Name: Het bepalen van onderdrukking van het immuunsysteem versus CNS Bescherming voor farmacologische interventies bij auto-Demyelinisatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Leer een methode om farmacologische interventies bij EAE te evalueren op immuunsuppressie versus CNS-bescherming. Dit helpt bij het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën voor multiple sclerose.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door NINDS P30-NS069324, The National Multiple Sclerosis SocietyRG 4587-A-1, De Civitan International Research Foundation, The Mike L. Jezdimir Transversale Myelitis Foundation, de Universiteit van Alabama Health Services Foundation - General Endowment Fund, The National Science Foundation 1355183, en T32 AI007051 van het Nationaal Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekten, National Institutes of Health.

<ol><li>Teitelbaum, D., Meshorer, A., Hirshfeld, T., Arnon, R., Sela, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+by+a+synthetic+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by a synthetic polypeptide.</a> Eur J Immunol. 1, 242-248 (1971).</li>
<li>Yednock, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+by+antibodies+against+alpha+4+beta+1+integrin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prevention of experimental autoimmune encephalomyelitis by antibodies against alpha 4 beta 1 integrin.</a> Nature. 356, 63-66 (1992).</li>
<li>Ridge, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+by+mitoxantrone%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+immunology+and+immunopathology%22%5BJournal%5D)">Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by mitoxantrone.</a> Clinical immunology and immunopathology. 35, 35-42 (1985).</li>
<li>Steinman, L., Zamvil, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+successfully+apply+animal+studies+in+experimental+allergic+encephalomyelitis+to+research+on+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis.</a> Annals of Neurology. 60, 12-21 (2006).</li>
<li>Kuerten, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MP4-+and+MOG%3A35-55-induced+EAE+in+C57BL%2F6+mice+differentially+targets+brain%2C+spinal+cord+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">MP4- and MOG:35-55-induced EAE in C57BL/6 mice differentially targets brain, spinal cord and cerebellum.</a> J Neuroimmunol. 189, 31-40 (2007).</li>
<li>Brownell, B., Hughes, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+plaques+in+the+cerebrum+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The distribution of plaques in the cerebrum in multiple sclerosis.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 25, 315-320 (1962).</li>
<li>Kidd, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+lesions+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Cortical lesions in multiple sclerosis.</a> Brain. 122 (Pt 1), 17-26 (1999).</li>
<li>Kutzelnigg, A., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+lesions+and+brain+atrophy+in+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+neurological+sciences%22%5BJournal%5D)">Cortical lesions and brain atrophy in MS.</a> Journal of the neurological sciences. 233, 55-59 (2005).</li>
<li>Geurts, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+lesions+in+multiple+sclerosis%3A+combined+postmortem+MR+imaging+and+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22AJNR+Am+J+Neuroradiol%22%5BJournal%5D)">Cortical lesions in multiple sclerosis: combined postmortem MR imaging and histopathology.</a> AJNR Am J Neuroradiol. 26, 572-577 (2005).</li>
<li>Rasmussen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+activation+of+microglia+is+associated+with+neuronal+dysfunction+of+callosal+projecting+pathways+and+multiple+sclerosis-like+lesions+in+relapsing--remitting+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing--remitting experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain. 130, 2816-2829 (2007).</li>
<li>Evonuk, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+System+Xc%28-%29+Transporter+Attenuates+Autoimmune+Inflammatory+Demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of System Xc(-) Transporter Attenuates Autoimmune Inflammatory Demyelination.</a> J Immunol. 195, 450-463 (2015).</li>
<li>Rowse, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium+controls+central+nervous+system+autoimmunity+through+modulation+of+IFN-gamma+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Lithium controls central nervous system autoimmunity through modulation of IFN-gamma signaling.</a> PloS one. 7, e52658(2012).</li>
<li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+%28MOG35-55%29+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Flaherty, S., Reynolds, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Naive+CD4%2B+T+Cell+Isolation+and+In+vitro+Differentiation+into+T+Cell+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>McWilliams, I. L., Rajbhandari, R., Nozell, S., Benveniste, E., Harrington, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT4+controls+GM-CSF+production+by+both+Th1+and+Th17+cells+during+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">STAT4 controls GM-CSF production by both Th1 and Th17 cells during EAE.</a> J Neuroinflammation. 12, 128(2015).</li>
<li>Legoux, F. P., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide%3AMHC+tetramer-based+enrichment+of+epitope-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Law, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Foxp3+antibody+and+fixation%2Fpermeabilization+buffer+combinations+in+identifying+CD4%2BCD25%2BFoxp3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A+%3A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">The importance of Foxp3 antibody and fixation/permeabilization buffer combinations in identifying CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells.</a> Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75, 1040-1050 (2009).</li>
<li>Strober, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Monitoring cell growth.</a> Current protocols in immunology. Appendix 3, Appendix 3A(2001).</li>
<li>Korn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin-specific+regulatory+T+cells+accumulate+in+the+CNS+but+fail+to+control+autoimmune+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Myelin-specific regulatory T cells accumulate in the CNS but fail to control autoimmune inflammation.</a> Nature medicine. 13, 423-431 (2007).</li>
<li>Pierson, E. R., Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+promote+induction+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+by+facilitating+reactivation+of+T+cells+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">B cells promote induction of experimental autoimmune encephalomyelitis by facilitating reactivation of T cells in the central nervous system.</a> Journal of immunology. 192, 929-939 (2014).</li>
<li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+depletion+with+rituximab+in+relapsing-remitting+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">B-cell depletion with rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis.</a> The New England journal of medicine. 358, 676-688 (2008).</li>
<li>Bar-Or, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rituximab+in+relapsing-remitting+multiple+sclerosis%3A+a+72-week%2C+open-label%2C+phase+I+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis: a 72-week, open-label, phase I trial.</a> Ann Neurol. 63, 395-400 (2008).</li>
<li>Kappos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocrelizumab+in+relapsing-remitting+multiple+sclerosis%3A+a+phase+2%2C+randomised%2C+placebo-controlled%2C+multicentre+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Ocrelizumab in relapsing-remitting multiple sclerosis: a phase 2, randomised, placebo-controlled, multicentre trial.</a> Lancet. 378, 1779-1787 (2011).</li>
<li>Berer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+microbiota+and+myelin+autoantigen+cooperate+to+trigger+autoimmune+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Commensal microbiota and myelin autoantigen cooperate to trigger autoimmune demyelination.</a> Nature. 479, 538-541 (2011).</li>
<li>Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronavirus+infection+of+the+central+nervous+system%3A+host-virus+stand-off%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).</li>
