Bereiding van formaline gefixeerde paraffine-ingebed weefsel Cores voor zowel RNA en DNA-extractie
21 augustus 2016
Deze gewijzigde extractie protocol verbetert RNA en DNA opbrengst van meer doelgerichte regio's van belang in histopathologische weefsel blokken.
Het algemene doel van deze procedure is om RNA en DNA sequentieel te extraheren uit archiefmateriaal van formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde weefselkernen. Dit is een protocol voor het verzamelen van weefselkernen waaruit we zowel RNA als DNA zullen extraheren. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het de opbrengsten van RNA en DNA verbetert van precies gerichte gebieden in het weefselblok.
Deze procedure is grotendeels ontwikkeld in archiefmateriaal van prostaatkanker. Het kan ook worden toegepast op andere soorten archiefweefsels. De visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de stappen voor het kernen van weefsels niet vaak worden gebruikt in onderzoekslaboratoria.
De meeste onderzoekslaboratoria gebruiken in plaats daarvan dwarsdoorsneden, wat weefsels sneller uitput en aanzienlijke heterogeniteit aan het monster toevoegt. Begin met het bekijken van de microscoopslide en omlijn de regio van belang met een fijne punt permanente marker. Snijd vervolgens een sectie van paraffinefolie die groot genoeg is om de regio van belang op de microscoopslide te bedekken.
Plaats vervolgens de folie stevig op de slide en wikkel de folie over de randen om te voorkomen dat deze wegglijdt. Gebruik een fijne punt permanente marker om het hele weefsel en de regio van belang binnen het weefsel te omlijnen. Verwijder vervolgens de folie van de slide en breng het over naar het overeenkomstige weefselblok.
Orienteer de folie door deze om te draaien of te draaien zodat de omtrek van het hele weefsel overeenkomt met de waargenomen vorm van het weefsel in de blok. Druk de sectie van de folie stevig op het oppervlak van de blok om wegglijden te voorkomen. Gebruik de punt van de permanente marker om ondiepe maar zichtbare indrukkingen langs de omtrek van de regio van belang te maken en verwijder vervolgens de folie.
Maak vervolgens de receptor punch schoon uit de set van 0,6 millimeter door de punt onder te dompelen in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter met één milliliter bleekmiddel en de punch meerdere keren op en neer te schuiven. Herhaal de wassing met de buis bevattende 70 procent ethanol en vervolgens water. Druk nu de schoongemaakte punch tot een diepte van drie millimeter in de regio van belang en trek deze terug.
Laat de kern los in een laag-bindend microcentrifugebuisje door deze eruit te duwen met de stylus. Voeg één milliliter xyleen toe aan de microfugebuisjes met de weefselkernen en vortex krachtig gedurende tien seconden. Plaats vervolgens in een heatblok ingesteld op 50 graden Celsius gedurende drie minuten.
Na de incubatie, centrifugeer gedurende twee minuten bij kamertemperatuur op maximale snelheid. Plaats na de centrifugatie de kernen vijf minuten op ijs om de wasachtige residuen te laten stollen. Verwijder nu voorzichtig het paraffine dat zich heeft opgehoopt rond de meniscus samen met de supernatant met behulp van een pipettenpunt.
Herhaal vervolgens de xyleenbehandeling. Voeg na het verwijderen van de paraffine-xyleenmix één milliliter 100 procent ethanol toe en vortex krachtig gedurende tien seconden. Na centrifugatie bij maximale snelheid gedurende twee minuten, gooi de ethanol voorzichtig weg.
Herhaal de ethanolwassing nog een keer voordat u begint met de homogenisatie. Resuspendeer de ontparaffineerde kernen in 700 microliter 100 procent ethanol voorafgaand aan homogenisatie. Gebruik een gemotoriseerde weefselhomogenisator op een middelbare instelling om de kernen in fijne deeltjes te malen.
Grondige homogenisatie van de weefselkernen is vereist voor een optimale opbrengst van DNA en RNA. Vul vervolgens aparte 15 milliliterbuisjes met ongeveer tien milliliter bleekmiddel, RNase-neutraliserende oplossing en 70 procent ethanol. Na homogenisatie van het monster, was de homogenisatorsonde in elke reinigingsoplossing achter elkaar.
