Name: Natte Chemie en Peptide immobilisatie op Polytetrafluoroethyleen voor betere Cel-adhesie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Leer een op natte chemie gebaseerde oppervlaktebehandeling van PTFE voor verbeterde biocompatibiliteit. Deze methode vereist minimaal materiaal en is breed toepasbaar in biomaterialenonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de hulp van Walter Scholdei (Max-Planck-Institut für Polymerforschung, Mainz, Duitsland) graag erkennen.

1. Bereiding van natriumnaftalenide activeren Solution en Oppervlakte Activering Opmerking: Voer reacties in een goed geventileerde zuurkast. Volg de algemene regels voor het omgaan met licht ontvlambare oplosmiddelen en corrosieve metalen zoals metallisch natrium. Naftaleen heeft een zeer onaangename geur (mottenballen), zelfs in zeer kleine hoeveelheden! Tenzij anders aangegeven reacties worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. Natriumazide is zeer giftig! THF (99,9%, zie Lijst van Materials) werd opgeslagen meer dan ongeveer 20% (in volume) moleculaire zeef. Distilleren THF met een merkbare watergehalte over natrium. De vorming van natriumnaftalenide treedt niet op als kleine hoeveelheden water aanwezig zijn. <ol><li> Aan een oplossing van 1,4 g (10,9 mmol) naftaleen in 20 ml tetrahydrofuran (THF, gedroogd op 3 A moleculaire zeef), voeg 0,25 g (10,9 mmol) natriummetaal in een 100 ml glazen fles schroefdop uitgerust met een PTFE- beklede magnetische roerstaaf. Opmerking: Dissolutie kan sterk worden verbeterd door het snijden van het natrium in kleine stukjes en bescheiden verwarmen (35-40 ° C). De uiteindelijke oplossing heeft een donkere, ietwat groenachtige kleur en kunnen onder strikt droge omstandigheden worden bewaard. </li><li> Pons PTFE schijven met een diameter van 12 mm van 0,5 mm dik folie materiaal. Mark de ene kant (bijvoorbeeld met behulp van een brief stempel punch) en schoon met iso-propanol. </li><li> Incubeer PTFE-monsters afzonderlijk in de activerende oplossing (stap 1.1) voor 1-2 min met behulp van een tang. Opmerking: De kleurverandering van wit tot donkerbruin geeft aan een succesvolle behandeling. </li><li> Vervolgens tweemaal met THF en spoel na met iso-propanol. Opmerking: De naphthalenide oplossing is uitgeput wanneer de kleur verandert in een waterige lichtbruin. Ongebruikte naphthalenide oplossing (eventueel metallisch natrium) worden ontleed door langzaam toevoegen iso-propanol voorafgaand aan verwijdering. </li><li> Oxideren behandelde monsters in waterstofperoxide (30%) bevattende 20% (w / v) trichloorazijnzuur gedurende 3 uur. Wassenmet water en droog. Het oppervlak heeft nu een lichte bruinachtig uiterlijk. Opmerking: Activering en oxidatie resulteert in een drastisch toegenomen bevochtigbaarheid van het oppervlak. Deze bevinding werd in detail onderzocht eerder 14. </li><li> Behandel geoxideerd schijven met 50% (v / v) hexamethyleendiisocyanaat (HMDI) in droog THF gedurende 2 uur, spoel met THF en laten drogen. </li><li> Hydrolyseren isocyanaat lager monsters in water gedurende 2-3 uur en droog. Opmerking: De uiteindelijke aminogefunctionaliseerde PTFE oppervlak is veel stabieler dan de isocyanaat-dragende monsters en is compatibel met vele standaard verknopingsmiddelen voor verdere koppeling. </li></ol> 2. Peptide Immobilisatie <ol><li> Bereid een oplossing van 20% (v / v) diethyleenglycol diglycidyl ether (di-epoxide) in 50 mM carbonaatbuffer, pH 9. </li><li> Plaats de geamineerd schijven met de gemarkeerde zijde naar boven individueel in een 24 well plaat en voeg 1,5 ml van het epoxide oplossing. Zorgen voor een volledige dekking van de monsters. Incubeer gedurende 2 uur en was tweemalen met water en eenmaal met carbonaatbuffer. </li><li> Voeg 50 ul van een 0,5 mg / ml peptide (bijvoorbeeld REDV) in 50 mM carbonaatbuffer, pH 9 met 0,01% NaN3, onderaan naar individuele putjes van een nieuwe plaat met 24 putjes en plaats voorzichtig het epoxy-gefunctionaliseerde schijven ondersteboven -down (dwz gemarkeerde zijde naar beneden) op de daling van het peptide-oplossing. Zorg ervoor dat de ruimte tussen de bodem van de put en de PTFE schijf volledig bevochtigd door capillaire werking. </li><li> Incubeer in een vochtige ruimte (bijvoorbeeld elke lasbare kunststof doos met een strakke sluitdeksel) met bevochtigde atmosfeer (door nat tissuepapier op de bodem) gedurende ten minste 3 uur of overnacht. Opmerking: ondanks de REDV motief kan worden geacht goed gekarakteriseerd, gecodeerde of omgekeerde aminozuursequentie kan worden opgenomen als extra negatieve controle. </li><li> Was drie keer met water en steriliseer in 50% isopropanol / water gedurende 30 min. Voorafgaand aan het zaaien, rins cele de monsters in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). </li></ol> 3. Cel zaaien <ol><li> Grow HUVECs met behulp van standaard celcultuur procedures 17,18. </li><li> Plaats de peptide-geconjugeerde monsters met gemodificeerde naar boven in een 24 well platen. Gebruik onbehandelde PTFE-schijven als een controle. </li><li> Zaad 5 x 10 4 HUVEC in 2 ml medium per putje en incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C en 5% CO2 in een incubator. </li><li> Verwijder de schijven, spoel zorgvuldig losse cellen te verwijderen en over te dragen aan een nieuwe plaat met 24 putjes. Voeg 2 ml vers medium en incubeer gedurende de gewenste periode (bijvoorbeeld, 24 uur, 1 w, enz.). Verander medium om de twee dagen. </li><li> Bereid een voorraadoplossing van 1 mg / ml calceïne-AM in dimethylsulfoxide (DMSO). </li><li> Na kweken van de cellen te verwijderen het medium, wassen met PBS en voeg PBS dat 1 ui / ml calceïne-AM kleuring (bijvoorbeeld 1 pi van een voorraadoplossing per ml PBS). Schud voorzichtig en incubate bij 37 ° C gedurende 45 minuten in het donker. </li><li> Was met PBS en onmiddellijk micrografische op een fluorescentiemicroscoop uitgerust met standaard FITC filters (Ex 488 nm, Em 515 nm). Gebruik 100-voudige vergroting. Voer drievoud van ongemodificeerde evenals behandelde monsters. </li><li> Behulp ImageJ software bepaalt het gebied gekoloniseerd door de cellen. U kunt ook handmatig tellen van de cellen of gebruik ImageJ. Beide methoden zullen soortgelijke informatie over de aanhechting en groei van cellen op de respectievelijke oppervlakken geven. </li></ol>

