Het bepalen van onderdrukking van het immuunsysteem versus CNS Bescherming voor farmacologische interventies bij auto-Demyelinisatie
12 september 2016
Dit protocol beschrijft hoe te bepalen of farmacologische behandelingen voor experimentele auto-immuun encefalomyelitis CNS-bescherming vertonen als gevolg van het onderdrukken van immuuncel-infiltratie of neuroprotectief zijn tijdens de aanval van immuuncel-infiltratie.
Het algemene doel van deze conceptuele methode is om te bepalen of farmacologische behandelingen voor experimentele auto-immuun encefalomyelitis hun bescherming van het centrale zenuwstelsel aantonen tijdens de aanval van immuuncelinfiltratie of als gevolg van onderdrukking van immuuncelinfiltratie. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van neurale immunologie te beantwoorden. Bijvoorbeeld, hoe onderscheidt het manipuleren van EAE-behandelingstijden de effecten op immuuncelinfiltratie versus bescherming.
De implicaties van deze techniek strekken zich ook uit naar de therapie van multiple sclerose, omdat er momenteel geen neurale beschermende behandelingen voor deze ziekte zijn. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we ontdekten dat het behandelen van EAE-muizen met een remmer van de Xc-transporter van systeem zowel neuroprotectief als immunomodulerend was. Hoewel deze methode kan worden gebruikt om medicijnbehandelingen te bestuderen, kan deze ook worden toegepast op onderzoek met genetisch knockout-muizen die zijn onderworpen aan EAE of andere manipulaties.
Begin met het gebruik van steriele scharen om de hersenen en ruggenmerg van individuele dieren in kleine stukken te snijden. Gebruik vervolgens één plunjer van een drie milliliter spuit per weefsel om elk monster in individuele 70 micron celzeefjes te pletten in individuele 50 milliliter kegelbuizen terwijl de zeefjes worden gespoeld met medium. Wanneer alle stukken zijn gemalen, breng het uiteindelijke volume in de buizen op 50 milliliter met vers medium, centrifugeer vervolgens de celsuspensies.
Resuspendeer elk pellet in vier milliliter 40% dichtheidsgradiëntoplossing. Leg vervolgens de cel langzaam langs de wanden van individuele 15 milliliter kegelbuizen op de bovenkant van twee milliliter 70% dichtheidsgradiëntoplossing per buis. Scheid de cellen door centrifugatie en gebruik één milliliter overdrachtspipetten om voorzichtig de bovenste myelinelagen weg te gooien.
Breng vervolgens de levensvatbare cellen van de monstersinterface over in nieuwe 15 milliliter kegelbuizen en was de cellen in een eindvolume van 15 milliliter vers medium per buis. Resuspendeer de pellets in 200 microliter vers medium en breng de celsuspensies over in individuele putjes van een 96-welrondbodemplaat. Centrifugeer de plaat en gooi de supernatanten eraf.
Resuspendeer vervolgens de pellets in 200 microliter re-stimulatiemedium en incubeer de cellen gedurende vier uur bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, centrifugeer de plaat opnieuw en verwijder de supernatanten. Was vervolgens de cellen in 200 microliter PBS aangevuld met 2%FCS en resuspendeer de cellen in 200 microliter PBS aangevuld met 2%FCS en FC-blokker gedurende 10 tot 15 minuten op ijs.
Aan het einde van de incubatie, was de cellen zoals zojuist is aangetoond en resuspendeer de pellets in 15 microliter celoppervlaktekleuringcocktail gedurende 15 minuten op ijs. Draai vervolgens de cellen neer en was de monsters twee keer in 200 microliter PBS. Resuspendeer vervolgens de cellen in FOXP3 transcriptiefactorkleuringreagentia volgens de instructies van de fabrikant gedurende 30 minuten tot een nacht bij 4 graden Celsius.
Aan het einde van de incubatie, was de cellen in 150 microliter permeabilisatiebuffer. Centrifugeer vervolgens de cellen en resuspendeer de pellets in de intracellulaire antilichamen van belang in 15 microliter permeabilisatiebuffer op ijs. Na 30 minuten, draai de cellen neer gevolgd door drie wasbeurten in 200 microliter permeabilisatiebuffer.
Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de pellets in 200 microliter PBS en analyseer de monsters door middel van flowcytometrie, met poorting op de levende CD4-positieve, TCR bèta-positieve cellen. Het is ook belangrijk om de proliferatie van perifere T-cellen te beoordelen, omdat veranderingen in de periferie de immuuncelinfiltratie in het centraal zenuwstelsel kunnen beïnvloeden. Om het aantal astrocyten en gliacellen dat aanwezig is in de ruggenmergweefselmonsters na EAE-inductie te kwantificeren, verkrijg afbeeldingen van elke sectie bij een 4x-vergroting en sla de afbeeldingen op als TIFF-bestanden.
