Snelle en vereenvoudigde methode voor High Through-put Isolatie van miRNA uit Highly Purified high density lipoproteïne

Het algemene doel van deze methode is om een vereenvoudigde aanpak te ontwikkelen om snel gezuiverde hoog dichtheidslipoproteïnen uit menselijk bloedplasma te isoleren voor micro RNA-analyse. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in de hepatologie en cardiologie te beantwoorden, zoals het begrijpen van de moleculaire mechanismen en beschermende functies van hoog dichtheidslipoproteïnen. Enkele belangrijke voordelen van deze techniek zijn dat gezuiverd HDL micro RNA komt pre-geïsoleerd uit minder volume aan monsters binnen een korte periode van tijd.

In dit protocol wordt plasma verkregen uit nuchtere perifere veneuze bloedmonsters door meerdere centrifugatie stappen zoals beschreven in de protocoltekst. Breng het plasma over naar een nieuwe buis. En meet de dichtheid van het plasma met een densitometer bij kamertemperatuur, volgens de instructies van de fabrikant.

Om de circulerende exosomen te verwijderen die een bron van micro RNA contaminatie vertegenwoordigen, voeg 252 microliters van exosome precipitatie oplossing toe aan één milliliter plasma. En incubeer gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Centrifugeer vervolgens het mengsel gedurende 30 minuten om de exosomen te pelletten.

Breng een milliliter van het resulterende supernatant over naar een polycarbonaat dikwandige ultracentrifugebuis voor verdere verwerking, zoals gedemonstreerd in het volgende videosegment. Isolatie van hoog dichtheidslipoproteïnen, of HDL, wordt bereikt door een drie stappen dichtheidsgradiënt ultracentrifugeringsprotocol, dat een sequentiële isolatie van zeer laag dichtheidslipoproteïnen, of VLDL, laag dichtheidslipoproteïnen, of LDL, en HDL omvat. De drie verschillende dichtheidsoplossingen, A, B en C, moeten vers worden bereid, volgens de procedure beschreven in de protocoltekst.

In een 6,5 milliliter polycarbonaat dikwandige ultracentrifugebuis, meng één milliliter plasma en 200 microliters van nuclease-vrije Fat Red 7B. Breng vervolgens voorzichtig vijf milliliter van oplossing A aan bovenop het mengsel. Voeg indien nodig extra Fat Red 7B aan bovenop oplossing A toe om het gewicht van elke buis in balans te brengen.

Laad de buizen in een voorgekoelde rotor. Plaats de rotor in een vloercentrifuge en centrifugeer gedurende twee uur. Aan het einde van de run zouden twee lagen zichtbaar moeten zijn.

Verwijder 1,5 milliliter van de toplaag, die de VLDL fractie vertegenwoordigt. En bewaar het bij vier graden Celsius. Gebruik een pipette om vier milliliter van de bodem van de buis over te brengen naar een nieuwe 50 milliliter buis.

Dit bevat de LDL en HDL fractie. De volgende stap is de isolatie van LDL. Meng twee milliliter van oplossing B en 100 microliters van nuclease-vrije Fat Red 7B in de buis die de LDL en HDL fractie bevat.

Plaats op ijs gedurende vijf tot tien minuten. Breng 6,5 milliliter van het gemengde monster over in een polycarbonaat dikwandige ultracentrifugebuis. Laad de buis in een voorgekoelde rotor en centrifugeer gedurende drie uur.

Wanneer de centrifugatie voltooid is, verwijder 1,5 milliliter van de toplaag, die de LDL fractie vertegenwoordigt en bewaar bij vier graden Celsius. Breng vier milliliter van de bodem van de buis, die de HDL fractie bevat, over naar een 50 milliliter steriele buis. De derde stap is de isolatie van HDL.

Meng twee milliliter van oplossing C, 100 microliters van nuclease-vrije Fat Red 7B en 15 microliters van 98% bèta mercaptoethanol in de buis, die de HDL fractie bevat. Controleer de dichtheid van het mengsel. Laad de buis in een voorgekoelde rotor en centrifugeer gedurende drie uur.

Verwijder daarna twee milliliter van de toplaag, die de HDL fractie vertegenwoordigt, en bewaar bij vier graden Celsius. Overtollig zout moet worden verwijderd uit de lipoproteïnefracties om interferentie met daaropvolgende agarose gel elektroforese en PCR te voorkomen. In deze video zal ontzouten en concentratie worden gedemonstreerd voor alleen de HDL fractie.

Voeg 13 milliliter van koud PBS toe aan de HDL fractie en breng over naar een centrifugaal filterapparaat met de molecuulgewichts afsnijding van 10K. Centrifugeer in een zwenkbekerrotor, bij 4000 keer g, en vier graden Celsius, gedurende 30 minuten. Ontzou de HDL fractie, een tweede keer, met behulp van 13 milliliter van koud PBS, en centrifugeer zoals voorheen.

Na centrifugatie, verwijder de lipoproteïne bevattende opgeloste stoffen, en bewaar bij vier graden Celsius. Om de kwaliteit en zuiverheid van de geïsoleerde lipoproteïnen te beoordelen, werd agarose gel elektroforese uitgevoerd met menselijke lipoproteïne standaarden, inbegrepen als maatstaf. Representatieve resultaten van een isolatie, zonder bèta mercaptoethanol, toonden aan dat de HDL fractie vrij is van enige contaminatie van VLDL en vertoont typische alfa mobiliteit.

Echter, de HDL fractie vertoont ook sporen van bèta mobiliteit als gevolg van contaminatie met lipoproteïnen. De toevoeging van bèta mercaptoethanol aan oplossing C, tijdens de laatste centrifugatie stap, verwijdert effectief alle verontreinigende lipoproteïnen uit de HDL fractie. Om de haalbaarheid van het kwantificeren van micro RNA's, gedragen in menselijk HDL, gezuiverd met deze methode, te demonstreren, werden twee verschillende micro RNA's aangemaakt door real-time kwantitatieve PCR.

In deze amplificatiegrafieken vertegenwoordigen de horizontale lijnen de detectie drempel. Representatieve real-time PCR gegevens van geïsoleerde HDL, verkregen uit zes monsters, toonden de consistente detectie van beide micro RNA's. Ten slotte tonen smeltcurveanalyses duidelijk een duidelijke enkele piek voor beide micro RNA's, consistent met specifieke amplificatie in de voorafgaande PCR.

Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in negen uur worden uitgevoerd, samen met de ontzoutingsprocedures, als het goed wordt gedaan. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te allen tijde bij vier tot acht graden Celsius te werken. En om de dichtheid van elke lipoproteïnefractie aan te passen voordat ultracentrifugatie