<ol><li>Doctor, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+various+prosthetic+materials+and+newer+meshes+for+hernia+repairs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Minim.+Access+Surg%22%5BJournal%5D)">Evaluation of various prosthetic materials and newer meshes for hernia repairs.</a> J. Minim. Access Surg. 2, 110-116 (2006).</li>
<li>Zaghal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+totally+implantable+venous+access+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Surg.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Update on totally implantable venous access devices.</a> Surg. Oncol. 21, 207-215 (2012).</li>
<li>Niu, G., Sapoznik, E., Soker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Opin.+Biol.+Th%22%5BJournal%5D)">Bioengineered blood vessels.</a> Exp. Opin. Biol. Th. 14, 403-410 (2014).</li>
<li>Wang, M. -J., Tsai, W. -B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+M-J+%22Biomaterials+in+Blood-Contacting+Devices%3A+Complications+and+Solutions%22">Biomaterials in Blood-Contacting Devices: Complications and Solutions</a>. , Nova Science Publishers. 1 ed (2010).</li>
<li>de Mel, A., Jell, G., Stevens, M. M., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofunctionalization+of+biomaterials+for+accelerated+in+situ+endothelialization%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Biofunctionalization of biomaterials for accelerated in situ endothelialization: a review.</a> Biomacromolecules. 9, 2969-2979 (2008).</li>
<li>Zdrahala, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+caliber+vascular+grafts.+Part+I%3A+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomat.+Appl%22%5BJournal%5D)">Small caliber vascular grafts. Part I: state of the art.</a> J. Biomat. Appl. 10, 309-329 (1996).</li>
<li>Cleary, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+tissue+engineering%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Vascular tissue engineering: the next generation.</a> Trends Mol. Med. 18, 394-404 (2012).</li>
<li>Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGD+and+other+recognition+sequences+for+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Dev.+Bi%22%5BJournal%5D)">RGD and other recognition sequences for integrins.</a> Annu. Rev. Dev. Bi. 12, 697-715 (1996).</li>
<li>Lei, Y., Remy, M., Labrugere, C., Durrieu, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+immobilization+on+polyethylene+terephthalate+surfaces+to+study+specific+endothelial+cell+adhesion%2C+spreading+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mat.+Sci.+Mater.+M%22%5BJournal%5D)">Peptide immobilization on polyethylene terephthalate surfaces to study specific endothelial cell adhesion, spreading and migration.</a> J. Mat. Sci. Mater. M. 23, 2761-2772 (2012).</li>
<li>Gabriel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+RGD+Modification+of+the+Inner+Pore+Surface+of+Polycaprolactone+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomat.+Sci..+Polym.+E%22%5BJournal%5D)">Covalent RGD Modification of the Inner Pore Surface of Polycaprolactone Scaffolds.</a> J. Biomat. Sci.. Polym. E. 23, 941-953 (2012).</li>
<li>Ceylan, H., Tekinay, A. B., Guler, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+adhesion+and+growth+of+vascular+endothelial+cells+on+bioactive+peptide+nanofiber+functionalized+stainless+steel+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Selective adhesion and growth of vascular endothelial cells on bioactive peptide nanofiber functionalized stainless steel surface.</a> Biomaterials. 32, 8797-8805 (2011).</li>
<li>Chlupac, J., Filova, E., Bacakova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessel+replacement%3A+50+years+of+development+and+tissue+engineering+paradigms+in+vascular+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Res.+%2F+Academia+Scientiarum+Bohemoslovaca%22%5BJournal%5D)">Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery.</a> Physiol. Res. / Academia Scientiarum Bohemoslovaca. 58, Suppl 2 119-139 (2009).</li>
<li>Wise, S. G., Waterhouse, A., Kondyurin, A., Bilek, M. M., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-based+biofunctionalization+of+vascular+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+UK%22%5BJournal%5D)">Plasma-based biofunctionalization of vascular implants.</a> Nanomedicine UK. 7, 1907-1916 (2012).</li>
<li>Mikulikova, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+microarrays+on+photochemically+modified+polytetrafluoroethylene%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cell microarrays on photochemically modified polytetrafluoroethylene.</a> Biomaterials. 26, 5572-5580 (2005).</li>
<li>Gabriel, M., Dahm, M., Vahl, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wet-chemical+approach+for+the+cell-adhesive+modification+of+polytetrafluoroethylene%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Mater%22%5BJournal%5D)">Wet-chemical approach for the cell-adhesive modification of polytetrafluoroethylene.</a> Biomed. Mater. 6, 035007(2011).</li>
<li>Gabriel, M., van Nieuw Amerongen, G. P., Van Hinsbergh, V. W., Amerongen, A. V., Zentner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+grafting+of+RGD-motif-containing+peptide+on+the+surface+of+polycaprolactone+films%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomat.+Sci..+Polym.+E%22%5BJournal%5D)">Direct grafting of RGD-motif-containing peptide on the surface of polycaprolactone films.</a> J. Biomat. Sci.. Polym. E. 17, 567-577 (2006).</li>
<li>Larsen, C. C., Kligman, F., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+RGD+fluorosurfactant+polymer+modification+of+ePTFE+on+endothelial+cell+adhesion%2C+growth%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of RGD fluorosurfactant polymer modification of ePTFE on endothelial cell adhesion, growth, and function.</a> Biomaterials. 27, 4846-4855 (2006).</li>
<li>Gabriel, M., Nazmi, K., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V., Zentner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+LL-37-grafted+titanium+surfaces+with+bactericidal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Preparation of LL-37-grafted titanium surfaces with bactericidal activity.</a> Bioconjugate Chem. 17, 548-550 (2006).</li>
<li>Lotz, A., Heller, M., Brieger, J., Gabriel, M., Förch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+Plasma+Polymerized+Thin+Films+and+Attachment+of+Biomolecules+to+Influence+HUVEC-Cell+Adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Plasma+Process+Polym%22%5BJournal%5D)">Derivatization of Plasma Polymerized Thin Films and Attachment of Biomolecules to Influence HUVEC-Cell Adhesion.</a> Plasma Process Polym. 9, 10-16 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De gedetailleerde beschrijving van oppervlaktemodificatie protocol PTFE bestaat uit opeenvolgende stappen beginnen met de verwijdering van fluor uit het polymeerskelet zoals weergegeven in figuur 6. Hierdoor wordt een laag gevormd die een overvloedige hoeveelheid geconjugeerde koolstof-koolstof dubbele bindingen bevat in overeenstemming met de donkere bruine kleur die ontwikkeld op naphthalenide behandeling. Standard oxidatie met zure waterstofperoxide levert een gehydroxyleerd oppervlak vergezeld van v...