Selecteer vervolgens in ImageJ de gewenste afbeelding en gebruik het polygoonselectiegereedschap om de volledige ruggenmergweefselsectie na te trekken. Selecteer onder het afbeeldingsmenu type en 16-bits om de afbeelding om te zetten naar 16-bits. Open vervolgens het procesmenu en selecteer achtergrond onderwerp om de rolling ball-radius in te stellen op ten minste de grootte van het grootste object dat geen deel uitmaakt van de achtergrond.
Controleer de glijdende paraboloïde en klik op OK. Selecteer vervolgens onder afbeelding, aanpassen en drempel, en gebruik de glijdende balken om het onderste drempelniveau in te stellen. Om het percentage van het gedrempelde gebied binnen de geselecteerde regio te verkrijgen, selecteert u onder analyse en instellingen, gebiedsfractie. Zorg ervoor dat de limiet tot drempel is uitgeschakeld en dat de labelweergave is ingeschakeld, en klik op OK. Om de metingen te verkrijgen, selecteert u onder analyse, meten.
Er verschijnt een pop-upvenster met resultaten. Sla deze gegevens op en vergelijk de gebiedsfractiewaarden tussen de behandelingsgroepen. Om de myelinebasiskleuring door optische dichtheid te kwantificeren, opent u de gewenste afbeelding en gebruikt u het polygoonsectiegereedschap om een gebied van belang binnen het monster te tekenen.
Selecteer onder analyse en instellingen, gemiddelde grijswaarde en bevestig dat de limiet tot drempel is uitgeschakeld en dat de labelweergave is ingeschakeld. Klik op OK. Selecteer vervolgens onder het analysemenu, meten. Er verschijnt een nieuw pop-upvenster met de gegevens van de myelinebasisproteïne gemiddelde grijswaarde.
Verwijdering van het ruggenmerg en flowcytometrische analyse maakt de beoordeling van immuuncelinfiltratie in het centrale zenuwstelsel mogelijk, waarbij immuuncelinfiltratie maximaal is op het hoogtepunt van de ziekte. Statistische analyse van de CD4-positieve, interferon gamma-positieve, IL-17-positieve en FOXP3-positieve celgetallen kan de significantie van de waargenomen veranderingen in de CD4-posit
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om vast te stellen of farmacologische behandelingen voor experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) bescherming van het centrale zenuwstelsel bieden door immuuncelinfiltratie te onderdrukken of via neuroprotectieve effecten tijdens immuuncelinfiltratie. Deze aanpak is van groot belang voor het begrijpen van de implicaties van behandelingen bij multiple sclerose.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Immunologie
- Farmacologie
Achtergrond
- Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is een model voor het bestuderen van multiple sclerose.
- Huidige behandelingen missen neuroprotectieve opties.
- Inzicht in de dynamiek van immuuncellen is cruciaal voor de ontwikkeling van effectieve therapieën.
- Eerdere bevindingen gaven aan dat bepaalde behandelingen zowel neuroprotectief als immunomodulerend kunnen zijn.
Doel van de studie
- Om de effecten van farmacologische behandelingen op de infiltratie van immuuncellen en de bescherming van het centrale zenuwstelsel te differentiëren.
- Om de timing van EAE-behandelingen en de impact daarvan op immuunresponsen te onderzoeken.
- Om inzichten te verschaffen die kunnen leiden tot nieuwe therapeutische strategieën voor multiple sclerose.
Gebruikte methoden
- Isolatie en analyse van immuuncellen uit EAE-muismodellen.
- Flowcytometrie om T-celpopulaties en hun activatiestatus te beoordelen.
- Beeldanalyse voor het kwantificeren van astrocyten en gliacellen in ruggenmergweefsels.
- Statistische analyse om de effecten van behandelingen op de infiltratie van immuuncellen te vergelijken.
Belangrijkste resultaten
- Belangrijke verschillen in de infiltratie van immuuncellen geïdentificeerd op basis van het tijdstip van behandeling.
- De significantie van neuroprotectieve effecten in behandelde dieren aangetoond.
- Kwantitatieve gegevens verschaft over astrocyten- en gliacelpopulaties.
- Inzichten onthuld in de mechanismen van immuunmodulatie bij EAE.
Conclusies
- De methode maakt effectief onderscheid tussen de immunomodulerende en neuroprotectieve effecten van behandelingen.
- De bevindingen hebben implicaties voor de ontwikkeling van therapieën voor multiple sclerosis.
- Verder onderzoek is nodig om de langetermijneffecten van deze behandelingen te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Deze methode vult een kritische leemte in het onderzoek naar auto-immuun gedemyelinisering door onderscheid te maken tussen farmacologische interventies die CNS-bescherming bieden via directe neuroprotectie of indirect via de onderdrukking van de infiltratie van pathogene immuuncellen. Dit onderscheid is essentieel voor het beperken van risico's bij de validatie van targets en het sturen van portfoliobeslissingen bij de ontwikkeling van therapieën voor MS, waarbij de huidige immunomodulerende therapieën er niet in slagen om langdurige neurodegeneratie te voorkomen. Door een mechanistische scheiding van immunomodulerende en neuroprotectieve effecten mogelijk te maken, ondersteunt deze aanpak het voorspellend vertrouwen bij de selectie van targets en de afstemming van translationele biomarkers voor pijplijnen die gericht zijn op neuroprotectie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door te bepalen of de waargenomen bescherming van het CZS voortkomt uit de modulatie van immuuncellen of uit directe preservering van neuraal weefsel.
