Geautomatiseerde analyse van C. elegans Swim Gedrag Met behulp van Celest Software
7 december 2016
Een efficiënte en eenvoudige methode voor het computer-gebaseerde analyse van nematode zwemmen gedrag in de vloeistof wordt beschreven. De methode vereist weinig tot geen investering voor C. elegans laboratoria. De gebruikte hardware is standaard, en de computer software voor de gedragsanalyse (celest) is een open source is.
Het algemene doel van deze methodologie is om het zwemgedrag van C.Elegans kwantitatief te evalueren met behulp van computervisiesoftware genaamd CeleST, voor C.Elegans Swim Test"Deze analysemethode kan helpen om de impact van genetische mutaties of farmacologische interventies op het zwemgedrag van C.elegans aan te pakken. Het kan ook gemakkelijk de leeftijdsgerelateerde afname in de locomotieve capaciteiten scoren. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat meerdere dieren tegelijkertijd kunnen worden gevolgd, met verschillende aspecten van zwemhouding geanalyseerd om acht parameters van zwemgedrag te scoren, en geautomatiseerde gegevensevaluatie.
Begin met het verkrijgen van een stereomicroscoop en een digitale CCD-camera, evenals een computer met digitale video-opnamesoftware en computervisiesoftware voor de analyse van het zwemgedrag van C.Elegans. Stel binnen de digitale video-opnamesoftware de volgende instellingen in: Bedek de microscoop met een donkere doek om glans in het zwemgedeelte op de microscoopplaat te voorkomen en de beeldkwaliteit te verbeteren. Pas de werkafstand en vergroting van de microscoop aan voor volledige weergave van het zwemgebied, en pas de basisspiegel aan om een scherp contrast van de dieren tegen de achtergrond te krijgen.
Stel vervolgens de verlichting in op donkerveld om de lichamen van de volwassenen als wit te visualiseren tegen een zwarte achtergrond. Pipetteer vervolgens 60 microliters van 1 x M9-buffer in een ring van 10 millimeter, vooraf bedrukt op een microscoopplaat, en zorg ervoor dat de druppel het binnenste gebied van de ring volledig bedekt. Breng vier volwassen nematoden over in de druppel van 1 x M9-buffer terwijl het transport van bacteriën dat de vloeistof kan vertroebelen, wordt geminimaliseerd.
Minimaliseer bacteriën in de zwemput door nematoden kort te laten kruipen op een ongezeten gebied van de plaat voordat ze worden overgebracht, of door de zwemput lichtjes te mengen om kleine sporen van bacteriën te verspreiden voordat ze worden opgenomen. Plaats vervolgens de plaat geladen met volwassen nematoden op de basis van de microscoop om hun zwemgedrag in vloeistof in video's van 30 seconden op te nemen. Selecteer voor het opnemen Nieuwe reeks in RAM onder het kopje Home en druk vervolgens op de rode opnameknop.
Klik tenslotte, nadat de opname is voltooid, op het Home-kopje en selecteer Exporteer volledige reeks om de video in een reeks beeldframes te fragmenteren. Begin met het starten van de computervisiesoftware voor C.elegans zwemgedragsanalyse uit Mat Lab door op de knop Uitvoeren te klikken. Gebruik op de startpagina van het zwemanalyseprogramma de knoppen Eén video toevoegen"of Meerdere video's toevoegen"om sequenties van beeldframes één voor één of in groepen te uploaden terwijl relevante labels worden toegevoegd, zoals genotype, datum, proef en duur.
Klik vervolgens op Video's verwerken"om gelijktijdige tracking van meerdere dieren in de geüploade sequenties mogelijk te maken. Selecteer in het nieuwe scherm dat verschijnt de gewenste video's in het linkervak en klik op Toevoegen aan de lijst"Vervolgens demarcateert u de zwemzone door drie punten binnen de ring te selecteren en start u de verwerking door te klikken op Verwerk alle video's die hierboven worden vermeld. Bekijk de voortgang van de videoverwerking onderaan het midden van het scherm.
Nadat het voltooid is, sluit u het videoverwerkingsscherm. Klik om te beginnen op Maatregelen berekenen"om een nieuw scherm te openen waar de verwerkte video's één voor één kunnen worden geüpload om de tracking van enkele dieren te valideren of af te wijzen. Gebruik deze handmatige stap om u te concentreren op gebieden met gemiste tracking, weergegeven in de rode blokken, en contrast met succesvolle tracking, genoteerd in de groene blokken.