Verschillende polymeren gebruikt in de geneeskunde die zijn goedgekeurd voor enige tijd niet verbeterde biocompatibiliteit, dat wil zeggen, gebrek aan cel-kleverigheid, inductie van fibrotische inkapseling en trombogeniciteit vertonen, om een paar te noemen. Interacties tussen het biomateriaal en het biologische systeem voornamelijk plaatsvindt aan het oppervlak van het implantaat. Dientengevolge is onderzoek gericht op oppervlaktemodificatie teneinde passende eigenschappen te creëren voor een gewenste toepassing terwijl de bulk van het materiaal beïnvloed. Polytetrafluorethyleen (PTFE) als een fysiologisch inert polymeer wordt gebruikt in vele medische gebieden zoals hernia chirurgisch gaas 1, medische poorten 2 en, belangrijker, vasculaire transplantaten 3. Vooral in bloed contact situaties de hydrofobe aard van PTFE zorgt onspecifieke adsorptie van plasmacomponenten en bijgevolg bloedplaatjesadhesie, vaak resulterend in thrombotic gebeurtenissen en occlusie van het implantaat 4. Bovendien PTFE, zoals de meeste polymeren, ondersteunt celadhesie en dekking die zou een wenselijke eigenschap voor de vorming van een gunstig laag van endotheelcellen (EC) op de binnenzijde (luminaal) oppervlak van het vasculaire transplantaat 5 induceren. Een biomimetische endotheel wordt verwacht dat veel van de functies van de natuurlijke equivalent, met name de antitrombogene eigenschappen 6 voldoen. Een algemene biomimetische modificatie strategie is gebaseerd op het concept van uitsluitend begiftigt het materiaal cel-kleverigheid terwijl de materialen bulkeigenschappen onaangetast. Bovendien kunnen bloedplaatjesadhesie worden verminderd door reeds adhesie (aangroeiwerende) kenmerken 7. Verschillende peptiden - meestal afgeleid van eiwitten van de extracellulaire matrix - beschreven die sterk verbeteren celadhesie door binding aan cellulaire receptoren, die behoren tot de klasse van integrinen 8. het zijnst bekend voorbeeld in dit verband is het peptide Arg-Gly-Asp (RGD) die samenwerkt met de meeste celtypen. Andere aminozuursequenties worden herkend door integrinen exclusief tot expressie op specifieke cellen. Bijvoorbeeld, Arg-Glu-Asp-Val (REDV) en Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) gevonden te binden aan EC aan een specifieke wijze 9. Covalente immobilisatie van dergelijke peptiden heeft op een overvloed aan inherent niet-zelfklevende materialen waaronder metalen en polymeren 10,11 uitgevoerd. Poreus PTFE, nauwkeuriger geëxpandeerd PTFE (ePTFE) - samen met polyethyleentereftalaat (PET) - is de belangrijkste grondstof voor de productie van vasculaire transplantaten 12. Vastgesteld fysische technieken voor geschikte behandelingen, zoals plasma modificatie 13 of fotochemische methoden 14 worden bemoeilijkt doordat poreuze en / of buisvormige structuren zijn niet gemakkelijk te behandelen in de poriën of het lumen resp. natchemischeop PTFE is een moeilijke taak, omdat de zeer inerte aard van het fluorin bevattend polymeer dat de meeste chemische aanvallen 15 weerstaat. In dit artikel beschrijven we een relatief gemakkelijke werkwijze voor covalente modificatie strategie. Aangepast van een procedure om PTFE bondable te maken, werden functionele groepen die zijn gemaakt op de materialen oppervlak die dienen als ankerpunten voor verdere vervoeging van biologisch actieve moleculen.

