Name: -Microscopie gebaseerde testen voor high-throughput screening van Host factoren die betrokken zijn in Brucella Infectie van Hela cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: Leer microscopie-gebaseerde high-throughput screening om gastheerfactoren te identificeren bij Brucella-infectie van HeLa-cellen. Deze siRNA-methode versnelt onderzoek naar gastheer-pathogeen interacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies 51RT 0_126008 en 51RTP0_151029 voor het Research and Technology Development (RTD) project InfectX en TargetInfectX, respectievelijk, in het kader van SystemsX.ch, de Zwitserse Initiatief voor Systeembiologie. We danken subsidie 310030B_149886 van de Swiss National Science Foundation (SNSF). Het werk van S.H.L en A.C. werd ondersteund door het International PhD Program "Fellowships for Excellence" van het Biozentrum. Simone Muntwiler wordt erkend voor technische assistentie. We willen Dirk Bumann bedanken voor het verstrekken van pNF106 en Jean Celli voor pJC43 en pJC44.

<ol><li>Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+global+map+of+human+brucellosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The new global map of human brucellosis.</a> Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).</li>
<li>Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+the+human+pathogenic+Brucella+species+with+their+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Interactions of the human pathogenic Brucella species with their hosts.</a> Annu Rev Microbiol. 65, 523-541 (2011).</li>
<li>Guzman-Verri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPases+of+the+Rho+subfamily+are+required+for+Brucella+abortus+internalization+in+nonprofessional+phagocytes%3A+direct+activation+of+Cdc42%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">GTPases of the Rho subfamily are required for Brucella abortus internalization in nonprofessional phagocytes: direct activation of Cdc42.</a> J Biol Chem. 276, 44435-44443 (2001).</li>
<li>Starr, T., Ng, T. W., Wehrly, T. D., Knodler, L. A., Celli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+intracellular+replication+requires+trafficking+through+the+late+endosomal%2Flysosomal+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Brucella intracellular replication requires trafficking through the late endosomal/lysosomal compartment.</a> Traffic. 9, 678-694 (2008).</li>
<li>Boschiroli, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Brucella+suis+virB+operon+is+induced+intracellularly+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The Brucella suis virB operon is induced intracellularly in macrophages.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1544-1549 (2002).</li>
<li>Celli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+evades+macrophage+killing+via+VirB-dependent+sustained+interactions+with+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum.</a> J Exp Med. 198, 545-556 (2003).</li>
<li>Porte, F., Liautard, J. P., Kohler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+acidification+of+phagosomes+containing+Brucella+suis+is+essential+for+intracellular+survival+in+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages.</a> Infect Immun. 67, 4041-4047 (1999).</li>
<li>Anderson, T. D., Cheville, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+morphometric+analysis+of+Brucella+abortus-infected+trophoblasts+in+experimental+placentitis.+Bacterial+replication+occurs+in+rough+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural morphometric analysis of Brucella abortus-infected trophoblasts in experimental placentitis. Bacterial replication occurs in rough endoplasmic reticulum.</a> Am J Pathol. 124, 226-237 (1986).</li>
<li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screen+of+endoplasmic+reticulum-associated+host+factors+reveals+a+role+for+IRE1alpha+in+supporting+Brucella+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication.</a> PLoS Pathog. 4, e1000110(2008).</li>
<li>Ramo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+analysis+of+large-scale+RNAi+screens+for+pathogen+entry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Simultaneous analysis of large-scale RNAi screens for pathogen entry.</a> BMC genomics. 15, 1162(2014).</li>
<li>Kuhbacher, A., Gouin, E., Cossart, P., Pizarro-Cerda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+InlC+secretion+to+investigate+cellular+infection+by+the+bacterial+pathogen+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging InlC secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen Listeria monocytogenes.</a> J Vis Exp. , e51043(2013).</li>
<li>Kentner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+reroutes+host+cell+central+metabolism+to+obtain+high-flux+nutrient+supply+for+vigorous+intracellular+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Shigella reroutes host cell central metabolism to obtain high-flux nutrient supply for vigorous intracellular growth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9929-9934 (2014).</li>
<li>Celli, J., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+coopts+the+small+GTPase+Sar1+for+intracellular+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Brucella coopts the small GTPase Sar1 for intracellular replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1673-1678 (2005).</li>
<li>von Bargen, K., Gorvel, J. P., Salcedo, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+affairs%3A+investigating+the+Brucella+intracellular+lifestyle%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+microbiology+reviews%22%5BJournal%5D)">Internal affairs: investigating the Brucella intracellular lifestyle.</a> FEMS microbiology reviews. 36, 533-562 (2012).</li>
<li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+structure%2C+function+and+compatibility+for+CellProfiler%3A+modular+high-throughput+image+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Bacteriele pathogeen hebben talloze strategieën ontwikkeld om eukaryotische gastheercellen naar hun voordeel te manipuleren. Pathogenen die acute infecties veroorzaken vertonen vaak snelle proliferatie, wat gepaard gaat met aanzienlijke alarmering van het immuunsysteem en verlies van levensvatbaarheid van geïnfecteerde cellen. In tegenstelling daarmee, Brucella en andere pathogenen die chronische infecties veroorzaken, weten langdurige interacties binnen gastheercellen tot stand te brengen. Daarom moeten bacteri...

