Name: Protocol voor de directe omzetting van muizen embryonale fibroblasten in Trofoblast Stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Leer hoe muizen embryonale fibroblasten direct worden omgezet in trofoblast stamcellen via tijdelijke overexpressie van transcriptiefactoren. Deze methode biedt inzicht in embryonale en extra-embryonale differentiatieroutes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Alle muizen experimenten werden uitgevoerd volgens de Duitse wet van de bescherming van dieren en in overeenstemming met de goedkeuring van de lokale institutionele Animal Care commissies (Landesamt fuer Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Noord-Rijnland-Westfalen [goedkeuring ID-nummer: AZ 84-02.04.2013 .A428]). 1. Mediavoorbereiding <ol><li> Bereid 293T medium Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), 10% (v / v) FBS, L-glutamine (2 mM), natriumpyruvaat (1 mM), penicilline / streptomycine (1x). </li><li> Bereid MEF medium: DMEM, 10% (v / v) FBS, L-glutamine (2 mM), 1 x niet-essentiële aminozuren, penicilline / streptomycine (1x). </li><li> Bereid TS medium (w / o FGF4 / heparine): Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) 1640, 20% (v / v) FBS (stam celkweekniveau), penicilline / streptomycine (1x), L-glutamine (2 mM ), natriumpyruvaat (1 mM), 2-mercaptoethanol (0,1 mM). </li><li> Bereid TS medium met FGF4 / heparine (TS + F4H): RPMI 1640, 20% (v / v) FBS (stamcelcultuur kwaliteit), penicilline / streptomycine (1x), L-glutamine (2 mM), natriumpyruvaat (1 mM), 2-mercaptoethanol (0,1 mM), 25 ng / ml FGF4, 1 ug / ml heparine. Noot: FGF4 en heparine toegevoegd direct in het medium onmiddellijk vóór gebruik. </li><li> Bereid TS-CM met FGF4 / heparine (TS-CM + F4H): 70%-MEF geconditioneerd TS medium + 30% vers bereide TS medium + 25 ng / ml FGF4, 1 ug / ml heparine. Noot: FGF4 en heparine toegevoegd direct in het medium onmiddellijk vóór gebruik. </li><li> Bereid transfectiemedium: Uitgebreid DMEM, 2% (v / v) FBS (stam celkweekniveau), L-glutamine (2 mM), penicilline / streptomycine (1x). </li><li> Bereid Virus-productiemedium: Uitgebreid DMEM, 5% (v / v) FBS (stam celkweekniveau), L-glutamine (2 mM), penicilline / streptomycine (1x). </li></ol> 2. Muizen Embryonale fibroblast Afleiding <ol><li> Set getimede paringen behulp gew 129S2SV vrouwtjes en homozygote mannelijke R26 :: rtTA muizen (stam naam, B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor TM1 (rtTA* M2) Jae / J 7). Op E13.5 offer muizen door cervicale dislocatie en isoleren primaire muriene embryonale fibroblasten (MEF) volgens standaardprotocollen 8. Daarna plaat cellen uit een embryo op een 150 mm schotel in MEF media. </li><li> Zodra primaire MEF culturen confluentie bereiken op 150 mm schalen, wassen cellen tweemaal met 10 ml PBS en voeg 4 ml 0,05% trypsine / EDTA-oplossing. Incubeer gerechten voor 3-4 min in de incubator bij 37 ° C. </li><li> Na incubatie controleren of cellen losgemaakt van de schaal met behulp van een omgekeerde microscoop (met een 10x lens). Voeg 5 ml van MEF media om trypsine te stoppen en het verzamelen van celsuspensie in een 50 ml conische buis. </li><li> Pool celsuspensie van verschillende gerechten en het verzamelen in een 50 ml conische buis. Centrifugeer celsuspensie gedurende 3 minuten bij 200 xg en 10 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer celpellet in FBS dat 10% (v / v) dimethylsulfoxide. Freeze MEF in porties voor verder gebruik. Let op: U kunt ook gebruik maken van wilde type primaire MEF; echter een extra lentivirale vector die rtTA moet samen worden getransduceerd met de andere lentivirale vectoren (bijvoorbeeld met de FUdeltaGW-rtTA plasmide beschreven door Maherali et al. 9). </li><li> Voorbereiding van de MEF-geconditioneerde TS medium Opmerking: Voorafgaand aan de conversie experimenten, heeft MEF-geconditioneerd (CM) TS media te worden voorbereid, die nodig is voor de subcultuur van de individuele ITSC lijnen (in hoofdstuk 6 beschreven). <ol><li> Plaat 1 x 10 7 mitotisch geïnactiveerd MEF per 150 mm schaal in MEF medium van de gewenste aantal gerechten. Inactiveer MEF door γ-straling met een dosis van 9 Gy. Opmerking: De opbrengst per 150 mm schaal ongeveer 60 ml CM. </li><li> De dag na plating, aspireren en gooi MEF medium en voeg 20 ml vers bereide TS medium (zonder FGF4 / heparine) op elke schaal van mitotisch geïnactiveerd MEFs en vaat terug in de incubator bij 37 ° C. </li><li> na incubatieTS medium gedurende drie dagen op mitotisch geïnactiveerd MEFs, laat middelmatige 50 ml conische buizen. Filter medium door een 0,2 um filter en ga verder met 2.6.4. CM vervangen door 20 ml vers medium TS voor de bereiding van een verdere partij CM. Noot: mitotisch geïnactiveerd MEFs kan voor CM bereiding tot drie keer. </li><li> Aliquot 35 ml gefiltreerd CM in 50 ml conische buizen en bewaar bij -20 ° C totdat het nodig is. Na ontdooien, voeg 15 ml vers bereide TS medium om en opslag tot 70% TS-CM verkrijgen bij 4 ° C gedurende maximaal één maand. </li></ol></li></ol> 3. Lentivirale Vector Production in 293T-cellen Opmerking: Alle stappen worden uitgevoerd in het laboratorium de ruimte in licentie gegeven aan Biosafety Level 2 uitgevoerd. <ol><li> Voorafgaand aan de conversie experimenten, voor te bereiden lentivirale vectoren voor de doxycycline (DOX) afhankelijke overexpressie van Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2 en mCherry. Voor elk lentivirus, co-transfecteren 293T cellen met behulp van derespectieve lentivirale transfervector samen met een verpakking plasmide en een VSV-G tot expressie enveloppe plasmide (voor plasmide informatie vindt u in de Materials Table). Opmerking: Voor nuttige informatie met betrekking tot het virus de productie te verwijzen naar Gavrilescu et al. 10. Hoewel het beschrijft retrovirus productie, algemene opmerkingen met betrekking tot de kwaliteit van de 293T-cellen en plasmide-DNA zijn waar voor lentivirus productie ook. LET OP: Passende veiligheidsmaatregelen moeten worden genomen, bij het werken met lentivirale vectoren en werk moet worden uitgevoerd in een Biosafety Level 2 faciliteit. </li><li> Coat vijf 100 mm schalen met poly-L-lysine (100 ug / ml) oplossing voor de schotels met 5 ml oplossing en voorzichtig wiegen coatingoplossing gelijkmatig te verdelen. De schaaltjes terug in de incubator bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Na 30 min aspireren bekledingsoplossing en spoel gerechten eenmaal met PBS. </li><li> Plaat 7 x 10 6 293T-cellen per schaaltje in 10 ml 293T-cel media, swirl gerechten gelijkmatig verdelen cellen en plaats schotels terug in de incubator bij 37 ° C. </li><li> De volgende ochtend, vervang groeimedium met 5 ml transfectie medium. Voeg 6 pi van een voorraad 1000x chloroquine-oplossing (25 mM) en vaat terug in de incubator bij 37 ° C. </li><li> Ondertussen bereiden transfectie mengsel: <ol><li> Voor elke lentivirale vector bereiden twee 5 ml reageerbuisjes, aangeduid met A en B. </li><li> Voeg 600 ul van 2x HEPES gebufferde zoutoplossing (HBS) aan de buis A. </li><li> In buis B mix 61,5 gl CaCl2-oplossing (2 M), met 18,5 ug lentivector DNA en 9,25 ug psPAX2 en 9,25 ug pMD2.G. Stel het volume tot 600 ul met steriele cultuur klasse H 2 