<table><tbody><tr><td>PTFE folie 0,5 mm</td><td>Cadillac Plastic&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>REDV peptide</td><td>Genecust</td><td>n/a</td><td>custom synthese >95% zuiverheid</td></tr><tr><td>iso-propanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34965</td><td></td></tr><tr><td>tetrahydrofuraan (THF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>moleculaire zeef 3 &Aring;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208574</td><td></td></tr><tr><td>natriummetaal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>483745</td><td></td></tr><tr><td>fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>naftaleen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>147141</td><td></td></tr><tr><td>waterstofperoxide 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95321</td><td></td></tr><tr><td>trichloorazijnzuur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6399&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>diethyleenglycol diglycidylether</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17741</td><td></td></tr><tr><td>hexamethyleendi-isocyanaat (HMDI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52650</td><td></td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56496</td><td></td></tr><tr><td>natriumbicarbonaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>natriumazied</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>24 well platen</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>662 160</td><td></td></tr><tr><td>ATR-FTIR spectrofotometer Nicolet Magna-IR 850</td><td>&nbsp;Nicolet</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>fluorescentiemicroscoop Olympus X-70</td><td>Olympus</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>endotheelcellen uit de navelstrengslagader (HUVECs)</td><td>Lonza</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>ePTFE vaattransplantaat</td><td>Gore</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