Brucella species zijn gram-negatieve, facultatief intracellulaire pathogenen die behoren tot de klasse van α-Proteobacteria. Ze veroorzaken abortussen en onvruchtbaarheid in hun natuurlijke gastheren zoals koeien, geiten of schapen wat resulteert in ernstige economische verliezen in endemische gebieden. Brucellose is een van de belangrijkste zoönosen wereldwijd waardoor meer dan een half miljoen nieuwe infecties bij mensen per jaar 1. Toezending aan de mens wordt meestal veroorzaakt door direct contact met besmette dieren of door inname van besmet voedsel, zoals ongepasteuriseerde melk. Symptomen van febriele ziekte aspecifieke, die problemen veroorzaakt bij de diagnose van brucellose. Indien onbehandeld, kunnen de patiënten een chronische infectie te ontwikkelen met meer ernstige symptomen zoals artritis, endocarditis en neuropathie 2. Op cellulair niveau Brucella kan fagocytische en niet-fagocytische cellen binnendringen en repliceert in een intracellulairecompartiment bekend als de Brucella-bevattende vacuole (BCV). Internalisering van bacteriën vereist actine cytoskelet herschikkingen door Rac, Rho, en directe activatie van Cdc42 3. Binnen de eukaryotische gastheercel, de BCV trafieken langs de endocytische route en ondanks de interactie met lysosomen, bacteriën erin slagen om degradatie te vermijden 4. Aanzuring van de BCV de vesiculaire ATPase moet de expressie van het bacteriële type IV secretie systeem (T4SS) 5 induceren. Men gelooft dat bacteriële effectoren afgescheiden door de T4SS essentieel zijn voor Brucella zijn replicatieve niche tonen, aangezien deletie van de T4SS 6 of remming van de vesiculaire ATPase leiden tot defecten in de inrichting van de intracellulaire niche 7. Bacteriën niet herhalen tijdens de fase van de handel tot ze bereiken een-ER afgeleid vacuolaire compartiment 8. Zodra intracellulaire proliferatie optreedt, wordt de BCV in close associatie met ER merkers zoals calnexin en glucose-6-fosfatase 6. De moleculaire mechanismen die Brucella binnenkomt cellen, vermijdt lysosomale degradatie en tenslotte repliceert in een ER-achtige compartiment blijven grotendeels onbekend. Host factoren die betrokken zijn in verschillende stappen van de infectie zijn voornamelijk geïdentificeerd door een gerichte aanpak of een kleine schaal kleine interfererende RNA-scherm (siRNA) uitgevoerd in Drosophila cellen 9. Deze zijn licht werpen op de bijdrage van individuele gastheer factoren tijdens Brucella infectie, maar we zijn nog ver verwijderd van een beter begrip van het gehele proces. Hier, protocollen die de identificatie van menselijke gastheer factoren met behulp van grootschalige RNA interferentie (RNAi) screening in combinatie met geautomatiseerde wide-field fluorescentie microscopie en geautomatiseerde beeldanalyse mogelijk worden gepresenteerd. Reverse siRNA transfectie van HeLa-cellen wordt uitgevoerd zoals described eerder 10,11 met kleine aanpassingen. Het eindpunt assay beslaat een groot deel van de levenscyclus Brucella intracellulaire behalve de uitgang en de infectie van naburige cellen. De treffers die in het eindpunt assay verder te karakteriseren, wordt een gemodificeerd protocol factoren betrokken bij vroege stappen van de infectie te identificeren gebruikt. Een Brucella abortus stam die constitutief tot expressie GFP wordt gebruikt voor het eindpunt assay waarin bacteriën mogen cellen te infecteren gedurende twee dagen. Gedurende deze tijd, bacteriën in cellen, verkeer naar de ER-afgeleide replicatieve niche en repliceren in de peri-nucleaire space. De hoge niveaus van GFP-signaal kan dan worden gebruikt op betrouwbare wijze vast afzonderlijke replicerende cellen die bacteriën bevatten. Om Brucella invoer in een high-throughput assay bestuderen, is het belangrijk om onderscheid te kunnen maken tussen de intracellulaire en extracellulaire bacteriën. De methode die hier circumv gepresenteerdeents differentiële antilichaam kleuring van intracellulaire en extracellulaire bacteriën. Het is gebaseerd op een Brucella stam die een tetracycline-induceerbare GFP in combinatie met constitutieve expressie van DsRed. De aanwezigheid van een constitutieve DsRed merker maakt de identificatie van bacteriën die in het monster aanwezig zijn. GFP expressie wordt geïnduceerd door toevoeging van de niet-toxische tetracycline analoog anhydrotetracycline (ATC) gelijktijdig met inactivering van extracellulaire bacteriën door gentamicine (Gm). Terwijl de cel-ondoordringbare antibioticum Gm doodt extracellulaire bacteriën, kunnen ATC de gastheercel in te voeren en te induceren GFP expressie selectief in intracellulaire bacteriën. Deze dubbele verslaggever maakt de robuuste scheiding van enkele intracellulaire bacteriën (GFP en DsRed signaal) van de extracellulaire bacteriën (alleen DsRed signaal) met behulp van wide-field microscopie. Om detecteerbare GFP expressie bereikt door intracellulaire Brucella gebleken dat 4 uur van inductie door atc resulteert in een betrouw-staat signaal. Vertaald inductie schema selectief GFP expressie in intracellulaire bacteriën is eerder gebruikt om intracellulaire Shigella 12 bestuderen.