<li>Anghelina, D., Pewe, L., Perlman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+role+for+virus-specific+CD4+T+cells+in+mice+with+coronavirus-induced+acute+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pathogenic role for virus-specific CD4 T cells in mice with coronavirus-induced acute encephalitis.</a> The American Journal of Pathology. 169, 209-222 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Patiënten met MS blijven ziekte recidieven ervaren tijdens het nemen van drugs dat T cel activatie en / of infiltratie te verzwakken in het centraal zenuwstelsel, rechtvaardigt de ontwikkeling van de behandeling opties die het centrale zenuwstelsel rechtstreeks te beschermen. EAE is klassiek gebruikt om de symptomen van MS model en kan een krachtig hulpmiddel zijn bij het ​​bestuderen van de aard van de interacties tussen het immuunsysteem en het centrale zenuwstelsel in vivo. Gebruik timing van de behandeling overwegingen in EAE, bijvoorbeeld voor of na het begin van ziekte, in samenhang met de behandeling immuuncel infiltratie in het CZS en proliferatie en activering in de periferie is het mogelijk de effecten van behandelingen in te gaan op zowel het immuunsysteem het CNS. Terwijl EAE in de C57BL / 6 muis op grotere schaal toegepast, kunnen EAE in SJL muizen representatiever voor de meeste gevallen van MS, omdat deze muizen een relapsing remitting fenotype en infiltratie van immuuncellen in het parenchymvan de hersenen 10. SJL muizen duidelijk herstel tijdens remissie en maakt het mogelijk om de behandeling te beginnen nadat de ziekte is gepresenteerd, maar in tijden van verminderde ontsteking. Het is belangrijk om te overwegen dat SJL muizen niet altijd terugvallen en afdragen synchroon, wat resulteert in potentieel grote variabiliteit wanneer de resultaten worden samengevoegd. Daarom kunnen sommige onderzoekers kiezen om representatieve resultaten voor de klinische scores te tonen van het ene dier tijdens het gebruik van muizen voor FACS-analyse en histologie bij geïndividualiseerde punten in de progressie van de ziekte. Aangezien bij manipulaties worden gegeven aan EAE muizen kunnen helpen bij het bepalen hoe een behandeling beïnvloedt het immuunsysteem of CNS. Er zijn vele opties voor als behandeling begint, elk met zijn eigen connotatie of immuuncellen het CZS heeft ingevoerd en hoe ze kunnen krijgen met het CNS. Behandeling vóór aanvang van de symptomen impliceert dat immuuncellen nog niet heeft ingevoerd of veroorzaakt schade aan het centrale zenuwstelsel.Behandeling na aanvang van de symptomen impliceert dat afweercellen de CNS zijn binnengekomen en wat schade hebben veroorzaakt. SJL-muizen gebruikt, kan de behandeling ook beginnen in een terugval, waarbij immuuncellen actief infiltreren en die ontsteking of tijdens remissie, waarbij immuuncellen minder vaak in het CZS kunnen met minder ontstekingen. Initiële hypotheses over hoe behandelingen beïnvloeden het CNS en het immuunsysteem kan worden gemaakt bij het overwegen wanneer immuuncellen in het ziekteproces tijdens de behandeling. Er zijn een aantal manieren waarop behandelingen kunnen beïnvloeden immuuncellen en de CNS, elk met het eindresultaat van het verminderen ernst van EAE symptomen. Daarom is het noodzakelijk om flowcytometrische analyse en immunohistochemie om te kijken hoe immuuncellen worden beïnvloed in de periferie en CZS of immuuncellen het CZS heeft ingevoerd, en hoe het CZS reageert op behandeling. Terwijl flowcytometrische analyse van het ruggenmerg kan bepalen hoeveel cellen have ging de CNS op een gegeven moment, kan men vaststellen dat dit effect door verminderde immuuncel handel tenzij proliferatie van immuuncellen wordt niet beïnvloed in de milt. Daarom is het noodzakelijk om zowel perifere als CNS weefsel te analyseren en te bepalen welke resultaten mechanistisch bedoel wanneer beide weefsels worden vergeleken. Het is ook mogelijk dat immuuncel activiteitsprofielen worden gewijzigd door behandeling, bijvoorbeeld met een schakelaar in een pathogene helper T-cel-zwaar profiel een regulatoire T cel zware profiel. Kijkend naar merkers voor verschillende celtypes en vergelijken procent expressie tussen behandelde en onbehandelde dieren is dan ook een belangrijke overweging. Een nieuwe concept in het MS onderzoek suggereert dat B-cellen een belangrijke rol in auto-immune demyelinisatie spelen. Dit is gebaseerd op studies blijkt dat B-cellen nodig zijn voor de reactivering van T-cellen 20. Dit concept wordt ondersteund door het succes van behandelingen zoals rituximab, een antilichaam tegen CD20 exgedrukt op het oppervlak van B-cellen 21,22. Zoals aangetoond door het succes van het monoklonale antilichaam ocrelizumab in klinische studies, kunnen medicijnen die verschillende epitopen van CD20 de werkzaamheid van B-cel gerichte therapieën 23 verbeteren. Een beperking van de hier gepresenteerde technieken is dat het mogelijk is immuuncellen het CZS voeren maar niet in staat om in de parenchym. Immunohistochemie kan worden gebruikt om perivasculaire cuffing van immuuncellen detecteren en beoordelen afstand in het parenchym tussen behandelde en onbehandelde dieren. Een andere mogelijke beperking betreft de werking van de microbiome op EAE pathogenese. Commensal darmflora kan een enorme invloed op de ziekte pathogenese 24; derhalve muizen ondergebracht in verschillende kolonies en zelfs in verschillende kooien kunnen grote verschillen in ernst van de ziekte hebben. Dienovereenkomstig is het altijd beter om waar mogelijk nestgenoot controles opgegroeid in dezelfde kooi voor gebruikexperimenten met EAE. Een laatste opmerking is dat als het experimenteel wenselijk het immuunsysteem van cel proliferatieve veranderingen in de periferie te elimineren, kan het mogelijk zijn om dit te doen met passieve overdracht inductie in plaats van de actieve inductie beschreven in dit protocol. Verdere bevestiging voor neuroprotectie kunnen worden met behulp van een co-kweeksysteem 11 specifieke mechanismen van celdood of door het gebruik van conditionele knockout muizen die zorgt voor verwijdering van eiwitten op selectieve wijze op een celtype testen. Bovendien, om de exploratie van farmacologische middelen die neuroprotectieve zijn uit te breiden, moet markers van axonale doorsnijding en neuronale dood worden opgenomen. Een ander punt van belang is remyelinisatie. Gewonde axonen zijn niet remyelinate lenen verdere ondersteuning dat neuroprotectieve therapieën een belangrijk onderdeel van remyelinisatie therapie moet worden. Bovendien, niet-gemyeliniseerde axonen zijn gevoeliger voor schade dan myelinated axonen. Dit suggereert dat wanneer een axon wordt gedemyeliniseerde therapeutische interventies die tijdig remyelination zal axonen letsel te voorkomen promoten. Om deze mogelijkheden te ontdekken, kunnen andere in vivo modellen voor demyelinisatie en remyelinisatie worden gebruikt (bijv cuprizone en lysolecithine). De hierin beschreven werkwijze gericht op het beoordelen van neuroprotectie door het kwantificeren van myeline verlies. Voor de evaluatie van remyelinisatie het aantal voorlopercellen en hun vermogen om te prolifereren en rijpen ook belangrijk onderzoeken. Met het noemen van deze alternatieve modellen, moet men ook rekening houden met verschillende modellen van hersenontsteking die viraal worden bemiddeld. Er zijn twee goed gekarakteriseerde virale RNA modellen myeline verlies produceren: men Theiler&#39;s murine encephalomyelitis, een niet-omhulde Picornaviridae virus, en de andere muis hepatitis virus, lid van de familie Coronaviridae virus 25,26. EAE is een waardevol instrument voor studies hoe manipulaties of behandelingen invloed op het immuunsysteem en het CZS in vivo. Het protocol beschreven kunnen helpen bepalen waar behandelingen beïnvloeden het ziekteproces, of het nu in de periferie van de bloed-hersenbarrière of in het CZS. Geen huidige behandelingen voor MS te genezen van de ziekte en de patiënten vaak last van verval in de tijd. Evenzo kunnen andere ziekten waarbij immune cel infiltratie in het CNS en de afbraak van myeline, waaronder acute gedissemineerde encefalomyelitis, transversale myelitis en neuromyelitis optica, gebrek behandelingen die het CZS beschermen zij rechtstreeks aangevallen door infiltrerende immuuncellen. Gezien de timing van de behandeling en het gebruik van flowcytometrische analyse van de milt en het ruggenmerg samen met immunohistochemie van het centraal zenuwstelsel aan ontsteking en beschadiging evalueren zal zorgen voor mechanische vaststellingen worden gemaakt voor behandelingen.

