Vergelijking van de Tabak Host Cell Protein methode voor het verwijderen van blancheren intacte planten of door een warmtebehandeling van Extracten

Het algemene doel van deze reeks experimenten is om plant-gastheercelproteïnen neer te slaan met behulp van hitte. Hiermee wordt de daaropvolgende chromatografische zuivering van recombinante biofarmaceutische proteïnen vergemakkelijkt. Deze methode kan helpen om de procesontwikkeling te stroomlijnen en de productstabiliteit te verhogen, bijvoorbeeld door gastheerproteasen te activeren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze eenvoudig kan worden geïmplementeerd in bestaande proteasen en snel kan worden aangepast aan verschillende doeleiwitten. De procedure zal worden gedemonstreerd door Hannah Gruchow, een masterstudent uit mijn laboratorium. Om gastcelproteïnen door verhitting neer te slaan.

Bijvoorbeeld uit tabaksbladeren. Nadat de tabaksplanten zijn gekweekt volgens het tekstprotocol, wordt een waterbad met een werkvolume van acht liter ingericht in een thermisch geïsoleerde polystyreenschuimemmer. Plaats de gehele opstelling op een magnetische roerplaat en plaats een magneetvis in het waterbad.

Omring de roerstaaf vervolgens met een niet-magnetische steunplaat die ongeveer één centimeter boven de roerstaaf uitsteekt. Hierop zal later in de procedure een polypropyleenmandje worden geplaatst. Voeg acht liter buffer toe aan het waterbad.

Plaats vervolgens een polypropyleen mand van 23 bij 23 bij 23 centimeter op de steuntegels. Zorg ervoor dat de steun de rotatie van de roerstaaf niet belemmert en dat de mand volledig in de vloeistof is ondergedompeld. Verwijder daarna de mand.

Gebruik een instelbare thermostaat om het waterbad op 70 °C te brengen. Wacht ten minste 15 minuten nadat de gewenste temperatuur is bereikt om er zeker van te zijn dat de gehele opstelling het thermisch evenwicht heeft bereikt. Bereid vervolgens aliquots van 150 gram van de tabaksbladeren.

Plaats één aliquot in het mandje, waarbij irreversibele compressie en beschadiging van de bladeren, zoals scheuren, wordt voorkomen. Dompel het mandje voorzichtig maar snel onder in de hete vloeistof en plaats het op de ondersteuningstegels.

Plaats vervolgens een roestvrijstalen blok bovenop de mand om drijven te voorkomen. Incubeer de bladeren gedurende vijf minuten in de blancheringsvloeistof, of kies een tijdstip dat geschikt is voor het experimentele ontwerp.

Houd de temperatuur van de vloeistof gedurende de gehele incubatieperiode in de gaten. Verwijder na de incubatie voorzichtig de mand uit het blancheringsmedium en laat de bladeren 30 seconden uitlekken. Haal vervolgens de plantenbladeren uit de mand, breng ze over naar de blender en start onmiddellijk de extractie volgens de tekstprotocollen.

Om neergeslagen HCP's te verhitten in een geroerd vat. Plaats een waterbad op een magnetische roerplaat en zet een roestvrijstalen vat van twee liter in het waterbad, zodanig dat het midden van het vat is uitgelijnd met het midden van de roerplaat. Plaats een magnetische roerstaaf in het roestvrijstalen vat.

Vul het vat met extractiebuffer. Vul het vervolgens met gedeïoniseerd water. Vul het waterbad tot vijf centimeter onder de bovenrand van het roestvrijstalen vat.

Gebruik een polystyreen schuimdeksel om het af te dekken. Plaats vervolgens een thermometer door een opening in het deksel in het roestvrijstalen vat. Stel daarna de temperatuur van het waterbad in op 78 degrees Celsius en incubeer de gehele opstelling 15 minuten om thermisch evenwicht te bereiken.

Wanneer de opstelling in evenwicht is, leegt u het vat en giet u 300 milliliters extract in het vat terwijl dit nog in het waterbad staat, en start u de timer. Roer het extract bij 150 rpm terwijl het gedurende vijf minuten wordt geïncubeerd. Zorg ervoor dat het extract tijdens de incubatieperiode gedurende ten minste twee minuten een temperatuur van 70 degrees Celsius bereikt.

Verwijder na de incubatie het warme waterbad van de magnetische roerder. Haal het roestvrijstalen vat eruit en plaats het in een emmer met ijskoud water. Plaats de emmer vervolgens op de roerplaat.

Zorg ervoor dat het plantenhomogenaat goed wordt geroerd bij 150 rpm. Plaats de thermometer in het extract en incubeer dit totdat een temperatuur van 20 °C of de gespecificeerde temperatuur is bereikt. Nadat twee waterbaden met een werkvolume van acht liter zijn ingericht volgens het tekstprotocol, dient het eerste bad te worden gevuld met gedeïoniseerd water.