<table><tbody><tr><td>Tryptic Soy Agar (TSA)</td><td>BD</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td><td>Fluka</td><td>22092</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Skim milk</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml screw cap bottle</td><td>Corning</td><td>8396</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Heat-inactivated</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.5%)</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>10x stock solution, dilute 1:10 in PBS</td></tr><tr><td>Scepte 2.0 Cell Counter</td><td>Merck Milipore</td><td>PHCC20060</td><td>Alternative cell counting devices can be used</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 384-well plate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2062</td><td></td></tr><tr><td>Peelable aluminum foil</td><td>Costar</td><td>6570</td><td></td></tr><tr><td>Reagent dispenser: "Multidrop 384 Reagent Dispenser"</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840150</td><td>Alternative reagent dispenser can be used.</td></tr><tr><td>Transfection reagent: "Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>Automated plate washer: "Plate washer ELx50-16"</td><td>BioTek</td><td>ELX5016</td><td>This plate washer contains a 16-channel manifold suitable for 384-well plates. It fits into a biosafety cabinet and has a lid covering the plate during washing which reduces the risk of aerosol production. Alternative plate washers with similar features could be used.</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td>100 &#956;g/ml solution in 100% ethanol is kept at -20 &deg;C protected from light in aluminum-foil</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Dissolve in 0.2 M HEPES buffer, pH 7.4. Store at -20 &deg;C and thaw freshly the day before use. Caution, PFA is toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>Scrambled siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10</td><td></td></tr><tr><td>Kif11 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-003317-00</td><td></td></tr><tr><td>ARPC3 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-005284-00</td><td></td></tr><tr><td>Brucella abortus 2308</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pJC43 (apHT::GFP)</td><td></td><td></td><td>Celli et al.12</td></tr><tr><td>pAC042.08 (apht::dsRed, tetO::tetR-GFP)</td><td></td><td></td><td>Construction: pJC44 4 was digested with EcoRI followed by generation of blunt ends with Klenov enzyme and subsequent digestion with SalI. TetR-GFP was amplified from pNF106 using primer prAC090 and prAC092. Following digestion with SalI, the TetR-GFP product was ligated to the digested pJC44 vector.</td></tr><tr><td>Primer prAC090</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC</td></tr><tr><td>Primer prAC092</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT TC</td></tr><tr><td>HeLa CCL-2</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Micro</td><td>Molecular Devices&nbsp;</td><td>IXM IMAGING MSCOPE</td><td>Automated cellular imaging microscope equipped with a precision motorized Z-stage. Alternative systems for automated microscopy and alternative components for hard- and software specified below can be employed.</td></tr><tr><td>High-Speed Laser Auto-Focus</td><td>Molecular Devices&nbsp;</td><td>1-2300-1037</td><td></td></tr><tr><td>CFI Super Fluor 10X objective</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>MRF00100</td><td>N.A 0.50, W.D 1.20 mm, DIC Prism: 10X, Spring loaded</td></tr><tr><td>Photometrics CoolSNAP HQ Monochrome CCD Camera</td><td>Molecular Devices&nbsp;</td><td>1-2300-1060</td><td>1,392 x 1,040 imaging pixels, 6.45 x 6.45 &micro;m pixels, 12 bits digitization</td></tr><tr><td>MetaXpress software</td><td>Molecular Devices&nbsp;</td><td>9500-0100</td><td></td></tr><tr><td>LUI-Spectra-X-7</td><td>Lumencor</td><td>SPECTRA X V-XXX-YZ</td><td>Light engine. The following light sources are used: violet (DAPI), cyan (GFP), green/yellow (RFP)</td></tr><tr><td>Single Band Exciter for DAPI</td><td>Semrock</td><td>FF01-377/50-25</td><td></td></tr><tr><td>Single Band Emitter for DAPI</td><td>Semrock</td><td>FF02-447/60-25</td><td></td></tr><tr><td>Single Band Dichroic for DAPI</td><td>Semrock</td><td>FF409-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Single Band Exciter for GFP</td><td>Semrock</td><td>FF02-472/30-25</td><td></td></tr><tr><td>Single Band Emitter for GFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-520/35-25</td><td></td></tr><tr><td>Single Band Dichroic for GFP</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Single Band Exciter for RFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-562/40-25</td><td></td></tr><tr><td>Single Band Emitter for RFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-624/40-25</td><td></td></tr><tr><td>Single Band Dichroic for RFP</td><td>Semrock</td><td>FF593-Di03-25x36</td><td></td></tr></tbody></table>