Multiple sclerose (MS) wordt gekenmerkt door inflammatoire lesies overwegend witte stof hersengebieden begin van de ziekte. Na langdurige progressie is grijze stof atrofie gedetecteerd door MRI en markeert de neurodegeneratieve fase van de ziekte. Reactieve gliosis, demyelinisatie en axonale schade in de witte stof worden toegeschreven aan CNS-infiltrerende immuuncellen. Geen van de behandelingen momenteel in MS keren of direct neurodegeneratie te voorkomen in het CZS - maar verminderen ze ontstekingen dempt T-celactivering en / of infiltratie in het CNS. Omdat er geen genezing voor MS en patiënten met behulp van de huidige behandelingen blijven progressie van de ziekte ervaren, ontdekkingen van geneesmiddelen die demyelinisatie en neuronale verlies te voorkomen zijn van cruciaal belang. Echter een verschil tussen de effecten op immune cellen en die op het centrale zenuwstelsel kan moeilijk experimenteel zijn, als resultaat - dat wil zeggen, minder schade aan het CZS - ziet de same ongeacht de mechanismen waardoor het zich voordoet. Daarom moet het mogelijk CZS bescherming worden samen met beoordeling van CNS-infiltrerende immuuncellen en proliferatie van immuuncellen in de periferie te bepalen hoe farmacologische middelen beïnvloeden ziektemechanisme. Experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) is een gevestigde diermodel van autoimmune ontstekingsziekten die direct verantwoordelijk voor de ontdekking van geneesmiddelen die momenteel voor de behandeling van MS 1-4 was. Muizen worden vaak gebruikt voor EAE, met C57BL / 6-muizen een populaire soort, afkomstig van de beschikbaarheid van genetische varianten. C57BL / 6-muizen geïnduceerd met EAE vertonen chronische progressie van de ziekte optreden rond dag 10 na inductie. Infiltratie van het ruggenmerg parenchym en cerebellum zijn kenmerkend voor de histopathologie van deze dieren, met afwezigheid van infiltratie in de corticale parenchym 5. Bovendien, corticale letsels en demyelinisatie in Bregen zijn kenmerken van de ziekte 6-9, die relatief afwezig in C57BL / 6 muizen. Daarom kan het de voorkeur indien mogelijk SJL muizen, die recidieve ziekten en afwijkingen in zowel de hersenen en het ruggenmerg die vergelijkbaar zijn met die in MS 10 weergegeven hebben gebruikt. De behandeling kan niet worden aangemerkt als neurobeschermende als immuuncellen de CNS nooit bereiken. Daarom dit protocol maakt gebruik van flowcytometrische analyse van hersenen, ruggenmerg en de milt van muizen EAE behandelingseffecten op immuuncellen infiltratie in het CNS en de proliferatie van immune cellen in de periferie te bepalen zoals eerder aangetoond 11. Immunohistochemische analyses van CZS-weefsel te bepalen omvang en aard van neuroprotectie wordt ook beschreven. Een combinatie van deze methoden maakt te bepalen of immune cellen geactiveerd en verspreidden zich in de periferie of immuuncellen ging de CNS en of het CNS was protected van ontsteking of beschadiging. Als neuroprotectieve effecten worden verdacht ondanks effecten op het immuunsysteem, kunnen onderzoekers veranderen behandeling starttijden na immune cel infiltratie in het CNS is opgetreden. Hier presenteren we een protocol met twee verschillende modellen van actieve EAE, een T-cel gemedieerde diermodel van MS en flowcytometrie analyse gecombineerd met immunohistochemie op verschillende tijdstippen tijdens de ziekte op de werkzaamheid van experimentele therapieën bepalen verschillende aspecten van MS pathogenese. Deze methode zal onderzoekers helpen bij het differentiëren tussen de effecten op het immuunsysteem proliferatie en infiltratie versus CNS bescherming cel, waardoor het makkelijker wordt om een ​​beperking van hoe drugs handelen pathogenese van de ziekte.

<table><tbody><tr><td>22 x 22 x 20 mm inbeddingsvorm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9719245</td><td></td></tr><tr><td>22 x 30 x 20 mm inbeddingsvorm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9531194</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutaan</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>30 x 22 x 20 mm inbeddingsvorm</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-30</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysering Buffer</td><td>Quality Biological</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>552775</td><td>0.2 mg/ml stock concentratie</td></tr><tr><td>anti-Foxp3-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5773-82</td><td>0.5 mg/ml stock concentratie</td></tr><tr><td>anti-GFAP (Cocktail)</td><td>Biolegend</td><td>835301</td><td>1 - 3 mg/ml stock concentratie</td></tr><tr><td>anti-Iba-1 Polyclonal Antibody (50 &#181;g)</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>0.5 mg/ml stock concentratie</td></tr><tr><td>anti-IFN-&gamma; APC</td><td>eBioscience</td><td>17-7311-82</td><td>0.2 mg/ml stock concentratie</td></tr><tr><td>anti-IL-17A PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-7177-82</td><td>0.2 mg/ml stock concentratie</td></tr><tr><td>anti-Ki-67 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5698-82</td><td>0.2 mg/ml stock concentratie</td></tr><tr><td>anti-MBP (D-18)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-13912</td><td>0.2 mg/ml stock concentratie</td></tr><tr><td>anti-TCR&beta; FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5961-85</td><td>0.5 mg/ml stock concentratie</td></tr><tr><td>anti-TCR&beta; PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5961-83</td><td>0.2 mg/ml stock concentratie</td></tr><tr><td>Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Vector Labs</td><td>BA-1000</td><td>1.5 mg/ml stock concentratie</td></tr><tr><td>Biotinylated Horse Anti-Mouse IgG</td><td>Vector Labs</td><td>BA-2000&nbsp;</td><td>1.5 mg/ml stock concentratie</td></tr><tr><td>Citroenzuur, Anhydraat, 99,5%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC42356-5000</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), tetranatriumzout dihydraat, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC446085000</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscoopglazen, doos van 10</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Golgi Plug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>eiwittransportremmer</td></tr><tr><td>Immedge Hydrofobe Barrière Pen</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9545623</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>EMD Millipore</td><td>407952-5mg</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine, 100x</td><td>Corning</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>MEM Niet-essentiële Aminozuren</td><td>Corning</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Near IR Live/Dead Kleuring Kit</td><td>Life Technologies</td><td>L10119</td><td>levensvatbaarheidskleurstof</td></tr><tr><td>Normaal geitenserum</td><td>Vector Labs</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Normaal paardenserum</td><td>Vector Labs</td><td>S-2000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 96%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC416785000</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine Oplossing, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td>dichtheidsgradient</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td>harsachtige montagemedium</td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA)</td><td>Sigma</td><td>P1585-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Gezuiverd anti-Myeline Basiseiwit Antilichaam</td><td>BioLegend</td><td>808401</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Pyruvaat</td><td>Corning</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>niet-ionogene detergent</td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC Kit (Standaard)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9206402</td><td>avidine-biotine-peroxidase&nbsp;complex (ABC) in immunoperoxidase&nbsp;</td></tr><tr><td>Vector Laboratories Peroxidase Substraat Kit (DAB)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9276270</td><td>DAB oplossing</td></tr></tbody></table>