Stel de thermostaat in op 74,5 °C en incubeer de assemblage gedurende 15 minuten om thermisch evenwicht te bereiken. Bereid een geïsoleerd bewaarmiddel voor door een plastic beker van 0,5 liter in een plastic beker van één liter te plaatsen. Gebruik een isolatiemateriaal zoals watten om de tussenruimten op te vullen.

Sluit de warmtewisselaar met LS24-slangen aan één uiteinde aan op een peristaltische pomp en aan het andere uiteinde op een uitlaatslang. Plaats beide uiteinden van de slangen samen met de thermometer in het geïsoleerde opslagvat. Vul dit vervolgens met 300 millimeters extractiebuffer.

Plaats vervolgens de warmtewisselaar in het warme waterbad en start de peristaltische pomp met een snelheid van 300 milliliters per minuut. Controleer na drie minuten of de resulterende temperatuur in het vat 70 degrees Celsius is. Dit ligt ongeveer 4,5 degrees Celsius onder het ingestelde punt van het waterbad.

Gooi de extractiebuffer uit het geïsoleerde vat en bereid aliquoten van 300 milliliter van het plantenextract voor. Vul het geïsoleerde vat vervolgens met één alikwot. Pomp nu het plantenextract gedurende vijf minuten met een snelheid van 300 milliliter per minuut door de warmtewisselaar.

Zorg vervolgens dat de temperatuur van het extract na drie minuten 70 °C is of gelijk is aan de temperatuur die in het experimentele ontwerp is aangegeven. Plaats de warmtewisselaar na vijf minuten in het ijskoude waterbad. Controleer of de temperatuur van het extract onder de 30 °C ligt voordat u verdergaat.

Verwijder de inlaatslang die is aangesloten op de peristaltische pomp uit het geïsoleerde vat. Ga door met pompen om het resterende door warmte geprecipiteerde plantextract uit de warmtewisselaar te verzamelen. Stop vervolgens de pomp.

Om zakfiltratie van het plantextract uit te voeren, plaatst u een zakfilter in de bijbehorende ondersteuningsmand die is ingemonteerd in de filterbehuizing. Plaats een vessel van één liter onder de mand en breng de extractaliquots aan op de zak met een snelheid van 150 milliliters per minuut. Gebruik na filtratie een turbidimeter om de troebelheid van een 1 op 10 verdunning van het filtraat in extractiebuffer te meten.

Neem een aliquot van één milliliter van het monster en verwerk het filtraat uit de zak. Bijvoorbeeld via dieptefiltratie en chromatografie. Analyseer het monster vervolgens verder volgens het tekstprotocol.

Hitteprecipitatie van gastcelproteïnen door blancheren vermindert het totaal oplosbare eiwit of TSP met 96 plus of minus één procent. Blancheren herstelde tot 83 plus of minus één procent van DsRed en 51 procent van het Vax8-doeleiwit, waardoor de zuiverheid toenam van 0,1 procent naar 1,2 procent vóór de chromatografische scheiding.

De filtercapaciteit nam af bij blancheringstemperaturen boven de 63 °C. Dit kan worden opgelost door flocculanten toe te voegen na de eiwitextractie en filterhulpmiddelen na de zakfiltratie. Een geroerde reactor voor hitteprecipitatie verwijderde maximaal 84 ± 1% HCP's.

Er werd een zuiverheid bereikt van 0,33 ± 0,02 procent voor Vax8 en 20,2 ± 1,4 procent voor DsRed. In tegenstelling tot blancheren en de opstelling met de warmtewisselaar, verhoogt HCP-precipitatie in een vat de capaciteit van de daaropvolgende dieptefiltratie met een factor 2,5. Dit weerspiegelt de lagere schuifkrachten in het vat in vergelijking met het pompen van extract door de warmtewisselaar of homogenisatie na het blancheren.

Ongeveer 88,3 ± 0,7 procent van de HCP-inhoud werd consistent uit het extract verwijderd met behulp van een warmtewisselaar tussen 60 en 70 °C. Hierbij werd een zuiverheid van 0,31 ± 0,01 procent bereikt voor Vax8 en 27,6 ± 2,0 procent voor DsRed.

Ten slotte behaalde de warmtewisselaar ook de laagste capaciteit van het downstream dieptefilter. Er werden slechts 13.5 ± 6.0 liter per vierkante meter geklaard voordat verstopping optrad. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in minder dan 50 minuten plus de tijd voor de monsterverwerking worden uitgevoerd, mits deze correct wordt uitgevoerd.

Bij het uitvoeren van deze methode is het belangrijk om er rekening mee te houden dat het doeleiwit hittebestendig moet zijn. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals chromatografie, worden toegepast om het product verder te zuiveren tot het gewenste niveau. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van plantentechnologie om de zuivering van vaccinkandidaat-eiwitten en Nicotiana-soorten te onderzoeken.

Na het bekijken van deze video hebt u een goed inzicht gekregen in hoe u plantgastcelproteïnen kunt neerslaan middels blancheren, een geroerde reactor of een warmtewisselaar.