O. </li><li> Voeg oplossing van buis B druppelsgewijs aan de buis Een tijdje vortexen. Incubeer transfectie mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Voeg transfectie mengsel zeer zorgvuldig druppelsgewijs aan de voorbereide 293T cellen op de 100 mm gerecht. EENN a 5-6 uur verwijderen medium en te vervangen door 10 ml virus-productiemedium. De vaat terug in de incubator bij 37 ° C. Let op: Wees voorzichtig bij het verwijderen en vervangen van medium sinds 293T-cellen gemakkelijk los te maken van het gerecht. Mediumverversing 5-6 uur na transfectie cruciaal, omdat langdurige blootstelling aan chloroquine is giftig voor de cellen. </li><li> De volgende ochtend, verwijder voorzichtig en gooi medium en te vervangen door 7 ml virus-productie medium. </li><li> De volgende morgen de oogst van de eerste partij van virus-bevattend medium. Zuig medium en het verzamelen in een 15 ml conische buis. Nogmaals, 7 ml virus-productiemedium op de cellen. Store virus-bevattend medium in de koelkast tot de tweede partij de volgende dag wordt geoogst. </li><li> De volgende morgen zuigen de tweede partij van virus-bevattend medium toe te voegen aan de 15 ml conische buis met de eerste partij. 293T cellen kunnen nu worden verwijderd. Filter virus-bevattend medium door een 0,45 urn surfactant-free celluloseacetaat -membrane filter. Aliquot gefiltreerd virus-bevattend medium en bewaar bij -80 ° C voor verder gebruik. Noot: De virusproductie kan ook worden uitgevoerd in 6 putjes. De schaal van volumes en mobiele nummers dienovereenkomstig. </li></ol> 4. fibroblast Transductie met 4 factoren en mCherry Controle Vector Opmerking: Alle stappen worden uitgevoerd in een Biosafety Level 2 faciliteit uitgevoerd. <ol><li> Voor een schematische weergave van de experimentele outline zie figuur 1. Dooi een aliquot van primaire MEFs rtTA-plaat en 3,33 x 10 5 cellen per putje van een 6-putjes in een totaal volume van 2 ml van MEF media. Maak minstens 3 putten en label ze met 4 factoren (4F), mCherry en controle. Let op: U kunt wild type MEFs worden gebruikt, wanneer een rtTA uitdrukken lentivirale vector op de lentivector cocktail wordt toegevoegd tijdens stap 4.2. </li><li> De volgende dag nadat de cellen volledig hersteld van cryopreinstandhouding vervangen MEF media in de drie 6-putjes met 0,6 ml (4F), 0,9 ml (mCherry) en 1 ml (controle) van Transductie media resp. Dooi een hoeveelheid van PLV-tetO-Tfap2c, -Gata3, -Eomes, ets en -mCherry virus bij kamertemperatuur en voeg 100 ul van elk virus-bevattende supernatant (Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2) in de 4F ook. Opmerking: Bij wildtype MEF, afbouwen preplated media door 100 pl en bovendien voeg 100 ul FUdeltaGW-rtTA virus supernatant naar 4F mix. </li><li> Voeg 100 ul van mCherry-virus bevattende media aan de goed gelabeld met mCherry. polybreen voegen tot een eindconcentratie van 8 ug / ml in elk putje. Zet de schaal terug in de incubator bij 37 ° C en incubeer MEFs O / N met virus-bevattende supernatans. Opmerking: In het geval van wild type MEFs, verminderen volume van preplated media met 100 ul en bovendien voeg 100 ul van FUdeltaGW-rtTA-virus bevat supernatant. </li><li> De volgende ochtend, verwijder voorzichtigVirus-bevattende media en was drie keer met 2 ml PBS. Tot slot, voeg 2 ml van TS media (zonder FGF4 / heparine). Opmerking: Getransduceerde MEFs kan direct worden gebruikt voor experimenten ITSC inductie of ingevroren voor verder gebruik. </li></ol> 5. fibroblast om ITSC Conversion Opmerking: Alle stappen worden uitgevoerd in het laboratorium de ruimte in licentie gegeven aan Biosafety Level 2 uitgevoerd. <ol><li> Wassen getransduceerd MEF tweemaal met 2 ml PBS en na toevoeging van 0,5 ml trypsine / EDTA-oplossing te incuberen in de incubator gedurende 3-4 min. Kijk onder een omgekeerde microscoop voor goede losmaking van de cellen. <ol><li> Inactiveer trypsine door toevoeging van 1 ml TS medium. Breng de celsuspensie in een 15 ml conische buis en centrifugeer gedurende 3 min bij 200 x g. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 2 ml TS medium. Gebruik de getransduceerde controle monster om de cellen te tellen. </li><li> Plaat 4F-MEF, mCherry-MEF en niet getransduceerde controle MEFs elk bij een dichtheid van 2 x 10 5cellen per 100 mm celkweek schotel in 10 ml TS medium met 2 ug / ml DOX (TS medium + FGF4 / heparine + DOX). </li><li> Als alternatief, het uitvoeren van transdifferentiatie op kleinere gerechten. Plate 3,6 x 10 3 cellen per cm 2 van de gewenste schotel omvang, schaal volume dienovereenkomstig. </li></ol></li><li> De volgende dag, met een epifluorescentie microscoop (met een 10x lens en een geschikt rode fluorescentie excitatie) bewaken van expressie mCherry eiwit om transductiedoeltreffendheid schatten. Opmerking: Transductie efficiëntie moeten dicht bij de 100%. Als verhoogde celdood blijkt na transgene inductie betekent dat virustiter te hoog was. Transductie wordt herhaald met verminderde hoeveelheid virus bevattend medium. </li><li> Van nu af aan verandering media op alle gerechten om de andere dag tot dag 10 na plating. Daarna voeden cellen met TS medium zonder DOX (TS medium + FGF4 / heparine). </li><li> Onder toepassing van een omgekeerde microscoop monitorverschijning van &#39;transdifferentiated gebieden&#39; (zie figuur 2B en C) op 4F gerecht voor maximaal 3 weken. Dergelijke kolonies mogen niet zichtbaar op de twee controle gerechten (mCherry-MEF en niet getransduceerde MEF) zijn. </li></ol> 6. Isolatie van individuele ITSC Lines Opmerking: Voor stap 6.3 een weefselkweek kap is niet vereist. Aanbevolen wordt vegen van de omgekeerde microscoop met 70% ethanol om de kans op bacteriële besmetting te minimaliseren. ITSC ​​individuele kolonies worden geïsoleerd tussen 21 dagen en 28 dagen transdifferentiatie. <ol><li> Voeg 40 ul van 0,05% trypsine / EDTA-oplossing in 12 putjes van een 96 U-bodem goed schaal en zet de schaal op het ijs. </li><li> Voordat kolonie isolatie, zuig medium op 4F-MEF transdifferentiatie gerecht. Was de cellen eenmaal met 10 ml PBS. Nogmaals, voeg 10 ml PBS en plaats schotel onder een omgekeerde microscoop. </li><li> Met behulp van een 100-ul pipet ingesteld op 40 ui lift individuele kolonies door circling ze met de pipet tip en het opzuigen van de drijvende kolonie. Overdracht cellen van een kolonie elk in een putje van de bereide 96-putjes. Na het plukken 12 kolonies plaatsen 96-putjes in de incubator bij 37 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Dissociëren cellen door en neer te pipetteren meerdere malen en overdracht celsuspensie in een putje van een 24-putjes met voorbereide 500 gl CM TS-medium (30% vers TS medium + 70% + CM FGF4 / heparine). </li><li> De volgende dag vervangen door medium met verse TS-CM medium om dode cellen te verwijderen. Wijzig medium om de andere dag. </li><li> Controleer op verschijnen van kolonies met licht epitheliale grenzen (zie figuur 2). Zodra kolonies verschijnen, cultuur tot 70% confluent of voor maximaal een week en geleidelijk uit te breiden op grotere gerechten. Van nu af aan, kweekcellen als bona fide TSC&#39;s, volgens de standaard protocollen in het serum bevattende media of in serumvrij, gedefinieerde media 3,5,11. </li></ol>

