-Microscopie gebaseerde testen voor high-throughput screening van Host factoren die betrokken zijn in

Het algemene doel van deze high-throughput assay op basis van microscopie is het identificeren van gastheerfactoren die betrokken zijn bij de Brucella-infectie van HeLa-cellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van gastheer-pathogeeninteracties, zoals het identificeren van gastheerproteïnen die de kolonisatie door het intracellulaire pathogeen Brucella bevorderen of juist voorkomen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de semi-geautomatiseerde workflow, van het veterinaire laboratorium tot de beeldanalyse, het gebruik van robots en efficiënte high-throughput experimenten mogelijk maakt.

Zo kan deze methode inzicht bieden in interacties tussen Brucella en de gastheer met behulp van siRNA-screens. Het grootste deel van het protocol kan worden toegepast op andere screeningsstrategieën, zoals siRNA-bibliotheken.

Na het kweken van HeLa-cellen en het voorbereiden van screeningplaten met siRNAs volgens het tekstprotocol, wordt een zwarte 384-wellplaat ontdooid door centrifugatie bij 300 ×g en kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Bereid het transfectiemedium met behulp van DMEM zonder FCS op kamertemperatuur. Verdun het transfectiereagens 1 op 200 en meng dit voorzichtig voor gebruik.

Voeg met een reagensdispenser 25 µL transfectiemedium toe aan elke well van de 384-wells plaat en meng de oplossingen door de plaat heen en weer te bewegen. Incubeer de plaat gedurende één uur bij kamertemperatuur om de vorming van siRNA-transfectiereagenscomplexen mogelijk te maken. Bereid ondertussen de HeLa-cellen voor door het cultuurmedium af te zuigen en 2,5 mL 0,05%trypsine EDTA in PBS toe te voegen om de subconfluente cellen in een kolf van 75 cm² één keer te wassen.

Voeg vervolgens 1,5 milliliters verse trypsine toe en plaats de kolf bij 37 graden Celsius gedurende twee tot drie minuten totdat de cellen afronden. Gebruik 10 milliliters voorverwarmde dmem 60%FCS om de cellen te resuspenderen. Gebruik vervolgens een automatische celteller om de cellen te tellen voordat u een celsuspensie van 10.000 cellen per milliliter in dmem met 16%FCS bereidt.

Voeg 50 µL celisuspensie toe aan elke well met transfectiereagens, zodat er 500 cellen per well aanwezig zijn. Beweeg de plaat heen en weer om de cellen gelijkmatig te verdelen.

Laat de plaat vervolgens vijf tot 10 minuten bij kamertemperatuur staan zodat de cellen kunnen bezinken. Gebruik parafilm om de plaat af te dichten. Incubeer de plaat vervolgens in een bevochtigde incubator op een voorverwarmde aluminium plaat bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 72 uur.

Het werken met het pathogeen B.abortus uit risicoklasse 3 is gevaarlijk; de lokale regelgeving voor biologische veiligheid moet worden nageleefd, wat onder meer het dragen van een beschermend overallpak, beschermende handschoenen, een masker en een veiligheidsbril omvat. Inoculeer één dag vóór de infectie de eerder bepaalde hoeveelheid B.abortus-startcultuur in 50 milliliter TSB KM-medium in een schroefdopfles van 250 milliliter.

Gebruik parafilm om de fles af te sluiten en kweek de bacteriën gedurende de nacht bij 37 °C en 100 RPM op een schudmachine tot een optische dichtheid 600 van 0,8 tot 1,1. Meet de optische dichtheid 600 van de bacteriële cultuur. Bereid vervolgens het infectiemedium voor door de bacteriële cultuur te verdunnen in DMEM met 10% FCS om de gewenste multiplicity of infection te bereiken.

Of, MOI. Vervang met een automatische platenwasser het transfectiemedium door 50 µL infectiemedium. Plaats de plaat in de zuiventhouder van de centrifuge in de zuurkast en centrifugeer de 384-wells plaat bij 400 ×g en 4 °C gedurende 20 minuten.

Gebruik vervolgens parafilm om de plaat af te dichten en incubeer deze op een voorverwarmde aluminium plaat bij 37 °C en 5% CO2 gedurende vier uur. Na de incubatie worden de cellen met een automatische plaatwasser gewassen met DMEM met 10% FCS, bevattend 100 µg/ml dentrimycine of GM, om extracellulaire bacteriën te inactiveren. Gebruik daarna opnieuw parafilm om de plaat af te dichten en plaats deze terug op de voorverwarmde aluminium plaat in de incubator voor nog eens 40 uur voor de eindpuntanalyse.