het bepalen van onderdrukking van het immuunsysteem versus cns bescherming voor farmacologische interventies bij auto-demyelinisatie

Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination

Een belangrijk kenmerk van de auto-immuun demyeliniserende ziekte multiple sclerose (MS) is het binnendringen van immuuncellen in de hersenen en het ruggenmerg, wat resulteert in myelindestruc­tie, die niet alleen de geleiding van zenuwimpulsen vertraagt, maar ook axonale schade veroorzaakt, wat leidt tot motorische en cognitieve achteruitgang. Huidige behandelingen voor MS zijn gericht op het verminderen van het binnendringen van immuuncellen in het centrale zenuwstelsel (CZS). Deze behandelingen verminderen het aantal terugvallen, verbeteren de kwaliteit van leven, maar elimineren terugvallen niet volledig, waardoor langdurige handicap niet wordt verbeterd. Daarom zijn therapeutische middelen die het CZS beschermen gerechtvaardigd. Zowel in diermodellen als bij menselijke patiënten met MS wordt het binnendringen van T-cellen in het CZS over het algemeen beschouwd als het initiërende ontstekingsproces. Om te beoordelen of een geneesmiddel het CZS beschermt, moeten alle mogelijke effecten op het binnendringen of de proliferatie van immuuncellen in de periferie worden uitgesloten. Dit protocol beschrijft hoe te bepalen of CZS-bescherming die wordt waargenomen na geneesmiddelinterventie, een gevolg is van het verminderen van CZS-infiltrerende immuuncellen of het blokkeren van de dood van CZS-cellen tijdens ontstekingsstoten. De mogelijkheid om MS-behandelingen te onderzoeken die beschermend zijn voor het CZS tijdens ontstekingsstoten is zeer cruciaal voor de ontwikkeling van therapeutische strategieën, aangezien huidige behandelingen terugvallen verminderen, maar niet volledig elimineren (d.w.z. immuuncellen infiltratie), waardoor het CZS kwetsbaar blijft voor degeneratie.

