteins, of LDL, en HDL. De drie verschillende dichtheidsoplossingen, A, B en C, moeten vers worden bereid volgens de procedure die in de protocoltekst wordt beschreven.

Meng één milliliter plasma en 200 µL nucleasevrij Fat Red 7B in een dikwandige polycarbonaat ultracentrifugebuis van 6,5 milliliter. Breng vervolgens voorzichtig vijf milliliter oplossing A aan als een laag bovenop het mengsel. Voeg indien nodig extra Fat Red 7B toe bovenop oplossing A om het gewicht van elke buis te balanceren.

Plaats de buisjes in een vooraf gekoelde rotor. Plaats de rotor in een vloercentrifuge en centrifugeer gedurende twee uur. Aan het einde van de run moeten twee lagen zichtbaar zijn.

Verwijder 1,5 milliliters van de bovenste laag, wat de VLDL-fractie vertegenwoordigt. Bewaar deze bij vier graden Celsius. Gebruik een pipet om vier milliliters vanuit de bodem van de buis over te brengen naar een nieuwe 50 milliliter buis.

Dit bevat de LDL- en HDL-fractie. De volgende stap is de isolatie van LDL. Meng twee milliliter van oplossing B en 100 µL nuclease-vrije Fat Red 7B in de buis met de LDL- en HDL-fractie.

Plaats vijf tot tien minuten op ijs. Breng 6,5 milliliters van het gemengde monster over in een polycarbonaat dikwandige ultracentrifugebuis. Plaats de buis in een vooraf gekoelde rotor en centrifugeer gedurende drie uur.

Wanneer de centrifugatie is voltooid, verwijdert u 1,5 milliliters van de bovenste laag, die de LDL-fractie vertegenwoordigt, en bewaart u deze bij vier graden Celsius. Draag vier milliliters van de bodem van de buis, die de HDL-fractie bevat, over naar een steriele buis van 50 milliliters. De derde stap is de isolatie van HDL.

Meng twee milliliters van oplossing C, 100 microliters nuclease-vrije Fat Red 7B en 15 microliters 98% beta-mercaptoethanol in de buis die de HDL-fractie bevat. Controleer de dichtheid van het mengsel. Plaats de buis in een vooraf gekoelde rotor en centrifugeer gedurende drie uur.

Verwijder daarna twee milliliters van de bovenste laag, die de HDL-fractie vertegenwoordigt, en bewaar deze bij vier graden Celsius. Overtollig zout moet uit de lipoproteïnefracties worden verwijderd om interferentie met de daaropvolgende agarosegelelektroforese en PCR te voorkomen. In deze video worden het ontzouten en concentreren uitsluitend voor de HDL-fractie gedemonstreerd.

Voeg 13 milliliters koud PBS toe aan de HDL-fractie en breng dit over naar een centrifugeerfilter met een molecular weight cut-off van 10K. Centrifugeer in een swinging bucket-rotor, bij 4000 times g en vier graden Celsius, gedurende 30 minuten. Ontzout de HDL-fractie voor een tweede maal met behulp van 13 milliliters koud PBS en centrifugeer op dezelfde wijze als eerder.

Verwijder na centrifugatie de lipoproteïne-bevattende opgeloste stoffen en bewaar deze bij vier graden Celsius. Om de kwaliteit en zuiverheid van de geïsoleerde lipoproteïnen te beoordelen, werd agarosegelelektroforese uitgevoerd met menselijke lipoproteïnestandaarden, die als grootte-referentie werden gebruikt. Representatieve resultaten van een isolatie, zonder bèta-mercaptoethanol, toonden aan dat de HDL-fractie vrij is van enige VLDL-contaminatie en een typische alfa-mobiliteit vertoont.

De HDL-fractie vertoont echter ook sporen van bètamobiliteit als gevolg van contaminatie met lipoproteïnen. De toevoeging van bèta-mercaptoethanol aan oplossing C, tijdens de laatste centrifugatiestap, verwijdert effectief alle contaminerende lipoproteïnen uit de HDL-fractie. Om de haalbaarheid aan te tonen van het kwantificeren van micro-RNA's, aanwezig in menselijk HDL en gezuiverd met deze methode, werden twee verschillende micro-RNA's geamplificeerd middels real-time kwantitatieve PCR.

In deze amplificatieplots vertegenwoordigen de horizontale lijnen de detectiedrempel. Representatieve real-time PCR-gegevens van geïsoleerd HDL, verkregen uit zes monsters, toonden de consistente detectie van beide micro-RNA's. Ten slotte laten smeltcurve-analyses duidelijk een kenmerkende enkele piek zien voor beide micro-RNA's, wat consistent is met specifieke amplificatie in de voorafgaande PCR.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze, mits correct uitgevoerd, in negen uur worden voltooid, inclusief de ontziltingsprocedures. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te allen tijde bij vier tot acht graden Celsius te werken. Pas bovendien de dichtheid van elke lipoproteïnefractie aan vóór de ultracentrifugatie.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals elektronenmicroscopie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de zuiverheid van HDL. Na de ontwikkeling zal deze techniek onderzoekers op het gebied van het metabool syndroom in staat stellen om HDL-geassocieerde micro-RNA's als biomarkers te onderzoeken bij mensen met een vermoedelijke leververvetting. Het kan ook worden gebruikt om de functie van HDL en de moleculaire mechanismen waarmee het de celbiologie beïnvloedt, beter te begrijpen.