Protocol voor de directe omzetting van muizen embryonale fibroblasten in Trofoblast Stamcellen

Het algemene doel van deze procedure is om bonafide geïnduceerde trofoblaststamcellen of iTSC's te genereren uit muizfibroblasten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen in het veld van stamcellen over de aard van de barrière die de embryonale lijn scheidt van de extra-embryonale lijn. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de transgene expressie slechts transient wordt geactiveerd, wat de selectie van stabiel geconverteerde cellen vergemakkelijkt.

Bedek in een laboratorium met bioveiligheidsniveau 2, onder gebruik van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, vijf schalen van 100 milliliter met vijf milliliter Poly-L-lysine-oplossing en schud de schalen voorzichtig om de coatingoplossing gelijkmatig te verdelen. Plaats de schalen gedurende 30 minuten in een incubator van 37 °C, aspireer vervolgens de Poly-L-lysine en spoel de schalen één keer met PBS. Zaai daarna zeven keer 10⁶ 293T-cellen per schaal uit in 10 milliliter 293T-celmedium, draai de schalen rond om de cellen gelijkmatig te verdelen en plaats de schalen terug in de incubator.

Vervang de volgende ochtend het groeimedium door vijf milliliter transfectiemedium. Behandel de culturen vervolgens met zes microliter van een 1000X stockoplossing van Chloroquine en plaats de platen terug in de incubator bij 37 graden Celsius. Om het transfectiemengsel te bereiden, wordt voor elke Lentivirale vector 600 microliter Lentivector DNA-oplossing druppelsgewijs toegevoegd aan 600 microliter 2X HEPES-gebufferde zoutoplossing terwijl er wordt gevortext; laat het transfectiemengsel vervolgens incuberen bij kamertemperatuur.

Voeg na 15 minuten het mengsel zeer voorzichtig druppelsgewijs toe aan de voorbereide 293 T-cellen en plaats de schaaltjes terug in de incubator. Vervang na vijf tot zes uur het medium door 10 milliliters virusproductiemedium en plaats de platen terug in de incubator. Vervang de volgende ochtend het medium voorzichtig door zeven milliliters vers virusproductiemedium voor een verdere incubatie gedurende de nacht.

Beweeg vervolgens het medium van elke plaat over naar individuele conische buisjes van 15 milliliter en voeg zeven milliliter vers virusproductiemedium toe aan de platen voor een volgende incubatie gedurende de nacht. Oogst de volgende ochtend de tweede batch virushoudend medium, voeg het supernatant samen met de eerste batch virus en filtreer het virushoudende medium door een surfactantvrij celluloseacetaatmembraanfilter van 0,45 micron voor bewaring in aliquots van 500 microliter bij minus 80. Om de fibroblasten om te zetten in geïnduceerde trofoblaststamcellen, was de getransduceerde embryonale fibroblasten uit de muis of MEFs twee keer met twee milliliter PBS.

Detach vervolgens de cellen met 0,5 milliliter Trypsine-EDTA-oplossing bij 37 graden Celsius. Bevestig na drie tot vier minuten onder een geïnverteerde microscoop of de cellen van de plaat zijn losgekomen en inactiveer de Trypsine vervolgens met één milliliter TS-medium. Breng de celsuspensies over naar individuele conische buisjes van 15 milliliter en centrifugeer de cellen.

Resuspendeer vervolgens de pellets in twee milliliter TS-medium en zaai 2 × 10⁵ mCherry- of controle-niet-getransduceerde MEFs per 100 millimeter schaal in 10 milliliter TS-medium met fibroblastgroeifactor 4 en heparine, aangevuld met doxycycline voor een nachtelijke kweek. Schat de volgende dag de transductie-efficiëntie aan de hand van de mCherry-proteinexpressie onder een epifluorescentiemicroscoop. Als de transductie-efficiëntie ongeveer 100% is, worden de kweken teruggeplaatst in de incubator, waarbij het medium in alle schalen om de dag wordt ververst tot dag 10.

Voed de cellen vervolgens met vers TS-medium dat fibroblast groeifactor vier en heparine bevat, zonder doxycycline, waarbij de omgekeerde microscoop wordt gebruikt om gedurende maximaal drie weken het verschijnen van transdifferentiegebieden op de schaal met de vier factoren te monitoren. De identificatie van de transdifferentiegebieden is cruciaal, aangezien MEF's op dit punt morfologisch niet lijken op trofoblaststamcellen. Zoek naar dicht op elkaar gestapelde koloniën naast de trofoblastreuzencellen, die kunnen worden geïdentificeerd aan hun celgrootte en grote kern.

Om individuele iTSC-lijnen te isoleren, maak eerst het omgekeerde microscoop schoon met 70% ethanol om de kans op bacteriële contaminatie te minimaliseren. Voeg vervolgens 40 µL 0,5% Trypsine EDTA toe aan 12 wells van een 96-wells plaat met U-bodem en plaats de plaat op ijs. Aspireer nu het medium uit de schaal voor transdifferentiatie van MEF met vier factoren en was de cellen één keer met 10 mL PBS.

Voeg na het wassen 10 milliliters verse PBS toe aan de cellen en plaats de plaat op de tafel van de omgekeerde microscoop. Gebruik een 100 microliter pipette ingesteld op 40 microliters om elke individuele kolonie met de pipetpunt te omsingelen en zuig de resulterende drijvende kolonie op. Draag elke kolonie over naar individuele putjes van de 96-wells plaat totdat er 12 kolonies zijn verzameld.

Incubeer de kolonies vervolgens vijf minuten lang bij 37 graden Celsius. Ontkoppel na afloop van de incubatie de cellen door middel van pipetteren en breng de celsuspensies over naar afzonderlijke wells van een 24-wells plaat met 500 microliters compleet TS plus fibroblast growth factor en Heparin medium voor een nachtelijke cultuur. Vervang de volgende dag het medium door vers compleet TS plus fibroblast growth factor en Heparin medium om de dode cellen te verwijderen en plaats de plaat terug in de incubator.

Controleer de culturen dagelijks op de verschijning van epitheliale kolonies met heldere grenzen. Zodra de kolonies zichtbaar zijn, worden de cellen tot maximaal één week of tot een confluentie van 70% gecultiveerd. In culturen waarin de transgene expressie van de vier factoren is geactiveerd, verandert de morfologie van de cellen snel.

Rond dag 14 tot 21 ontstaan er duidelijke transgedifferentieerde gebieden. Deze primaire koloniën missen de typische morfologie van trofoblaststamcellen, maar zodra ze worden gesubcultured, wordt een karakteristieke epitheliale morfologie met strakke randen en heldere begrenzingen waargenomen, die sterk doet denken aan bonafide trofoblaststamcellen. Wanneer de door de vier factoren geïnduceerde trofoblaststamcellen positief blijven voor de trofoblasttranscriptiefactoren Cdx2 en Tfap2c, kunnen deze lijnen worden gebruikt voor daaropvolgende in vitro- of in vivo-analyses.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in zes weken worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals blastocyst-geassisteerde injectie, worden toegepast om aanvullende vragen over het chimerisatiepotentieel van de gegenereerde iTSC's te beantwoorden. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van vroege lijnsegregatie om de conversie van embryonale versus extra-embryonale celbestemming bij muizen te onderzoeken.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe nieuwe embryonale fibroblasten direct kunnen worden omgezet in geïnduceerde trofoblaststamincellen. Vergeet niet dat het werken met lentivirale vectoren extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het volgen van passende werkprocedures voor biosafety level 2, altijd moeten worden nageleefd.