Om de cellen te fixeren, worden de wells eerst gewassen met PBS. Vervang vervolgens de PBS door 50 microliters 3.7% PFA in PBS bij pH 7.4.

Incubeer de cellen vervolgens 20 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik na de incubatie 50 µL PBS om het fixatiemedium te vervangen. Om de monsters te kleuren met de automatische platenwasser, begint u met het gebruik van 50 µL 1% Triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten om de cellen te permeabiliseren.

Nadat de cellen drie keer zijn gewassen met PBS, voegt u 50 µL PBS toe met 1 µg/mL DAPI en incubeert u dit gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen vervolgens drie keer met PBS voordat u ze tegen licht beschermt. Plaats de plaat vervolgens in de automatische microscoop.

Stel de microscoopinstellingen in. Selecteer het 10-X objectief. Selecteer vervolgens het plaatformaat dat overeenkomt met de 384-well plaat.

Veramel gegevens van negen locaties per putje. Selecteer Enable laser-based focusing. Stel vervolgens de focus in op de plaat en de bodem van het putje.

Stel vervolgens de eerste verworven well in als de initiële well voor het vinden van het monster en alle locaties voor de site autofocus. Pas daarna handmatig de Z-offset voor de focus aan voor het DAPI-kanaal. Druk vervolgens op Find Sample om de focus op de bodem van de well in te stellen.

Gebruik de AutoExposure-functie om een goede schatting van de belichtingstijd te verkrijgen. Corrigeer de belichtingstijd voor het DAPI-kanaal handmatig om een breed dynamisch bereik met een lage overbelichting te garanderen. Gebruik deze belichtingstijd om verschillende locaties over de gehele plaat af te beelden.

Pas de belichtingstijd handmatig aan totdat de helderste pixels ongeveer 80% van de maximale helderheid over de locaties bereiken. Herhaal de stappen voor het instellen van de focus en de belichtingstijd dienovereenkomstig voor alle andere kanalen. Start vervolgens de acquisitie van de volledige plaat.

Gebruik voor de eindpuntanalyse de DAPI- en GFP-kanalen om de volledige plaat te beelden. Om een beeldanalyse uit te voeren op gekleurde cellen in de eindpuntanalyse, selecteert u na het berekenen van een shading-model, volgens het tekstprotocol onder View output settings, de invoermap met de beelden en een uitvoermap voor de resultaten. Definieer vervolgens de tekst die de beelden gemeen hebben en laad de shading-modellen.

Klik op Start test mode en zorg ervoor dat de pauze- en weergave-instellingen voor alle modules zijn uitgeschakeld. Schakel de pauze- en weergave-instelling in voor module negen ImageMath. Het ingeschakelde pauzesymbool verschijnt in het geel.

De ingeschakelde weergavefunctie verschijnt als een open oog. Klik vervolgens op Run om de analyse uit te voeren tot en met module negen. Pas in module negen de parameter multiply the second image by aan naar een waarde die het DAPI-signaal in Brucella onderdrukt zonder de kernen te onderdrukken.

Om de waarden voor de module te testen, drukt u op Step. Klik met de rechtermuisknop op de nieuw geopende afbeelding en stel het beeldcontrast in op log normalized. Ga vervolgens stap voor stap terug naar module negen.

Pas de parameter vermenigvuldig de tweede afbeelding met aan en voer de module opnieuw uit totdat het Brucella-signaal volledig is onderdrukt, terwijl gelijktijdig zwarte gebieden die wijzen op oversubtractie worden geminimaliseerd. Het vinden van goede parameters voor bepaalde modules vereist een geleidelijke optimalisatie van de parameters. Het is essentieel om de modules herhaaldelijk uit te voeren, verschillende waarden te proberen en het effect op het weergegeven resultaat te observeren.

Schakel pauze en weergave in voor module 10. Identificeer de primaire objecten. Stel de ondergrens van de parameter in op de drempelwaarde, hoog genoeg zodat kernen worden gesegmenteerd en de achtergrond wordt genegeerd.