<ol><li>Cambuli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+of+the+first+cell+fate+decision+prevents+complete+ES+cell+reprogramming+into+trophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+commun%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast.</a> Nat commun. 5, 5538(2014).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Kubaczka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Induction+of+Trophoblast+Stem+Cells+from+Murine+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).</li>
<li>Benchetrit, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Nuclear+Reprogramming+Underlies+Lineage+Conversion+into+Functional+Trophoblast+Stem-like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanaka%2C+S+%22Science%22">Science</a>. 282 (5396), 2072-2075 (1998).</li>
<li>Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+mouse+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+TGF-beta%2Factivin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin.</a> Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).</li>
<li>Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+Oct-4+blocks+progenitor-cell+differentiation+and+causes+dysplasia+in+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues.</a> Cell. 121 (3), 465-477 (2005).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+system+for+the+generation+and+study+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. (10), e550(2007).</li>
<li>Kubaczka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+Maintenance+of+Murine+Trophoblast+Stem+Cells+under+Defined+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions.</a> Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De 4-factor (Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2) op basis transdifferentiatie protocol hier gepresenteerde biedt een betrouwbare methode om trouw te genereren omgezet iTSCs van muis embryonale fibroblasten. Verder is de werkwijze ook toepasbaar voor postnatale staart fibroblasten, maar met een afname van efficiëntie vergeleken met embryonale fibroblasten 3. Over het algemeen kwaliteit van primaire fibroblasten is een kritische factor transdifferentiatie uitkomst en voorzichtigheid is geboden vroege passage cellen (pa...