Zoek de Geldigheid van het gesegmenteerde lichaam"in de eerste kleurenbalk over het scherm in de onderste helft. Let op dat het percentage geldige frames groen is en het percentage afgewimpelde frames rood is. Navigeer vervolgens en wijzig blokken met geldige of afgewimpelde frames met behulp van de volgende blok, Geldigheid schakelen"Blok splitsen"en Isoleren frame"opties.
In het zeldzame geval dat twee dieren elkaar kruisen in een onbezette zwemzone, wissel hun identificatienummers uit over een specifiek framebereik met de Schakel-knop. Klik ten slotte op Opslaan en berekeningen uitvoeren"om de geldigheidsinvoer op te slaan voordat u een andere verwerkte video uploadt. Selecteer vervolgens Sluiten"om het scherm Meetwaarden berekenen te verlaten.
Merk op dat de software kromtenkaarten van de zwemprestaties van individuele dieren op de achtergrond berekent, evenals de acht parameters die later worden aangegeven. Klik op de startpagina van het computervisiesoftwareprogramma op Resultaten weergeven"om de analyse-uitvoer te verkrijgen. Maak vervolgens steekproefgroepen voor statistische behandeling door de gewenste geanalyseerde sequenties van frames in het linkervak te selecteren en ze in een nieuwere bestaande steekproefgroep te verplaatsen door op de knoppen Toevoegen aan de geselecteerde steekproef"of Toevoegen aan een nieuwe steekproef"te klikken.
Klik op Grafieken weergeven voor deze steekproeven"om naar een tweede scherm te gaan dat de grafieken en belangrijke statistieken van de steekproeven voor elk van de acht parameters weergeeft door selectie bovenaan het scherm. Selecteer vervolgens 2D-histogrammen"om combinaties van twee parameters te plotten via de maat op de X-as en maat op de Y-as dropdown menu's aan de linkerkant van het scherm. Klik op Sluiten"om terug te keren naar het scherm Resultaten weergeven.
Selecteer vervolgens de exportknop linksboven in het scherm om gedetailleerde numerieke gegevens op te slaan als een csv-bestand om te openen en verder te manipuleren in een spreadsheetprogramma. Selecteer ten slotte Sluiten"om het scherm Resultaten weergeven te verlaten en terug te gaan naar de startpagina. Klik op Afsluiten"om het opslaan van de database met de geanalyseerde videosequenties te garanderen.
Bepaalde zwemparameters, zoals golfinitiatiefrequentie, activiteitsindex, borstelslag en reissnelheid, namen geleidelijk af met de leeftijd, zelfs in gunstige gene
Overzicht
Dit artikel presenteert een eenvoudige methodologie voor het analyseren van het zwemgedrag van C. elegans met behulp van de opensourcesoftware CeleST. De aanpak is kostenefficiënt en maakt gebruik van standaard laboratoriumapparatuur, waardoor deze toegankelijk is voor diverse onderzoekssituaties.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsanalyse
- Genetica
Achtergrond
- C. elegans is een modelorganisme dat veelvuldig wordt gebruikt in genetische en gedragsstudies.
- Het begrijpen van het zwemgedrag kan inzicht bieden in de effecten van genetische mutaties en farmacologische interventies.
- Leeftijdsgerelateerde veranderingen in de locomotieve capaciteiten kunnen kwantitatief worden beoordeeld.
- Computer vision-technieken verhogen de precisie van de gedragsanalyse.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor de kwantitatieve evaluatie van het zwemgedrag van C. elegans.
- Het beoordelen van de impact van genetische en omgevingsfactoren op het zwemgedrag.
- Het faciliteren van de analyse van leeftijdsgerelateerde afnames in de locomotie.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een stereomicroscoop en een digitale CCD-camera voor videoregistratie.
- Toepassing van CeleST-software voor het volgen en analyseren van het zwemgedrag.
- Registratie van het zwemgedrag in een gecontroleerde omgeving met minimale bacteriële interferentie.
- Verwerking van videodata om belangrijke gedragsparameters te extraheren en statistische analyses te genereren.
