-Microscopie gebaseerde testen voor high-throughput screening van Host factoren die betrokken zijn in Brucella Infectie van Hela cellen
5 augustus 2016
Twee assays voor microscopie-gebaseerd high-throughput screening van gastheerfactoren betrokken bij Brucella -infectie worden beschreven. De entry assay detecteert gastheerfactoren die nodig zijn voor Brucella entry en de endpoint assay degenen die nodig zijn voor intracellulaire replicatie. Hoewel toepasbaar voor alternatieve benaderingen, wordt siRNA screening in HeLa-cellen gebruikt om de protocollen te illustreren.
Het algemene doel van deze high-throughput microscopie-gebaseerde test is om gastheerfactoren te identificeren die betrokken zijn bij Brucella-infectie van HeLa-cellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het veld van gastheer-pathogeen-interactie, zoals het identificeren van gastheereiwitten die kolonisatie door de intracellulaire pathogeen Brucella bevorderen of voorkomen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de semi-geautomatiseerde workflow van het veterinaire laboratorium tot beeldafbeeldanalyse robots en efficiënte high-throughputs toelaat om experimenten te creëren.
Deze methode kan dus inzicht geven in Brucella-gastheerinteracties door middel van siRNA-screens. Het grootste deel van het protocol kan worden toegepast op andere screeningstrategieën. Bijvoorbeeld, of siRNA-bibliotheken.
Na het kweken van HeLa-cellen en het voorbereiden van screeningsplaten met siRNA's volgens het tekstprotocol, ontdooit u een zwarte 384-wellsplaat door centrifugeren bij 300 keer G en kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Bereid transfectiemedium voor door kamertemperatuur dmem zonder FCS te gebruiken. Verdun het transfectiereagens een op 200 en meng voor gebruik voorzichtig.
Gebruik een reagentiadispenser om 25 microliter transfectiemedium toe te voegen aan elk putje van de 384-wellsplaat en meng de oplossingen door de plaat heen en weer te bewegen. Incubeer de plaat een uur op kamertemperatuur om de vorming van het siRNA-transfectiereagenscomplex mogelijk te maken. Bereid intussen HeLa-cellen voor door het kweekmedium af te zuigen en 2,5 milliliter 0,05% trypsin EDTA in PBS toe te voegen om de subconfluente cellen van een 75 vierkante centimeter fles eenmaal te wassen.
Voeg vervolgens 1,5 milliliter vers trypsin toe en breng de fles over naar 37 graden Celsius gedurende twee tot drie minuten tot de cellen rond worden. Gebruik 10 milliliter voorverwarmd dmem 60%FCS om de cellen te resuspenderen. Gebruik vervolgens een geautomatiseerde celteller om de cellen te tellen voordat u een celsuspensie van 10.000 cellen per milliliter in dmem met 16%FCS bereidt.
Voeg 50 microliter celsuspensie toe aan elk putje van transfectiereagens. Resulteert in 500 cellen per putje. Beweeg de plaat heen en weer om de cellen gelijkmatig te verdelen.
Laat de plaat vervolgens vijf tot tien minuten op kamertemperatuur staan om de cellen te laten bezinken. Gebruik parafilm om de plaat te verzegelen. En incubeer het in een vochtige incubator op een voorverwarmde aluminium plaat bij 37 graden Celsius met 5%C02 gedurende 72 uur.
Het werken met het klasse drie pathogeen B.abortus is gevaarlijk en lokale bioveiligheidsvoorschriften moeten worden gevolgd, wat onder meer het dragen van een beschermend overallpak, beschermende handschoenen, masker en veiligheidsbril inhoudt. Een dag voorafgaand aan infectie, inoculeer de eerder bepaalde hoeveelheid B.abortus-startercultuur in 50 milliliter TSB KM-medium. In een 250 milliliter fles met schroefdop.
