Protocol voor de directe omzetting van muizen embryonale fibroblasten in Trofoblast Stamcellen

Het algemene doel van deze procedure is om bonafide geïnduceerde trofoblast-stamcellen of iTSC's te genereren uit muisfibroblasten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het stamcelveld met betrekking tot de aard van de barrière die de embryonale van de extra-embryonale lijn scheidt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de transgene expressie slechts tijdelijk wordt geactiveerd, wat de selectie van stabiel geconverteerde cellen vergemakkelijkt.

In een bioveiligheidslaboratorium van niveau twee met behulp van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, bedek vijf 100 milliliter schotels met vijf milliliter Poly-L-lysine oplossing, en schud de platen voorzichtig om de lak gelijkmatig te verdelen. Plaats de schotels in een incubator van 37 graden Celsius gedurende 30 minuten, aspireer vervolgens de Poly-L-lysine en spoel de schotels eenmaal met PBS. Plaats vervolgens zeven keer 10 tot zesde 293 T-cellen per schotel in 10 milliliter 293 T-celmedium, slinger de schotels om de cellen gelijkmatig te verdelen en plaats de schotels terug in de incubator.

De volgende ochtend vervangt u het groeimedium door vijf milliliter transfectiemedium. Behandel vervolgens de culturen met zes microliter van een 1000X voorraadoplossing van Chloroquine-oplossing en plaats de platen terug in de incubator bij 37 graden Celsius. Om het transfectiemengsel voor te bereiden, voegt u voor elke Lentivirale vector 600 microliter Lentivector DNA-oplossing druppelsgewijs toe aan 600 microliter 2X HEPES gebufferde zoutoplossing terwijl u het transfectiemengsel incubeert bij kamertemperatuur.

Na 15 minuten voegt u het mengsel heel voorzichtig druppelsgewijs toe aan de voorbereide 293 T-cellen en plaatst u de schotels terug in de incubator. Na vijf tot zes uur vervangt u het medium door 10 milliliter virusproductiemedium en plaatst u de platen weer in de incubator. De volgende ochtend vervangt u het medium zorgvuldig door zeven milliliter vers virusproductiemedium voor een andere overnachtelijke incubatie.

Breng vervolgens het medium van elke plaat over in afzonderlijke 15 milliliter kegelbuisjes en voeg zeven milliliter vers virusproductiemedium toe aan de platen voor een andere overnachtelijke incubatie. De volgende ochtend oogst u de tweede batch virusbevattend medium, poolt u het supernatant met de eerste batch virus en zet u het virusbevattend medium door een 0,45 micron surfactantvrij celluloseacetaatmembraanfilter voor opslag in 500 microliter Aliquots bij min 80. Om de fibroblasten om te zetten in geïnduceerde trofoblast-stamcellen, spoelt u de getransduceerde massale embryonale fibroblasten of MEF's twee keer met twee milliliter PBS.

Los vervolgens de cellen op met 0,5 milliliter Trypsin EDTA-oplossing bij 37 graden Celsius. Na drie tot vier minuten bevestigt u dat de cellen zich onder een omgekeerde microscoop van de plaat hebben losgemaakt en activeert u vervolgens het Trypsin met een milliliter TS-medium. Breng de celsuspensies over in afzonderlijke 15 milliliter kegelbuisjes en centrifugeer de cellen.

Suspenseer vervolgens de pellets opnieuw in twee milliliter TS-medium en plateer twee keer 10 tot de vijfde vier factor mCherry of controle niet-getransduceerde MEF's per 100 milliliter schotel in 10 milliliter TS-medium bevattend fibroblastgroeifactor vier en Heparine gesupplementeerd met Doxycycline voor overnachtelijke cultuur. De volgende dag, gebruikt u onder een epifluorescentiemicroscoop de mCherry-eiwitexpressie om de transductie-efficiëntie te schatten. Als de transductie-efficiëntie ongeveer 100% is, keert u de culturen terug naar de incubator, ververst u het medium in alle schotels om de andere dag tot dag 10.

Daarna voedt u de cellen met vers TS-medium bevattend fibroblastgroeifactor vier en Heparine zonder Doxycycline door gebruik te maken van de omgekeerde microscoop om het verschijnen van transgedifferentieerde gebieden op de vier factoren schotel gedurende maximaal drie weken te controleren. Identificatie van de transgedifferentieerde gebieden is cruciaal, omdat op dit punt MEF's morfologisch niet lijken op trofoblast-stamcellen. Zoek naar dicht opgestapelde kolonies naast de trofoblast-reuzencellen die worden geïdentificeerd door hun celgrootte en grote kern.

Om individuele iTSC-lijnen te isoleren, veegt u eerst de omgekeerde microscoop af met 70%ethanol om de kans op bacteriële besmetting te minimaliseren. Voeg vervolgens 40 microliter 0,5% Trypsin EDTA toe aan 12 putjes van een 96 U-bodemputjesplaat en plaats de plaat op ijs. Aspireer nu het medium van de transdifferentiatieschotel van de vier factoren MEF en spoel de cellen eenmaal met 10 milliliter PBS.

Na het wassen, voegt u 10 milliliter vers PBS toe aan de cellen en plaatst u de plaat op de draaischijf van de omgekeerde microscoop. Gebruik een 100 microliter pipettenset ingesteld op 40 microliter, omring elke individuele kolonie met de pipettentip en aspireer de resulterende zwevende kolonie. Breng elke kolonie over in afzonderlijke putjes van de 96-putjesplaat totdat er 12 kolonies zijn gepikt.

Incubeer vervolgens de kolonies gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, dissocieert u de cellen door te pipetteren en brengt u de celsuspensies over in afzonderlijke putjes van een 24-putjesplaat bevattend 500 microliter compleet TS plus fibroblastgroeifactor en Heparine medium voor overnachtelijke cultuur. De volgende dag vervangt u het medium door vers compleet TS plus fibroblastgroeifactor en Heparine medium om de dode cellen te verwijderen en plaatst u de plaat terug in de incubator.

Controleer de culturen dagelijks op het verschijnen van Epitheelkolonies met heldere randen. Wanneer de kolonies worden waargenomen, kweekt u de cellen tot een week of tot ze 70% conflueert zijn. In culturen waar de expressie van het transgen van de vier factoren wordt geactiveerd, veranderen de cellen snel van morfologie.

Rond dagen 14 tot 21 verschijnen er duidelijke transgedifferentieerde gebieden. Deze primaire kolonies missen de typische trofoblast-stamcelmorfologie, maar zo