Belangrijkste resultaten
- Meerdere C. elegans kunnen gelijktijdig worden gevolgd, wat een uitgebreide analyse mogelijk maakt.
- Er werden leeftijdsgerelateerde afnames in bepaalde zwemparameters waargenomen.
- Sommige nematoden behielden hun fysieke conditie langer dan andere, wat wijst op variabiliteit in de veroudering.
- De methode maakt een snelle analyse van het zwemgedrag mogelijk, wat de efficiëntie van het onderzoek verhoogt.
Conclusies
- De CeleST-software biedt een robuust platform voor het analyseren van het zwemgedrag van C. elegans.
- Deze methodologie kan een aanzienlijke bijdrage leveren aan studies over genetica en veroudering.
- Toekomstig onderzoek kan deze benadering benutten om verdere gedragsmatige en fysiologische vragen te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Geautomatiseerde analyse van het zwemgedrag van C. elegans maakt high-throughput fenotypische screening mogelijk voor de ontdekking van neuroactieve verbindingen en doelwitvalidatie. Door locomotieparameters in vloeistof te kwantificeren, ondersteunt de methode de mechanistische risicoreductie van genetische en farmacologische interventies in een schaalbaar, reproduceerbaar modelsysteem. Deze aanpak vergroot het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door gedragsmatige output te koppelen aan de functie van neurale circuits.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door middel van kwantitatieve beoordeling van de neuromusculaire functie in genetische mutanten.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door acht parameters van het zwemgedrag gelijktijdig te volgen bij honderden dieren.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfolio-triage door verbindingen te identificeren die de leeftijdgerelateerde afname van het locomotieve vermogen beïnvloeden.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows via gestandaardiseerde afbakening van zwemzones en geautomatiseerde tracking.
- Kwantitatieve outputs: Genereert krommingskaarten en acht houdingsgebaseerde parameters zonder drempelwaarden, wat een betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk maakt.
- Schaalbaarheid: Verwerkt 250 dieren per dag met remote computation, wat hergebruik van het platform over verschillende screeningscampagnes ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Verbindt fenotypes van zwemgedrag met modellen van veroudering en neurodegeneratie via leeftijdgerelateerde parametertrends.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug van ontdekking naar preklinische validatie door consistente gedragsmatige read-outs over verschillende workflows te handhaven.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Informeert go/no-go-beslissingen door nieuwe fenotypes te onthullen in goed gekarakteriseerde genetische achtergronden.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van vroege target-validatie tot lead-identificatie, door kwantitatieve gedragsmatige read-outs te leveren die bijdragen aan het mechanistische begrip en de prioritering van verbindingen.
- Discoverybiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en de verduidelijking van signaalpaden via geautomatiseerde analyse van de zwemhouding en bewegingsdynamiek.
- Screening: Waarborgt assay-gereedheid en reproduceerbaarheid door gelijktijdige tracking van meerdere dieren en gestandaardiseerde videoverwerking.
- Analytiek: Levert statistische output en kernstatistieken voor elk van de acht parameters, wat vergelijking tussen verschillende condities mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Zorgt voor translationele continuïteit in preklinische fasen door afstemming van biomarkers gerelateerd aan leeftijd in trajecten van afnemende locomotie.
- Enterprise-hergebruik: Fungeert als een herbruikbare capaciteit voor gedragsscreening over meerdere projecten en therapeutische gebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende zekerheid bij targetvalidatie door vermindering van mechanistische ambiguïteit in de neuromusculaire functie.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via geautomatiseerde data-evaluatie en minimale handmatige interventie.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium door vroege fenotypische risicoreductie.
- Impact op de portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van kwantitatieve drempelwaarden voor zwemgedrag.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in het bedienen van computer vision-software en het hanteren van C. elegans.
- Necessiteert een stereomicroscoop, een digitale CCD-camera en een computer met CeleST-software voor videocapture en analyse.
- Vereist cross-team standaardisatie van de afbakening van de zwemzone en videolabeling voor genotype, datum, trial en duur.
- Houdt rekening met adaptatie-overwegingen tussen modelsystemen vanwege de afhankelijkheid van op vloeistof gebaseerde locomotie-assays.
- Omvat praktische beperkingen, zoals de noodzaak om bacteriële contaminatie in zwembuizen te minimaliseren om de beeldkwaliteit te behouden.