Gebruik parafilm om de fles te verzegelen en laat bacteriën overnacht groeien bij 37 graden Celsius en 100 RPM op een schudler tot optische dichtheid 600,8 tot 1,1. Meet de optische dichtheid 600 van de bacteriecultuur. En bereid het infectiemedium voor door de bacteriecultuur in dmem 10%FCS te verdunnen om de gewenste infectiemultiplicitieit te bereiken.
Of MOI. Gebruik een geautomatiseerde platenwasser om het transfectiemedium te vervangen door 50 microliter infectiemedium. Binnen de kap brengt u de plaat over naar de centrifugekooien en centrifugeert u de 384-wellsplaat bij 400 keer G en vier graden Celsius gedurende 20 minuten.
Gebruik vervolgens parafilm om de plaat te verzegelen en incubeer het op een voorverwarmde aluminium plaat bij 37 graden Celsius en 5%C02 gedurende vier uur. Na de incubatie met de geautomatiseerde platenwasser, gebruikt u dmem met 10%FCS bevattend 100 microgram per milliliter dentrimysen of GM om de cellen te wassen om extracellulaire bacteriën te inactiveren. Gebruik vervolgens parafilm om de plaat te verzegelen en plaats deze terug op de voorverwarmde aluminium plaat in de incubator voor nog eens 40 uur voor de eindpunttesten.
Om de cellen te fixeren, gebruikt u eerst PBS om de putjes te wassen. Vervolgens vervangt u de PBS met 50 microliter 3,7%PFA. In 2 bij pH 7,4.
En incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Na de incubatie, gebruikt u 50 microliter PBS om het fixatiemedium te vervangen. Om de monsters te kleuren met de geautomatiseerde platenwasser, begint u met het gebruik van 50 microliter 1%Triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten om de cellen te permeabiliseren.
Na het wassen van de cellen met PBS, voegt u 50 microliter PBS met een microgram per milliliter DAPI toe en incubeert u bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Gebruik vervolgens PBS om de cellen drie keer te wassen voordat u ze tegen licht beschermt. Breng de plaat over naar de geautomatiseerde microscoop.
Stel de microscoopparameters in. Selecteer de 10-X subjectief. Selecteer vervolgens het platenformaat dat overeenkomt met de 384-wellsplaat.
Verwerf negen locaties per putje. Selecteer Laser-based focusing inschakelen. En focus op plaat en putbodem.
Stel vervolgens de eerste verworven put in als de initiële put voor het vinden van het monster en alle locaties voor site autofocus. Vervolgens, voor het DAPI-kanaal, pas u handmatig de Z-offset aan voor de focus. Druk vervolgens op Sample vinden om de focus op de putbodem te stellen.
Gebruik de AutoExposure-functie om een goede schatting te krijgen voor de belichtingstijd. Corrigeer handmatig de belichtingstijd voor het DAPI-kanaal om een brede dynamische bereik met lage overbelichting te garanderen. Gebruik deze belichtingstijd om verschillende locaties in de plaat te fotograferen.
En pas de belichtingstijd handmatig aan tot de helderste pixels ongeveer 80%van de maximale
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft twee assays voor microscopie-gebaseerde high-throughput screening om gastheerfactoren te identificeren die betrokken zijn bij Brucella-infectie van HeLa-cellen. De entry-assay richt zich op factoren die nodig zijn voor Brucella-entry, terwijl de endpoint-assay degenen beoordeelt die noodzakelijk zijn voor intracellulaire replicatie.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Celbiologie
- Pathogeen-Gastheer Interacties
Achtergrond
- Brucella is een intracellulair pathogeen dat de gastheer immuunresponsen kan ontwijken.
- Het begrijpen van gastheerfactoren kan helpen bij het ontwikkelen van therapeutische strategieën.
- High-throughput screening maakt een efficiënte identificatie van deze factoren mogelijk.
- HeLa-cellen dienen als model voor het bestuderen van Brucella-infectie.