Onlangs heeft een vergelijkende studie van verschillende benaderingen van de muis embryonale stamcellen om stamcellen conversie trofoblast is gebleken dat in alle geanalyseerde systemen, geslacht conversie onvolledig gebleven. In plaats van geïnduceerde trofoblast stamcellen (iTSCs) de zogenaamde trofoblast stamcel-achtige cellen zijn gegenereerd vasthouden van een geheugen van het lot van de cel van oorsprong 1. Hier volgden we een andere benadering van ITSC generatie. Net als bij de directe inductie van pluripotente stamcellen van muizen embryonale fibroblasten (MEF) 2, zijn iTSCs rechtstreeks omgezet van gedifferentieerde somatische weefsel. Ten eerste hebben we geïdentificeerd 12 kandidaat-inducerende factoren TSC lot wanneer overexpressie in MEF. Later zijn de factoren Tfap2c, GATA3, Eomes en ETS2 geïdentificeerd noodzakelijk en voldoende zijn voor de ITSC inductie 3. Tegelijkertijd, een andere groep zelfstandig gevonden Tfap2c, GATA3 en Eomes voldoende om MEF om te zetten in iTSCs te zijn. In datstudie, is de tijd die transgenexpressie aanzienlijk langer in vergelijking met ons onderzoek aangeeft verschillende conversie kinetiek wanneer ETS2 ontbreekt in de transdifferentiatie cocktail 4. Conventionele foetaal runderserum (FBS) bevattende kweek van geïnduceerde en blastocyst afgeleide trofoblast stamcellen berust op de aanwezigheid van factoren afgescheiden door groei geïnactiveerd MEFs 5,6. Tijdens de ITSC inductie, worden deze elementen door MEF, waarbij de volledige combinatie van transgenen missen en worden transdifferentiatie niet ondergaan. Echter, zodra ITSC individuele kolonies zijn sub-gekweekt, ze vereisen media, die is geconditioneerd door groei geïnactiveerd MEFs. Vanaf dat moment, kan iTSCs gekweekt en behandeld als blastocyst afgeleid TSC&#39;s volgens standaard protocollen. Van de nota, in tegenstelling tot Tanaka et al. 5, we regelmatig cultuur TSC&#39;s en iTSCs zonder gelatiniseren celkweek gerechten.