Om een goede waarde te bepalen, stapt u over de module en klikt u met de rechtermuisknop op de inputafbeelding om het histogram weer te geven, waarbij de piek doorgaans de achtergrond aangeeft. Verhoog de parameter, uitgaande van de achtergrondintensiteit, totdat er een goede segmentatie van de kernen is bereikt, zoals weergegeven in de outputafbeelding. Het doel van de beeldanalyse-pipeline is om cellen te identificeren die replicerende bacteriën bevatten.

Dit wordt bereikt door verschillende drempelwaarden in te stellen voor het pathogeensignaal in de nucleus, het peri-nucleaire gebied en het Voronoi-cel lichaam. Schakel pauze en weergave in voor module 15. Filter objecten, zoals eerder getoond, en druk op Run.

Stel de minimale waarde van de parameter voldoende hoog in, zodat alleen cellen met duidelijk zichtbare Brucella in de nucleus behouden blijven en alle andere worden weggefilterd. Om een goede waarde te bepalen, stapt u over de module heen en toont u het resultaatbeeld. Verhoog de waarde stapsgewijs totdat alleen cellen met duidelijk zichtbare Brucella bij de nucleus behouden blijven.

Nadat u in modules 16 en 17 heeft gefilterd op cellen met bacteriën in het perinucleaire gebied en het Voronoi-cel lichaam volgens het tekstprotocol, verlaat u de testmodus en vinkt u alle oogsymbolen naast de modules uit om er zeker van te zijn dat geen van de modules hun weergave tonen voorafgaand aan het uitvoeren van de volledige analyse. Druk tenslotte op Analyze Images om de analyse te starten. Wanneer de analyse is voltooid, inspecteert u de resulterende PNG-afbeeldingen en het CSV-spreadsheet om te controleren of de analyse over de gehele plaat betrouwbaar heeft gewerkt.

Voer de entry-assay en de infectiescore uit volgens het tekstprotocol. Deze figuur toont een voorbeeld van de beeldanalyse die wordt gebruikt om geïnfecteerde cellen in de eindpuntassay automatisch te identificeren. Kernen van HeLa-cellen gekleurd met DAPI werden geïdentificeerd.

Er werd een peri-nucleus berekend met een breedte van acht pixels rondom de nucleus. Daarnaast werd een Voronoi-celbody berekend door de nucleus met 25 pixels uit te breiden. Een cel werd als geïnfecteerd beschouwd indien het pathogensignaal in ten minste één compartiment de overeenkomstige drempelwaarde overschreed.

Brucella heeft actine-reorganisaties nodig voor een succesvolle interactie met gastheercellen. Daarom is de uitputting van ARP23 een geschikte positieve controle voor siRNA-screening. De uitputting van ARPC3 verminderde het aantal cellen met prolifererende bacteriën twee dagen na de infectie.

Vergeleken met controlecellen behandeld met scrambled siRNA. Geautomatiseerde beeldanalyse liet in deze grafiek een kwantificeerbare afname zien in de infectie van ARPC3-gedepleteerde HeLa-cellen vergeleken met controlecellen. De depletie van ARPC3 vertoonde in de entry-assay ook een reductie van de Brucella-infectie vergeleken met controlecellen.

Zoals blijkt uit het verminderde aantal intracellulaire Brucella, weergegeven in geel. Ten slotte bevestigde kwantificering van de infectie via geautomatiseerde beeldanalyse dat zowel het aantal geïnfecteerde cellen als het aantal intracellulaire bacteriën in geïnfecteerde cellen was afgenomen door de depletie van ARPC3. Zodra dit protocol onder de knie is, kunnen de resultaten van de beeldanalyse binnen anderhalve week na de start van het experiment worden verkregen.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de resultaten van de beeldanalyse zorgvuldig te beoordelen om er zeker van te zijn dat de gekozen parameters over de gehele plaat goed functioneren. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals live-cell imaging, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, bijvoorbeeld wanneer men onderzoekt hoe een bepaalde gastheerfactor interacteert met Brucella tijdens het transport.

Of hoe de uitputting van een gen de intracellulaire dynamiek van een infectie beïnvloedt. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de infectiebiologie om gastheerfactoren te onderzoeken die nodig zijn voor een Brucella-infectie in een HeLa-celassay. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u gastheerfactoren kunt identificeren die de succesvolle kolonisatie van HeLa-cellen door het intracellulaire pathogeen Brucella abortus bevorderen of juist voorkomen.

Vergeet niet dat het werken met Brucella abortus uiterst gevaarlijk kan zijn en dat de lokale regels voor biosafety strikt moeten worden nageleefd.