-microscopie gebaseerde testen voor high-throughput screening van host factoren die betrokken zijn in<em&gt; brucella</em&gt; infectie van hela cellen

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella soorten zijn facultatief intracellulaire pathogenen dat dieren besmetten als hun natuurlijke gastheren. Overdracht op de mens wordt meestal veroorzaakt door direct contact met besmette dieren of door inname van besmet voedsel en kan leiden tot ernstige chronische infecties. Brucella kunnen binnenvallen professionele en niet-professionele fagocytische cellen en repliceert binnen endoplasmatisch reticulum (ER) afgeleide vacuolen. De gastheer factoren die nodig zijn voor Brucella binnenkomst in gastheercellen, het vermijden van lysosomale degradatie en replicatie in de ER-achtige compartiment blijven grotendeels onbekend. Hier beschrijven we twee assays gastheerfactoren betrokken bij Brucella binnenkomst en replicatie in HeLa cellen te identificeren. De protocollen beschrijven het gebruik van RNA interferentie, terwijl alternatieve screeningmethoden worden toegepast. De assays zijn gebaseerd op de detectie van fluorescent gelabelde bacteriën fluorescent gelabelde gastheercellen middels geautomatiseerdewide-microscopie. De fluorescerende beelden worden geanalyseerd met behulp van een gestandaardiseerde beeldanalyse pijpleiding CellProfiler die eencellige gebaseerde infectie scoring mogelijk maakt. In het eindpunt assay wordt intracellulaire replicatie gemeten twee dagen na infectie. Dit maakt het mogelijk bacteriën om verkeer naar hun replicatieve niche waar de proliferatie wordt geïnitieerd ongeveer 12 uur na bacteriële binnenkomst. Brucella die met succes hebben gevestigd een intracellulaire niche zal dus sterk hebben zich verspreid in gastheercellen. Sinds intracellulaire bacteriën sterk individuele extracellulaire of intracellulaire niet-replicatieve bacteriën overtreffen, kan een stam die constitutief GFP worden gebruikt. De sterke GFP signaal wordt vervolgens gebruikt om geïnfecteerde cellen te identificeren. In tegenstelling, voor de toevoeging test is het belangrijk om onderscheid te maken tussen de intracellulaire en extracellulaire bacteriën. Hier wordt een stam codeert voor een tetracycline-induceerbare GFP gebruikt. Inductievan GFP met gelijktijdige inactivering van extracellulaire bacteriën door gentamicine maakt het onderscheid tussen intracellulaire en extracellulaire bacteriën op basis van het GFP-signaal, slechts intracellulaire bacteriën te kunnen GFP expressie. Hierdoor kan de robuuste detectie van enkele intracellulaire bacteriën voor intracellulaire proliferatie wordt geïnitieerd.

Figuur 1A toont een voorbeeld van beeldanalyse gebruikt om geïnfecteerde cellen automatisch te identificeren op het eindpunt assay. Kernen van HeLa cellen gekleurd met DAPI geïdentificeerd, een peri-kern van 8 pixels breed rondom de kern, en een Voronoi cellichaam door verlenging van de kern van 25 pixels berekend. Omdat bacteriën voornamelijk prolifereren in de peri-nucleaire ruimte, de GFP intensiteit in dit gebied van de cel is de meest robuuste meting te maken tussen...