Laat de homogenisator tijdens het wasstadium op de hoogste snelheid draaien. Veeg de sonde af met een tissue en laat de sonde volledig drogen voordat u het volgende monster homogeniseert. Inspecteer de sondebladen visueel op resterende weefselstukken en reinig de sonde opnieuw als er resten worden gevonden.
Na homogenisatie, breng het monstervolume tot één milliliter met 100 procent ethanol en centrifugeer vervolgens gedurende 15 minuten op maximale snelheid. Aspiseer voorzichtig de ethanol en laat de pellets ongeveer 15 tot 20 minuten luchtdrogen voordat u begint met de extractie van proteinase K. Resuspendeer de pellets in 150 microliter proteinase K-digestiebuffer en knik de buisjes om de pellet los te maken.
Overnachtelijke digestie met proteinase K wordt aanbevolen voor hogere DNA-opbrengst. Voeg 10 microliter temperatuurstabiele proteinase K toe en meng door te knikken. Incubeer gedurende 15 minuten bij 56 graden Celsius met milde agitatie.
Incubeer de buisjes drie minuten op ijs. Na afkoeling, centrifugeer de buis gedurende 15 minuten op maximale snelheid. Transfer vervolgens, zonder de pellets te verstoren, elke supernatant voorzichtig naar een nieuwe microcentrifugebuis voor RNA-zuivering.
Extract RNA en DNA met behulp van de geoptimaliseerde procedure in het geschreven protocol, dat een verlengde weefseldigestietijd voor DNA-extractie omvat. RNA en DNA kunnen worden teruggewonnen uit oudere formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde weefselmonsters met behulp van deze methode. Nucleïnezuren werden geco-extracteerd uit prostaatkankermonsters variërend van drie tot 14 jaar in monsterleeftijd.
De gemiddelde opbrengst was 2.270 nanogram RNA en 820 nanogram DNA. Interessant genoeg was er geen significante correlatie tussen de leeftijd van het weefselmonster en de herstelde nucleïnezuren. Over het algemeen waren de opbrengsten van RNA en DNA gecorreleerd tussen monsters, hoewel in de meeste gevallen meer dan tweemaal zoveel RNA werd teruggevonden in vergelijking met DNA.
Om de prestaties van genomisch DNA te demonstreren dat met dit protocol is geëxtraheerd, werden bisulfiet geconverteerde DNA-extracten van archiefmateriaal van prostaatkanker door methylatiespecifieke PCR versterkt. ALU-repetitieve elementen werden gebruikt als methylatiecontrole en vertoonden weinig variatie tussen monsters. GSTP1, een gen dat bek
Overzicht
Dit protocol verhoogt de opbrengsten van RNA- en DNA-extractie uit doelgebieden in archiefweefselblokken, in het bijzonder prostaatkankermonsters.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Moleculaire biologie
Achtergrond
- Gearchiveerde in formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde weefsels worden veelvuldig in onderzoek gebruikt.
- Traditionele methoden voor dwarsdoorsneden kunnen leiden tot weefseluitputting en monsterheterogeniteit.
- Verbeterde extractiemethoden zijn nodig voor een betere terugwinning van nucleïnezuren.
- Dit protocol richt zich op weefsels van prostaatkanker, maar kan worden aangepast voor andere weefsels.
Doel van de Studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het extraheren van RNA en DNA uit specifieke regio's van interesse in weefselblokken.
- Het verbeteren van de opbrengst van nucleïnezuren uit archiefmonsters.
- Het geven van een visuele demonstratie van de coring-techniek.
Gebruikte methoden
- Sequentiële extractie van RNA en DNA uit weefselkernen.
- Gebruik van een permanent marker met fijne punt om interessegebieden af te bakenen.
- Homogenisatie van gedeparaffiniseerde weefselkernen voor een optimale opbrengst.
- Proteinase K-digestie voor een verbeterde terugwinning van nucleïnezuren.
Belangrijkste resultaten
- Gemiddelde opbrengsten van 2.270 ng RNA en 820 ng DNA uit prostaatkanker-monsters.
- Geen significante correlatie tussen de ouderdom van het weefsel en het herstel van nucleïnezuren.
- Hoger RNA-herstel vergeleken met DNA in de meeste monsters.