Hier gebruikten we twee modellen van EAE te begrijpen als een farmacologisch middel biedt CNS bescherming door een verzachtende CNS-infiltrerende T-cellen of voorkomen van myeline en axonen letsel tijdens de aanval van inflammatoire immuun cel infiltratie. Om te bepalen of een therapeutisch middel voorkomt immune cel infiltratie in het ruggenmerg, is de C57BL / 6 muizenmodel van chronische EAE gebruikt wanneer immuuncellen infiltratie en pathologie voornamelijk ligt in het ruggenmerg (figuur 1A). Om te bepalen of een therapeutisch geneesmiddel verschaft CNS bescherming tijdens het binnendringen van immuuncellen in het CNS, de SJL diermodel van EAE recidieve gebruikt die pathologie toont in zowel de hersenen en het ruggenmerg (Figuur 1B). Clinical Assessments Relevante klinische evaluaties worden uitgevoerd volgens de volgende rubriek voor typische (figuur 1C) of atypische (figuur 1D) EAE. Voor typische klinische ziekte, een score van 0 is geen abnormaal gedrag. Als deze wordt opgepakt door de basis van de staart, kan de staart snel roteren (net als een helikopter rotor) en de achterste benen uit elkaar. Een klinische score van 1 is een gedeeltelijk slappe staart, die kan worden bepaald door het optillen van de muis door de basis van de staart. De gewone helikopter-achtige roterende kan worden verzwakt of afwezig zijn, en een deel van de staart kan volledig slap. Een handige manier om te bepalen omvang van de staart verlamming is om je vinger omhoog de lengte van de staart lopen, als een unparalyzed staart meestal krullen rond de vinger, terwijl een gedeeltelijk verlamd staart niet in staat om dat te doen zal zijn. Een klinische score van 2 een volledig verlamd staart. Geen beweging van de staart treedt helemaal bij het ophalen van de muis bij de basis van de staart. Een klinische score van 3 vertegenwoordigt een gedeeltelijke verlamming. Bepaling van deze score vereist dat de muis vrij te bewegen op een flat oppervlak. Als een achterpoot sleept als de muis naar voren beweegt, of als een of beide achterpoten lijken gedeeltelijk verlamd te zijn, kan een score van 3 worden gegeven. Een klinische score van 4 staat voor volledige verlamming van de achterpoten. Met deze score, zal een muis niet meer aan zijn achterpoten te bewegen en zal zich te slepen naar voren met behulp van de voorste ledematen. Een klinische score van 5 betekent een stervende muis of een muis met moeite bewegen zich over zijn kooi of ademhalen. Als een muis zich niet langs de bodem van de kooi of de ademhaling moeizaam kan slepen, moet de muis humane wijze worden gedood. Een klinische score van 6 een muis dood aangetroffen in zijn kooi. Een score van 6 is ongebruikelijk en de oorzaken van andere dan EAE de dood moeten worden onderzocht. Atypische klinische ziekte kan al dan niet gepaard gaan met verlamming. Het kan nodig twee aparte scoring omvatten als een muis weer met atypische ziekte plus typische symptomen. Een score van 0 is geen abnormaal gedrag, eens met de typische scoresysteem. Een klinische score van 1 betekent een lichte kop turn of kantelen, terwijl de muis loopt. Deze kan worden vastgesteld doordat de muis naar voren lopen en observeren van een constante links of rechts gerichtheid zijn beweging. Een klinische score van 2 geeft een meer uitgesproken hoofd te draaien en slechte oprichtende vermogen. Net als bij een atypisch score van 1, de muis heeft gerichtheid om zijn beweging en kan lichte problemen met de balans te hebben. Een klinische score van 3 vertegenwoordigt een onvermogen om te lopen in een rechte lijn. De muis zal moeilijk balanceren en kan gebruik maken van de kant van de kooi naar rechts te helpen zichzelf als het loopt. Een klinische score van 4 een muis tot op zijn kant, niet in staat om te lopen als gevolg van het balanceren van problemen. De muis in staat zijn om zich sleuren de bodem van de kooi, maar kan directionaliteit moet zijn beweging. Een klinische score van 5 vertegenwoordigt doorrolt tenzij ondersteund. Een muis die deze score bereikt worden op humane wijze gedood. Een clinical score van 6 een muis dood aangetroffen in zijn kooi. Een score van 6 is ongebruikelijk en de oorzaken van andere dan EAE de dood moeten worden onderzocht. Het kan nodig zijn om voor &quot;in-between&quot; scores zijn, bijvoorbeeld, het toevoegen van 0,5 tot een score als voorwaarde veranderingen een muis lichtjes of als kiezen tussen twee scores is moeilijk. Bijvoorbeeld, een muis die begint om langzamer te bewegen dan zijn normale tegenhangers, maar geeft geen verlamming, of een muis die zijn achterste poten omklemt met de voorkant in plaats van wijd te spreiden haar benen toen opgepikt door de staart kan een score van 0,5 worden gegeven . Een muis die zich alleen over de bodem van de kooi slepen en is alleen in staat om haar achterpoten periodiek trillen of bij aanraking kan een score van 3,5 wordt gegeven. Het beoordelen van een verlaging van de immuuncel Infiltration Na inductie van EAE in de C57BL / 6 muismodel (Figuur 1A, dag 0), antigeen Presentatop en proliferatie van T-cellen in de milt plaatsvinden op dagen 1-5 gevolgd door immuuncellen infiltratie in het CNS rond dag 7 ongeveer 3 tot 5 dagen na de initiële immune celinfiltratie muizen aanwezig met klinische scores. Te beoordelen of een therapeutisch middel blokkeert immune cel infiltratie in het ruggenmerg worden drugs of drager ingebracht op dag 7 na antigeen presentatie en proliferatie in de milt en vóór immuuncellen beginnen te infiltreren in het ruggenmerg. Als immune infiltratie is verzwakt, dient het klinisch ziekteverloop verbeterde klinische scores tijdens de stijgende fase van de ziekte van 10 tot 15 dagen (figuur 2) weerspiegelen. Een vermindering van immuun infiltratie zou ook resulteren in verminderde inflammatoire processen. Reactieve astrocytose en microgliosis worden beschouwd als de belangrijkste kenmerken voor neuroinflammatie. Kleuring voor astrocyten met GFAP en microglia met Iba-1 kan vervolgens worden gebruikt om te beoordelen Changes in gemiddelde oppervlak fractie kleuring kwantificeren neuroinflammatie (figuur 3). Om te bepalen of immuun cel infiltratie wordt verminderd, worden de ruggenmerg verwijderd en verwerkt voor flowcytometrie-analyse op het hoogtepunt van de ziekte (figuur 1A, ongeveer dag 18). Dit zorgt ervoor dat het grootste aantal immuuncellen in het ruggenmerg heeft ingevoerd. Ingang van T-cellen in het CZS wordt beschouwd als de initiërende gebeurtenis en inflammatoire zowel Th1 en Th17 cellen in dierlijke modellen van EAE en MS. Bij elkaar genomen, moet flowcytometrische analyse omvat de beoordeling van beide soorten pathogene T-cellen. Bovendien Tregs goed gekarakteriseerde suppressor-T-cellen die ziekte temperen. Daarom moet het percentage Tregs een totale CD4 + populatie geëvalueerd vergeleken met het percentage van effector T-cel populaties. Dit zal onthullen als een algehele vermindering van T-cel infiltratie heeft plaatsgevonden of als there is een scheeftrekken van T cel fenotypes in het CZS. Representatieve dot plots (Figuur 4A) tonen een vermindering van de totale aantal CD4 + infiltrerende T-cellen in het ruggenmerg van-geneesmiddel behandelde muizen in vergelijking met het ruggenmerg van het voertuig behandelde muizen (nummers in de rechterbovenhoek kwadranten). IFN-γ + IL-17 + en Foxp3 +, respectievelijk worden verlaagd (Figuur 4A): Th1, Th17 en Treg cellen de volgende ondertekening eiwitten geëvalueerd evalueren. Statistische analyse worden uitgevoerd op CD4 + IFN-γ + IL-17 + en Foxp3 + celaantallen significante reductie (figuur 4B) tonen. Uit te sluiten scheeftrekken van T cel subsets, statistische beoordeling van het percentage IFN-γ + IL-17 +, IFN-γ + IL-17 - IL-17 + IFN-γ - en Foxp3 + cellen wordt uitgevoerd ( Figuur 4C). Om de mogelijkheid dat een vermindering van CNS-infiltrerende T-cellen is een gevolg van de remming proliferatie, activatie en differentiatie in de periferie te elimineren, het aantal actief prolifererende T-cellen alsook de hoeveelheid T cel subtypes geëvalueerd worden. Geen verandering in het percentage CD4 + IFN-γ + IL-17 + of Foxp3 moeten vinden als activering en differentiatie niet beïnvloed (Figuur 5A). Bovendien moet geen verandering