Twee assays voor microscopie-gebaseerd high-throughput screening van gastheerfactoren betrokken bij Brucella -infectie worden beschreven. De entry assay detecteert gastheerfactoren die nodig zijn voor Brucella entry en de endpoint assay degenen die nodig zijn voor intracellulaire replicatie. Hoewel toepasbaar voor alternatieve benaderingen, wordt siRNA screening in HeLa-cellen gebruikt om de protocollen te illustreren.

-Microscopie gebaseerde testen voor high-throughput screening van Host factoren die betrokken zijn in<em&gt; Brucella</em&gt; Infectie van Hela cellen

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Het algemene doel van deze high-throughput assay op basis van microscopie is het identificeren van gastheerfactoren die betrokken zijn bij de Brucella-infectie van HeLa-cellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van gastheer-pathogeeninteracties, zoals het identificeren van gastheerproteïnen die de kolonisatie door het intracellulaire pathogeen Brucella bevorderen of juist voorkomen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de semi-geautomatiseerde workflow, van het veterinaire laboratorium tot de beeldanalyse, het gebruik van robots en efficiënte high-throughput experimenten mogelijk maakt.Zo kan deze methode inzicht bieden in interacties tussen Brucella en de gastheer met behulp van siRNA-screens. Het grootste deel van het protocol kan worden toegepast op andere screeningsstrategieën, zoals siRNA-bibliotheken.Na het kweken van HeLa-cellen en het voorbereiden van screeningplaten met siRNAs volgens het tekstprotocol, wordt een zwarte 384-wellplaat ontdooid door centrifugatie bij 300 ×g en kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Bereid het transfectiemedium met behulp van DMEM zonder FCS op kamertemperatuur. Verdun het transfectiereagens 1 op 200 en meng dit voorzichtig voor gebruik.Voeg met een reagensdispenser 25 µL transfectiemedium toe aan elke well van de 384-wells plaat en meng de oplossingen door de plaat heen en weer te bewegen. Incubeer de plaat gedurende één uur bij kamertemperatuur om de vorming van siRNA-transfectiereagenscomplexen mogelijk te maken. Bereid ondertussen de HeLa-cellen voor door het cultuurmedium af te zuigen en 2,5 mL 0,05%trypsine EDTA in PBS toe te voegen om de subconfluente cellen in een kolf van 75 cm² één keer te wassen.Voeg vervolgens 1,5 milliliters verse trypsine toe en plaats de kolf bij 37 graden Celsius gedurende twee tot drie minuten totdat de cellen afronden. Gebruik 10 milliliters voorverwarmde dmem 60%FCS om de cellen te resuspenderen. Gebruik vervolgens een automatische celteller om de cellen te tellen voordat u een celsuspensie van 10.000 cellen per milliliter in dmem met 16%FCS bereidt.Voeg 50 µL celisuspensie toe aan elke well met transfectiereagens, zodat er 500 cellen per well aanwezig zijn. Beweeg de plaat heen en weer om de cellen gelijkmatig te verdelen.Laat de plaat vervolgens vijf tot 10 minuten bij kamertemperatuur staan zodat de cellen kunnen bezinken. Gebruik parafilm om de plaat af te dichten. Incubeer de plaat vervolgens in een bevochtigde incubator op een voorverwarmde aluminium plaat bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 72 uur.Het werken met het pathogeen B.abortus uit risicoklasse 3 is gevaarlijk; de lokale regelgeving voor biologische veiligheid moet worden nageleefd, wat onder meer het dragen van een beschermend overallpak, beschermende handschoenen, een masker en een veiligheidsbril omvat. Inoculeer één dag vóór de infectie de eerder bepaalde hoeveelheid B.abortus-startcultuur in 50 milliliter TSB KM-medium in een schroefdopfles van 250 milliliter.Gebruik parafilm om de fles af te sluiten en kweek de bacteriën gedurende de nacht bij 37 °C en 100 RPM op een schudmachine tot een optische dichtheid 600 van 0,8 tot 1,1. Meet de optische dichtheid 600 van de bacteriële cultuur. Bereid vervolgens het infectiemedium voor door de bacteriële cultuur te verdunnen in DMEM met 10% FCS om de gewenste multiplicity of infection te bereiken.Of, MOI. Vervang met een automatische platenwasser het transfectiemedium door 50 µL infectiemedium. Plaats de plaat in de zuiventhouder van de centrifuge in de zuurkast en centrifugeer de 384-wells plaat bij 400 ×g en 4 °C gedurende 20 minuten.Gebruik vervolgens parafilm om de plaat af te dichten en incubeer deze op een voorverwarmde aluminium