natte chemie en peptide immobilisatie op polytetrafluoroethyleen voor betere cel-adhesie

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Begiftigt materialen oppervlak met cell-hechtende eigenschappen is een gemeenschappelijke strategie in biomaterialen onderzoek en tissue engineering. Dit is vooral interessant voor reeds goedgekeurde polymeren die een langdurige toepassing in de geneeskunde omdat deze materialen zijn goed gekarakteriseerd en wetgeving die samenhangen met de introductie van nieuw gesynthetiseerde polymeren kunnen worden vermeden. Polytetrafluorethyleen (PTFE) is een van de meest gebruikte materialen voor het vervaardigen van vasculaire enten, maar mist de polymere cel adhesiebevorderende kenmerken. Endothelialisatie, dwz dat volledige dekking van de enten binnenoppervlak met een confluente laag van endotheelcellen beschouwd essentieel voor de optimale prestaties, vooral door het beperken trombogeniciteit van de kunstmatige interface. Deze studie onderzoekt de groei van endotheliale cellen op peptide-gemodificeerde PTFE en vergelijkt deze resultaten met die verkregen met ongemodificeerde substraat. Koppeling met deendotheelcel lijm peptide Arg-Glu-Asp-Val (REDV) wordt uitgevoerd via activatie van de fluorin polymeer met het reagens natriumnaftalenide, gevolgd door achtereenvolgende conjugatie stappen. Celkweek wordt bewerkstelligd middels humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) en uitstekende celgroei on-peptide geïmmobiliseerd materiaal wordt aangetoond gedurende een periode van twee weken.