<table><tbody><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-10G</td><td>Oplossen in steriele PBS, bereid 2 mg/ml stamoplossing. Bewaar aliquoten bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Chloroquine diphosphate salt&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td>Bereiden 25 mM stamoplossing in steriele celkweekkwaliteit water. Bewaar aliquoten bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td>Bereiden 8 mg/ml stamoplossing in steriele celkweekkwaliteit water. Bewaar aliquoten bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>human recombinant Fibroblast Growth Factor 4</td><td>ReliaTech</td><td>300-131L</td><td>Oplossen in steriele 0,1% BSA in PBS, bereid 25 &micro;g/ml stamoplossing. Bewaar aliquoten bij -80 &deg;C</td></tr><tr><td>Heparine natriumzout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td>Bereiden 1 mg/ml stamoplossing door oplossen in steriele PBS. Bewaar aliquoten bij -80&deg;C</td></tr><tr><td>ProFection Mammalian Transfection System</td><td>Promega</td><td>E1200</td><td></td></tr><tr><td>PBS, geen calcium, geen magnesium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1419-094</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, geen glutamine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), fenol rood</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03IR</td><td></td></tr><tr><td>Surfactant-vrije cellulose acetaat-membraanfilter</td><td>Corning</td><td>431220</td><td></td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline Streptomycine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Pyruvaat&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-24</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), celkweekkwaliteit</td><td>Panreac AppliChem GmbH</td><td>A3672,0100</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Tfap2c</td><td>Addgene</td><td>70269</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Gata3</td><td>Addgene</td><td>70270</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Eomes</td><td>Addgene</td><td>70271</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Ets2</td><td>Addgene</td><td>70272</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-mCherry</td><td>Addgene</td><td>70273</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>FUdeltaGW-rtTA&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>19780</td><td></td></tr><tr><td>Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7</td><td>JAX Mice</td><td>6965</td><td></td></tr><tr><td>129S2SV</td><td>Charles River</td><td>129</td><td></td></tr></tbody></table>