in Ki67 + CD4 + cellen worden gevonden als proliferatie niet beïnvloed (Figuur 5B). Geneesmiddelbehandelingen worden geïntroduceerd op dag 7 of hoger te vermijden wijziging initiële antigeenpresentatie en T-celactivering in de periferie. Echter, in de genetische modellen eiwitten worden vaak constitutief verwijderd tijdens embryogenese of geïnduceerde voor inductie van EAE maken splenocyten assessment van groot belang. Het beoordelen van CNS Protection Om aan te tonen of een bepaald therapeutisch middel moduleert ziekte pathologie in het CZS na immuuncel infiltratie, moet drug interventies worden toegediend tijdens de eerste piek in klinische ziekte scoren. De SJL model van EAE is voordelig voor deze experimenten aangezien deze muizen vertonen een relapsing-remitting fenotype. Als een behandeling met geneesmiddelen voorkomt myeline-axon degeneratie, zal een verbetering van de klinische scores worden waargenomen (Figuur 6). Pathologische beoordeling van myeline moet een vermindering myelinebeschadiging overeenstemming met verbeterde klinische scores bevestigen. Myeline integriteit DAB kleuring van myeline basisch eiwit kwantitatief te evalueren (MBP) wordt uitgevoerd, gevolgd door statistische analyse van de optische dichtheid voor deze kleuring (Figuur 7). Om verder te onderbouwen dat neuroinflammatie wordt ondersteund of verlaagd therapeTherapeutische interventies, kunnen reactieve gliosis worden beoordeeld door het meten gemiddelde fractie ruimte voor reactieve gliosis zoals hierboven (figuur 3) beschreven. Om te bevestigen dat een therapeutische interventie de CNS rechtstreeks beschermt zonder immunomodulerende effecten, moet verzwakking van het immuunsysteem cel infiltratie in het centraal zenuwstelsel en de proliferatie in de milt worden verdisconteerd. Om dit aan te pakken, moeten werkwijzen voor de hersenen en het ruggenmerg beoordeling van immuuncellen infiltratie en controle van het perifere proliferatie en activering van T-cellen wordt uitgevoerd zoals hierboven beschreven (figuren 4 en 5). Tezamen therapeutische middelen die celbeschadiging in het CNS blok geen bewijs voor een vermindering van CNS-infiltrerende T-cellen of proliferatie van T-cellen in de periferie CNS-beschermende behandelingen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig1.jpg" /> Figuur 1. Representatieve Results Klinische scores van EAE in C57BL / 6 en SJL muizen. (A) Klinische scores (gemiddelde ± SEM) van C57BL / 6 muizen (n = 10) geïnduceerd met MOG 35-55 om EAE te produceren met chronische ziekte. (B) Klinische scores (gemiddelde ± SEM) van SJL-muizen (n = 3) geïnduceerd met PLP 139-151 EAE produceren met recidieve ziekte. (C) De klinische scoring rubriek waarmee u een ziekteprogressie volgen in EAE muizen. (D) De klinische scoring rubriek gebruikt om atypische progressie van de ziekte in EAE muizen te volgen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54348/54348fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig2.jpg" /> Figuur 2. Farmacologische behandeling vóór immuuncel infiltratie in C57BL / 6 muizen met EAE. </strong&gt; Klinische score (gemiddelde ± SEM) van C57BL / 6 muizen die met PBS (n = 20) of SAS (n = 19) vanaf dag 7 immunisatie met MOG 35-55. De gegevens zijn afkomstig van drie samengevoegde onafhankelijke experimenten. Statistisch verschil werd bepaald met behulp van een niet-parametrische tweezijdige Mann-Whitney U test, * p &lt;0,05. Re-print met toestemming van (11). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig3.jpg" /> Figuur 3. immunofluorescentiekleuring en kwantificering van reactieve gliosis in ruggenmerg of Control, EAE en behandelde C57BL / 6 muizen. (A) Fluorescente labeling voor GFAP (astrocyten) en Iba-1 (microglia) in het ruggenmerg van controle (niet-geïmmuniseerde ) muizen (links panelen) en EAE muizen behandeld met PBS (middelste panelen) of SAS (rechter panelen). Schaal bar = 100 micrometer. Kwantificering van de kleuring werd bepaald met behulp van het gebied fractie techniek om procent immunop metenOSITIEVE gebied voor GFAP (B) en Iba-1 (C). Gemiddelde ± SEM, n = 3 controle, n = 3 SAS-behandelde of n = 4 PBS-behandelde muizen, 6 delen per muis. Statistische verschillen werden bepaald met een one-way ANOVA, * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001. Re-print met toestemming van (11). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54348/54348fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig4.jpg" /> Figuur 4. FACS analyse van EAE C57BL / 6 muis ruggenmerg demonstreren kleinere T-cel infiltratie in behandelde muizen. C57BL / 6-muizen behandeld met PBS of SAS, beginnend 7 d postinduction van EAE. Ruggenmerg werden verkregen op dag 15 (A) Representatieve dot plots tonen Th1 (IFN-γ + / IL-17 -) en Th17 (IFN-γ- / IL-17 +) cellen CD4 + gate (bovenste panelen) en regulatoire T-cellen (Foxp3 +) (onderste panelen). Dot plots tonen percentages in de rechterbovenhoek kwadrant. (B) Absolute aantallen CD4 + -cellen en IFN-γ +, IL-17A + en Foxp3 + cellen werden statistisch geanalyseerd. (C) De procentuele verandering van T cel populaties tussen SAS- en PBS behandelde muizen EAE werd eveneens onderzocht. Gemiddelde ± SEM, n = 10 voor PBS behandelde en n = 9 voor SAS behandeld twee onafhankelijke experimenten. Tweezijdig t-toets werd gebruikt voor alle grafieken. ** P &lt;0,01. Re-print met toestemming van (11). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54348/54348fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig5.jpg" /> Figuur 5. FACS Analyse van EAE C57BL / 6 muis milten Aantonen Equivalent T cel proliferatie en expressieprofielen in behandelde en onbehandelde muizen. Milten van PBS en SAS-behandelde muizen werden geanalyseerd 15 d postinduction van EAE. (A) het percentage van CD4 + T-cellen Th1 (IFN-γ + / IL-17 -), Th17 (IFN-γ - / IL-17 +) en regulatoire T-cellen (Foxp3 +) in de milt van PBS- behandeld (n = 10) en SAS-behandelde (n = 9) muizen uit twee onafhankelijke experimenten. (B, linker paneel) Het percentage van Ki-67 + cellen in de CD4 + populatie naïeve milten (n = 4) en uit PBS (n = 5) en SAS-behandelde muizen (n = 5) geïnduceerd met EAE. Een one-way ANOVA-test aangetoond statistische significantie tussen het aandeel van de Ki-67 + cellen uit naïeve milt in vergelijking met ofwel PBS of SAS-behandelde EAE milt. Geen significantie werd waargenomen tussen PBS en SAS-behandelde EAE milt. (B, rechter paneel) Vertegenwoordiger puntdiagrammen; getallen geven percentage proliferatie. Dot plots tonen percentages. Staafdiagrammen vertegenwoordigen tweezijdige t-toets, *** p &lt;0,001. Re-print met toestemming van (11). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54348/54348fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig6.jpg" /> Figuur 6. Farmacologische behandeling na immuuncel infiltratie in SJL muizen met EAE. Klinische score (gemiddelde ± SEM) van SJL-muizen behandeld met PBS (n = 8) en SAS (n = 8) van dag 24 immunisatie (stippellijn) met PLP 139-151. Gegevens zijn gemiddelde ± SEM van klinische scores. Statistisch verschil werd bepaald met behulp van een niet-parametrische tweezijdige Mann-Whitney U test, *** p &lt;0,001. Top lijn geeft waarden die worden gebruikt voor statistischeanalyse. Re-print met toestemming van (11). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig7.jpg" /> Figuur 7. Kwantificering van MBP kleuring met behulp van optische dichtheid. (A) Vertegenwoordiger kleuring van MBP in thoracale ruggenmerg van een niet nader genetische knockout muis vergeleken met littermate controle C57BL / 6 muis geïnduceerd met EAE. Beugel geeft representatieve gebied van verminderde MBP kleuring aangeeft demyelinisatie. (B) MBP kleuring van thoracale ruggenmerg van een niet nader genetische knockout C57BL / 6 muis. (C) opgegeven genetische knockout muizen geïnduceerd met EAE (KO; n = 6 muizen, 2-4 lumbale en thoracale secties per dier) vertonen een hogere optische dichtheid (OD) van MBP kleuring in het ruggenmerg dan wildtype (WT; n = 3 muizen, 2-4 lumbale en thoracale secties per dier) muizen geïnduceerd met EAE. Statistisch geanalyseerd using een tweezijdige t-toets, * p &lt;0,05. Foutbalken vertegenwoordigen SEM. Schaal bar 100 micrometer.