De resultaten van de cruciale chemische reactiestappen werden gevolgd met IR-spectroscopie (figuur 1). De eerste activering met natriumnaftalenide genereert dubbele bindingen - en in mindere mate - OH-functionaliteiten. Het signaal dat C = C bindingen verdwijnen bij oxidatie, waardoor een oppervlak dat bijna uitsluitend hydroxylgroepen. Analyse van de verdere standaard vervoeging stappen worden hier niet weergegeven. De kleur verandert door activatie en oxidatie in overe...

Cel-adhesiviteit is essentieel voor veel benaderingen in biomateriaalonderzoek en weefselengineering. Er wordt een stapsgewijze techniek gepresenteerd die gebruik maakt van natte chemie voor de oppervlaktemodificatie van het belangrijke polymeer PTFE met peptiden.

Natte Chemie en Peptide immobilisatie op Polytetrafluoroethyleen voor betere Cel-adhesie

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Het algemene doel van deze procedure is het bieden van een op natte chemie gebaseerde oppervlaktebehandeling voor het fluorcarbonpolymeer polytetrafluoretheen, of PTFE. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de biomaterialen, zoals de vraag hoe de biocompatibiliteit van medische polymeren kan worden verbeterd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er slechts een minimum aan apparatuur vereist is en dat de methode over het algemeen breder toepasbaar is in vergelijking met andere methoden.De bereiding van de natriumnaftalenide-oplossing vereist strikt watervrije omstandigheden. Snijd 0,25 gram natriummetaal in kleine stukjes om de oplosbaarheid te vergroten. Voeg het natriummetaal toe aan een oplossing van 1,4 gram naftaleen in 20 milliliter tetrahydrofuran in een glazen fles van 100 milliliter met schroefdop, voorzien van een PTFE-gecoate magnetische roerstaaf.Verwarm de oplossing licht om de oplosbaarheid verder te verbeteren. De uiteindelijke oplossing heeft een donkere, lichtgroene kleur en kan onder strikt droge omstandigheden worden bewaard. Pons PTFE-schijven met een diameter van 12 millimeter uit foliemateriaal met een dikte van 0,5 millimeter.Markeer één zijde en reinig deze met iso-propanol. Incubeer de PTFE-monsters individueel gedurende één tot twee minuten in de activeringsoplossing met behulp van een pincet. De kleurverandering van wit naar donkerbruin geeft aan dat de behandeling is geslaagd.Spoel vervolgens twee keer na met THF en daarna met isopropanol. Oxideer de behandelde monsters gedurende drie uur in 30% waterstofperoxide, bevattend 20% trichloorazijnzuur. Was met water en droog.Het oppervlak heeft nu een lichtbruine kleur. Behandel de geoxideerde schijven gedurende twee uur met 50% HMDI in droog THF. Spoel ze vervolgens af met THF en laat ze drogen.Hydroliseer tot slot de isocyanaatbevattende monsters gedurende twee tot drie uur in water en droog deze. Plaats elke geamineerde schijf met de gemarkeerde zijde naar boven in de individuele putjes van een 24-wells plaat. Voeg 1,5 milliliters van de epoxide-oplossing toe, waarbij volledige bedekking van de monsters wordt gewaarborgd.Na twee uur incuberen wordt er twee keer gewassen met water en eenmaal met carbonaatbuffer. Voeg aan de bodem van afzonderlijke putjes van een nieuwe 24-wells plaat 50 µL van 0,5 mg/mL peptide en 50 mM carbonaatbuffer, pH 9, met 0,1% natriumazide toe. Plaats de epoxy-gefunctionaliseerde schijfjes voorzichtig ondersteboven op de druppels van de peptideoplossing.Zorg ervoor dat de ruimte tussen de bodem van een well en de PTFE-schijf volledig is bevochtigd door capillaire werking. Incubeer de plaat