plaat bij 37 °C en 5% CO2 gedurende vier uur. Na de incubatie worden de cellen met een automatische plaatwasser gewassen met DMEM met 10% FCS, bevattend 100 µg/ml dentrimycine of GM, om extracellulaire bacteriën te inactiveren. Gebruik daarna opnieuw parafilm om de plaat af te dichten en plaats deze terug op de voorverwarmde aluminium plaat in de incubator voor nog eens 40 uur voor de eindpuntanalyse.Om de cellen te fixeren, worden de wells eerst gewassen met PBS. Vervang vervolgens de PBS door 50 microliters 3.7% PFA in PBS bij pH 7.4.Incubeer de cellen vervolgens 20 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik na de incubatie 50 µL PBS om het fixatiemedium te vervangen. Om de monsters te kleuren met de automatische platenwasser, begint u met het gebruik van 50 µL 1% Triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten om de cellen te permeabiliseren.Nadat de cellen drie keer zijn gewassen met PBS, voegt u 50 µL PBS toe met 1 µg/mL DAPI en incubeert u dit gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen vervolgens drie keer met PBS voordat u ze tegen licht beschermt. Plaats de plaat vervolgens in de automatische microscoop.Stel de microscoopinstellingen in. Selecteer het 10-X objectief. Selecteer vervolgens het plaatformaat dat overeenkomt met de 384-well plaat.Veramel gegevens van negen locaties per putje. Selecteer Enable laser-based focusing. Stel vervolgens de focus in op de plaat en de bodem van het putje.Stel vervolgens de eerste verworven well in als de initiële well voor het vinden van het monster en alle locaties voor de site autofocus. Pas daarna handmatig de Z-offset voor de focus aan voor het DAPI-kanaal. Druk vervolgens op Find Sample om de focus op de bodem van de well in te stellen.Gebruik de AutoExposure-functie om een goede schatting van de belichtingstijd te verkrijgen. Corrigeer de belichtingstijd voor het DAPI-kanaal handmatig om een breed dynamisch bereik met een lage overbelichting te garanderen. Gebruik deze belichtingstijd om verschillende locaties over de gehele plaat af te beelden.Pas de belichtingstijd handmatig aan totdat de helderste pixels ongeveer 80% van de maximale helderheid over de locaties bereiken. Herhaal de stappen voor het instellen van de focus en de belichtingstijd dienovereenkomstig voor alle andere kanalen. Start vervolgens de acquisitie van de volledige plaat.Gebruik voor de eindpuntanalyse de DAPI- en GFP-kanalen om de volledige plaat te beelden. Om een beeldanalyse uit te voeren op gekleurde cellen in de eindpuntanalyse, selecteert u na het berekenen van een shading-model, volgens het tekstprotocol onder View output settings, de invoermap met de beelden en een uitvoermap voor de resultaten. Definieer vervolgens de tekst die de beelden gemeen hebben en laad de shading-modellen.Klik op Start test mode en zorg ervoor dat de pauze- en weergave-instellingen voor alle modules zijn uitgeschakeld. Schakel de pauze- en weergave-instelling in voor module negen ImageMath. Het ingeschakelde pauzesymbool verschijnt in het geel.De ingeschakelde weergavefunctie verschijnt als een open oog. Klik vervolgens op Run om de analyse uit te voeren tot en met module negen. Pas in module negen de parameter multiply the second image by aan naar een waarde die het DAPI-signaal in Brucella onderdrukt zonder de kernen te onderdrukken.Om de waarden voor de module te testen, drukt u op Step. Klik met de rechtermuisknop op de nieuw geopende afbeelding en stel het beeldcontrast in op log normalized. Ga vervolgens stap voor stap terug naar module negen.Pas de parameter vermenigvuldig de tweede afbeelding met aan en voer de module opnieuw uit totdat het Brucella-signaal volledig is onderdrukt, terwijl gelijktijdig zwarte gebieden die wijzen op oversubtractie worden geminimaliseerd. Het vinden van goede parameters voor bepaalde modules vereist een geleidelijke optimalisatie van de parameters. Het is essentieel om de modules herhaaldelijk uit te voeren, verschillende waarden te proberen en het effect op het weergegeven resultaat te observeren.Schakel pauze en weergave in voor module 10. Identificeer de primaire objecten. Stel de ondergrens van de parameter in op de drempelwaarde, hoog genoeg zodat kernen worden gesegmenteerd en de achtergrond wordt genegeerd.Om een goede waarde te bepalen, stapt u over de module en klikt u met de rechtermuisknop op de