protocol voor de directe omzetting van muizen embryonale fibroblasten in trofoblast stamcellen

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Trofoblast stamcellen (TSC) ontstaan ​​als gevolg van de eerste Celgedrag in de ontwikkeling van zoogdieren. Ze kunnen in vitro worden gekweekt, het vermogen behouden om te hernieuwen en om te differentiëren in alle subtypen van de trofoblast lijn gelijk aan het in vivo stamcelpopulatie die tot de foetale deel van de placenta. Daarom TSC&#39;s bieden een uniek model voor ontwikkeling van de placenta en embryonale versus extra-embryonale Celgedrag in vitro te bestuderen. Vanaf het blastocyst stadium verder, een duidelijke epigenetische barrière die bestaat uit DNA-methylatie en histon modificaties scheidt strak beide geslachten. Hier beschrijven we een protocol om deze lijn barrière volledig overwonnen door transiënte overexpressie van trophoblast belangrijke regulatoren Tfap2c, GATA3, Eomes en ETS2 in muriene embryonale fibroblasten. De geïnduceerde trofoblast stamcellen in staat zijn om zichzelf te vernieuwen en zijn vrijwel identiek aan afgeleide trofoblast stamcellen blastocysten in termen van de morfologie, marker genexpressie en methylatie patroon. Functionele in vitro als in vivo analyses bevestigen dat deze cellen kunnen differentiëren langs de trofoblast lineage genereren polyploïde trofoblast reuzencellen en chimerizing de placenta bij injectie in blastocysten. De inductie van trofoblast stamcellen van somatische weefsels opent nieuwe mogelijkheden voor genetische en epigenetische eigenschappen van deze extra-embryonale afstammingslijn bestuderen en biedt de mogelijkheid om trofoblast stamcellijnen genereren zonder het vernietigen van de respectievelijke embryo.

Op de schaal waarin transgenexpressie van het 4F geactiveerd, cellen snel morfologie (vergelijk Figuur 2A en B) veranderen. Rond dag 14-21 transdifferentiated afzonderlijke gebieden ontstaan ​​(twee voorbeelden zijn aangegeven in figuur 2B en C). Deze primaire kolonies missen typische TSC morfologie; maar zodra ze zijn sub-gekweekt, karakteristieke epitheliale morfologie met strakke randen en heldere grenzen sterk doet denken aan bona fide TSC&#39;s komt...

Hier presenteren we een protocol voor de directe omzetting van muis embryonale fibroblasten in volledig functionele en stabiele trofoblast-stamcellen door tien dagen overexpressie van Tfap2c, Gata3, Eomes en Ets2.

Protocol voor de directe omzetting van muizen embryonale fibroblasten in Trofoblast Stamcellen