gedurende ten minste drie uur, of overnacht in een vochtige kamer met een bevochtigde atmosfeer, wat wordt bereikt door nat vloeipapier op de bodem van de kamer te plaatsen. Was na incubatie drie keer met water en steriliseer in 50% iso-propanol water gedurende ten minste 30 minuten.Voorafgaand aan het zaaien van de cellen, zoals beschreven in het tekstprotocol, worden de monsters gespoeld met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing. De resultaten van de cruciale chemische reactiestappen werden gemonitord via infraroodspectroscopie. De initiële activering met natriumnaftalamide genereert dubbele bindingen en, in geringere mate, hydroxylfunctionaliteiten.Het signaal dat duidt op koolstofdubbele bindingen verdwijnt bij oxidatie, wat resulteert in een oppervlak dat bijna uitsluitend hydroxylgroepen bevat. De kleurveranderingen als gevolg van activering en oxidatie komen overeen met de verwachte chemie. Geconjugeerde dubbele bindingssystemen worden verwacht bruinachtig te zijn, en het verlies van deze dubbele bindingssystemen leidt tot een lichtere kleur.Daarnaast is het mogelijke effect van activering en oxidatie op de oppervlaktemorfologie onderzocht met behulp van scanning-elektronenmicroscopie. Er werd vrijwel geen nadelig effect van de behandeling waargenomen. Immobilisatie van het adhesiepeptide voor endotheelcellen, arginine, glutamine, aspartinezuur valine, op het polymeeroppervlak ondersteunt de groei van endotheelcellen.Terwijl er op onbehandeld materiaal vrijwel geen celadhesie en proliferatie plaatsvindt, ondersteunt de modificatie de kolonisatie gedurende een periode van twee weken sterk. Ter illustratie voor een klinische toepassing werd de modificatie op identieke wijze uitgevoerd op origineel materiaal van een commercieel verkrijgbaar transplantaat gemaakt van expanded PTFE, met soortgelijke resultaten over een periode van één week. Eenmaal onder de knie, neemt deze techniek ongeveer 12 uur in beslag.Houd er rekening mee dat deze procedure specifiek is voor PTFE. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe PTFE oppervlakte-geactiveerd kan worden en hoe peptiden in volgende stappen kunnen worden geïmmobiliseerd. Door deze procedure te volgen, kunnen andere moleculen, zoals polysachariden of cord-factoren, op een soortgelijke wijze worden geïmmobiliseerd.Houd er rekening mee dat het werken met zeer toxische en corrosieve chemicaliën gevaarlijk is en dat de standaard voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen.

wet-chemistry-peptide-immobilization-on-polytetrafluoroethylene-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Deze video is een snelle, efficiënte methode om poly (ethyleenglycol) methacrylaat illustreren, waardoor keten polymerisaties en hydrogel synthese. Het zal laten zien hoe je methacrylamide functionaliteiten dezelfde wijze te introduceren in peptiden, detail gemeenschappelijke analytische methoden om functionalisering efficiëntie te beoordelen, suggesties voor het oplossen van problemen en geavanceerde aanpassingen, en tonen typische hydrogel karakterisering technieken.

Microgolven Functionalisering van poly (ethyleenglycol) en On-hars Peptiden voor gebruik in Chain Polymerisaties en Hydrogel Vorming

Nanoschalige zee-eilandoppervlakken, samengesteld uit thermoresponsieve blokcopolymeren, werden vervaardigd door de Langmuir-Schaefer-methode voor het controleren van spontane celhechting en loslating. Zowel de bereiding van het oppervlak als de hechting en loslating van cellen op het oppervlak werden gevisualiseerd.