inputafbeelding om het histogram weer te geven, waarbij de piek doorgaans de achtergrond aangeeft. Verhoog de parameter, uitgaande van de achtergrondintensiteit, totdat er een goede segmentatie van de kernen is bereikt, zoals weergegeven in de outputafbeelding. Het doel van de beeldanalyse-pipeline is om cellen te identificeren die replicerende bacteriën bevatten.Dit wordt bereikt door verschillende drempelwaarden in te stellen voor het pathogeensignaal in de nucleus, het peri-nucleaire gebied en het Voronoi-cel lichaam. Schakel pauze en weergave in voor module 15. Filter objecten, zoals eerder getoond, en druk op Run.Stel de minimale waarde van de parameter voldoende hoog in, zodat alleen cellen met duidelijk zichtbare Brucella in de nucleus behouden blijven en alle andere worden weggefilterd. Om een goede waarde te bepalen, stapt u over de module heen en toont u het resultaatbeeld. Verhoog de waarde stapsgewijs totdat alleen cellen met duidelijk zichtbare Brucella bij de nucleus behouden blijven.Nadat u in modules 16 en 17 heeft gefilterd op cellen met bacteriën in het perinucleaire gebied en het Voronoi-cel lichaam volgens het tekstprotocol, verlaat u de testmodus en vinkt u alle oogsymbolen naast de modules uit om er zeker van te zijn dat geen van de modules hun weergave tonen voorafgaand aan het uitvoeren van de volledige analyse. Druk tenslotte op Analyze Images om de analyse te starten. Wanneer de analyse is voltooid, inspecteert u de resulterende PNG-afbeeldingen en het CSV-spreadsheet om te controleren of de analyse over de gehele plaat betrouwbaar heeft gewerkt.Voer de entry-assay en de infectiescore uit volgens het tekstprotocol. Deze figuur toont een voorbeeld van de beeldanalyse die wordt gebruikt om geïnfecteerde cellen in de eindpuntassay automatisch te identificeren. Kernen van HeLa-cellen gekleurd met DAPI werden geïdentificeerd.Er werd een peri-nucleus berekend met een breedte van acht pixels rondom de nucleus. Daarnaast werd een Voronoi-celbody berekend door de nucleus met 25 pixels uit te breiden. Een cel werd als geïnfecteerd beschouwd indien het pathogensignaal in ten minste één compartiment de overeenkomstige drempelwaarde overschreed.Brucella heeft actine-reorganisaties nodig voor een succesvolle interactie met gastheercellen. Daarom is de uitputting van ARP23 een geschikte positieve controle voor siRNA-screening. De uitputting van ARPC3 verminderde het aantal cellen met prolifererende bacteriën twee dagen na de infectie.Vergeleken met controlecellen behandeld met scrambled siRNA. Geautomatiseerde beeldanalyse liet in deze grafiek een kwantificeerbare afname zien in de infectie van ARPC3-gedepleteerde HeLa-cellen vergeleken met controlecellen. De depletie van ARPC3 vertoonde in de entry-assay ook een reductie van de Brucella-infectie vergeleken met controlecellen.Zoals blijkt uit het verminderde aantal intracellulaire Brucella, weergegeven in geel. Ten slotte bevestigde kwantificering van de infectie via geautomatiseerde beeldanalyse dat zowel het aantal geïnfecteerde cellen als het aantal intracellulaire bacteriën in geïnfecteerde cellen was afgenomen door de depletie van ARPC3. Zodra dit protocol onder de knie is, kunnen de resultaten van de beeldanalyse binnen anderhalve week na de start van het experiment worden verkregen.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de resultaten van de beeldanalyse zorgvuldig te beoordelen om er zeker van te zijn dat de gekozen parameters over de gehele plaat goed functioneren. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals live-cell imaging, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, bijvoorbeeld wanneer men onderzoekt hoe een bepaalde gastheerfactor interacteert met Brucella tijdens het transport.Of hoe de uitputting van een gen de intracellulaire dynamiek van een infectie beïnvloedt. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de infectiebiologie om gastheerfactoren te onderzoeken die nodig zijn voor een Brucella-infectie in een HeLa-celassay. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u gastheerfactoren kunt identificeren die de succesvolle kolonisatie van HeLa-cellen door het intracellulaire pathogeen Brucella abortus bevorderen of juist voorkomen.Vergeet niet dat het werken met Brucella abortus uiterst gevaarlijk kan zijn en dat de lokale regels voor biosafety strikt moeten worden nageleefd.