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Het algemene doel van deze procedure is om bonafide geïnduceerde trofoblaststamcellen of iTSC's te genereren uit muizfibroblasten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen in het veld van stamcellen over de aard van de barrière die de embryonale lijn scheidt van de extra-embryonale lijn. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de transgene expressie slechts transient wordt geactiveerd, wat de selectie van stabiel geconverteerde cellen vergemakkelijkt.Bedek in een laboratorium met bioveiligheidsniveau 2, onder gebruik van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, vijf schalen van 100 milliliter met vijf milliliter Poly-L-lysine-oplossing en schud de schalen voorzichtig om de coatingoplossing gelijkmatig te verdelen. Plaats de schalen gedurende 30 minuten in een incubator van 37 °C, aspireer vervolgens de Poly-L-lysine en spoel de schalen één keer met PBS. Zaai daarna zeven keer 10⁶ 293T-cellen per schaal uit in 10 milliliter 293T-celmedium, draai de schalen rond om de cellen gelijkmatig te verdelen en plaats de schalen terug in de incubator.Vervang de volgende ochtend het groeimedium door vijf milliliter transfectiemedium. Behandel de culturen vervolgens met zes microliter van een 1000X stockoplossing van Chloroquine en plaats de platen terug in de incubator bij 37 graden Celsius. Om het transfectiemengsel te bereiden, wordt voor elke Lentivirale vector 600 microliter Lentivector DNA-oplossing druppelsgewijs toegevoegd aan 600 microliter 2X HEPES-gebufferde zoutoplossing terwijl er wordt gevortext; laat het transfectiemengsel vervolgens incuberen bij kamertemperatuur.Voeg na 15 minuten het mengsel zeer voorzichtig druppelsgewijs toe aan de voorbereide 293 T-cellen en plaats de schaaltjes terug in de incubator. Vervang na vijf tot zes uur het medium door 10 milliliters virusproductiemedium en plaats de platen terug in de incubator. Vervang de volgende ochtend het medium voorzichtig door zeven milliliters vers virusproductiemedium voor een verdere incubatie gedurende de nacht.Beweeg vervolgens het medium van elke plaat over naar individuele conische buisjes van 15 milliliter en voeg zeven milliliter vers virusproductiemedium toe aan de platen voor een volgende incubatie gedurende de nacht. Oogst de volgende ochtend de tweede batch virushoudend medium, voeg het supernatant samen met de eerste batch virus en filtreer het virushoudende medium door een surfactantvrij celluloseacetaatmembraanfilter van 0,45 micron voor bewaring in aliquots van 500 microliter bij minus 80. Om de fibroblasten om te zetten in geïnduceerde trofoblaststamcellen, was de getransduceerde embryonale fibroblasten uit de muis of MEFs twee keer met twee milliliter PBS.Detach vervolgens de cellen met 0,5 milliliter Trypsine-EDTA-oplossing bij 37 graden Celsius. Bevestig na drie tot vier minuten onder een geïnverteerde microscoop of de cellen van de plaat zijn losgekomen en inactiveer de Trypsine vervolgens met één milliliter TS-medium. Breng de celsuspensies over naar individuele conische buisjes van 15 milliliter en centrifugeer de cellen.Resuspendeer vervolgens de pellets in twee milliliter TS-medium en zaai 2 × 10⁵ mCherry- of controle-niet-getransduceerde MEFs per 100 millimeter schaal in 10 milliliter TS-medium met fibroblastgroeifactor 4 en heparine, aangevuld met doxycycline voor een nachtelijke kweek. Schat de volgende dag de transductie-efficiëntie aan de hand van de mCherry-proteinexpressie onder een epifluorescentiemicroscoop. Als de transductie-efficiëntie ongeveer 100% is, worden de kweken teruggeplaatst in de incubator, waarbij het medium in alle schalen om de dag wordt ververst tot dag 10.Voed de cellen vervolgens met vers TS-medium dat fibroblast groeifactor vier en heparine bevat, zonder doxycycline, waarbij de omgekeerde microscoop wordt gebruikt om gedurende maximaal drie weken het verschijnen van transdifferentiegebieden op de schaal met de vier factoren te monitoren. De identificatie van de transdifferentiegebieden is cruciaal, aangezien MEF's op dit punt morfologisch niet lijken op trofoblaststamcellen. Zoek naar dicht op elkaar gestapelde koloniën naast de trofoblastreuzencellen, die kunnen worden geïdentificeerd aan hun celgrootte en grote kern.Om individuele iTSC-lijnen te isoleren, maak eerst het omgekeerde microscoop schoon met 70% ethanol om de kans op bacteriële contaminatie te minimaliseren. Voeg vervolgens 40 µL 0,5% Trypsine EDTA toe aan 12 wells van een 96-wells plaat met U-bodem en plaats de plaat op ijs. Aspireer nu het medium uit de schaal voor transdifferentiatie van MEF met vier factoren en was de cellen één keer met 10 mL PBS.Voeg na het wassen 10 milliliters verse PBS toe aan de cellen en plaats de plaat op de tafel van de omgekeerde microscoop. Gebruik een 100 microliter pipette ingesteld op 40 microliters om elke individuele kolonie met de pipetpunt te omsingelen en zuig de resulterende drijvende kolonie op. Draag elke kolonie over naar individuele putjes van de 96-wells plaat totdat er 12 kolonies zijn verzameld.Incubeer de kolonies vervolgens vijf minuten lang bij 37 graden Celsius. Ontkoppel na afloop van de incubatie de cellen door middel van pipetteren en breng de celsuspensies over naar afzonderlijke wells van een 24-wells plaat met 500 microliters compleet TS plus fibroblast growth factor en Heparin medium voor een nachtelijke cultuur. Vervang de volgende dag het medium door vers compleet TS plus fibroblast growth factor en Heparin medium om de dode cellen te verwijderen en plaats de plaat terug in de incubator.Controleer de culturen dagelijks op de verschijning van epitheliale kolonies met heldere grenzen. Zodra de kolonies zichtbaar zijn, worden de cellen tot maximaal één week of tot een confluentie van 70% gecultiveerd. In culturen waarin de transgene expressie van de vier factoren is geactiveerd, verandert de morfologie van de cellen snel.Rond dag 14 tot 21 ontstaan er duidelijke transgedifferentieerde gebieden. Deze primaire koloniën missen de typische morfologie van trofoblaststamcellen, maar zodra ze worden gesubcultured, wordt een karakteristieke epitheliale morfologie met strakke randen en heldere begrenzingen waargenomen, die sterk doet denken aan bonafide trofoblaststamcellen. Wanneer de door de vier factoren geïnduceerde trofoblaststamcellen positief blijven voor de trofoblasttranscriptiefactoren Cdx2 en Tfap2c, kunnen deze lijnen worden gebruikt voor daaropvolgende in vitro- of in vivo-analyses.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in zes weken worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals blastocyst-geassisteerde injectie, worden toegepast om aanvullende vragen over het chimerisatiepotentieel van de gegenereerde iTSC's te beantwoorden. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van vroege lijnsegregatie om de conversie van embryonale versus extra-embryonale celbestemming bij muizen te onderzoeken.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe nieuwe embryonale fibroblasten direct kunnen worden omgezet in geïnduceerde trofoblaststamincellen. Vergeet niet dat het werken met lentivirale vectoren extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het volgen van passende werkprocedures voor biosafety level 2, altijd moeten worden nageleefd.

protocol-for-direct-conversion-murine-embryonic-fibroblasts-into

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

In deze video, tonen we de isolatie van de muis blastocysten en de afleiding van trofoblast stamcellen uit blastocysten. We beschrijven ook de voorwaarden voor het onderhoud van de stamcel terrein en in de inductie van differentiatie in cultuur.