Doel van het onderzoek
- Om gastheereiwitten te identificeren die Brucella-kolonisatie bevorderen of remmen.
- Om inzichten te geven in gastheer-pathogeen interacties.
- Om het gebruik van siRNA-screening in deze context te illustreren.
Gebruikte methoden
- Microscopie-gebaseerde high-throughput screening assays.
- siRNA-screening in HeLa-cellen.
- Geautomatiseerde workflows voor efficiënte dataverzameling.
- Beeldanalyse om de betrokkenheid van gastheerfactoren te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van belangrijke gastheerfactoren betrokken bij Brucella-entry en replicatie.
- Demonstratie van de effectiviteit van siRNA-screening.
- Mogelijke toepassing van de methoden op andere screeningstrategieën.
- Inzichten in de mechanismen van Brucella-gastheer interacties.
Conclusies
- De assays bieden een robuust kader voor het bestuderen van Brucella-infecties.
- High-throughput methoden kunnen de ontdekking van gastheerfactoren versnellen.
- Bevindingen kunnen toekomstige therapeutische benaderingen tegen Brucella informeren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This microscopy-based high-throughput screening approach enables systematic identification of host factors that modulate Brucella infection in HeLa cells, providing a scalable platform for target validation in intracellular pathogen research. By combining siRNA screening with automated image analysis, the method supports mechanistic de-risking of host-directed therapeutic strategies and improves predictive confidence in early discovery workflows. The assay outputs quantitative infection phenotypes that can inform go/no-go decisions in antimicrobial target prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of host pathways that promote or prevent Brucella entry and replication, supporting target hypothesis testing.
- Operational Value: Uses siRNA-mediated knockdown to functionally validate host factors involved in pathogen colonization.
- Scientific Value: Provides phenotypic readouts that clarify mechanisms of intracellular trafficking and niche establishment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, single-cell infection scoring via fluorescent pathogen detection in labeled host cells.
- Operational Value: Employs automated wide-field microscopy and CellProfiler pipeline for reproducible, high-throughput data acquisition.
- Scientific Value: Distinguishes intracellular from extracellular bacteria using tetracycline-inducible GFP and gentamicin protection for accurate entry assay quantification.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Identifies host factors required for Brucella avoidance of lysosomal degradation and ER-derived vacuole replication, informing mechanistic de-risking.
- Operational Value: Supports continuity from hit identification to pathway validation in disease-relevant systems.
- Scientific Value: Enables assessment of genetic perturbations on intracellular bacterial load, supporting target confidence scoring.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, linking target validation through phenotypic screening to preclinical follow-up by providing quantitative, replication-competent infection readouts in a scalable format.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven screening for host proteins that modulate Brucella internalization and intracellular survival.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized infection scoring and Z’-compatible dynamic range in 384-well format.
- Analytics: Produces quantitative output metrics including infected cell count and intracellular bacterial burden per cell for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery-phase host factor hits to preclinical validation via defined infection phenotypes in ER-replicative niches.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular microscopy-based platform adaptable to other intracellular pathogens via pathogen labeling and host cell substitution.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in host-pathogen interaction studies through direct visualization of infection compartments.
- Operational Value: Enables semi-automated workflow from transfection to image analysis, increasing throughput and reducing manual variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by providing reproducible, phenotype-based target validation data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of host-directed targets by quantifying impact on bacterial entry and replication.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, siRNA transfection, and biosafety level 3 practices for Brucella abortus handling.
- Dependent on automated microscopy infrastructure, image analysis software (CellProfiler), and plate handling robotics.
- Necessitates standardization of infection parameters (MOI, incubation times) and fluorescence compensation across channels.
- Involves optimization of segmentation thresholds for nuclei, pathogen signal, and subcellular compartments to ensure accurate single-cell scoring.
- Limited by the need for fluorescent pathogen strains and potential signal interference in high-density infection conditions.