Voorbereiding van de thermoresponsieve nanogestructureerde oppervlakken voor Tissue Engineering

Gratis oplossing capillaire elektroforese is een snelle, goedkope en robuuste analytische methode die het kwantitatieve bewaken van chemische reacties in real time mogelijk maakt. Het nut ervan voor snelle, gemakkelijke en nauwkeurige analyse wordt hier aangetoond door middel van analyse van covalente peptide-grafting op chitosanfilms voor verbeterde celadhesie.

Capillaire elektroforese Monitor Peptide Enten op chitosan films in Real Time

Verschillende methoden voor het manipuleren van driedimensionale architectuur in hydrogels op basis van eiwitten zijn hier geëvalueerd met betrekking tot de eigenschappen van het materiaal. De macroporeuze netwerken zijn matiemaatschappij met een peptide cel-lijm, en hun haalbaarheid in celkweek wordt geëvalueerd met behulp van twee verschillende model cellijnen.

Gemakkelijke manipulatie van platforms in op basis van eiwitten Hydrogels voor cel cultuur toepassingen

Bij deze methode, wij gebruiken photopolymerization en klik op chemie technieken proteïne of peptide om patronen te creëren op het oppervlak van polyethyleenglycol (PEG) hydrogels, verstrekken geïmmobiliseerd bioactieve signalen voor de studie van cellulaire reacties in vitro .

Patronen van bioactieve eiwitten of peptiden op Hydrogel Fotochemie voor biologische toepassingen gebruiken

Hier gepresenteerd is een protocol voor het toevoegen van peptide CD47 (pepCD47) aan metalen stents met behulp van polybisfosfonaat chemie. Functionalisatie van metalen stents met behulp van pepCD47 voorkomt de bevestiging en activering van ontstekingscellen waardoor hun biocompatibiliteit wordt verbeterd.

Mitigatie van Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilisatie

Dit protocol presenteert de experimentele procedures om de adhesievoetafdruktest uit te voeren om de adhesiegebeurtenissen tijdens snelle celrollende adhesie in beeld te brengen.

Beeldvorming van moleculaire adhesie in celrollen door adhesievoetafdruktest

Near-UV-lithografie en tractiekrachtmicroscopie worden gecombineerd om cellulaire krachten op microgepatterde hydrogels te meten. De gerichte licht-geïnduceerde afgifte van enkele cellen maakt een groot aantal metingen op hetzelfde monster mogelijk.

Controle van celhechting met behulp van Hydrogel-patroontechnieken voor toepassingen in tractiekrachtmicroscopie

Dit protocol beschrijft de synthese van cyclische celdoordringende peptiden met aromatische dwarsverbanden en de evaluatie van hun permeabiliteit over biologische barrières heen.

Constructie van cyclische celdoordringende peptiden voor verbeterde penetratie van biologische barrières

Dit protocol heeft tot doel biofunctionele zelfassemblerende peptiden te evalueren voor celadhesie, organoïde morfologie en genexpressie door immunokleuring. We zullen een colorectale kankercellijn gebruiken om een kosteneffectieve manier te bieden om organoïden te verkrijgen voor intensieve tests.

Fabricage en karakterisering van organoïden van colorectale kanker uit de SW1222-cellijn in ultrakorte zelfassemblerende peptidematrix

Dit protocol presenteert drie snelle en eenvoudige bereidingsmethoden die omgevingsomstandigheden gebruiken om de zelfassemblage van peptiden tot hydrogels op gang te brengen. Daarnaast wordt de karakterisering van peptidehydrogels beschreven, wat aantoont dat mechanisch stabiele peptidehydrogels onder deze eenvoudige omstandigheden kunnen worden gevormd.

Bereiding van mechanisch stabiele, zelf geassembleerde peptiden, hydrogels

Leer een op natte chemie gebaseerde oppervlaktebehandeling van PTFE voor verbeterde biocompatibiliteit. Deze methode vereist minimaal materiaal en is breed toepasbaar in biomaterialenonderzoek.

Natte Chemie en Peptide immobilisatie op Polytetrafluoroethyleen voor betere Cel-adhesie

Meer video's verkennen