Afleiding van Mouse trofoblast stamcellen uit blastocysten

De kwaliteit van muizen embryonische fibroblasten (MEF) wordt bepaald door de juiste spanning van muis zoals CF-1. Pluripotentie-ondersteunende MEFs en geconditioneerde media (CM), verkregen van deze moeten bevatten optimale concentraties van Activin A, Gremlin en Tgfβ1 nodig is voor de Activin / Nodal en FGF wegen naar co-operatief te behouden zelfvernieuwing en pluripotentie.

Voorbereiding van muis embryonale Fibroblast cellen die geschikt zijn voor het kweken van menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen

We beschrijven een protocol voor het afleiden van op lentivirus gebaseerde, gereprogrammeerde en gekarakteriseerde factorvrije humane geïnduceerde pluripotente stamcellen en de omzetting hiervan in vermeende klinische-kwaliteitscondities.

Afleiden en karakterisatie van een Transgene gratis humane geïnduceerde pluripotente Stem Cell Line en de omschakeling naar Defined Klinisch-grade Voorwaarden

Het hier beschreven protocol beschrijft de inductie van een hemogenetisch programma in muis embryonale fibroblasten via overexpressie van een minimale set transcriptiefactoren. Deze technologie kan worden toegepast op het menselijk systeem om platforms te bieden voor toekomstig onderzoek naar hematopoëse, hematologische ziekten en hematopoietische stamceltransplantatie.

Herprogrammeren muis embryonale fibroblasten met transcriptiefactoren een Hemogenic Program Laten

In deze studie genereren we geïnduceerde pluripotente stamcellen uit muis-vruchtwatercellen, met behulp van een niet-viraal transposonsysteem.

De productie van pluripotente stamcellen van Mouse Vruchtwater cellen met behulp van een transposon System

Hier presenteren we een protocol om efficiënt humane trofoblastische cellen te genereren uit humane pluripotente stamcellen met behulp van botmorfogenetisch eiwit 4 en remmers van de Activin/Nodal-routes. Deze methode is geschikt voor de efficiënte differentiatie van humane pluripotente stamcellen en kan grote hoeveelheden cellen genereren voor genetische manipulatie.

In vitro differentiatie van humane pluripotente stamcellen in trofoblastcellen

Dit manuscript beschrijft een stapsgewijs protocol voor het genereren en kwantificeren van diverse geherprogrammeerde hartsubtypen met behulp van een retrovirus-gemedieerde levering van Gata4, Hand2, Mef2c en Tbx5.

Het beoordelen van Cardiomyocyte Subtypen Na transcriptie Factor-gemedieerde herprogrammeren van muis embryonale fibroblasten

Hier presenteren wij ons protocol voor produceren geïnduceerde erythroid progenitoren (iEPs) van volwassen fibroblasten muis met behulp van transcriptie factor-gedreven directe bloedlijn herprogrammering (DLR).

Directe bloedlijn herprogrammering van volwassen muis Fibroblast te Erythroid voorlopercellen

Hier beschrijven we een methode voor het opwarmen van verglaasde menselijke blastocysten, die ze in vitro door de implantatieperiode kweekt, verteren tot enkele cellen en vroege trofoblastcellen verzamelen voor verder onderzoek.

Single Cell Collection van Trophoblast Cellen in Peri-implantatie Stage Human Embryo's

Dit protocol beschrijft een techniek om veranderingen in de maternale vaatstructuur tijdens zwangerschap bij muizen te beoordelen. Met behulp van stereologische methoden wordt de verandering van de deciduale spiraalvormige slagaders kwantitatief beoordeeld en worden de resultaten kwalitatief bevestigd door middel van immunohistochemie.

Beoordeling van de moeder Vasculaire Verbouwing tijdens de zwangerschap in de muis Baarmoeder

Leer hoe muizen embryonale fibroblasten direct worden omgezet in trofoblast stamcellen via tijdelijke overexpressie van transcriptiefactoren. Deze methode biedt inzicht in embryonale en extra-embryonale differentiatieroutes.

Protocol voor de directe omzetting van muizen embryonale fibroblasten in Trofoblast Stamcellen

Meer video's verkennen