- Succesvolle amplificatie van bisulfiet-geconverteerd DNA uit archiefmonsters.
Conclusies
- Dit protocol verbetert de opbrengst van nucleïnezuren uit gearchiveerde weefsels aanzienlijk.
- Het is toepasbaar op verschillende soorten gearchiveerde weefsels buiten prostaatkanker.
- Visuele ondersteuning bevordert het begrip en de implementatie van de methode.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor management
Gearchiveerde in formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde weefsels vormen een cruciale bron voor de ontdekking van biomarkers en de validatie van targets bij de ontwikkeling van oncologische geneesmiddelen. Dit protocol maakt een precieze moleculaire analyse van gedefinieerde weefselregio's mogelijk, waardoor de opbrengst en kwaliteit van nucleïnezuren voor downstream genomische en epigenomische analyses worden verbeterd. Door monsterheterogeniteit en uitputting te verminderen, ondersteunt het een betrouwbaardere toetsing van target-hypotheses en mechanistische risicoreductie in preklinische pipelines.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt hypothese-gestuurde analyse van kankerspecifieke regio's mogelijk om de betrokkenheid van signaalpaden en de relevantie van therapeutische targets te verduidelijken.
- Operationele waarde: Vermindert biologische ruis door regio's van belang te isoleren, wat de betrouwbaarheid van targets verbetert tijdens vroege stadia van targetvalidatie.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert hoogwaardig RNA en DNA dat geschikt is voor multi-analyte genexpressieplatforms en methylatiespecifieke PCR, wat een robuuste assay-ontwikkeling mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Een gestandaardiseerde workflow voor weefselboring en extractie verbetert de reproduceerbaarheid over verschillende screeningcampagnes heen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de afstemming van translationele biomarkers door de co-extractie van RNA en DNA uit gearchiveerde kankerstalen voor correlatieve studies mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Faciliteert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door middel van consistente moleculaire profilering van preklinische modellen.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode wordt geïntegreerd in discovery-workflows door gerichte moleculaire analyse van archiefweefsels mogelijk te maken, wat de identificatie van lead-compounds ondersteunt via biomarker-gekoppelde target-validatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten en het verduidelijken van pathways door moleculaire profilering mogelijk te maken van nauwkeurig in kaart gebrachte weefselregio's.
- Screening: Verbetert de assay-gereedheid via gestandaardiseerde, hoog-rendement extractie van nucleïnezuren uit gedefinieerde monsters.
- Analytics: Genereert kwantitatieve RNA- en DNA-outputs die geschikt zijn voor qPCR, methyleringsanalyse en genexpressieprofilering.
- Translationeel onderzoek: Verbindt discovery met preklinische continuïteit door biomarkeranalyse in gearchiveerde menselijke weefsels mogelijk te maken.
- Enterprise Reuse: Creëert een herbruikbare capaciteit voor moleculaire pathologieteams om nucleïnezuren te extraheren uit diverse gearchiveerde weefselcollecties.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit uit heterogene monsters te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en schaalbaarheid van nucleic acid-extractie uit archiefweefsels.
- Strategische waarde: Ondersteunt betere go/no-go-beslissingen door de datakwaliteit uit kostbare archiefmonsters te verbeteren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk via betrouwbare moleculaire profilering van weefselgebaseerde biomarkers.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in weefselmicroscopie en moleculaire pathologie voor een nauwkeurige mapping van de regio's van belang.
- Afhankelijk van toegang tot microarray-ponsjes, homogenisatoren en standaard reagentia voor nucleic acid-extractie.
- Noodzaak van standaardisatie tussen pathologie- en moleculaire biologie-eenheden voor een consistente monsterverwerking.
- Aanpassing aan verschillende weefseltypen kan optimalisatie van de deparaffinatie- en digestiestappen vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de afhankelijkheid van weefselintegriteit en de nauwkeurigheid van annotaties in archiefmonsters.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Tissue Coring
2:40
Deparaffinization of the FFPE Tissue Cores
3:45
Homogenization of the Deparaffinized Cores
5:07
Digestion with Proteinase K and Nucleotide Separation
6:12
Results: Assessment of RNA and DNA Recovery and Integrity and Representative Performance in Downstream Analysis
7:50
Conclusion