microscopy-based-assays-for-high-throughput-screening-host-factors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Casanova, A., et al. Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates high-throughput imaging of Brucella abortus infection in epithelial cells with siRNA-mediated STING knockdown to investigate the role of cytosolic DNA sensing in intracellular bacterial replication and host innate immune response.

High-Throughput Imaging of Intracellular Brucella abortus Infection in Host Epithelial Cells

We beschrijven een werkwijze voor het volgen van de endomembraan scheuren opgewekt door de intracellulaire...

Single Cell Metingen van vacuole Rupture Veroorzaakt door intracellulaire pathogenen

Deze techniek verschaft een werkwijze te oogsten, normaliseren en kwantificeren intracellulaire groei van bacteriële pathogenen die vooraf gekweekt in natuurlijke protozoa gastheercellen voor infecties van zoogdiercellen. Deze methode kan worden aangepast aan een grote verscheidenheid van gastheercellen voor de priming podium en doelcel types tegemoet.

Handelbaar Mammalian Cell Infecties met Protozoan-geprimed Bacteriën

We beschrijven een correlatieve microscopie methode die high-speed 3D levende cellen fluorescerend licht microscopie en hoge-resolutie cryo-electron tomografie combineert. We demonstreren het vermogen van de correlatieve wijze dynamische beeldvorming, kleine HIV-1 deeltjes interactie met gastheer HeLa cellen.

Correlatieve microscopie voor 3D Structural Analysis van Dynamic Interactions

Hier beschrijven we een fenotypische test die van toepassing is op de high-throughput/high-content schermen van small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemische verbinding en Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. Deze methode is gebaseerd op de detectie van fluorescerend gelabelde Mycobacterium tuberculosis in fluorescerend gelabelde gastheercel met behulp van geautomatiseerde confocale microscopie.

Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud

Coxiella burnetii is een obligaat intracellulaire Gram-negatieve bacterie die verantwoordelijk is voor de zoönose Q-koorts. Hier beschrijven we werkwijzen voor het genereren van Coxiella fluorescent transposon mutanten en de geautomatiseerde identificatie en analyse van de verkregen internalisatie, replicatie en cytotoxische fenotypes.

Generatie en Multi-fenotypische High-inhoud Screening van<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Er werd een doorvoer, real-time test ontwikkeld om gelijktijdig (1) eukaryotische cel-penetrante antibiotica te identificeren die zich richten op een intracellulair bacterieel pathogeen, en (2) de cytotoxiciteit van eukaryotische cellen te beoordelen. Een variatie op dezelfde technologie werd vervolgens gecombineerd met digitale doseertechnologie om gemakkelijke, hoge resolutie, dosis-respons en twee- en driedimensionale synergiestudies mogelijk te maken.

High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit

We presenteren in de huidige studie een nieuwe fluorescentie gebaseerde assay middels lymfocyten afkomstig van een transgene muis. Deze test is geschikt voor high-throughput screening (HTS) van kleine moleculen begiftigd met de hoedanigheid van het remmen of bevorderen van lymfocyt activering.

Een fluorescentie gebaseerde lymfocyt Assay geschikt voor high-throughput screening van kleine moleculen

We hebben een multi goed formaat polyacrylamide gebaseerde assay voor het effect van extracellulaire matrix stijfheid op bacteriële infectie van Adherente cellen indringende ontwikkeld. Deze test is compatibel met stroom cytometry immunokleuring en tractie kracht microscopie, waardoor voor kwantitatieve metingen van de biomechanische interacties tussen cellen, hun extracellulaire matrix en pathogene bacteriën.

Een multi goed formaat Polyacrylamide gebaseerde Assay voor het bestuderen van het Effect van extracellulaire Matrix stijfheid op de bacteriële infectie van Adherente cellen

Deze studie ontwikkelde een test voor high-throughput screening tegen Mycobacterium abscessus met een recent gecreëerde dubbele reporterstam, waarbij fluorescentie en luminescentie worden gebruikt om de levensvatbaarheid van bacteriën snel te beoordelen. Dit protocol zal relevant zijn voor onderzoekers die nieuwe geneesmiddelen willen screenen op deze resistente bacterie.

Ontwikkeling van tests voor high-throughput medicijnscreening tegen mycobacteriën

Leer microscopie-gebaseerde high-throughput screening om gastheerfactoren te identificeren bij Brucella-infectie van HeLa-cellen. Deze siRNA-methode versnelt onderzoek naar gastheer-pathogeen interacties.

-Microscopie gebaseerde testen voor high-throughput screening van Host factoren die betrokken zijn in Brucella Infectie van Hela cellen (Video) | JoVE Journal

-Microscopie gebaseerde testen voor high-throughput screening van Host factoren die betrokken zijn in

Meer video's verkennen