Dit protocol beschrijft hoe te bepalen of farmacologische behandelingen voor experimentele auto-immuun encefalomyelitis CNS-bescherming vertonen als gevolg van het onderdrukken van immuuncel-infiltratie of neuroprotectief zijn tijdens de aanval van immuuncel-infiltratie.

Het bepalen van onderdrukking van het immuunsysteem versus CNS Bescherming voor farmacologische interventies bij auto-Demyelinisatie

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in ...

Het algemene doel van deze conceptuele methode is om vast te stellen of farmacologische behandelingen voor experimentele auto-immuun encefalomyelitis hun bescherming van het centrale zenuwstelsel bewijzen tijdens de aanval van immuuncelinfiltratie of als gevolg van de onderdrukking van immuuncelinfiltratie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het neurale immunologische veld. Zoals: hoe verschilt het effect op immuuncelinfiltratie ten opzichte van bescherming wanneer de timing van de EAE-behandeling wordt aangepast.De implicaties van deze techniek strekken zich ook uit tot de therapie voor multiple sclerose, aangezien er momenteel geen neuraal beschermende behandelingen voor deze ziekte bestaan. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we ontdekten dat de behandeling van EAE-muizen met een remmer van de systeem Xc-transporter zowel neuroprotectief als immunomodulerend was. Hoewel deze methode gebruikt kan worden om geneesmiddelenbehandelingen te bestuderen, kan deze ook worden toegepast in studies met genetische knockout-muizen die zijn onderworpen aan EAE of andere manipulaties.Begin met het fijnmalen van de hersenen en het ruggenmerg van individuele dieren in kleine stukjes met een steriele schaar. Gebruik vervolgens per weefsel één zuiger van een spuit van drie milliliter om elk monster door individuele cellenzeven van 70 micron in individuele conische buizen van 50 milliliter te persen, terwijl de zeven met medium worden gespoeld. Wanneer alle stukjes zijn gemacereerd, wordt het uiteindelijke volume in de buizen aangevuld tot 50 milliliter met vers medium, waarna de celstuspensies worden gecentrifugeerd.Resuspendeer elke pellet in vier milliliter van de 40% densiteitsgradiëntoplossing. Breng de cellen vervolgens voorzichtig over door ze langzaam langs de wanden van individuele conische buizen van 15 milliliter op twee milliliter van de 70% densiteitsgradiëntoplossing per buis te plaatsen. Scheid de cellen door middel van centrifugatie en gebruik transferpipetten van één milliliter om de bovenste myeline-lagen voorzichtig weg te werpen.Breng vervolgens de levensvatbare cellen van de monsterinterfaces over naar nieuwe conische buisjes van 15 milliliter en was de cellen in een eindvolume van 15 milliliters vers medium per buisje. Resuspendeer de pellets in 200 microliters vers medium en breng de celsuspensies over naar individuele putjes van een 96-well plaat met ronde bodem. Centrifugeer de plaat en verwijder de supernatanten door te tikken.Resuspendeer vervolgens de pellets in 200 µL restimulatiummedium en incubeer de cellen gedurende vier uur bij 37 °C. Centrifugeer de plaat aan het einde van de incubatie opnieuw en verwijder de supernatanten. Was de cellen vervolgens in 200 µL PBS aangevuld met 2% FCS en resuspendeer de cellen gedurende 10 tot 15 minuten op ijs in 200 µL PBS aangevuld met 2% FCS en FC-block.Was na afloop van de incubatie de cellen zoals zojuist gedemonstreerd en resuspendeer de pellets gedurende 15 minuten op ijs in 15 µL celoppervlak-kleuringscocktail. Centrifugeer vervolgens de cellen en was de monsters twee keer in 200 µL PBS. Resuspendeer de cellen daarna in FOXP3-transcriptiefactor-kleuringsreagentia volgens de instructies van de fabrikant gedurende 30 minuten tot overnacht bij 4 °C.Was na afloop van de incubatie de cellen in 150 µL permeabilisatiebuffer. Centrifugeer vervolgens de cellen en resuspendeer de pellets on ice in 15 µL permeabilisatiebuffer met de gewenste intracellulaire antilichamen. Centrifugeer de cellen na 30 minuten en was deze vervolgens drie keer met 200 µL permeabilisatiebuffer.Resuspendeer na de laatste wasbeurt de pellets in 200 microliters PBS en analyseer de monsters via flowcytometrie, waarbij gegated wordt op de levende CD4-positieve, TCR bèta-positieve cellen. Het is daarnaast belangrijk om de proliferatie van perifere T-cellen te beoordelen, aangezien veranderingen in de periferie de infiltratie van immuuncellen in het CZS kunnen beïnvloeden. Om het aantal astrocyten en gliacellen in de ruggenmergweefselmonsters na EAE-inductie te kwantificeren, worden van elke sectie beelden gemaakt bij een 4x vergroting, welke als TIFF-bestanden worden opgeslagen.Select vervolgens in ImageJ de gewenste afbeelding en gebruik de tool voor polygoonselecties om de gehele sectie van het ruggenmergweefsel te omtrekken. Selecteer onder het afbeeldingsmenu 'type' en '16-bit' om de afbeelding naar 16-bit te converteren. Open daarna het procesmenu en selecteer 'subtract background' om de straal van de rollende bol (rolling ball radius) in te stellen op minimaal de grootte van het grootste object dat geen deel uitmaakt van de achtergrond.Controleer de verschuivende paraboloïde en klik op OK. Selecteer vervolgens onder afbeelding 'adjust' en 'threshold', en gebruik de schuifregelaars om het onderste drempelwaardeniveau in te stellen. Om het percentage van het gedrempelde gebied binnen de geselecteerde regio te verkrijgen, selecteert u onder 'analyze' en 'set measurements' de optie 'area fraction'. Zorg ervoor dat 'limit to threshold' is uitgevinkt en dat 'display label' is aangevinkt, en klik op OK. Selecteer vervolgens onder 'analyze' de optie 'measure' om de metingen te verkrijgen.Er verschijnt een pop-upvenster met de resultaten. Sla deze gegevens op en vergelijk de waarden van de area fraction tussen de behandelingsgroepen. Om de basiskleuring van myeline te kwantificeren via optische densiteit, opent u de betreffende afbeelding en gebruikt u de tool voor polygoonsecties om een region of interest binnen het monster te tekenen.Select onder 'analyze and set measurements' de optie 'mean gray value' en controleer of 'limit to threshold' is uitgevinkt en 'display label' is aangevinkt. Klik op OK. Selecteer vervolgens onder het menu 'analyze' de optie 'measure'. Er verschijnt een nieuw pop-upvenster met resultaten met de gegevens van de gemiddelde grijswaarde van het myelin basic protein.Het verwijderen van het ruggenmerg en flowcytometrische analyse maken het mogelijk om de infiltratie van immuuncellen in het centrale zenuwstelsel te beoordelen, waarbij de infiltratie van immuuncellen maximaal is op het hoogtepunt van de ziekte. Statistische analyse van het aantal CD4-positieve, interferon gamma-positieve, IL-17-positieve en FOXP3-positieve cellen kan de significantie onthullen van veranderingen die waargenomen zijn in het aantal infiltrerende CD4-positieve T-cellen in met medicijnen behandelde dieren vergeleken met controledieren, waarbij een diepgaande co-expressieanalyse essentieel is om skewing uit te sluiten als een verstorende factor in de algehele afname van het aantal infiltrerende CD4-positieve T-cellen. Om de mogelijkheid uit te sluiten dat een afname van infiltrerende T-cellen in het centrale zenuwstelsel het gevolg is van het remmen van proliferatie, activatie en differentiatie in de periferie, kunnen het aantal actief prolifererende T-cellen en de proportie T-celsubtypen worden geëvalueerd.Voor een kwantitatieve evaluatie van de integriteit van de myeline kan een statistische analyse van de optische dichtheid van de kleuring van het myelin basic protein worden uitgevoerd, wat bijvoorbeeld een significante demyelinisatie van het ruggenmergweefsel in niet-gespecificeerde genetische knockout-dieren onthult in vergelijking met wild-type nestgenoten. Om verder aan te tonen of neuro-inflammatie wordt in stand gehouden of verminderd door therapeutische interventies, kan reactieve gliose ook worden beoordeeld door de gemiddelde fractie van het oppervlak voor reactieve gliose te meten, zoals zojuist gedemonstreerd. Zodra de techniek onder de knie is, kan de flowcytometrische methode in twee dagen worden voltooid mits correct uitgevoerd, terwijl de kwantificering van de weefselkleuring in ongeveer twee uur per kleuring kan worden uitgevoerd.De immunomodulatie kan worden beoordeeld door de behandelingen toe te dienen vóór de infiltratie van immuuncellen, om zo de migratieve en proliferatieve veranderingen in de T-cellen te kwantificeren. De CNS-bescherming kan worden beoordeeld door de behandelingen toe te dienen tijdens de piek van de ziekte, wanneer de immuuncellen reeds in het CZS zijn geïnfiltreerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met het evalueren van de optimale drempelinstellingen in ImageJ voor de specifieke markering van uitsluitend de cellulaire kleuring.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u de effecten van specifieke behandelingen op het centrale zenuwstelsel, de T-celproliferatie en migratie-responsen kunt beoordelen, door de behandelingsperioden vóór en na de infiltratie van immuuncellen te variëren.