- Operationele waarde: Biedt een kader om targets te ontrisken door perifere immuuneffecten uit te sluiten als storende variabelen (confounders) voor CZS-uitkomsten.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de prioritering van targets door neuroprotectieve mechanismen te isoleren die onafhankelijk zijn van immunomodulatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, multiparametrische resultaten, waaronder flowcytometrische immuunprofilering en immunohistochemische kwantificering van astrocyten, gliacellen en myeline-integriteit.
- Operationele waarde: Standaardiseert weefselverwerking en analyseworkflows voor een reproduceerbare beoordeling van CNS-bescherming versus immunomodulatie over verschillende studiegroepen.
- Schaalbaarheid: Compatibel met genetische knockout- en farmacologische interventiemodellen in EAE, waardoor het platform hergebruikt kan worden voor validatiecampagnes van targets.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Koppelt de dynamiek van immuuncellen in EAE aan de menselijke MS-pathologie door het kwantificeren van T-cel-subsets die het CZS infiltreren en hun cytokinenprofielen.
- Mechanistische Risicoreductie: Verduidelijkt of het therapeutische voordeel voortvloeit uit verminderde immuun-gemedieerde schade of een verhoogde neuronale veerkracht tijdens een inflammatoire aanval.
- Biomarker-Afstemming: Ondersteunt de evaluatie van reactieve gliose en myelin basic protein als translationele biomarkers voor neuroprotectie of demyelinisatie.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking, van targetvalidatie tot preklinische beoordeling van de effectiviteit, waardoor teams specifiek de risico's van neuroprotectieve kandidaten kunnen verminderen door hun effecten te isoleren van immunomodulerende activiteit.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door behandelingseffecten te vergelijken die zijn toegediend vóór versus na de piek van immuuncelinfiltratie om het werkingsmechanisme te ontleden.
- Screening: Levert assay-klare, kwantitatieve outputs over immuuncelinfiltratie (CD4+, IFNγ+, IL-17+, FOXP3+ T-cellen) en de structurele integriteit van het CZS (optische densiteit van myelin basic protein, area fraction van astrocyten/glia).
- Analytica: Maakt statistische vergelijking mogelijk van co-expressieprofielen van immuuncellen en weefselkleuringsmetrieken om scheefgroei of confounders door perifere proliferatie uit te sluiten.
- Translationeel onderzoek: Verbindt EAE-immuundynamiek met MS-relevante pathways door kwantificering van de infiltratie van antigeen-ervaren T-cellen en gliale responsen in het CZS.
- Bedrijfsbrede hergebruikbaarheid: Vestigt een gestandaardiseerde capaciteit voor het evalueren van CZS-bescherming via diverse modaliteiten (small molecules, biologics, genetische modellen) in programma's voor auto-immuun demyelinisatie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Mechanistische risicoreductie van targets door immunomodulatie te onderscheiden van echte neuroprotectie.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde, reproduceerbare workflow voor multiparametrische CNS-immuunfenotypering.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door te onthullen of een kandidaat de ziekte modificeert via immunosuppressie of directe neurale ondersteuning.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde voortgang van neuroprotectieve kandidaten mogelijk met een duidelijkere mechanistische rationale.
Overwegingen voor de implementatie
- Expertise in flowcytometrie, immunohistochemie en beeldanalyse (ImageJ) voor multiparametrische gegevensverzameling.
- Toegang tot apparatuur voor centrifugatie, cel sorteren en fluorescentiemicroscopie voor de isolatie van immuuncellen en weefselkleuring.
- Standaardisatie van drempelwaarden en kleuringsprotocollen tussen laboratoria om de vergelijkbaarheid van metingen van de area fraction en optische dichtheid te waarborgen.
- Overwegingen voor aanpassingen bij verschillende knaagdierstammen, ziekte heeft modellen en weefselverwerkingstijden die de celviabiliteit en antigenbehoud beïnvloeden.
- Praktische beperking: Vereist een zorgvuldige temporele afstemming van de toediening van het geneesmiddel ten opzichte van de pieken van immuuncelinfiltratie om het werkingsmechanisme te isoleren.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
4:44
Quantification of Reactive Gliosis Using Mean Fraction Area and Myelin Using Optical Density
2:57
Central Nervous System (CNS) CD4+ T Cell Phenotype Assessment
6:52
Results: System Xc-transporter Inhibition Attenuates T Cell CNS Infiltration and Myelin Destruction
8:31
Conclusion
1:10
Brain and Spinal Cord Immune Cell Isolation