determining-immune-system-suppression-versus-cns-protection-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Sommige muizenstammen in staat zijn om de inductie van experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) te weerstaan ​​met myeline basisch eiwit. Hier beschreven is een eenvoudige immunisatieprotocol dat het niet-reageren omkeert en induceert verlammende ziekte in een aantal typische EAE resistent muis vlekken.

Het overwinnen van reageert niet in experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) Resistant muizenstammen door adoptieve overdracht en Antigene Challenge

Een nieuw ex vivo voorbereiding voor het afbeelden van de muis ruggenmerg. Dit protocol maakt twee-foton beeldvorming van levende cellulaire interacties gehele ruggenmerg.

Twee-foton Imaging van Cellular Dynamics in de Muis Spinal Cord

Demyeliniserende ziekten kunnen worden gemodelleerd bij dieren door lokale toepassing van lysolecithin in het CZS. Een enkele injectie van lysolecithin in het ruggenmerg van muizen produceert een laesie die zich na verloop van tijd spontaan herstelt. Het doel is om factoren te bestuderen die betrokken zijn bij de- en remyelinisatie en middelen te testen om het herstel te verbeteren.

Experimentele Demyelinisatie en Remyelinisatie van Muriene Spinal Cord door Focal Injectie van lysolecithine

Dit manuscript beschrijft de methoden voor inductie en scoren van het experimentele auto-immuunencefalomyelitis (EAE) model, samen met de beoordeling van immuunceldistributie en mRNA-cytokineniveaus in lymfeklieren, milt, bloed en ruggenmerg met behulp van flowcytometrie en kwantitatieve PCR, respectievelijk, in verschillende fasen van de ziekte.

Inductie van experimentele auto-immune Encefalomyelitis in Muizen en evaluatie van de ziekte-afhankelijke Verdeling van immuuncellen in verschillende weefsels

Hier presenteren we protocollen om te onderzoeken op bijzondere waardeverminderingen van de neurovasculaire eenheid tijdens de experimentele autoimmune encefalomyelitis in vivo. Wij ingaan specifiek op het bepalen van de bloed - hersenbarrière permeabiliteit en gelatinase activiteit die betrokken zijn bij migratie van leukocyten in de glia-limitans.

Visualiseren van de waardevermindering van het endotheel en gliale belemmeringen van de neurovasculaire eenheid tijdens de experimentele Autoimmune encefalomyelitis In Vivo

Dit manuscript presenteert een protocol om actieve experimentele auto-immuunenceomyelitis (EAE) bij muizen te induceren. Een methode voor de isolatie en karakterisering van de geïnfiltreerde lymfocyten in het centrale zenuwstelsel (CNS) wordt ook gepresenteerd om te laten zien hoe lymfocyten betrokken zijn bij de ontwikkeling van cns auto-immuunziekte.

Flow Cytometrische Analyse van lymfocyten infiltratie in het centrale zenuwstelsel tijdens experimentele auto-immuunenceomyelitis

Het huidige protocol beschrijft de inductie van experimentele auto-immune encefalomyelitis in een muismodel met behulp van myeline oligodendrocytenglycoproteïne en het monitoren van het ziekteproces met behulp van een klinisch scoresysteem. Experimentele auto-immuun encefalomyelitis-gerelateerde symptomen worden geanalyseerd met behulp van muis femur micro-computertomografie analyse en open veld test om het ziekteproces uitgebreid te beoordelen.

Inductie- en diverse beoordelingsindicatoren van experimentele auto-immuun encefalomyelitis

Het huidige protocol beschrijft een tweepuntsinjectie van lysofosfatidylcholine via een stereotaxisch frame om een stabiel en reproduceerbaar demyelinisatiemodel bij muizen te genereren.

Een stabiel gevestigde tweepuntsinjectie van lysofosfatidylcholine-geïnduceerd focale demyelinisatiemodel bij muizen

Tot op heden zijn protocollen voor de gelijktijdige isolatie van alle belangrijke celtypen van het centrale zenuwstelsel uit dezelfde muis een onvervulde vraag. Het protocol toont een procedure die toepasbaar is bij naïeve en experimentele auto-immuun encefalomyelitis-muizen om complexe cellulaire netwerken tijdens neuro-inflammatie te onderzoeken en tegelijkertijd het vereiste aantal muizen te verminderen.

Gelijktijdige isolatie van de belangrijkste celtypen van het centrale zenuwstelsel van volwassen auto-immuun encefalomyelitis-muizen

Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) dient als een diermodel van multiple sclerose. Dit artikel beschrijft een benadering voor het scoren van ruggenmergontsteking, demyelinisatie en axonaal letsel bij EAE. Daarnaast wordt een methode gepresenteerd om oplosbare neurofilamentlichtniveaus in het muizenserum te kwantificeren, waardoor de beoordeling van axonaal letsel bij levende muizen wordt vergemakkelijkt.

Scoren van ontsteking, demyelinisatie en axonletsel van het centrale zenuwstelsel bij experimentele auto-immuunencefalomyelitis

Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is een diermodel van multiple sclerose (MS), dat met de menselijke ziekte een robuuste humorale auto-immuunrespons deelt. Hier rapporteren we een eenvoudig en flexibel ELISA-protocol om auto-antilichamen in het serum van EAE-geïmmuniseerde muizen te kwantificeren.

Kwantificering van autoreactieve antilichamen bij muizen bij experimentele auto-immuunencefalomyelitis

Leer een methode om farmacologische interventies bij EAE te evalueren op immuunsuppressie versus CNS-bescherming. Dit helpt bij het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën voor multiple sclerose.

Het bepalen van onderdrukking van het immuunsysteem versus CNS Bescherming voor farmacologische interventies bij auto-Demyelinisatie (Video) | JoVE Journal

Het bepalen van onderdrukking van het immuunsysteem versus CNS Bescherming voor farmacologische interventies bij auto-Demyelinisatie

Meer video's verkennen